CN111542328A - 用于治疗癌症的包含α-聚谷氨酸-锌的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含锌2+盐和α‑聚谷氨酸载体以及任选地作为肿瘤敏化剂的NF‑κB抑制剂的药物组合物，以及使用此类组合物来在患者中治疗肿瘤的方法。所述方法包括对有需要的患者给予治疗有效量的Zn(II)盐和α‑聚谷氨酸载体的液体剂型或固体剂型。提供了使用所公开的组合物治疗广谱的人类肿瘤、包括具有耐药表型的肿瘤的方法。响应于本文公开的药物组合物的肿瘤包括神经内分泌肿瘤(成神经细胞瘤)、胃肿瘤、子宫肿瘤和肺肿瘤。

Description

用于治疗癌症的包含α-聚谷氨酸-锌的组合物
技术领域
本发明涉及包含alpha-聚谷氨酸(α-PGA)载体和锌盐以及任选的NF-κB抑制剂的组合物、其药物制剂、以及使用该组合物和制剂中的任一种作为抗肿瘤剂以在患者中治疗癌症的方法。
背景技术
对癌症药物的固有耐药性和获得性耐药性是癌症治疗失败的主要原因。抗性的一般机制包括p53细胞凋亡蛋白的功能异常和/或由MDR1或MRP1基因编码的能量依赖性药物喷射泵(drug ejection pump)的过表达。克服耐药性问题的一种肿瘤破坏策略是单独地纠正功能异常的p53细胞凋亡功能或抑制药物喷射泵。一种可选的途径是利用PARP1介导的能量耗竭所诱导的坏死性细胞死亡机制(“PARP1介导的坏死”)，其完全绕过了p53介导的细胞凋亡机制。
最初在心脏或脑组织的缺血性坏死之后观察到的PARP1介导的坏死是由于借助于PARP1酶的过度的DNA修复活性导致细胞能量(NAD+和ATP)的耗竭所引起的。响应于遗传损伤的PARP1/PARG的超活化触发NAD+和ATP细胞能量物质的耗竭，这随后触发来自MPTP活化的线粒体启动的坏死(mitochondria-initiated necrosis)。这一组事件在图1中说明。由于该坏死机制绕过p53介导的细胞凋亡，因此提出该机制可以用于靶向癌症(非专利文献(NPL)3)。然而，没有人成功地将该想法转化为临床上有用的治疗性疗法，这是因为所尝试的方法被证明是毒性过大的。仅可以通过过度辐射暴露和/或给予高毒性化学治疗剂如阿霉素(doxorubicin)来在实验肿瘤中诱导PARP1介导的坏死。使用毒性药剂来活化PARP1介导的坏死的另一个问题是该药剂还以亚临界水平活化p53蛋白，有效地通过p53诱导的PARP1酶的裂解使得无法进行PARP1介导的坏死。考虑到肿瘤内的药物分布由于物理和结构限制是异质的，推测毒性药剂将同时使得大部分的癌症肿块缺乏PARP1，因而对PARP1介导的坏死不敏感。
在大量临床癌症病例中要解决的问题是，某些癌症天然地对常规抗癌药物有抗性，并且其它癌症在全身性治疗的过程中发展出多药耐药性，导致治疗失败。虽然有理论提示，通过过量给予辐射和化学治疗剂来利用PARP1介导的肿瘤坏死可以用于治疗癌症，但是由于治疗的固有毒性和上述机制的固有的自我矛盾的性质，实现这一潜在结果是困难的。因而，仍然有未被满足的寻找基于积极诱导PARP1介导的肿瘤坏死的组合物和/或治疗方法的需求。此外，高度期望的是包含载体和靶向系统的组合物和/或治疗方法，所述载体和靶向系统可以特异性地将此类诱导物递送至肿瘤组织而不干扰肿瘤坏死过程或过度有毒。还继续期望的是降低针对多种多样的癌症类型和/或耐药性状(drug resistance trait)所需的肿瘤破坏剂量，以及降低健康组织中的不希望的副作用。
评估锌盐的神经毒性的报告描述了来自简单锌盐的高浓度的锌离子(400μM或26μg/mL)在培养的皮层细胞中诱导PARP/PARG介导的NAD+和ATP耗竭以及随后的坏死(NPL6)。然而，该报告没有研究锌盐的肿瘤破坏活性和它们的抗癌治疗用途。
评估吡啶硫酮锌(zinc pyrithione)对免疫细胞的毒性的报告显示，纳摩尔浓度的吡啶硫酮锌在包括鼠胸腺细胞、鼠脾淋巴细胞、人Ramos B和人Jurkat T细胞的各种白细胞起源的细胞中诱导锌特异性细胞凋亡(NPL7)。该报告公开了吡啶硫酮锌经由半胱天冬酶9的活化来诱导细胞凋亡，其具有阻断坏死性细胞死亡的作用(NPL11)。总而言之，这些报告表明，在所研究的免疫细胞中，纳摩尔剂量的吡啶硫酮锌诱导细胞凋亡性细胞死亡而不是坏死性细胞死亡。
之后，证明了微摩尔浓度(1-10μM)的吡啶硫酮锌在雄激素依赖性LNCaP和雄激素非依赖性PC3、DU145前列腺癌细胞系中引发ATP耗竭，并且最终引发ERK和PKC依赖性坏死(NPL2)。然而，NPL2中使用的引发坏死的吡啶硫酮锌的剂量先前显示在对大鼠进行9～14天饮食给药(240ppm)后引起急性神经毒性，临床症状是渐进性的后肢虚弱、运动不协调、伴有肌肉萎缩的脊柱后凸、和阴茎脱垂(NPL10)。
因此，虽然有报道吡啶硫酮锌能够引起针对前列腺癌细胞系的选择性的坏死性细胞死亡，但是这需要高的(μM)药剂浓度(NPL2)，然而，已经显示吡啶硫酮锌在此类浓度下引起严重的和永久性的神经毒性(NPL12)，这会阻碍将其开发成抗肿瘤治疗剂的尝试。此外，NPL2没有证明对多种癌细胞类型的广谱抗癌活性，没有显示对逆转由MDR1或MRP1多药耐药基因过表达引起的耐药性的效力，也没有证明在任何动物癌症模型中的坏死效力。
NPL5开发了拟胰岛素锌(2+)复合物(insulin-mimetic zinc(2+)complex)，并研究了体外拟胰岛素活性以及锌(γ-聚谷氨酸)复合物在2型糖尿病KKAy小鼠中的体内抗糖尿病效果。具体地，研究显示，以γ-聚谷氨酸复合的锌口服给药10-20mg Zn每公斤体重30天，使KKAy小鼠中的高血糖正常化，并且改善受损的葡萄糖耐量、升高的HbA(1c)水平、以及与用ZnSO4治疗相关的代谢综合征(NPL5)。在NPL5中，作者推断，锌(γ-聚谷氨酸)复合物通过它们在2型糖尿病KKAy小鼠中降低高血糖的作用和它们减弱胰岛素的β细胞分泌的紊乱以及胰岛素抗性的能力而具有抗糖尿病效力，然而他们没有了解造成复合物的拟胰岛素活性的作用机制，并且他们没有以任何方式暗示锌(γ-聚谷氨酸)复合物的抗肿瘤活性，也没有暗示对于治疗药物难治性癌症类型的有效性。
总之，现有技术甚至没有暗示、更没有成功利用锌化合物来实现在体内有效治疗广谱癌症、包括有重要的耐药性状的那些癌症的上述目标，以及此外以在没有严重毒性风险的情况下来进行。因此，对于用于治疗癌症的临床有活性且安全的锌组合物存在着未被满足的需求，所述锌组合物对许多癌症类型、甚至是具有耐药表型(例如，功能异常的p53、MDR1过表达、MRP1过表达)的癌症起作用而没有毒性问题。此外，生物体系(例如，细胞、组织、动物等)中的大多数研究使用γ形式的聚(谷氨酸)。为了解决上述问题，发明人在该领域中进行了系统研究，并且开发了满足这些需求的具有α形式的聚(谷氨酸)(也称为聚(α-谷氨酸)或α-PGA)的锌复合物的制剂，因而完成了如本文所述的发明人的发明。
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发明内容
本文公开的组合物、药物制剂和方法基于如下令人惊讶的观察结果：锌与α-聚谷氨酸(α-PGA)的复合物可以在各种人类和小鼠癌细胞系中诱导坏死性细胞死亡。
