CN111554559A - 质谱仪的质量校准 - Google Patents

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Abstract

公开一种校准质谱仪10的方法以及用于所述质谱仪10的控制器200。所述质谱仪10包含生成样本离子的第一离子源20、生成外部校准物离子的第二离子源50以及质量分析器100。执行初步质量校准。在样本分析的时间段t之后，将外部校准物离子与所述样本离子分别引入到所述质谱仪10中。获得表示所述外部校准物离子的质荷比的数据。将所述外部校准物离子数据与参考外部校准物离子数据相比较以获得表示质量差的偏移值。如果此偏移低于阈值，则使用新的外部校准物离子数据修改所述初步校准。如果所述偏移高于阈值，则执行全面重新校准。

Description

质谱仪的质量校准
技术领域
本发明涉及质谱仪的质量校准，例如但不限于傅立叶变换质谱仪(FourierTransform Mass Spectrometer，FTMS)，例如OrbitrapTM，或飞行时间(TOF)或四极杆质谱仪。
背景技术
质谱通常需要某种形式的质量校准以确保质谱中报告的质量是准确的。通常，对形成“校准混合物”的多个校准种类进行测量，并确定已知的校准物离子种类的质荷(m/z)比与其理论m/z比之间的关系。理论m/z比是指实际或已知的m/z比。通常拟合并调整校准曲线，以使校准化合物的以实验方式确定的值与理论值之间的误差最小化。接着，可将校准曲线用在后续质量分析中，以校正测得的m/z比。
由于时间上可变的条件，例如温度波动，测得的m/z(或在飞行时间MS的情况下，涉及m/z的平方根的飞行时间)随时间而偏移。因此，在某一时间获得的校准曲线以当时的实验条件为基础，并且可能无法提供准确的随后分析的离子m/z。解决此问题的一种方式是通过选择材料和构造，从而使温度偏移的影响最小化。由于受影响材料的热时间限制(热惯性)，此类方法难以进行并且较贵，无论如何，还可能无效。
作为替代方案，已提议测量温度且接着基于测得的温度来调整校准参数。此类方法计算繁重，并且准确而充分地测量温度可能具有挑战性。
解决时间漂移的另一方法是定期重新校准质谱仪——也就是说，重新计算校准曲线。这需要使用已知的质量标准以允许计算修正/更新后的校准曲线参数。
使用此类“校准混合物”——即，使用单独地供应到质谱仪的已知m/z的离子种类)会造成困难。如果未充分频繁地重新计算校准系数，这可能就会导致m/z或TOF测量值的不可接受的不准确性；由于在分析校准混合物时没有进行任何样本测量，过度的重新校准就会负面地影响样本处理量，并且会干扰通常用于质谱分析的色谱过程。
样本处理量的这个问题的一个解决方案是采用所谓的“内部锁定质量”，也就是说，与样本混合并具有已知m/z的离子种类。内部锁定质量可在样本制备阶段与样本混合，也可从环境污染物(例如在色谱法和/或电离过程中由装置或其消耗品发出的分子)产生，前提是其具有已知质荷比。接着，可使用锁定质量在每个频谱中校正样本离子种类m/z或TOF。如果已知锁定质量离子的测得的m/z或TOF偏移，则接着对样本离子的测得的m/z或TOF进行全局调整以校正所述偏移。所施加的调整是对所有离子的测得的质荷比的全局调整，并且反映以下实情：由于例如温度的升高，测得的质荷比存在全局偏移。
在许多专利公开案中已论述了对质谱仪中的校准漂移问题的各种特定解决方法。例如，US-B2-7,518,104公开了一种用于确定参数何时充分改变以保证重新校准的方法。
US-B2-9,881,776采取了不同的方法，并在分析物信号低于特定阈值时进行重新校准，以避免干扰分析物峰，使得重新校准测量不会占用可用于ms/ms分析的时间。US-B2-9,805,920提出了响应于内部或外部锁定质量的测得的或估计的m/z来校正校准系数。
US-B-7,053,365公开了通过使用先前记录并存储在计算机存储器中的标准频谱来校正样本的测得的m/z。
US-B-9,418,824公开了一种或多种锁定质量离子的使用，所述离子起初与校准混合物混合以形成内部锁定质量。随后分析所述锁定质量，以允许重新校准。本文件指示，由于频谱干扰引起的频谱中的系统误差和残留误差，因此需要多于一个锁定质量。
GB-A-2,563,077利用
Figure BDA0002380192930000031
等傅立叶变换质谱仪(FTMS)中质量分析的相对温度独立性来提供飞行时间质谱仪的交叉校准。
上述针对系统参数的时间变化所致的重新校准的提议具有各种缺点。例如，全面重新校准(也就是说，对校准混合物中一系列校准物离子进行二次或进一步分析，以允许推导出跨越一定m/z范围的校准曲线)的耗时可能让人无法接受。将锁定质量添加到样本谱中(内部校准)存在问题：例如，锁定质量可能会干扰未知的样本分析物峰，从而导致锁定质量测量的可靠性降低；必须提供构件来将锁定质量和样本添加在一起；而且还有时间损失。此外，在ms/ms分析中，要碎片化的隔离母离子和锁定质量离子通常位于质谱的不同部分，并且需要额外的离子分离和组合步骤。
在此背景下，本发明力图提供一种改进的校准质谱仪的方法。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供一种如权利要求1所限定的校准。质谱仪的方法本发明还扩展到根据权利要求13所述的用于质谱仪的控制器，以及包括此类控制器的质谱仪。
本发明利用了存在于电子转移解离(ETD)中的试剂的存在。所述试剂用作外部校准物。质谱仪会周期性地从捕捉和分析样本离子切换到测量外部校准物的质量。如果测得的质量与参考质量的差异小于阈值量，则以所述差异为基础来调整质谱仪的校准曲线。然而，如果测得的质量与外部校准物的参考质量的差异大于阈值，则可例如使用样本夹带的一个或多个锁定质量作为内部校准物，或通过使用校准混合物来对质谱仪进行全面重新校准。参考质量是指理论质量，即，基于外部校准物的成分元素和电荷状态计算出的质荷比，或是来自已使用当前初步质量校准校正的外部校准物的前一测量的数据。
