CN111537480B - 基于单分子全内反射荧光成像技术的病毒快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于单分子全内反射荧光成像技术的病毒快速检测方法，包括：A、向病毒标准品溶液中加入荧光核酸探针，作为待测溶液；B、将待测溶液置于全内反射荧光成像装置上进行荧光信号检测，根据所追踪荧光信号相位点的动态变化计算扩散系数，作为病毒粒子的单分子动力学指纹信号，利用Stocks‑Einstein方程计算病毒平均流体力学直径；C、用待测病毒样本替换病毒标准品，按照相同操作获得待测病毒的单分子动力学指纹信号和流体力学直径，若与上述相符，则表明待测病毒样本中含有同类型病毒。通过相符扩散系数的荧光点信号二维路径计数可实现定量检测。该方法具有简单、快速、高效、经济的优点，适合病毒的大规模快速检测。

Description

基于单分子全内反射荧光成像技术的病毒快速检测方法

技术领域

本发明涉及病毒检测技术，具体地说，涉及一种基于单分子全内反射荧光成像技术的病毒快速检测方法。

背景技术

新型冠状病毒，世界卫生组织(WHO)已将其正式命名为SARS-CoV-2，旧称 2019-nCoV。SARS-CoV-2有别于SARS-CoV，是具有特殊临床、病毒学和流行病学特征的新毒株。其导致的疾病称为COVID-19。

SARS-CoV-2属于Beta冠状病毒属(Betacoronavirus)，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。SARS-CoV-2是正义单链RNA病毒，遗传物质约3万个碱基长度，蛋白质表面突出的刺突蛋白(S-Protein)是侵染宿主细胞的关键。 SARS-CoV-2与SARS-CoV病毒一样与人体呼吸道上皮细胞以及肺组织的血管紧张素转化酶2(ACE2)受体作用从而入侵细胞，但与ACE2蛋白结合的5个关键氨基酸有4 个发生了变化，维持了刺突蛋白与ACE2蛋白互作的原结构构象。

SARS-CoV-2主要通过飞沫和接触传播，在一些特定的条件下也会发生气溶胶传播，目前也有多个研究团队提出粪口传播和母婴传播也是值得高度警惕的潜在可能途径。感染SARS-COV-2病人的发病初期症状很隐蔽，潜伏期也比较长，大多在3-7 天，但也有个例超过20天。近9成感染SARS-CoV-2患者的临床表现出发热，近7成表现出咳嗽，也有呕吐和腹泻等其他症状，患者主要出现肺炎的症状，重症的患者会出现血氧不足。除肺部，其他器官与SARS-COV-2感染相关的损害表现有待进一步研究，有部分科学家认为SARS-CoV-2感染可合并ARDS、心肌损害、凝血功能异常、肾脏损伤、肝脏损害等多脏器损害。截至目前，还没有针对感染该病毒患者的特效药和疫苗。

目前对于病毒的快速检测主要采用以下三类方法：一是核酸类，核酸是由许多核苷酸单体聚合成的生物大分子化合物，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸 (RNA)。DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础。在RNA病毒中，RNA 作为遗传物质。每个物质都有独特的核酸序列作为遗传物质，通过对于核酸序列的检测就可以确定病毒。常见的核酸类检测技术有测序技术、聚合酶链式反应(PCR)、等温扩增、CRISPR技术等。该类型的检测是一种高特异性和高灵敏度的检测，但是对于该类型的检测，通常存在仪器成本高、检测时间长等的问题，如常用的选择性核酸扩增技术(RT-PCR)通常需要几个小时的检测时间。二是抗体抗原类，抗原是诱发机体产生免疫反应的物质，即诱导机体发生免疫应答。而抗体是在抗原诱导下由B细胞分化的浆细胞产生的与特定抗原特异性结合的免疫球蛋白。病毒的包膜表面突出有多种结构蛋白含有多个抗原表位，通过结构蛋白的特异性检测原理，可以诊断出病毒的存在。还有另一种方法就是利用机体免疫表达所产生免疫球蛋白，常用于检测的是免疫球蛋白M(Immunoglobulin M，IgM)和免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)。IgM是最早且迅速产生的机体应答抗体，维持时间短，消失快，通常作为早期感染的指标。IgG是主要的抗体成分，其产生时间晚，但维持时间长，通常作为既往感染的指标。这类检测方法较核酸类时间短，约一刻钟左右，也无需其他额外仪器。但是，检测灵敏度变化受限，非特异性吸附易造成假阳性，且机体最早产生免疫球蛋白也需要几天时间，对于早期检测不适用。三是直接观察，随着现有光学显微镜和电子显微镜分辨率的提高可以实现细胞分子水平上对生物粒子进行多参数、快速的定量分析，如流式细胞术、透射电子显微镜负染色法。该类方法需要染色处理，至少需要30分钟，而且成本较高。