本发明涉及含有锌的α-聚谷氨酸组合物，其触发PARP1介导的坏死性细胞死亡机制。不受理论的限制，锌过度活化PARP1，其进而导致细胞中ATP和NAD+的耗竭。结果，细胞耗尽了能源，然后进入坏死性细胞死亡途径。
这种诱导坏死的机制预计类似地可用于大多数癌细胞类型，因而含有锌的α-聚谷氨酸组合物展现了广谱的肿瘤破坏活性。此外，这种机制表明，对于不同的肿瘤破坏机制具有耐药表型的肿瘤也可以响应于该PARP1介导的机制。
根据本发明的组合物包含(i)作为活性成分的锌(II)物质(等价于Zn2+)以及(ii)处于未修饰形式和/或修饰形式的作为载体的α-PGA，其中叶酸和/或RGD肿瘤靶向肽共价地连接至α-PGA。组合物可以进一步包含NF-κB抑制剂或NF-κB信号转导级联抑制剂，来敏化肿瘤细胞(使它们更敏感于)对Zn(II)和α-PGA的肿瘤破坏效果。
可以将组合物配制为用于口服给药。在某些实施方案中，提供如下口服制剂，其包含胃耐受材料例如肠溶粘合剂和包衣、或蜡包衣，以防止、延迟或减弱锌离子在胃的强酸性环境中从复合物解离。
本发明还涉及制备上述组合物和药物制剂的方法，以及其治疗用途。
本发明的一个目的是提供可以积极诱导PARP1介导的肿瘤坏死的组合物，并且进一步的目的是使用对患者无毒性的组合物和制剂来实现这一点。
本发明的另一个目的是提供用于在患者中治疗多种多样的具有耐药表型的肿瘤和癌细胞的药物制剂。
本发明的另一个目的是提供包含可以将Zn(II)靶向递送至肿瘤细胞的α-PGA载体的组合物。此外，本发明的目的是提供具有降低的剂量要求、或在健康组织中具有减少的非期望副作用分布的强肿瘤破坏剂。
在患者的肿瘤中诱导PARP1介导的肿瘤坏死的方法的一个实施方案包括对患有肿瘤的患者给予治疗有效量的Zn(II)盐和α-聚谷氨酸载体，其中所述α-聚谷氨酸载体包括α-聚谷氨酸和/或肿瘤靶向性α-聚谷氨酸衍生物和/或电荷修饰的α-聚谷氨酸衍生物和/或肿瘤靶向性电荷修饰的α-聚谷氨酸衍生物。在方法的另一个实施方案中，对患有具有耐药表型的肿瘤的患者给予治疗有效量的Zn(II)盐和α-聚谷氨酸载体(除非另有说明，否则提及α-聚谷氨酸载体或组合物包括含有以上列出的α-聚谷氨酸的各种类型的衍生物的组合物)。
在方法的另一个实施方案中，将治疗有效量的Zn(II)盐和α-聚谷氨酸载体与治疗量的NF-κB抑制剂和/或NF-κB信号转导级联抑制剂组合给药。
在一个实施方案中，将治疗量的Zn(II)盐和α-聚谷氨酸载体以固体剂型或以液体剂型一起给药。在几种实施方案中，固体剂型选自片剂、迷你片(minitab)、硬胶囊、软胶囊、囊片(caplet)、囊形片(gelcap)、口腔崩解膜剂、颗粒剂、微丸剂(pellet)、糊剂和粉末囊剂(powder sachet)。在几种实施方案中，液体剂型选自液体溶液剂、液体混悬剂、糖浆剂和口腔喷雾剂。
在几种实施方案中，将治疗量的Zn(II)盐和α-聚谷氨酸载体通过口服给药或注射给药一起给药。
本发明的一个实施方案是药物组合物，其包含(i)药学上可接受的Zn(II)盐、(ii)含有肿瘤靶向部分和/或电荷修饰部分的α-聚谷氨酸、和(iii)任选地进一步包含α-聚谷氨酸。
在几种实施方案中，所述肿瘤靶向部分选自叶酸、二甲基四氢叶酸酯(dimethtyltetrahydrofolate，DMTHF)和RGD肽，并且所述部分的任意组合共价地连接至α-聚谷氨酸。在几种实施方案中，所述电荷修饰部分选自柠檬酸、乙二胺四乙酸、1,4,7,10-四环十二烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸和二亚乙基三胺五乙酸，并且所述部分的任意组合共价地连接至α-聚谷氨酸。
在另一个实施方案中，药物组合物进一步包含α-聚谷氨酸。在另一个实施方案中，在药物组合物中，所述Zn(II)盐的基本部分是Zn(II)离子与α-聚谷氨酸和/或所述肿瘤靶向部分和/或所述电荷修饰部分的结合复合物。在另一个实施方案中，在药物组合物中，Zn(II)盐和(ii)所述α-聚谷氨酸聚合物以固体混合物的形式混合在一起。
在另一个实施方案中，药物组合物进一步包含NF-κB抑制剂和/或NF-κB信号转导级联抑制剂。
在其它实施方案中，将任意上述药物组合物配制为固体剂型。在几种进一步的实施方案中，固体剂型进一步包含胃耐受粘合剂和/或胃耐受外包衣。在其它实施方案中，将任意上述药物组合物配制为液体剂型。在某些实施方案中，将液体剂型配制为用于注射。在进一步的实施方案中，液体剂型是进一步包含胃耐受材料的药物组合物的混悬剂。在进一步的实施方案中，液体剂型是包含任意上述药物组合物以及任选的胃耐受材料的蜡包衣微粒(wax-coated microparticles)的混悬剂。
在患者中治疗肿瘤的方法的一个实施方案包括对患有肿瘤的患者给予治疗有效量的、根据上述药物组合物的实施方案中的任一者的药物组合物。在所述方法的进一步的实施方案中，对患有具有耐药表型的肿瘤的患者给予治疗有效量的上述药物组合物。
由以下本发明的详细说明和权利要求，本发明的这些和其它目的和特征对于本领域普通技术人员而言将变得显而易见。
附图说明
图1是PARP1介导的坏死的示意性概述。
图2示出用Zn(II)/α-PGA组合物处理HEK-293细胞、HeLa细胞、MCF7细胞和A549细胞的结果。
具体实施方式
本文描述的组合物、制剂和方法中使用的组分是用于药物用途、用于食品用途、或用于人类消费产品用途的被监管机构接受的等级。在某些情况下，所述组分是药用等级或医用等级的化合物或物质。
本文使用的缩写的含义如下：“kDa”是指千道尔顿；“wt％”是指重量百分比。
锌作为锌(II)盐(等价于Zn2+盐)来提供，其中抗衡离子(阴离子)可以是任何适合的无机或有机阴离子。适合的阴离子是人体耐受的那些，包括无毒的那些。一般地，锌盐可以由式Zn2+X2-或Zn2+(X-)2或甚至Zn2+(X-)(Y-)表示，其中X和Y是适合的阴离子。阴离子可以选自作为获批药物的组分的阴离子的组。在某些实施方案中，锌(II)盐是药学上可接受的锌盐，其中所述锌(II)盐选自获批用于药物组合物的锌(II)盐的组。阴离子可以选自作为FDA批准的药物产品组分的阴离子的组。在某些实施方案中，锌(II)盐是药学上可接受的锌盐。在其它实施方案中，阴离子可以选自作为获批的食品添加剂或营养补充剂的组分的阴离子的组。锌盐的实例包括氯化锌、硫酸锌、柠檬酸锌、乙酸锌、吡啶甲酸锌、葡萄糖酸锌、氨基酸-锌螯合物例如甘氨酸锌或本领域已知和使用的其它氨基酸。两种或更多种不同的锌盐可以按任何比例一起使用，用于在组合物或制剂中的任一者中提供Zn(II)。
在某些实施方案中，提供在组合物或制剂中与α-聚谷氨酸化合物复合的Zn(II)。一般地，当提供Zn(II)与α-PGA的复合形式(“ZnPGA”)时，ZnPGA是纯化的，并且游离的Zn(II)离子以及对Zn阳离子的原始抗衡离子在加工中基本上被除去。