因此，此类方法提供了一种用于质量校准的混合解决方案，其优化了样本处理量，同时使因在系统参数随时间改变时未校正的校准曲线所致的不可接受的质量准确性误差的风险最小化。当系统参数发生小变化时，可实现校准曲线的相对快速和有益的重新计算，而当确定在分析方面需要时，所述方法仍可提供质谱仪的全面重新校准。此外，基于外部校准物可仅含有一个或两个需要确定质量的离子种类，相对快速地测量外部校准物是可行的。所述方法特别适合于飞行时间质谱仪，包含高分辨率多反射质谱仪，其中扫描速度意指外部校准物分析所需的时间通常约为毫秒或更低。飞行时间质谱仪还比例如FTMS/轨道捕集质谱仪对温度变化更敏感，使得需要更定期地重新校准。
因此，质谱仪可具有关于何时需要进行全面重新校准的有根据(依赖数据)的决策，并且对样本离子处理量的中断相对最小。先前的方法仅仅提出以周期间隔进行耗时的全面重新校准，而与暗示全面重新校准实际上是必需的或者过期的任何信息无关。
此外，使用外部校准物可避免可能降低校准可靠性的校准物峰与样本峰发生干扰的任何可能性。
附图说明
本发明可用数个方式来实践，现将仅通过举例并且参考附图来描述一些实施例，在附图中：
图1示出适于实施体现本发明的质量校准技术的质谱仪的示意性布局；
图2示出根据本发明的第一示范性实施例的质量校准技术的流程图；以及
图3示出根据本发明的第二示范性实施例的质量校准技术的流程图；
图4示出适于实施体现本发明的质量校准技术的质谱仪的另一实施例的示意性布局。
具体实施方式
在整个以下描述中，采用术语“质量”。应理解，此术语严格意义上是指质荷比m/z。
图1示出质谱仪10，其例示了用于实施本发明的实施例的布置。图1所示的布置是赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific，Inc.)制造和销售的
Figure BDA0002380192930000051
FusionTribrid系列质谱仪的示意性视图。需要重申的是，仅仅出于说明体现本发明的质量校准技术的目的而选择图1的布置，其采用超高场
Figure BDA0002380192930000052
Figure BDA0002380192930000053
质量分析器作为质量分析器。可同等地采用其它配置的质量分析器，例如(但不限于)其它形式的傅立叶变换质谱仪(FTMS)、线性离子阱(LIT)、飞行时间质谱仪(TOF-MS)等。
图1的质谱仪10包含主离子源20，例如电喷雾电离(ESI)或大气压化学电离(APCI)源。来自要分析样本的离子在大气压下生成，并以一定角度引导到截取锥，所述截取锥将离子接受到质谱仪10的第一真空室中。
来自主离子源20的离子穿过S透镜(电动离子漏斗)30。S透镜30的下游是第二离子源。第二离子源是试剂离子源(RIS)50，提供所述试剂离子源以允许执行电子转移解离(ETD)实验，如将在下文进一步解释。试剂离子源50具有其自身的专用引入系统，以允许高度稳定的试剂流的递送。RIS 50不是连续的，并且电离可断续地切换。在优选实施例中，试剂是从试剂容器60供应的荧蒽。例如，可采用汤生放电(Townsend discharge)来产生热电子，所述热电子用于通过电子捕捉使试剂分子电离，从而生成试剂ETD试剂(荧蒽)阴离子。通常，RIS 50不需要或不包含热离子长丝。应了解，在其它实施例中，可利用除荧蒽以外的ETD试剂。
RIS 50生成分子量为202.2Da的极强烈、稳定的荧蒽自由基阴离子流以及中等荧蒽自由基阳离子流。如下文将进一步详细描述，主离子源20和RIS 50各自处于系统控制器200的控制下，所述系统控制器能够控制注入到质谱仪10的下游部件中的离子。
在穿过RIS 50之后，离子进入其中具有离子导引件的第二真空室40。离子穿过第二真空室中的离子导引件，从孔出来并进入质谱仪10的又一真空室中，离子在此处进入主动离子束导引件70中。接着，离子进入四极滤质器80，此处可分离出具有分析意义的离子的质量范围。
四极滤质器80的下游是又一离子透镜、转移多极杆和弯曲线性离子阱(C阱)90。如将理解，C阱90可在各种模式中操作，从而捕集离子并正交或纵向地将离子射出。
在第一模式中，从四极滤质器80到达的离子可沿着C阱90的弯曲轴通过离子路由多极杆射出，并进入双压线性离子阱120中以进行质量分析，所述双压线性离子阱具有相对接近离子阱入口的第一高压捕集单元130和其下游的第二低压捕集单元140。在通过四极滤质器80进行任选的质量选择之后，注入高压单元130中的样本离子可与来自试剂离子源50的已单独地注入高压单元中的试剂离子发生反应。较大表面积的检测器150接近于线性离子阱120的低压单元140定位以检测离子。
线性离子阱120位于质谱仪内的“死角(dead end)”配置中。因此，在第二操作模式中，离子可在线性离子阱120中进行ETD反应，离子从此处沿着注入到线性离子阱120期间所遵循的路径返回。因此，离子再次进入C阱90，其中可沿着C阱的纵向轴在弯曲电势井中捕集并冷却离子。冷却后，捕集的离子可正交射向高分辨率质量分析器，例如
Figure BDA0002380192930000061
质量分析器100。如所属领域的技术人员熟悉的那样，注入到
Figure BDA0002380192930000062
中的离子作为相干包围绕中心轴旋转和往复运动。当这些相干离子通过检测器(未示出)时，引发检测器中的图像电流，从而产生时域中的瞬态信号，所述瞬态信号可通过使用快速傅立叶变换或其它已知数学处理转换为频域中的信号。接着，可从所得的频域信号中得出质谱。
在第三操作模式中，可将线性离子阱中经过ETD反应的离子传递到线性离子阱120的低压捕集单元140中进行质量分析。
Figure BDA0002380192930000071
质量分析器和线性离子阱质量分析器的更多细节与本发明无关，因此将不作进一步描述。
质谱仪10处于系统控制器200的总体控制下。尽管这会执行各种功能，但相对于本发明，出于下文结合图2和3进一步解释的原因，系统控制器200配置成控制来自主离子源20和RIS 50的离子的进入。系统控制器200还与质量分析器100通信。
在总体上描述了质谱仪10之后，现将参考图2描述体现本发明的质量校准方法的第一实施例。