全内反射荧光(Total Internal Reflection Fluorescence，TIRF)显微镜是用于微小结构和单分子成像的常用工具。当光束从光密介质进入光疏介质且入射角大于临界角时会发生全内反射。全内反射的光束会诱导介质的另一面200nm薄层内产生呈指数衰减的倏逝波(Evanescent field)。只有极靠近全内反射区域产生荧光反射，从而大幅降低背景荧光，实现微小区域与结构内单个荧光分子的激发与探测。基于此显微术的超分辨成像精度与合适的数据分析方法相结合就可以实现单分子成像与追踪技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于单分子全内反射荧光成像技术的病毒快速检测方法，特别是新型冠状病毒SARS-CoV-2的快速检测方法。

为了实现本发明目的，本发明提供一种基于单分子全内反射荧光成像技术的病毒快速检测方法(包括定性检测和定量检测)，包括以下步骤：

A、以离子型卤化物溶液为试剂配制一定浓度的病毒标准品溶液，向病毒标准品溶液中加入荧光标记的核酸探针，混匀作为待测溶液；可选地，用0.5M离子型卤化物溶液(如0.5M CaCl₂溶液)配制浓度为10⁸PFU/ml的病毒标准品溶液，向病毒标准品溶液中加入荧光标记的核酸探针，混匀作为待测溶液；

B、将待测溶液置于全内反射荧光成像装置上进行荧光信号检测，根据所追踪荧光信号相位点的动态变化计算扩散系数，以扩散系数作为病毒粒子的单分子动力学指纹信号，利用Stocks-Einstein方程计算得到病毒平均流体力学直径；

C、用待测病毒样本替换步骤A中的病毒标准品，按照相同的操作方法获得待测病毒的单分子动力学指纹信号和流体力学直径，若与上述病毒的单分子动力学指纹信号和平均流体力学直径相符，则表明待测病毒样本中含有与步骤A相同的病毒。

本发明中，所述病毒包括正义单链RNA包膜病毒，优选冠状病毒属(Betacoronavirus)的病毒，更优选SARS-CoV-2。

所述离子型卤化物选自CaCl₂、MgCl₂、NaCl、KCl等中的至少一种。

所述荧光标记的核酸探针为3’端带有荧光标记的单链DNA序列(ssDNA)，其长度为18～22个碱基(优选20个碱基)。在本发明的一个具体实施方式中，荧光探针的序列(5’-3’)为：TGATAAGCTAAACGACGAAA-SYBR Green II。