单个固体剂型中包括的锌的量一般在约1至约100mg锌(锌(II)离子)的范围内。因此，所配制的组合物中使用的锌盐的具体量将较高，这是因为盐的量必须计算抗衡离子的重量。仅考虑锌(II)，剂型中提供的量可以是至多约100mg、至多约75mg、至多约50mg、至多约25mg、至多约10mg锌、或至多约5mg。固体剂型中提供的锌(II)的量一般是至少约1mg。相比较而言，通常可获得的补充剂提供，例如，20、25、30、50、75和甚至100mg的锌。在该范围内或甚至更高的任何量的锌是可接受的，只要提供的量没有导致生理学上过高水平的锌被吸收即可。然而要考虑的是，过高的水平和由此的风险要与通过治疗肿瘤获得的治疗效益相平衡。虽然在大多数成年人中锌的可耐受的上限摄入水平是约40mg/天(对于儿童更低)，但是应当认识到的是，口服的固体剂型中的所有锌不太可能都被吸收，其一部分将经过身体而不被吸收。由于吸收的锌的量还将随制剂而变化，因此特定制剂中的锌含量的上限可以通过本领域已知的方法来测试以确定制剂提供的摄入水平，然后考虑在治疗中通过给予所述制剂获得的任何治疗效益，人们可以相应地调整给定的剂型或制剂的给药量。
液体剂型中的组合物或制剂提供的锌的浓度一般在约1mg/L至约100g/L的锌(锌(II)离子)的范围内。这对应于约0.0001wt％至约10wt％的锌的范围。Zn(II)的浓度可以是至少约10mg/L、或至少约100mg/L、或至少约1g/L、或至少约10g/L，或者Zn(II)的浓度的范围可以落入这些示例性浓度中的任意两者之间。在一个实施方案中，浓度可以在约100mg/L至约500mg/L的范围内。剂型中提供的液体的量将决定总的剂量。例如，对于示例性的范围，100mL量的液体将提供约10mg至约50mg的Zn(II)。在另一实施方案中，浓度可以为约1000mg/L(1mg/mL)，由此提供每毫升约1mg。关于固体剂型中锌的剂量的公开内容可以用作关于Zn(II)溶液的量的指导，以提供为液体剂量。
锌还可以作为悬浮在液体中的固体的一部分来提供。提供的锌(II)的量和混悬剂的体积遵循上文对固体剂型和液体剂型阐述的指导。
Alpha-聚谷氨酸(可选地，α-聚谷氨酸或α-PGA)是谷氨酸(一种氨基酸)的聚合物，其中聚合物骨架由连接氨基与α-碳处的羧基而非氨基酸侧链中的羧基的肽键(在蛋白质中形成的典型肽键)形成。α-PGA可以由谷氨酸的L异构体、D异构体或DL外消旋体形成。可以使用任何这些形式，并且可以以任何比例一起使用两种或更多种不同的形式。α-PGA的各种异构形式可以是合成的或源自天然来源。生物体通常仅从L异构体产生聚(氨基酸)，而产生α-PGA的某些细菌酶可以从任一异构体或从两种异构体产生聚合物。
可以使用各种尺寸和各种聚合物分散度的α-PGA。α-PGA的聚合物分子量一般是至少约1kDa且最多约1000kDa。在某些实施方案中，α-PGA的聚合物分子量是至少约1kDa、或至少约5kDa、或至少约10kDa、或至少约20kDa、或至少约30kDa、或至少约35kDa、或至少约40kDa、或至少约50kDa。在某些实施方案中，α-PGA的聚合物分子量是最多约700kDa、或最多约500kDa、或最多约300kDa、或最多约200kDa、或最多约100kDa。可接受的聚合物分子量范围可以选自任意上述的聚合物分子量值。在实施方案中，聚合物分子量在约5kDa至约500kDa的范围内。在另一实施方案中，聚合物分子量在约5kDa至约300kDa的范围内。在实施方案中，聚合物分子量在约50kDa至约100kDa的范围内。在一个实施方案中，聚合物分子量是约100kDa。在一个实施方案中，聚合物分子量是约50kDa。组合物或制剂可以包含一种或多种聚合物分子量形式的α-PGA。
聚合物分子量一般作为基于例如通过凝胶渗透色谱(GPC)测量的数均分子量(Mn)来给出。将上述聚合物质量作为Mn；可以使用其它测量技术来测定例如质量(重量)平均分子量(Mw)，并且对任何给定聚合物的说明(specification)可以在各种聚合物质量表示之间转换。
固体剂型中包括的α-PGA的量一般在约10wt％至约40wt％的范围内。在某些实施方案中，所述量是约20wt％或约30wt％。使用的量一般是基于锌与聚谷氨酸单体单元之间期望的摩尔比、锌盐的质量(考虑抗衡离子的重量)以及提供可接受的配制的剂型所需的赋形剂的量。例如，对于给定的总剂型尺寸，使用的α-PGA和锌盐的量越大，可以添加的赋形剂的量越少。本领域技术人员可以容易地平衡活性成分的量与获得稳定的剂型所需的赋形剂的量和类型。锌与α-PGA之间期望的比例也可以表示为每个剂型的锌的毫克数与α-PGA的wt％的比。示例性的比例包括5mg:10wt％；5mg:20wt％；5mg:40wt％；30mg:10wt％；30mg:20wt％；30mg:40wt％；或甚至100mg:10wt％；100mg:20wt％；100mg:40wt％；或以下值的任何其它组合：所述值在由这些示例性比例阐明的范围内、或由本说明书中对各成分引述的值而显而易见。
液体剂型中包括的α-PGA的量一般在约0.01wt％至约10wt％的范围内。在某些实施方案中，所述量是约0.1wt％至约1wt％。
使用的量一般基于锌与α-聚谷氨酸单体单元之间期望的摩尔比、α-PGA载体的性质(是未修饰的、还是用肿瘤靶向部分和/或电荷修饰部分修饰的)、以及与α-PGA载体形成Zn(II)复合物的程度。例如，如实施例1和2中说明的，ZnPGA复合物作为溶液获得，所述溶液包含大约1wt％的α-PGA和大约400μg/mL(mg/L)复合的锌。不受理论的限制，应理解的是当制备液体剂型时，在溶液中将锌盐与α-PGA载体组合将通常导致锌离子与α-PGA载体的复合物的形成，因此将形成的复合物分离或纯化的单独步骤可能不是必须的。其它示例性比例包括基于关于在液体剂型中的组合物或制剂提供的锌浓度以及与其组合的在液体剂型中包含的α-PGA的量的上述公开内容的范围。
为了获得具有有效量的Zn(II)盐和α-聚谷氨酸载体的适合的固体或液体组合物以及制剂，α-PGA载体与锌的相对量和各自的浓度可以由本领域技术人员根据公开内容容易地调整。在本文公开的组合物中，可以将α-PGA组分称为α-PGA或α-PGA载体。如所述的，α-PGA的衍生物也是预期的，并且可以不同地称为修饰的α-PGA或α-PGA缀合物(conjugate)等。
α-PGA可以包含肿瘤靶向部分。此类部分可以选自叶酸、N5,N10-二甲基四氢叶酸酯(DMTHF)和RGD肽。任意或全部所述部分可以共价地连接至α-聚谷氨酸来形成α-PGA的叶酸缀合物和/或DMTHF缀合物和/或RGD肽缀合物。叶酸受体蛋白常常在许多人类肿瘤中表达。