根据本发明的此实施例的质量校准过程的第一阶段是使用校准混合物对质谱仪10进行初步校准。这在步骤300示出。校准混合物(或简称为“calmix”)含有已准确知晓的质荷比的多种离子。这些离子通过主离子源20注入到质谱仪中，并以常见方式使用质量分析器100进行分析以获得质谱。替代地或另外，为了对线性离子阱120进行质量校准，可使用线性离子阱120来分析来自主离子源20的calmix离子。将质谱的足够强和/或无干扰的峰的位置(指示测得的质量)与这些峰的理论质量进行比较。由此，可获得质谱仪的初步校准曲线。由于所示质谱仪10具有两个质量分析器——Orbitrap 100和线性离子阱120——因此可根据需要以上述方式针对每个分析器获得校准曲线。确定初步校准曲线的具体方式并不形成本发明的一部分；有经验的读者无论如何都会熟悉用于获得校准曲线的现有数学技术，例如可能应用了曲线加权的最小二乘法线性回归等。
在使用校准混合物获得初步校准曲线后，将所述初步校准曲线存储在存储器中以用于将来的实验分析(步骤310)。接下来，在步骤320，接着例如从液相色谱仪或气相色谱仪(未示出)或以其它方式将要分析的样本供应到主离子源20。以标准方式分析样本，以获得一个或多个——通常多个——质谱；例如，可使用质量分析器100或120，优选Orbitrap质量分析器100，来对样本离子执行前体离子扫描，和/或可执行MS/MS扫描。可例如使用碰撞诱导解离(CID)或使用ETD试剂离子来执行MS/MS。在一个实施例中，可将质量经过选择的样本离子传送到线性离子阱120的高压单元130以捕集于其中，并且可从RIS50供应ETD试剂以与单元130中的样本离子混合，使得在单元130内发生样本离子的碎片化，碎片离子随后被C阱90捕捉，并正交射出到
Figure BDA0002380192930000081
质量分析器100以进行分析。或者，可使用线性离子阱120分析碎片离子。将存储在控制器200的存储器中的初步校准曲线应用于所得的测得质谱，从而校正样本离子和其碎片的测得质量中的误差。
在多个时段tn(n＝1、2、3...)的第一时段t1中执行此类样本分析。
在时段t1结束时，系统控制器200防止其它样本离子进入质谱仪10的主真空室。这可通过数个方式来完成。例如，系统控制器200可将信号施加到S透镜50，以防止来自主离子源20的分析物离子进入第二真空室40。然而，更优选地，系统控制器200配置施加到四极滤质器80的RF电势，例如通过施加允许约202Da的荧蒽离子通过的“凹口”波形，从而仅准许荧蒽离子通过。
无论哪种方式，如图2中的步骤330处所示，在时段t1期间，只有来自RIS50的离子进入C阱90，即，来自主离子源20的离子并未进入。这是本发明的重要特征：在时段t1期间，试剂离子既不用作内部校准物，也不与分析物离子混合。替代地，试剂离子在t1之后的时段期间用作外部校准物，即，与样本离子分开。通过在样本离子的分析期间特意防止ETD试剂离子注入到样本离子束中(优选地但非主要地，通过使系统控制器200在适当时间断续地切换RIS 50)，能避免试剂离子的峰干扰样本离子峰的风险。
来自RIS 50的ETD试剂离子作为外部校准物注入到质谱仪10中。在步骤340，获得ETD试剂频谱。因此，RIS 50在允许捕捉所述ETD试剂频谱所必要的时间段内将ETD试剂离子供应给质谱仪10。使用ETD试剂作为外部校准物的优势在于，已在许多质谱仪中出于碎片化离子的目的提供了此类试剂，因此不需要额外的外部校准物种类。
对于初始校准之后图2的第一循环，使用初步校准曲线(步骤310)调整所获得的“原始”数据中的荧蒽峰的位置。在图2所示方法的后续迭代中，可使用初步校准曲线或当前存储的校准曲线来调整荧蒽峰的位置。这将在下文进一步解释。
在图2的第一次迭代中使用初步校准曲线调整了ETD试剂离子的测得质量后，将此调整后的测得ETD试剂离子质量与参考质量进行比较，所述参考质量可以是存储于系统控制器200的存储器中的ETD试剂离子的理论质量(步骤350)。在替代实施例中，ETD试剂的参考质量可以是使用初步校准曲线调整后的测得ETD试剂离子质量，其中所述测得ETD质量在初始校准(步骤300)与样本分析的开始(步骤320)之间获得。接着，还将调整后的测得质量与理论质量之间以百万分率(ppm)计的差值(偏移值)存储在系统控制器200的存储器中。
在步骤370，系统控制器200中的逻辑将来自步骤360的所存储质量差值与同样预先存储在存储器中的阈值差值进行比较。基于质量准确性与样本处理量的权衡，此阈值可预配置为系统设置或可以是用户可配置的，将在下文进一步详细讨论此方面。
如果所述比较确定差值低于存储的阈值，则所述方法将沿着图2左侧所示的逻辑路径继续。在步骤380，调整在实验开始之前使用校准混合物确定的初步校准曲线。对初步校准曲线参数的调整基于调整后的测得ETD试剂质量与其理论质量之间的测得差值。在最简单的实施例中，ETD试剂质量的调整后的测得值与理论值之间的所确定偏移用于调整所有校准曲线参数(例如，所有校准系数)。例如，可将所有校准曲线参数调整一定的量(以ppm计)，所述量与ETD试剂质量的调整后的测得值与理论值之间的偏移相同。更复杂的技术可使用加权。系统控制器200可存储多个预先获得的校准曲线，并且可将最紧密经过或通过测得的调整后的ETD试剂质量的曲线选为存储器中的更新后的校准曲线。预先获得的校准曲线可能是在仪器的不同温度下获得的。例如，系统控制器200可保留特定质谱仪10中使用校准混合物和/或内部校准物(锁定质量)获得的任何校准曲线中的一些或全部。许多质谱仪长时间停留在单个位置，使得长时间获得的校准曲线可在计算上有用。系统控制器200可使用机器学习和/或可加权最近获得的全面校准曲线(即，使用校准混合物或通过内部校准物获得的曲线)，以在ETD试剂的测得质量的较小偏移引起图2中的步骤380和390的执行时告知对先前采用的校准曲线的“最佳”调整。
因确定测得的ETD试剂质量相对于理论值的偏移而使用初步校准曲线修改的初步校准曲线存储在系统控制器200的存储器中。接着，所述方法循环回到步骤320，其中此次在第二时间段t2内再次将样本离子从主离子源20引导到质谱仪10中。使用来自步骤390的更新后的校准曲线对所述时间段t2期间从样本分析获得的原始质谱进行质量校准。