叶酸天然地具有对叶酸受体的高亲和性，进一步地，在结合时，可以将叶酸和连接的缀合物通过内吞作用转运到细胞中。以该方式，用叶酸修饰的ZnPGA可以靶向肿瘤细胞且积聚在肿瘤细胞处，并且将锌(II)递送到肿瘤细胞的内部。DMTHF也已知具有对叶酸受体的高亲和性。在NPL13中记载了DMTHF的制备。此外，存在叶酸受体(FR)的两种主要同种型，FR-α和FR-β；并且DMTHF显示对FR-α比对FR-β具有更高的亲和性(NPL12)。这对于靶向肿瘤细胞是有利的，这是因为FR-α在许多恶性细胞类型中过表达，而FR-β在与炎性疾病相关的巨噬细胞上过表达。因此，将DMTHF缀合至α-PGA提供了可以选择性地结合至由肿瘤细胞表达的叶酸受体的缀合物。类似地，已知RGD肽与α(V)β(3)整联蛋白强结合，所述α(V)β(3)整联蛋白在肿瘤性内皮细胞上以及在某些肿瘤细胞上表达。因此，RGD缀合物是一种用于将抗肿瘤剂靶向和递送至部位的策略。如本发明中预期的，α-PGA可以与这些肿瘤靶向剂中的任意一者或二者、或者全部缀合(即，修饰)，并且当存在两种以上的这些药剂时，这些药剂的相对比例无特别限定。例如，α-PGA载体可以包括α-PGA与如下物质的缀合物：(a)叶酸、(b)DMTHF、(c)RGD、(d)叶酸和DMTHF、(e)叶酸和RGD、(f)DMTHF和RGD、或者(g)叶酸、DMTHF和RGD。其它类似的肿瘤靶向部分也在本发明的范围之内。
α-PGA在各谷氨酸单元的γ-碳处具有游离羧酸基团，可以用于与叶酸、与DMTHF、以及与RGD肽形成缀合物。叶酸具有环外的胺基(exocyclic amine group)，其可以与谷氨酸的γ-碳羧酸基团偶联以形成连接两者的酰胺键。与叶酸中相同的环外的胺基在DMTHF中是可得的，用于酰胺键形成。RGD缀合物也是本领域公知的，并且也可以类似地经由例如RGD中的游离α-氨基共价连接至γ-碳羧酸基团。可选地，任一部分可以经由间隔基团，如，例如聚乙二醇胺来缀合至α-PGA。α-PGA的γ-碳羧酸基团与氨基之间的缀合反应的实例可以在Bai等人的美国专利No.9,636,411中找到，并且与氨基和羟基的缀合反应的实例可以在Van等人的美国授权前公开No.2008/0279778中找到。叶酸和柠檬酸与相关的聚合物γ-PGA的缀合反应的实例可以在WO2014/155142中找到。
α-PGA可以包含电荷修饰部分。此类部分可以选自柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、1,4,7,10-四环十二烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸(DOTA)和二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)。同样，在γ-碳羧酸处，所述部分的任何组合可以共价地连接至α-聚谷氨酸。柠檬酸可以通过形成酯键缀合至α-PGA的γ-碳羧酸基团。(对于类似的缀合反应，参见例如WO 2014/155142。)可以使用例如间隔基团将EDTA、DOTA和DTPA连接至α-PGA，从而将这些部分的胺连接至α-PGA的γ-碳羧酸基团。许多选择对于本领域技术人员而言是可获得的。电荷修饰部分可以用作螯合Zn(II)离子的部位，并且电荷修饰还将影响ZnPGA复合物的转运和溶解度，因而可以用于调整载体和ZnPGA复合物的药效。
α-PGA可以包含肿瘤靶向部分和电荷修饰部分两者，从而可以对α-PGA载体赋予两种部分的效益和功能。肿瘤靶向部分和电荷修饰部分的任意组合可以缀合至α-PGA，并且这些部分的相对比例无特别限定。
根据本发明的组合物和制剂还可以包含NF-κB抑制剂。如本文使用的，NF-κB抑制剂包括直接抑制剂、以及可以抑制信号转导级联的化合物、或抑制NF-κB的作用并且由此限制肿瘤细胞的增殖或存活的任意化合物。可以用作本文定义的NF-κB抑制剂的示例性化合物包括吡咯烷硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine thiocarbamate，PDTC)(NPL4)、替米沙坦(NPL9)、奥美沙坦(NPL1)、缬沙坦(NPL8)、双硫仑(NPL4)、或其药学上可接受的盐。这些抑制剂还可以称为敏化剂，这是因为它们限制了肿瘤细胞的活力，并且由此使得它们对其它肿瘤破坏剂例如本发明的组合物和制剂的作用敏感。
液体制剂
可以将锌(II)和α-PGA载体成分配制为液体。适合的液体制剂包括液体溶液剂、液体混悬剂、糖浆剂和口腔喷雾剂。液体溶液剂可以口服或通过注射给药，例如静脉内、皮内、肌内、鞘内、或皮下、或者直接注射至肿瘤中或肿瘤附近，而液体混悬剂、糖浆剂和喷雾剂一般适合于口服给药。
制备液体剂型的方法
制备液体剂型的方法包括将期望量的(i)锌盐和α-PGA载体、和/或(ii)ZnPGA复合物、以及适合的赋形剂混合在一起。某些实施方案进一步在制剂中包含胃耐受粘合剂和/或包衣。
液体溶液制剂可以用适合的载体、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、或其它针对给药形式适当选择的赋形剂来制备。例如，可以制备在适合的pH下并且用等渗剂缓冲的静脉内制剂。
适用于注射或口服递送的液体制剂的实施方案包括锌(II)盐、α-PGA载体(如上所述，未修饰的α-PGA和/或任意形式的修饰的α-PGA)、和水。在进一步的实施方案中，液体制剂可以进一步包含缓冲剂和/或盐，如氯化钠。当包含缓冲剂时，优选的缓冲pH在约pH4至约pH9的范围内。在注射时，优选的是溶液与其要注入的溶液是等渗的并且具有适合pH。在一个实施方案中，硫酸锌七水合物、α-PGA、和氯化钠在水中结合，其中锌(II)的浓度为1mg/mL且α-PGA为10mg/mL。α-PGA的聚合物分子量可以选自任意上述范围。在一个实施方案中，其在约5kDa至约100kDa的范围内；并且在其它实施方案中，其在约1kDa至约100kDa的范围内。在任意实施方案中，可以包括一种或多种聚合物分子量形式的α-PGA。
在某些实施方案中，锌盐和α-PGA载体可以制备为ZnPGA复合物。一般地，例如，如实施例1和2中所述，为了形成ZnPGA复合物，将锌盐和α-PGA载体组合并纯化。可以将获得的ZnPGA复合物的溶液稀释或者基本干燥并以更浓缩的形式重构，用于制备液体剂型的过程。ZnPGA复合物可以配制为可注射溶液剂，或者配制为液体混悬剂、糖浆剂、或喷雾剂。
可以将锌盐和α-PGA组合物配制为在本发明的方法中使用的液体混悬剂。例如，首先，用包含在颗粒化的固体中的胃耐受粘合剂制备包含Zn(II)盐和α-PGA载体(包括未修饰的和/或任意修饰形式的α-PGA)的混合物的颗粒化的组合物。(参见下文关于制备固体制剂的方法的讨论。)可以从具有在以下范围内的平均分子量的α-PGA制备α-PGA载体：约5kDa至约500kDa、或约1kDa至约500kDa、或约5kDa至约100kDa、或约1kDa至约100kDa。然后将颗粒化的固体悬浮在适合于摄取的酸性液体中。
溶液剂的pH可以小于约pH6，以使作为胃耐受粘合剂的结果，颗粒化的固体保持稳定。在一个实施方案中，液体混悬剂制剂还含有增稠剂或增粘剂，使得颗粒化的固体可以保持充分地悬浮并且有效地从容器中被摄取。
在液体混悬剂的另一个实施方案中，通过首先制备其中Zn(II)与α-PGA载体复合的ZnPGA复合物来制备颗粒化的固体。例如，此类制剂的实例在实施例1和2中提供。此后，可以将ZnPGA与胃耐受粘合剂和其它适合的赋形剂一起制粒。然后，可以将该颗粒化的混合物如上文刚描述的那样制备为液体混悬剂。