返回到步骤370，如果逻辑确定ETD试剂的调整后的测得质量之间的差值大于预编程阈值，则在这种情况下，所述方法遵循图2右侧的步骤。在步骤400，代替使用调整后的测得ETD试剂质量与其理论质量之间的差值来计算修改的初步校准曲线，系统控制器200改为发起质谱仪的全面质量重新校准以获得更新后的质量校准曲线。这可通过用校准混合物替换样本来实现(就如在步骤300首次校准质谱仪时所执行的那样)，或可替代地以及不大具破坏性地可例如在尚未存在锁定质量的情况下通过将内部校准物(一个或多个锁定质量)添加到样本而获取具有一个或多个锁定质量存在的频谱来实现。在步骤410，使用新获得的校准曲线的结果来更新系统控制器200的存储器，然后在下一样本分析时段t2期间将所述结果用于对所得质谱进行质量调整。
所述过程在循环中重复(通过基于ETD试剂测量值对校准曲线的调整，或全面重新校准)，直到实验结束。在图2所示的方法的第二以及后续迭代中，可将调整后的测得ETD试剂离子质量与存储在系统控制器200的存储器中的理论质量(即，基于试剂离子的组成元素和电荷状态所计算的试剂离子质荷比)进行比较，或可将调整后的测得ETD试剂离子质量与存储在系统控制器存储器中的先前测得并调整的ETD试剂质量进行比较。在下文中，术语“参考质量”用于表示此类实际质量或已知/测得的质量。
此外，可使用初步质量校准、修改的初步质量校准或更新后的质量校准中的一个或多个来校正样本离子数据的m/z。用以选择哪个质量校准来用于校正样本数据的准则可以是：样本离子数据的获取时间是更接近执行初步质量校准的时间(步骤300)还是更接近分析外部校准物离子的时间(步骤330)或更接近执行重新校准的时间点(步骤400)。
总之，由调整后的测得ETD试剂质量与其参考质量之间的差值的小偏移所确定的系统参数的小偏移可视为对现有校准曲线的扰动，从而根据单个凭经验确定的数据点(ETD试剂的质量)有益地校正该曲线，如上文所解释。然而，随着系统参数的进一步偏移，对样本离子——尤其是质量在校准曲线上远离ETD试剂质量的点处的那些离子——的测得质量的校正变得越来越不可靠。因此，图2中示出的方法在系统参数发生小变化时提供对校准曲线的相对快速和有益的重新计算，而在确定在分析方面需要时仍可提供质谱仪10的全面重新校准。此外，样本分析时段之间对ETD试剂的相对快速测量为系统提供了关于何时需要进行全面重新校准的有根据决策(依赖数据)。
图3示出表示根据本发明的质量校准方法的替代实施例的流程图。图3的实施例与图2的实施例有许多相似之处；在这种情况下，为简洁起见并避免不必要的重复，图3的描述将返回参考图2。应理解，除非另外论述，否则关于图2阐述的考虑因素和优势同样适用于图3。
如同图2的实施例，根据图3的实施例的质量校准过程的第一阶段是使用校准混合物对质谱仪10进行初步校准。这在步骤500处示出。在使用校准混合物获得初步校准曲线后，将所述初步校准曲线存储在存储器中以用于将来的实验分析(步骤510)。接下来，在步骤520，将要分析的样本供应到主离子源20并引入到质谱仪10中，如结合图1和2所论述。将存储在控制器200的存储器中的初步校准曲线应用于所得的测得质谱，从而校正样本离子和其碎片的测得质量中的误差。
在多个时段tn(n＝1、2、3...)的第一时段t1中执行此类样本分析。
在时段t1结束时，系统控制器200防止其它样本离子进入质谱仪10的主真空室。在步骤530，代替上文参考图2所描述的，通过RIS 50将ETD试剂离子引入到质谱仪10中。
连同来自RIS 50的ETD试剂离子(例如，荧蒽)一起，一种或多种环境污染物的离子被引入到质谱仪中。例如，污染物可能来自ESI离子源和色谱系统中使用的管路，也可能来自用于形成RIS 50的材料或往来其中的供应管道。管路中常见的污染物是聚二甲基环硅氧烷，其离子可能与荧蒽离子一起引入；例如地板清洁产品、胶等源自质谱仪外部环境的分子也可能成为污染物离子。关于要选择的污染物的主要考虑因素在于，所述离子在与ETD试剂的m/z很好地分隔开的m/z处具有轮廓分明的峰。在此仅作为特定示例描述的ETD试剂荧蒽在202Da附近有峰，而示范性环境污染物聚二甲基环硅氧烷的合适峰在445Da附近，也就是说，与ETD试剂峰很好地分隔开。在图3的步骤530，将ETD试剂和环境污染物从RIS 50一起引入到质谱仪10中。这可通过使系统控制器200将RF电势施加到具有两个凹口的四极滤质器80来实现，一个凹口允许ETD试剂通过(在本示例中，在202Da附近)，另一凹口允许环境污染物通过(例如，对于所选的聚二甲基环硅氧烷聚合物，在445.120025Da处)。在步骤540，获得ETD试剂离子以及环境污染物离子两者的质谱。RIS 50将ETD试剂离子和环境污染物离子供应到质谱仪10一段必要的时间，以允许捕捉含有ETD试剂离子和环境污染物离子两者的频谱。
因此，应理解，图3的特定示例提出测量污染物的质量，所述污染物或是因RIS 50的部件构造而在RIS 50中固有，或是来自其它外部环境污染物。当然，在图2的步骤330/340中，污染物可能存在于进入质谱仪的离子中；区别在于，在图2的方法中不测量这些污染物离子(例如，通过使用在ETD试剂通行凹口附近具有单个窄带通行凹口的四极滤质器80将其滤除)并且在这种情况下仅将ETD试剂离子用于重新校准目的，或者在步骤340在ETD试剂频谱中测量这些污染物离子，但在后续步骤350、360和370中不使用其测量值。
环境污染物的具体身份对于所述方法并不重要，只要环境污染物在质谱中提供可在校准之后准确测量的轮廊分明的峰即可。
尽管不是优选的，但也应理解，一个或多个锁定质量(即，外部以及有意添加的离子种类)可连同/代替环境污染物离子与ETD试剂离子一起使用。此类技术的缺点在于，需要测量的不同离子种类越多，样本分析之间的停机时间就越长，并且质谱仪的布置变得越复杂以便供应更多离子种类。
使用当前存储的校准曲线来调整所获得的“原始”数据中荧蒽和聚二甲基环硅氧烷峰的位置。对于初始校准之后的图3的第一循环来说，当前存储的校准曲线是初始校准曲线(步骤510)。