液体制剂的其它实施方案包括形成Zn盐与α-PGA复合物的，例如，微球、微粒、颗粒(granules)等粒子(particle)或者其它适合的固体形式，并且用蜡的薄层来包覆粒子。在优选的实施方案中，粒子进一步包含胃耐受粘合剂。将包衣的粒子配制为液体混悬剂制剂。尽管包衣允许锌和α-PGA复合物向肠的递送，但是粒子上的蜡包衣促进了粒子的物理完整性并降低了渗透性。
适合于包衣的颗粒可以根据任意上述方法来制备。Zn盐、α-PGA和胃耐受粘合剂的微球或微粒可以通过本领域已知的多种方法中的任意者来制备，其包括单乳法(singleemulsion method)、复乳法(double emulsion method)、聚合、界面聚合、相分离和凝聚、喷雾干燥、喷雾凝结(spray congealing)、溶剂提取、分散相的冷冻干燥。此类微球或微粒的尺寸可以在十分之几微米至几千微米的范围内。作为实例，制备微球粒子的一种方法涉及在例如石蜡油等悬浮介质中搅拌含有锌盐与α-PGA的细碎的(如，粉末化的)固体混合物，并且将聚合性胃耐受粘合剂的溶液添加至经搅拌的混悬剂。当形成微球时，添加例如氯仿等非溶剂以使微球沉淀，将微球收集、干燥并且随后用蜡包覆。
认为蜡包衣是生物相容的且是非免疫原性的，并且适用于捕获(entrapment)和将药物递送至肠道。可以根据本领域已知的方法将粒子(微球、微粒、和颗粒等)用如下的蜡包覆，例如巴西棕榈蜡、蜂蜡、十六十八醇(cetostearyl alcohol)、鲸蜡、和其它蜡。例如，可以通过以下操作用巴西棕榈蜡来包覆粒子：将蜡溶解在白色石蜡油中，将溶液冷却至低于45℃，然后将粒子添加至机械搅拌的蜡/石蜡油溶液直至粒子被包覆。可以调整搅拌速度和时间以及蜡溶液的温度来改变蜡包衣的厚度。
将蜡包衣的锌盐和α-PGA粒子配制为给药用液体混悬剂。经包覆的锌/α-PGA粒子在最终配制的混悬剂中以约5wt％至30wt％存在。通常，液体混悬剂制剂包含助悬聚合物(suspending polymer)、粘度剂和缓冲剂。该制剂还可进一步包含甜味剂、调味剂和/或防腐剂中的一种或多种。
助悬聚合物可以选自黄原胶、卡波姆(carbomer)、微晶纤维素、羧甲基纤维素、和羧甲基纤维素钠，其可以单独地或以任意组合使用。也可以使用本领域已知的其它类似试剂。总体上，助悬聚合物组分在最终制剂中以约0.02wt％至约5wt％存在。
粘度剂可以选自甘油、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素、聚维酮、瓜尔豆胶、和刺槐豆胶(locust bean gum)，其可以单独地或以任意组合使用。也可以使用本领域已知的其它类似试剂。总体上，粘度剂组分在最终制剂中以约0.05wt％至约50wt％存在。
缓冲剂可以选自磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液、和柠檬酸盐缓冲液、或者在指定范围内具有缓冲能力的其它药学上可接受的缓冲剂。将缓冲剂调整为具有约6以下的pH。在某些实施方案中，pH在约3至约6之间。在某些实施方案中，pH在4.5至5之间。在其它实施方案中，pH在4至5之间，并且在另外的其它实施方案中，pH在3至5之间。
甜味剂可以选自蔗糖、转化蔗糖(invert sucrose)、木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇、阿斯巴甜、糖精、和三氯蔗糖，其可以单独地或以任意组合使用。也可以使用本领域已知的其它类似试剂。总体上，甜味剂组分在最终制剂中以约5wt％至40wt％存在。
调味剂可以选自任意药学上可接受的调味剂、或本领域已知的在食品或补充剂中使用的任意试剂，并且可以以与工业实践一致的量添加在最终制剂中。
防腐剂可以选自苯甲酸钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苄基醇、山梨酸钾、和柠檬酸，其可以单独地或以任意组合使用，并且可以以与工业实践一致的量添加在最终制剂中。也可以使用本领域已知的其它类似试剂。
根据某些实施方案的制剂和制备液体剂型的方法如下在实施例5中提供。
在液体混悬剂制剂的这些实施方案中的任意者中，α-PGA载体一般以约0.01wt％至约10wt％的浓度存在，并且在某些实施方案中，量为约0.1wt％或约1wt％。Zn(II)一般以约0.001wt％至约10wt％的浓度存在。
还可以制备液体给药制剂(liquid dosage formulation)来包括NF-κB抑制剂。在制剂中不包括此类NF-κB抑制剂的实施方案中，可以使用任何其它适合的制剂和给药形式来共同给予NF-κB抑制剂。
固体制剂
可以将锌盐和α-PGA载体配制成用于口服给药的口服固体剂型，例如，片剂、硬胶囊、软胶囊或相关的形式，例如，迷你片、囊片、囊形片，和口服崩解膜剂等。将剂型进一步配制为包括胃耐受粘合剂和/或胃耐受包衣。
将锌盐和α-PGA载体与适用于药用产品并且适用于制造特定剂型如片剂或胶囊剂等的赋形剂组合。典型的赋形剂包括填料、粘合剂、崩解剂、助流剂、润滑剂，以及缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、调味剂、甜味剂、和着色剂等。对于各种目的，例如，改进剂型的完整性，改进生物利用度、稳定性、制造、包衣、外观和/或顺应性，可以选择要添加的赋形剂的量和类型。某些赋形剂可以用于超过一种目的和/或提供超过一种改进的特征。
填料可以是水溶性的或水不溶性的，并且可以组合每种类型的一种或多种。如本领域已知的，水溶性填料的实例包括但不限于：糖类例如葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、右旋糖、和半乳糖等；以及糖醇，例如甘露醇、山梨糖醇、和木糖醇等。如本领域已知的，水不溶性填料的实例包括但不限于：蜡、长链脂肪酸、滑石、高岭土、二氧化硅、二氧化钛、氧化铝、淀粉、粉状纤维素、和微晶纤维素等。
如本领域已知的，粘合剂包括但不限于：纤维素衍生物，例如羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、邻苯二甲酸乙酸纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素；聚乙烯吡咯烷酮；以及淀粉、改性淀粉如部分水解的淀粉(例如麦芽糊精)；糖类；明胶；以及天然或合成的胶；等。
如上所述，在某些实施方案中，包括胃耐受材料作为胃耐受粘合剂和/或作为胃耐受外包衣。构成胃耐受粘合剂或外包衣的材料起到延迟锌盐和α-PGA从剂型的释放直至其穿过胃并进入肠部的作用。当使用胃耐受粘合剂或包衣时，它可以与其它(非胃耐受的)粘合剂或包衣组合使用。
通常，胃耐受材料为基质、或聚合物、或其它屏障，所述基质、或聚合物、或其它屏障在胃的酸性环境(pH～3)中并不明显地溶解或溶胀，但在肠的中性至微碱性环境(pH7～9)中将充分地溶解或溶胀从而释放内容物。肠溶包衣和肠溶粘合剂是胃耐受材料的实例。