在使用初步校准曲线调整了ETD试剂和环境污染物离子的测得质量(就图3的第一次迭代而言)后，将调整后的测得ETD试剂和污染物离子质量与其存储在系统控制器200的存储器中的相应理论质量进行比较(步骤550)。类似于结合图2描述的方法，在图3的替代实施例中，ETD试剂和环境污染物的参考质量可以是使用初步校准曲线调整后的测得ETD试剂和环境污染物离子质量，其中测得的ETD质量和测得的环境污染物离子质量在初始校准(步骤300)与样本分析的开始(步骤320)之间获得。然后还将调整后的测得质量与标称理论质量之间以百万分率(ppm)计的差值存储在系统控制器200的存储器中(步骤560)。
在步骤570，系统控制器200中的逻辑将来自步骤560的所存储质量差值与同样预先存储在存储器中的阈值差值进行比较。这些阈值可预配置为系统设置，或可由用户配置。
在一个实施例中，可将测得的和理论上的荧蒽质量之间的差值与荧蒽阈值进行比较，并且测得的和理论上的环境污染物质量之间的差值可单独地与环境污染物阈值进行比较。由此，可决定是否使用测得质量与理论质量之间的偏差来更新现有的校准曲线，或是否需要进行全面重新校准(使用校准混合物或内部锁定质量)。例如，当ETD试剂和环境污染物的质量值各自均超过阈值时，或当至少一个但未必都超过其各个阈值时，系统控制器200可决定执行全面重新校准。可采取更复杂的加权决策(例如，可在理论上或经验上确立：外部校准物离子之一(ETD试剂或环境污染物)的测得质量相对小的偏移很可能指示需要执行全面重新校准，而在需要使用校准混合物或通过向样本添加锁定质量以作为内部校准物来全面重新计算所得质量校准曲线之前，可容忍外部校准物离子中的另一者的测得质量相对较大的偏移。当然，代替比较两个单独的阈值，可采用表示平均值的单个阈值(加权的或以其它方式)，并将其与测得的ETD试剂和环境污染物离子质量的以类似方式计算出的平均值进行比较。
如果所述比较确定差值低于存储的阈值，则所述方法沿着图3左侧所示的逻辑路径继续。在步骤580，调整现有的校准曲线(其在第一循环中是在实验开始之前使用校准混合物确定的初始校准曲线)。校准曲线参数的调整基于调整后的测得ETD试剂和环境污染物质量与其理论质量之间的测得差值。
因确定测得的ETD试剂和环境污染物质量相对于其理论值的偏移而使用初步校准曲线修改的校准曲线存储在系统控制器200的存储器中。接着，所述方法循环回到步骤520，其中此次在第二时间段t2内再次将样本离子从主离子源20引导到质谱仪10中。使用来自步骤590的修改的校准曲线对所述时间段t2期间从样本分析获得的原始质谱进行质量校准。
返回到步骤570，如果逻辑确定ETD试剂的调整后的测得质量之间的差值大于预编程阈值，则在这种情况下，所述方法遵循图3右侧的步骤。在步骤600，代替使用调整后的测得ETD试剂和环境污染物质量与其理论质量之间的差值来计算修改的校准曲线，系统控制器200改为发起质谱仪的全面质量重新校准。如同图2的方法，这可通过使用校准混合物来实现，或可作为样本分析的部分，通过向样本添加一个或多个锁定质量以充当内部校准物来执行。在步骤610，使用新获得的校准曲线的结果来更新系统控制器200的存储器，然后在下一样本分析时段t2期间将所述结果用于对所得质谱进行质量调整。
所述过程在循环中重复(通过基于ETD试剂和环境污染物测量值对校准曲线的调整，或全面重新校准)，直到实验结束。如同图2，在图3的后续迭代中，可将调整后的测得ETD试剂和环境污染物离子质量的计算值与存储在系统控制器200的存储器中的理论质量(即，分别基于试剂和污染物离子的组成元素和电荷状态所计算的试剂和污染物离子的质荷比)进行比较，或者可将调整后的测得ETD试剂和环境污染物离子质量与存储在系统控制器存储器中的先前测得并调整的ETD试剂和环境污染物质量进行比较。在下文中，术语“参考质量”用于表示此类实际质量或已知/测得的质量。
又如同图2的方法，可使用初步质量校准、修改的初步质量校准或更新后的质量校准中的一个或多个来校正样本离子数据的m/z。用以选择哪个质量校准来用于校正样本数据的准则可以是：样本离子数据的获取时间是更接近执行初步质量校准的时间(步骤500)还是更接近分析外部校准物和环境污染物离子的时间(步骤530和540)或更接近执行重新校准的时间点(步骤600)。
图3的方法优于图2的方法的益处在于它在确定是否执行全面重新校准时提供了两个数据点，而不仅仅是一个。当这基于外部校准物的测得质量的变化时，所述方法还在新校准曲线的计算中提供了两个数据点而非一个(即，分别是图2和3的步骤380和580)。另一方面，存在与必须测量两个外部校准物离子质量而非仅一个外部校准物离子质量相关联的时间损失。在质量分析器100是Orbitrap的情况下，时间损失相对不大显著(与500-1000ms分析相比，为几毫秒)。然而，在采用多反射飞行时间质量分析器(MR-TOF MS)的情况下，时间损失与分析时间类似(几毫秒)，但这仍然是可接受的，因为每个分析时间都很短。
应了解，如果偏移值(调整后的外部校准物质量之间的差)既不低于也不高于阈值，而实际上与阈值完全相同，则控制器可配置成使用校正的外部校准物离子数据修改初步质量校准以生成修改的初步质量校准，或替代地可执行质谱仪的重新校准以生成更新后的质量校准。
时段tn可用各种方式进行选择。根据前述内容将理解，对ETD试剂(以及任选地，环境污染物)离子执行周期性分析的目的在于，确定质谱仪的物理参数是否已从先前执行全面校准时呈现的那些结果漂移到不可接受的程度(如果是，则校正任何变化)。本文所述的技术提供优于背景技术部分中描述的现有技术的显著优势——具体地说，可使用ETD试剂/ETD试剂和环境污染物进行相对快的评估，以查看是否需要进行全面重新校准。尽管如此，即使利用本文描述的技术，还是存在要评估的缺点。在样本处理量方面，切换到RIS 50来供应ETD试剂以进行校准校验会有损失。在当前优选实施例中，当将ETD试剂用作外部校准物以校验和确定任何漂移时，样本离子被四极滤质器80滤除。原则上，有可能在将ETD试剂自身供应给质量分析器的时段期间捕捉/存储那些样本离子，但这会引入更多复杂性。如果样本离子未被存储，则其当然会丢失。换句话说，一方面过度定期使用外部校准物执行校准校验(从而降低样本处理量，还可能导致样本离子丢失)与未足够定期地执行校准校验(从而导致样本分析中不可接受的质量不准确性)之间存在折衷。在一些实施例中，外部校准物离子源(例如RIS)可位于质谱仪中，使得样本离子和外部校准物离子遵循基本不同的路径到达质量分析器。例如，外部校准物离子源可位于相对远离主离子源的位置(例如，在