胃耐受材料的实例包括邻苯二甲酸乙酸纤维素，琥珀酸乙酸纤维素，偏苯三酸乙酸纤维素，邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素，选自(i)丙烯酸酯、(ii)甲基丙烯酸酯、和(iii)甲基丙烯酸中的两种或更多种单体的共聚物，聚乙酸乙烯基邻苯二甲酸酯(polyvinylacetate phthalate)，乙酸琥珀羟丙甲纤维素(hypromellose acetate succinate)，邻苯二甲酸羟丙甲纤维素，海藻酸钠，虫胶(shellac)，和玉米蛋白。
对于胃耐受材料存在多种等级和药典标准，并且它们提供了有用的指导来选择用于提供将锌和α-PGA递送至肠的功能的适合的材料。通过控制外包衣中的包衣厚度和聚合物组成、或粘合剂的量和聚合物组成，可以将释放点调整为较早或较晚出现、或者在肠的某个大致区域内出现。可以实现的控制程度的实例可以在满足各种药典标准的在商品名
Figure BDA0002559863870000201
下从Corel Pharma Chem(India)可获得的甲基丙烯酸共聚物系列中找到，如：USP/NF甲基丙烯酸共聚物、类型A-NF、以4-5％使用并通常将剂型内容物递送至空肠；USP/NF甲基丙烯酸共聚物、类型C-NF、以4-5％使用并通常将剂型内容物递送至十二指肠；和USP/NF甲基丙烯酸共聚物、类型B-NF、以10-20％使用并通常将剂型内容物递送至结肠。后者(类型B-NF)实现了使用pH依赖性聚合物的递送，尽管pH非依赖性聚合物也可用于向结肠或肠的递送。
如本领域已知的，崩解剂包括但不限于羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮(crospovidone)、海藻酸盐、低取代的羟丙基纤维素、羟丙基淀粉、和部分预胶化的淀粉等。
如本领域已知的，助流剂包括但不限于二氧化硅、硅酸盐、滑石、和磷酸钙等。
如本领域已知的，润滑剂包括但不限于碱金属或碱土金属、硬脂酸酯、油酸酯、苯甲酸酯、乙酸酯、和氯化物等。
其它类型的赋形剂，例如，缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、调味剂、甜味剂、着色剂是公知的，并且本领域普通技术人员可以容易地选择此类组分并且将其应用于制剂中。
还可以将固体给药制剂制备成包括NF-κB抑制剂。在固体制剂中不包括此类NF-κB抑制剂的实施方案中，可以使用任何其它适合的制剂和给药形式来共同给予NF-κB抑制剂。
除非另有说明，否则在不脱离本发明的范围的情况下，也可以将其它类型的活性成分，例如，维生素、矿物质、营养素、和适于在肠中吸收的其它营养或膳食补充剂添加至本文所述的液体或固体组合物和制剂中。
本文所述的组合物和制剂可以可选地包含以下物质、由以下物质组成或基本上由以下物质组成：锌盐和α-PGA载体、以及胃耐受外包衣和/或胃耐受粘合剂，只要其与说明书一致即可。组合物和制剂还可以缺少或基本上不含任何例如如下的组分：现有技术的组合物中存在的或者对于所公开的发明不是必需的活性成分和/或赋形剂。
制备固体剂型的方法
锌盐和α-PGA以及选定的赋形剂可以单独地或组合地改变大小、碎块(declumped)或粉化。各种组分可以通过如下来组合：干混；或者通过湿法制粒或干法制粒、喷雾、挤出、滚轧或流化床制粒来制粒，此后可以任选地磨碎；或者本领域已知的其它此类技术。
在某些实施方案中，可以将锌盐和α-PGA载体(如上所述，未修饰的α-PGA和/或任何形式的修饰的α-PGA)制备为ZnPGA复合物。一般地，例如，如实施例1和2中所述，将锌盐和α-PGA载体组合并且纯化。为了方便起见，可以将获得的ZnPGA复合物的溶液充分地干燥，并且在制备固体剂型的过程中作为干燥粉末或基本上粉末来使用。
制备固体剂型的方法涉及将期望量的(i)锌盐与α-PGA载体、和/或(ii)ZnPGA复合物、以及赋形剂混合在一起，所述赋形剂包含一种或多种填料和/或一种或多种粘合剂和/或一种或多种崩解剂和/或一种或多种润滑剂和/或一种或多种助流剂。如上所述，在某些实施方案中，所述一种或多种粘合剂可以为胃耐受粘合剂，并且其可以与其它(非胃耐受)粘合剂组合使用。当包括制粒步骤时，则在制粒步骤之前、期间或之后可以全部或部分地添加任何赋形剂。在某些实施方案中，在制粒步骤之后混合一些或全部润滑剂。在这些实施方案的某些之中，还在制粒步骤之后混合助流剂。
在制粒步骤涉及使用例如水或有机溶剂等溶剂、或水性有机溶液来在将组分制粒时润湿组分的共混物的情况下，通常将所得产物干燥以除去残余溶剂。如本领域已知的，有机溶剂的实例包括乙醇和异丙醇等。优选地，在干燥步骤中将基本上所有的有机溶剂除去。当水是制粒步骤中使用的溶剂的一部分时，优选地，在干燥并且进行下一步骤之后，保留不超过10wt％、或不超过5wt％、或不超过2wt％的水。
可以通过利用压缩(compression)、压实(compaction)或成形(molding)来将固体压片，使混合的或颗粒化的固体形成为片剂。此后，如上所述，在某些实施方案中，将片剂用胃耐受包衣包覆。一般地，将胃耐受物质和任选地其它赋形剂(例如，增塑剂、乳化剂)溶解于或分散于水性或有机溶剂中，然后使用包括喷雾包衣、流化床包衣、和包衣锅包衣等本领域已知的许多方法中的任一种来应用。在某些实施方案中，为了外观、机械稳定性、和化学稳定性等目的来将片剂包衣，但胃耐受材料没有包括在包衣中。
可选地，可以将混合的或颗粒化的固体填充至胶囊或囊片中，并且包封在内部。术语胶囊包括软胶囊、硬胶囊、囊形片、植物胶囊，并且可以是一件式(one-piece)或两件式(two-piece)胶囊。肠溶包衣的胶囊是可获得的(例如，肠溶胶囊药物递送技术)，或可以将胶囊填充、密封，然后通过使用物质的溶液或分散液的上述方法用胃耐受包衣、任选地用其它赋形剂来包衣。在其它实施方案中，混合的或颗粒化的固体包括胃耐受粘合剂材料，并且可以将此类固体装填在有或没有肠溶包衣的胶囊中。
片剂或者胶囊剂的尺寸与形状没有特别限定。预期可以将期望剂量的锌盐和α-PGA配制为不过大的片剂或胶囊剂。
以下在实施例6和7中提供制备根据本发明的实施方案的片剂剂型的示例性方法。
给药(Dosing)和给药(Administration)
可以给予本文所述的剂型来提供治疗有效量的锌以在受试者中实现期望的生物学应答。治疗有效量是指通过Zn、α-PGA、对α-PGA的任何修饰、任何ZnPGA复合物的形式、NF-κB抑制剂的存在或不存在、和/或剂型的递送效率等的组合作用而递送至需要治疗的患者的锌的量将实现期望的生物学应答。
期望的生物学应答包括，在受试者，例如哺乳动物，例如人类(也可以称为患者)中，预防肿瘤或癌症的发作或发展，部分或完全预防、延迟或抑制肿瘤或癌症的进展，或者预防、延迟或抑制肿瘤或癌症的复发。
对PARP1介导的坏死敏感的所有肿瘤类型预期是可以根据本文公开的治疗方法来治疗的适应症。
实现治疗有效量将取决于制剂的特征，并且将根据每个个体的性别、年龄、状况和基因组成而变化。与具有一般的充足水平的锌的个体相比，由于例如遗传原因或者吸收障碍或严重饮食限制的其它原因而具有不足的锌的个体可能需要不同的量以实现治疗效果。