Figure BDA0002380192930000171
Elite质谱仪中，处于仪器的相对端)。以此方式，样本离子无需丢失，而实际上可在将外部校准物ETD试剂引入质量分析器的同时存储在离子存储区中。
在最简单的形式中，对于所有n，时段tn的长度可以是预定并且恒定的，即，使得t1＝t2＝t3...。在一些实施例中，时段tn可以是在从1到1000秒、或1到100秒、或1到50秒、或1到10秒的范围内的时段，例如1秒、或2秒、或5秒或10秒...。然而，时段tn可短于或长于这些示范性时段。在更复杂的形式中，可基于先前或在当前实验过程中获得的信息来调整时段tn。例如，有可能使用对特定质谱仪的参数以及它们在质谱仪的特定位置和环境中随时间推移的偏移方式的先前学习来采用非线性(但仍是预定的)规律性(即，t1≠t2≠t3...)。
作为又一替代方案，假设对校准最强的影响之一是温度漂移，则可采用温度传感器(或一系列温度传感器)来提供实时反馈。应注意，将不会直接提供此类温度传感器以试图重新校准质谱仪；如背景技术部分中所论述，这有若干问题。替代地，温度传感器的目的将是提供应执行校准校验的总体指示，即，对于特定n，可探索性地采用温度传感器来确定时段tn。例如，控制器200可配置成使得由传感器测得的超过阈值的量的温度变化可用来触发从样本分析到使用外部校准物离子进行校准校验的切换，继而可能引发需要全面重新校准的决策。因此，在此示例中，tn将不是预定的(从将在步骤320中分析样本离子的时间在时段tn开始时就已知的这个意义上来说)，而是将确定为“在飞行中”。另外，有可能使用先前从相同样本的色谱获得的数据来识别分析期间不存在分析意义的离子的时段。接着，可在那些时段期间将ETD试剂注入到质谱仪10中。通常，如所指出，当使用mr-TOF而非Orbitrap作为质量分析器时，可更定期地执行使用ETD试剂的重新校准，因为mr-TOF的时间开销要低得多，并且因为mr-TOF的质量校准比Orbitrap更容易受到温度变化的影响。
图2和图3均示出串行过程。也就是说，如所示且如所描述，依序执行样本测量和分析、外部校准物测量和分析以及后续数据处理。然而，为了在保持本发明的益处的同时使处理量最大化，可并行执行至少一些方法步骤。
例如，为简单起见，参考图2，可在质谱仪10从RIS 50接收离子并获得ETD试剂离子的“原始”质谱(步骤340)时(基于先前存储的校准曲线)执行对测得样本离子的校正质量的计算(在步骤320中获得“原始”质谱之后)。类似地，可在进行下一轮样本离子注入和检测时，使用现有的校准曲线对ETD试剂离子的测得质量进行校正以及将此调整后的质量与阈值质量进行比较。此类并行处理确实需要假设无需全面重新校准；此假设至少在已执行初始校准后不久的所述方法的早期轮次期间很可能是正确的。
当此假设有效时，则可在下一样本数据收集时段tn+1期间基于调整后的ETD试剂质量与参考值之间的差值来计算新的校准曲线。显然，必须完成更新后的校准曲线的计算，然后才可应用于在此时间段tn+1内已经/正在收集的数据。
作为上文所描述方法的又一变型，即使步骤370/570的差值低于阈值，系统控制器也可配置成在某一预定时间段流逝后执行全面重新校准(使用校准混合物或一个或多个内部锁定质量)。例如，系统控制器200可配置成在X秒/分钟之后或在逻辑循环的一定周期数之后(即，当n的值达到阈值数时)迫使逻辑到步骤400或600，而不管步骤370/570的评估结果如何。其原因如下。考虑图2和3所示的循环的若干迭代。在各个迭代之间，可假设温度变化将引起外部校准物的调整后的测得质量之间的计算差。每个个别的迭代可能产生低于阈值的差值。在一些情况下，所述变化可能相互抵消(使得首次迭代期间的正变化可能会被后续迭代中的负变化抵消)。然而，由于长期的单向温度漂移，所述变化更有可能全都在相同的方向上。在这种情况下，尽管每个个别变化可能产生低于阈值的质量差，但在若干迭代中的累积偏移可能显著大于个别阈值量。在此情况下，最好进行全面重新校准。当然，更优选地，在每种情况下，任何变化都可与从初始实验设置中采用的calmix获得然后存储在存储器中的初始校准相比较。
尽管使用外部校准物提供一个或两个数据点可为小的质量校准偏移提供有用的重新校准，但在累积得较大的质量偏移上可能不大准确。
当然，作为即使各个质量校准的偏移都没有超过阈值也会执行周期性全面重新校准的一种替代方法，系统控制器200有可能将所有先前校准曲线保留在存储器中，包含由全面(重新)校准产生的最近校准曲线以及根据外部校准物质量校准的测得偏移修改的校准曲线。还使用提供用于质谱仪内的其它目的的温度传感器将仪器内部计算每个校准曲线时的温度保留在存储器中。在这种情况下，系统控制器200可使用(自身可能已基于先前迭代中外部校准物的测得质量偏移进行了修改的)最近校准曲线并且还使用通过全面校准获得的最近校准曲线来将外部校准物的质量偏移与参考质量进行比较。如果比较均确定差值小于阈值，则所述方法可通过图2和3的左侧循环继续。然而，如果(使用最近校准曲线调整的)外部校准物质量与参考质量的比较产生低于阈值的质量差，但(使用最近全面(重新)校准曲线调整的)外部校准物质量与参考质量的比较产生高于所述阈值或实际上高于第二可能更高的阈值的质量差，则在这种情况下，系统控制器200可遵循图2和3的右侧部分，从而触发使用一个或多个内部锁定质量或单独的校准混合物对质谱仪进行全面重新校准。
在前文描述中，已在FTMS型质量分析器的上下文中描述了校准技术。然而，本发明可同等地使用飞行时间(TOF)质量分析器等其它质量分析器来实施。在后一种情况下，可将上文所描述的校准技术应用于飞行时间数据而非质量/质荷比数据，因为众所周知，飞行时间和m/z成正比。因此，术语“质量”应解释为涵盖m/z还有飞行时间。实际上，当应用于具有TOF质量分析器的质谱仪上的周期性质量校准问题时，本发明可具有更多优势。在这种情况下，与获取样本离子数据所花的时间相比，获取外部校准物离子数据时引发的时间损失按比例降低，因为使用TOF质量分析器获取单个频谱所花的时间比使用FTMS质量分析器获取频谱所需的时间少得多。
图4示出质谱仪10/，例示了实施本发明的实施例的另一布置。图4中所示的布置是混合型
Figure BDA0002380192930000201
TOF质谱仪的示意性视图。要重申的是，仅仅出于说明体现本发明的质量校准技术的目的而选择了图4的布置，其将
Figure BDA0002380192930000202
质量分析器和TOF质量分析器两者用作质量分析器。此外，通过相似附图标记来标记图1和4的相同部件。
图4的质谱仪10/包含主离子源20，例如电喷雾电离(ESI)或大气压化学电离(APCI)源。来自要分析的样本的离子在大气压下在离子源20中生成，并以离子漏斗的形式进入S透镜(离子导引件)30。在其它实施例中，S透镜30可以是多极杆，或可包括离子迁移率装置。
第二离子源是试剂离子源(RIS)50，提供试剂离子源以允许执行电子转移解离(ETD)实验，如将在下文进一步解释。试剂离子源50具有其自身的专用连续引入系统，以允许高度稳定的试剂流的递送。在优选实施例中，试剂是从试剂容器(图4中未示出)供应的荧蒽。试剂离子源50以与图1所示的RIS 50相同的方式操作，以通过离子发生器提供强烈、稳定的荧蒽自由基阴离子流和中等荧蒽自由基阳离子流。如下文将进一步详细描述，主离子源20和RIS 50各自处于系统控制器200/的控制下，所述系统控制器能够控制注入到质谱仪10/的下游部件中的离子。
在穿过第二真空室(图4中未示出)中的离子导引件之后，离子穿过主动离子束导引件(图4中同样未示出)，然后进入四极滤质器80，此处可分离出具有分析意义的离子的质量范围。四极滤质器80的下游是又一离子透镜(未示出)和弯曲线性离子阱(C阱)90。如将理解，C阱90可在各种模式中操作，从而捕集离子并将其正交射向
Figure BDA0002380192930000211
质量分析器100或纵向下游。
在第一模式中，从四极滤质器80到达的离子可沿着C阱90的弯曲轴纵向射出，通过另一离子导引件(未示出)，然后进入碰撞/ETD单元120。离子从此处进入具有直线轴的矩形离子阱(R阱)220。R阱220可在各种模式中操作，从而捕集离子并将其正交射出或使其纵向朝向C阱90返回。在一个模式中，离子从R阱220正交射出到高分辨率飞行时间(TOF)质量分析器230以进行质量分析，所述质量分析器是多反射TOF质量分析器。
在第二模式中，在通过四极滤质器80进行任选的质量选择之后注入到碰撞/ETD单元120中的样本离子可被捕集于所述单元中并且与来自试剂离子源50的试剂离子反应以产生碎片离子。作为ETD的替代方案，碰撞/ETD单元120还可配置成允许样本离子的碰撞诱导解离。碎片化之后，离子可从碰撞/ETD单元120转移到R阱220，其中可沿其纵向轴在电势井中捕集和冷却离子。冷却后，捕集的离子可作为短离子包从R阱220正交射向高分辨率TOF质量分析器230以进行质量分析。TOF质量分析器包括沿离子漂移方向朝向离子检测器250延伸的两个平面的相对离子镜240。在以与离子镜的平面表面成一定角度进入TOF质量分析器230后，离子在离子镜之间反射多次，同时沿漂移方向行进，由此遵循Z形离子路径直到其到达离子检测器250。如所属领域的技术人员所熟悉的，离子因其不同质荷比所致的不同飞行时间而沿Z形离子路径分开。由此，离子检测器获取飞行时间频谱。接着，如所属领域中已知，可由控制器200/根据所得飞行时间频谱导出质谱。TOF质量分析器的更多细节与本发明无关，将不进一步描述。
图4的质谱仪10/处于系统控制器200/的控制下。尽管这会执行各种功能，但相对于本发明，出于下文进一步解释的原因，系统控制器200/配置成控制来自主离子源20和RIS50的离子的进入。系统控制器200/还与质量分析器100和230通信。
参考图2和3描述的体现本发明的质量校准方法的实施例可加以必要修正地使用图4的质谱仪10/执行。使用校准混合物、锁定质量等执行质谱仪10/的TOF质量分析器230的初步质量校准。使用TOF质量分析器230在时间段t内将要分析的样本的离子从主离子源20引入到质谱仪中，以获得表示源自样本的一种或多种样本离子的质荷比的样本离子数据。随后，由控制器200/使用存储的初步质量校准来校正样本离子数据。在时间段t结束时，停止将样本离子引入到质谱仪10/中，并且改为将ETD试剂形式的外部校准物离子从试剂离子源50引入到质谱仪10/中。使用质谱仪的TOF质量分析器，获得表示ETD试剂离子的质荷比的ETD试剂离子数据，将ETD试剂离子与样本离子分别引入到质谱仪中以在没有样本离子的情况下获得外部校准物离子数据。接着，由控制器200/使用初步质量校准校正ETD试剂离子数据，从而生成校正的ETD试剂离子数据。接下来，将校正的ETD试剂离子数据与表示ETD试剂离子的参考质荷比的参考ETD试剂离子数据进行比较，以生成表示校正的ETD试剂离子数据与参考ETD试剂离子数据之间的质量差的偏移值或差值。由控制器200/将偏移值与存储的阈值相比较，并且如果偏移值低于阈值，则控制器200/使用校正的外部校准物离子数据修改初步质量校准以生成修改的初步质量校准，但如果偏移值高于阈值，则控制器200/例如使用校准混合物、锁定质量等对质谱仪执行全面重新校准以生成更新后的质量校准。接着，以参考图2和3描述的方式循环重复所述步骤。例如，当污染物离子与ETD试剂离子一起存在以用于质量分析时，可加以必要修正地使用图4的质谱仪执行图3的实施例。

Claims (16)

1.一种校准质谱仪的方法，其包括：
(a)执行所述质谱仪的初步质量校准；
(b)将要分析的样本的离子从第一离子源引入到所述质谱仪中；
(c)在时间段t内，使用所述质谱仪的质量分析器获得样本离子数据，所述样本离子数据表示源自要分析的所述样本的一种或多种样本离子的质荷比；
(d)使用质量校准来校正所述样本离子数据；
(e)在所述时间段t结束时，将外部校准物离子从第二离子源引入到所述质谱仪中；