一般给予受试者每天约1mg到至多约300mg锌的锌量。例如，每天约25mg、或50mg、或75mg、或100mg、或150mg、或200mg的锌。在一天中可以一起或分开服用多种剂型。口服剂型一般可以不考虑进餐时间来给药。一般持续进行治疗直到实现期望的治疗效果。如果肿瘤消退或受到抑制，为了预防、延迟或抑制其复发的目的，低剂量水平的本文所述的组合物和制剂也可以继续作为根据本发明的实施方案的治疗，或者用作预防性治疗。
实施例
实施例1：使用磷酸盐-沉淀法除去未结合的过量的锌，在pH7.0下制备和表征ZnPGA。
为了制备ZnPGA，在室温下将55mgα-PGA(钠盐，60kDa平均分子量(单分散))(Alamanda Polymers，Huntsville，AL)溶解于pH7.0、含有10mM ZnSO4的5mL 10mM MES缓冲液中，然后在置于冰上的同时进行超声处理10分钟。然后，向溶液添加pH7.0的0.5mL 200mM磷酸盐缓冲液来沉淀游离锌离子，并且将混合物通过0.2μm注射灭菌过滤器过滤。使用ICP-MS和通过4-(2-吡啶偶氮)-间苯二酚试验测量锌含量。可以制备包含例如1％(wt/vol)PGA和400μg/mL结合的锌离子的ZnPGA的原液，并且将其用于口服给药。
实施例2：使用透析法除去未结合的过量的锌，在pH7.0下制备和表征ZnPGA。
为了制备ZnPGA，在室温下将55mgα-PGA(钠盐，60kDa平均分子量(单分散))(Alamanda Polymers，Huntsville，AL)溶解于pH7.0、含有10mM ZnSO4的5mL 10mM MES缓冲液中，然后在置于冰上的同时进行超声处理10分钟。然后，将溶液在冰上相对于pH7.0的1L10mM MES透析2小时，连续三次，在6小时内总计3体积。将回收的溶液通过0.2μm注射灭菌过滤器过滤。使用ICP-MS和通过4-(2-吡啶偶氮)-间苯二酚试验测量锌含量。可以制备包含例如1％(wt/vol)PGA和400μg/mL结合的锌离子的ZnPGA的原液，并且将其用于口服给药。
实施例3：液体制剂
适合于例如注射的液体制剂的示例性实施方案的组合物包含锌(II)盐、α-PGA、氯化钠、和水。通过组合硫酸锌七水合物、α-PGA(钠盐，60kDa平均分子量(单分散))(AlamandaPolymers，Huntsville，AL)、氯化钠并且添加水至定容来制备该组合物，其中各组分的浓度为1mg/mL的锌(II)、10mg/mL的α-PGA和6.5mg/mL的氯化钠。约276mOsm/kg渗透度(osmolality)和pH5.68的所得组合物适合于在人类患者中注射。
实施例4：对于四种细胞类型，在用不同的Zn(II)浓度、60kDaα-PGA聚合物的Zn(II)/α-PGA溶液处理时的体外细胞存活试验
A.Zn/α-PGA溶液的制备。获得α-PGA(钠盐，60kDa平均分子量(单分散))(AlamandaPolymers，Huntsville，AL)，并且如下以七个浓度的Zn(II)制备Zn/α-PGA溶液。将α-PGA溶于水，添加Tris·HCl，并且将溶液在pH7.0下缓冲，然后添加ZnSO4·7H2O来产生Zn(II)浓度为1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50和100μg/mL的溶液，其中锌:谷氨酸单体比例为1:8。这些溶液用于如下所述的MTT细胞存活试验。
B.MTT试验。使用MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物]试验来测定Zn/α-PGA对于HEK-293、HeLa、MCF7和A549细胞的细胞活力的影响。简言之，将培养的细胞(参见以下)以4×104个细胞/孔的密度分配至96孔板中。添加具有不同的Zn(II)浓度的Zn/α-PGA的溶液(各条件以一式四份(N＝4)来运行)，并且在温育24小时后，将孔内容物离心从而收集细胞并且除去培养基。将MTT溶液(150μL的1mg/mL工作溶液)添加至各孔，温育3小时以使晶体甲臜形成，并且离心以收集细胞和晶体甲臜。通过将形成的晶体甲臜溶解在200μL DMSO中并且测量在540nm下的吸光度来确定细胞活力。
C.细胞培养。在95％空气和5.0％CO2的湿润气氛下、在37℃下、在200μL的含有10％胎牛血清(FBS)和1％抗生素的Dulbecco’s Modified Eagle’s培养基(DMEM)和(RPMI)中在96孔细胞培养板中培养HEK-293、HeLa、MCF7和A549细胞24小时。
D.试验结果。试验结果示于图2中。由结果可知，显然Zn/α-PGA具有细胞毒性且对于60kDa的α-PGA聚合物该效果随着Zn(II)浓度增加而增加。
实施例5：α-聚谷氨酸-锌液体组合物
用于根据实施方案实施本发明的组合物示于表1中。该组合物提供每100g为0.68mg的Zn(Zn2+离子)作为包含蜡包衣粒子的液体混悬剂制剂。在该表之后为制备制剂的方法。该组合物仅是用于本申请的许多组合物中的一种的说明。
表1
悬浮的固体组分 量
硫酸锌·7H<sub>2</sub>O 3.011mg
α-PGA(MW(M<sub>n</sub>)≤100kDa) 6.848mg
蔗糖 9.5107g
HPMC-P 0.3804g
蜡 98.91mg
小计 10g
溶液组分 量
黄原胶 0.3g
瓜尔豆胶 0.3g
木糖醇 10g
柠檬酸 0.5g
柠檬烯(limonene) 0.1g
山梨酸钾 0.025g
水 78.7mL
总计 99.925g
A.制备包覆的ZnPGA微球(cZPM)。制备200mL的含有10g蔗糖(5％w/v)、45mgα-PGA、和19.79mg硫酸锌七水合物(以元素Zn计4.5mg)的水并且冷冻干燥。然后将所得粉末与含有高达5％玉米淀粉的细碎的蔗糖以1:4的比例一起磨碎，并且加压通过No.50美国标准不锈钢筛(48目)。将该粉末悬浮于在400mL烧杯中的200mL的白色石蜡油中。通过用安装至高扭矩搅拌器(型号RXR1，Caframo，Wiarton，Ontario)的44mm聚乙烯三叶桨以260rpm搅拌来将混合物分散。向混悬剂中添加20mL的在丙酮-95％乙醇(9:1)中的10％(w/v)羟丙甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMC-P)。持续搅拌5分钟，由此形成微球，然后添加75mL氯仿。倾析悬浮介质，将微球短暂地重悬于75mL氯仿中，并且在环境温度下风干。在干燥时，用巴西棕榈蜡包覆微球。具体地，将1g巴西棕榈蜡在70℃下溶解于200mL的白色石蜡油中，并且冷却至低于45℃。向该冷却的蜡-石蜡溶液中，添加所制备的微球并且在恒定的搅拌下悬浮15分钟。倾析蜡溶液，并且在滤纸上收集微球以吸收过多的蜡溶液，从而得到包覆的ZnPGA微球(cZPM)。
B.制备包覆的ZnPGA微球(cZPM)的液体混悬溶液。将以下组分溶解于78.7mL的水中：0.3g黄原胶(例如，作为助悬聚合物)；0.3g瓜尔豆胶(例如，作为粘度剂)；10g木糖醇(例如，作为甜味剂)；0.5g柠檬酸缓冲液(例如，作为缓冲剂)；0.1g柠檬烯(例如，作为调味剂)；0.025g山梨酸钾(例如，作为防腐剂)。将水溶液的pH调节至pH4.5，并且将10g的cZPM悬浮在水溶液中，从而得到cZPM液体混悬剂。