(f)使用所述质谱仪的所述质量分析器获得表示所述外部校准物离子的质荷比的外部校准物离子数据，将所述外部校准物离子与所述样本离子分别引入到所述质谱仪中以在没有样本离子的情况下获得所述外部校准物离子数据；
(g)使用所述初步质量校准来校正所述外部校准物离子数据，从而生成校正的外部校准物离子数据；
(h)将所述校正的外部校准物离子数据与表示所述外部校准物离子的参考质荷比的参考外部校准物离子数据进行比较，以生成表示所述校正的外部校准物离子数据与所述参考外部校准物离子数据之间的质量差的偏移值；
(i)将所述偏移值与阈值进行比较；
(j)如果所述偏移值低于所述阈值，则使用所述校正的外部校准物离子数据修改所述初步质量校准，以生成修改的初步质量校准；
(k)如果所述偏移值高于所述阈值，则对所述质谱仪执行重新校准以生成更新后的质量校准；
其中步骤(d)中用于校正所述样本离子数据的所述质量校准是以下之一：步骤(a)的所述初步质量校准、步骤(j)的所述修改的初步质量校准或步骤(k)的所述更新后的质量校准。
2.根据权利要求1所述的方法，其还包括在步骤(k)之后，用所述更新后的质量校准取代在步骤(a)中获得的所述初步质量校准，并且用所述更新后的质量校准重复步骤(b)至(k)。
3.根据权利要求1所述的方法，其还包括：在步骤(j)之后，用所述修改的初步质量校准取代所述初步质量校准，并且用所述修改的初步质量校准重复步骤(b)至(k)。
4.根据权利要求2或权利要求3所述的方法，其中在重复的步骤(c)中获得所述样本离子数据的所述时间段t在长度上与在步骤(c)的之前迭代期间获得所述样本离子数据的所述时间段t相同。
5.根据权利要求2或权利要求3所述的方法，其中在重复的步骤(c)中获得所述样本离子数据的所述时间段t与在步骤(c)的先前迭代期间获得所述样本离子数据的所述时间段t不同。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中执行初步质量校准的步骤(a)包括
(i)将离子的校准混合物引入到所述质量分析器中，所述校准混合物包括具有已知质荷比的多个离子种类；
(ii)使用所述质量分析器分析所述校准混合物中的所述离子；
(iii)获得校准混合物离子数据，其表示质荷比已知的所述校准混合物中的所述离子的测得质荷比；以及
(iv)根据所述校准混合物离子数据与表示所述校准混合物中的所述离子的已知质荷比的参考数据的比较得出所述初步质量校准。
7.根据权利要求6所述的方法，其中得出所述初步质量校准的步骤(iv)包括通过使用回归分析将所述校准混合物离子数据拟合到所述参考数据来生成初步校准曲线。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(k)包括
(i)将一个或多个锁定质量离子种类添加到要分析的所述样本，在一个或多个锁定质量离子种类尚未存在于要分析的所述样本中的情况下，所述或每个锁定质量离子种类具有已知质荷比和/或TOF；
(ii)使用所述质量分析器分析所述样本离子夹带的所述锁定质量离子；
(iii)获得锁定质量离子数据，其表示质荷比已知的所述锁定质量离子的测得质荷比；以及
(iv)根据所述锁定质量离子数据与表示所述锁定质量离子的所述已知质荷比的参考数据的比较，得出更新后的初步质量校准以在所述方法的进一步迭代中替代现有初步质量校准。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(e)包括引入具有单个离子种类的外部校准物离子。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述单个离子种类是电子转移解离(ETD)试剂，例如荧蒽。
11.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中步骤(e)包括引入具有两个单独的离子种类的外部校准物离子。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述两个单独的离子种类中的第一个是电子转移解离(ETD)试剂，例如荧蒽，并且所述两个单独的离子种类中的第二个是具有已知质荷比和/或TOF的环境污染物，例如聚二甲基环硅氧烷。
13.一种用于质谱仪的控制器，所述质谱仪包括配置成生成样本离子的第一离子源、配置成生成外部校准物离子的第二离子源以及质量分析器，所述控制器配置成：
(l)指示所述质谱仪执行所述质谱仪的初步质量校准；
(m)指示所述第一离子源将要分析的样本的离子引入到所述质谱仪中；
(n)在时间段t内从所述质量分析器获得样本离子数据，所述样本离子数据表示源自要分析的所述样本的一种或多种样本离子的质荷比；
(o)使用所述初步质量校准来校正所述样本离子数据；
(p)在所述时间段t结束时，使所述第二离子源将外部校准物离子引入到所述质谱仪中，并且防止所述第一离子源同时将样本离子引入到所述质谱仪中；
(q)获得表示所述外部校准物离子的质荷比的外部校准物离子数据；
(r)使用所述初步质量校准校正所述外部校准物离子数据，从而生成校正的外部校准物离子数据；
(s)将所述校正的外部校准物离子数据与表示所述外部校准物离子的参考质荷比的参考外部校准物离子数据相比较，以生成表示所述校正的外部校准物离子数据与参考外部校准物离子数据之间的质量差的偏移值；
(t)将所述偏移值与阈值相比较；
(u)如果所述偏移值低于所述阈值，则使用所述校正的外部校准物离子数据修改所述初步质量校准以生成修改的初步质量校准；
(v)如果所述偏移值高于所述阈值，则指示所述质谱仪对其执行质量重新校准，从而生成更新后的质量校准。
14.一种质谱仪，其包括配置成生成样本离子的第一离子源、配置成生成外部校准物离子的第二离子源、质量分析器以及根据权利要求13所述的控制器。
15.根据权利要求14所述的质谱仪，其中所述质量分析器是以下中的一个或多个：傅立叶变换质谱仪(FTMS)；飞行时间质谱仪(TOF-MS)；线性(2D)四极杆离子阱；3D(保罗)阱，和/或电性和/或磁性扇区质谱仪。
16.根据权利要求15所述的质量分析器，其中所述傅立叶变换质谱仪(FTMS)是轨道捕集质谱仪。
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