实施例6：α-聚谷氨酸-锌组合物
用于根据实施方案实施本发明的组合物示于表2中。该组合物提供每片为25mg的Zn(Zn2+离子)。在该表之后为制备片剂的方法。该组合物仅是用于本申请的许多组合物中的一种的说明。
表2
组分 每片的量 重量％
硫酸锌 110mg 22％
α-聚谷氨酸(MW(M<sub>n</sub>)≤100kDa) 110mg 22％
微晶纤维素 100mg 20％
淀粉 85mg 17％
二氧化硅 50mg 10％
硬脂酸镁 25mg 5％
邻苯二甲酸乙酸纤维素 20mg 4％
总计 500mg 100％
具有表2所示组成的包衣片剂可以使用湿法制粒技术来制备。首先，将硫酸锌和α-聚谷氨酸干法混合在一起。进一步添加微晶纤维素、淀粉和二氧化硅，并且将干组分全部进一步地混合在一起。将混合的组分转移至制粒机，并且添加适宜量的乙醇水溶液，并且进行制粒。将所得颗粒化的混合物在50-70℃下干燥，从而得到具有小于约5％含水量的颗粒化的组合物。将硬脂酸镁添加至颗粒化的组合物中并且与其混合。将所得混合物压制成片剂。最后，使用如本领域技术人员已知的标准技术用邻苯二甲酸乙酸纤维素包覆片剂。
实施例7：α-聚谷氨酸-锌组合物
用于根据实施方案实施本发明的组合物示于表3中。该组合物提供每片为30mg的Zn(Zn2+离子)。在该表之后为制备片剂的方法。该组合物仅是用于本申请的许多组合物中的一种的说明。
表3
Figure BDA0002559863870000291
*此处假定溶剂(乙醇、异丙醇和水)在配制的片剂中以微小的量存在。
具有表3所示组成的包衣片剂可以如下制备。首先，将硫酸锌、α-聚谷氨酸、微晶纤维素、HPMC-P(羟丙甲基纤维素邻苯二甲酸酯)、麦芽糊精和羧甲基纤维素钙干法混合在一起。将混合的组分转移至制粒机，并且添加适宜量的70％乙醇水溶液，并且进行湿法制粒。将所得颗粒化的混合物在高达约60℃下干燥，从而得到具有小于约3％LOD(干燥失重)的颗粒化的组合物。将二氧化硅(例如，
Figure BDA0002559863870000292
)和硬脂酸镁添加至颗粒化的组合物中并且与其混合。将所得混合物压制成片剂。使用如本领域技术人员已知的标准技术，首先使用HPMC-P的异丙醇溶液将片剂包衣，然后在第二步骤中使用HPMC的水溶液来包衣。

Claims (24)

1.一种在患者的肿瘤中诱导PARP1介导的肿瘤坏死的方法，所述方法包括对患有肿瘤的所述患者给予剂型中的治疗有效量的Zn(II)盐和α-聚谷氨酸载体；
其中所述α-聚谷氨酸载体包括α-聚谷氨酸和/或肿瘤靶向性α-聚谷氨酸衍生物和/或电荷修饰的α-聚谷氨酸衍生物和/或肿瘤靶向性电荷修饰的α-聚谷氨酸衍生物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤具有耐药表型。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述耐药表型是功能异常的p53。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述耐药表型是MDR1过表达。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述耐药表型是MRP1过表达。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中将所述剂型中的所述Zn(II)盐和所述α-聚谷氨酸载体以治疗量与治疗量的NF-κB抑制剂组合给药。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述剂型为固体剂型或液体剂型。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述剂型为固体剂型，并且选自片剂、迷你片、硬胶囊、软胶囊、囊片、囊形片、口腔崩解膜剂、颗粒剂、微丸剂、糊剂和粉末囊剂。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述剂型为液体剂型，并且选自液体溶液剂、液体混悬剂、糖浆剂和口腔喷雾剂。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述给药的步骤选自口服给药和注射给药。
11.一种药物组合物，其包含(i)药学上可接受的Zn(II)盐、和(ii)含有肿瘤靶向部分和/或电荷修饰部分的α-聚谷氨酸载体。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述肿瘤靶向部分选自叶酸、5N,10N-二甲基四氢叶酸酯和RGD肽，并且所述部分的任意组合共价地连接至α-聚谷氨酸。
13.根据权利要求11或12所述的药物组合物，其中所述电荷修饰部分选自柠檬酸、乙二胺四乙酸、1,4,7,10-四环十二烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸和二亚乙基三胺五乙酸，并且所述部分的任意组合共价地连接至α-聚谷氨酸。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的药物组合物，其进一步包含(iii)α-聚谷氨酸。
15.根据权利要求11-14中任一项所述的药物组合物，其中所述Zn(II)盐的基本部分是Zn(II)离子与α-聚谷氨酸和/或所述肿瘤靶向部分和/或所述电荷修饰部分的结合复合物。
16.根据权利要求11-14中任一项所述的药物组合物，其中(i)所述Zn(II)盐和(ii)所述α-聚谷氨酸载体以固体混合物的形式混合在一起。
17.根据权利要求11-16中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物进一步包含NF-κB抑制剂。
18.根据权利要求11-17中任一项所述的药物组合物，其中将所述组合物配制为固体剂型。
19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述固体剂型进一步包含胃耐受粘合剂和/或胃耐受外包衣。
20.根据权利要求11-17中任一项所述的药物组合物，其中将所述组合物配制为液体剂型。
21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述液体剂型适用于注射。
22.根据权利要求20或21所述的药物组合物，其中所述液体剂型是进一步包含胃耐受材料的药物组合物的混悬剂。
23.一种用于在患者中治疗肿瘤的方法，所述方法包括对患有肿瘤的所述患者给予治疗有效量的根据权利要求11-22中任一项所述的药物组合物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述肿瘤具有选自功能异常的p53、MDR1过表达和MRP1过表达的耐药表型。
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