本发明中，所述全内反射荧光成像装置包括光学显微系统、荧光激发系统、信号采集系统和微流控样品池(图1)；

所述光学显微系统包括盖玻片、物镜(油镜)、二向色镜、发射滤光片和反射镜；

所述荧光激发系统包括激光器，用于提供激发光光源；

所述信号采集系统包括电荷耦合器件(CCD)和计算机，用于接收荧光信号，并将所述荧光信号转换为对应的图像数据信号。

所述微流控样品池用于贮存待测溶液并将所述待测溶液驱动至光学显微系统的检测区；

进一步地，所述全内反射荧光成像装置还包括蠕动泵系统；

所述蠕动泵系统包括依次连接的蠕动泵、泵管以及抽吸针管，用于将所述待测溶液以恒定速度驱动至所述微流控样品池的储液槽内。

本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。

本发明基于单分子荧光成像与追踪技术，以单分子的灵敏度识别SARS-CoV-2，实现SARS-CoV-2的快速检测。

具体地，本发明所提供的SARS-COV-2检测方法，包括如下步骤：

(1)对短链ssDNA(single－stranded DNA，无特异性要求)进行荧光标记。

(2)将所述荧光标记ssDNA加入含离子型卤化物的检测溶液中，所述的荧光标记探针与所述的待测SARS-CoV-2发生静电结合。

(3)将所述待测溶液置于一种用于SARS-CoV-2检测的全内反射荧光成像装置上进行荧光信号检测。

为实现上述检测目的，本发明提供一种用于SARS-CoV-2检测的全内反射荧光成像装置，包括光学显微系统、荧光激发系统、信号采集系统和微流控样品池。所述光学显微系统包括盖玻片、物镜、二向色镜、发射滤光片和反射镜。荧光激发系统包括激光器，提供激发光光源。信号采集系统包括电荷耦合器件(CCD)和计算机，用于接收所述荧光信号，并将所述荧光信号转换为对应的数据信号。微流控样品池用于贮存待测溶液并将所述待测溶液驱动至光学信号检测区，其中，所述光学信号检测区对应于所述荧光激发系统的光路上使所述待测溶液生成对应的荧光信号。

可选的，所述微流控样品池还包括：

蠕动泵系统，用于将所述待测溶液以恒定速度驱动至所述微流控样品池的储液槽。

可选地，所述蠕动泵系统包括依次连接的蠕动泵、泵管以及抽吸针管。

(4)通过对一段时间内不同待测荧光信号的局域化提取，建立临近局域化荧光信号的关联，重建所述待测溶液中所述荧光标记SARS-CoV-2扩散的二维路径实现单粒子追踪，使用SARS-CoV-2检测软件实现扩散系数统计。

为实现上述目的，本发明提供一种SARS-CoV-2检测软件，包括单分子定位模块、二维路径绘制模块、扩散系数统计模块。

(5)将扩散系数作为“单分子动力学指纹信号”，通过斯托克斯-爱因斯坦(Stocks-Einstein)方程实现病毒平均粒径的计算，从而判断SARS-CoV-2存在与否。

(6)对SARS-CoV-2所处于的溶液环境的扩散系数进行标定。即将待测溶液替换已知定量的SARS-CoV-2标准品按步骤(2)-(4)进行得到标准的扩散系数。需要说明的是，该步骤只需要完成一次即可，之后的检测无需执行此步骤。

本发明实现单分子SARS-CoV-2成像与追踪的原理如下：

所述“静电结合”是指所述的ssDNA磷酸基团(修饰荧光探针)与所述的包膜病毒脂膜极性头(待测溶液中SARS-CoV-2)在室温下快速结合。SARS-CoV-2的包膜极性头磷酸基团具有负电性，ssDNA磷酸基团也具有负电性，离子型卤化物可提供正价离子。基于电荷相互作用的静电力作用可产生明亮且缓慢扩散的荧光粒子。在全内反射荧光激发下，一段时间内，静电结合表现出有规律的荧光粒子缓慢扩散信号，该单分子动力学指纹信号直接反映单分子SARS-CoV-2的存在。进一步地，该单分子动力学指纹信号是指通过SARS-CoV-2检测软件实现的单分子定位、二维路径绘制、扩散系数统计和平均粒径计算。

本发明实现全内反射荧光成像的原理如下：

根据Snell定律，当一束光穿透折射率由大(折射率为n₁)到小(折射率为n₂)的两种介质时，入射角增大到临界角：

此时的折射光将完全消失，发生全反射现象。但是，全反射回光密介质的光波会在光疏介质的表面传播波长量级的距离，在光疏介质表面传播的波就是倏逝波(Evanescentfield)。光的电场强度可以表示为：

其中，I₀为临界面的光场强度，z为距离界面的距离，d为倏逝波的穿透深度，可表示为：

其中，θ为入射光的夹角，λ为入射光的波长，当该入射光的波长为荧光激发光频波段时，倏逝波浸入样品的深度在200nm以下。平均坡印亭矢量(Poynting vector) 用于计算电磁能量的净能流密度，整个振荡周期内这些区域中的平均坡印亭矢量为零，即倏逝场区域内无净能流密度。只有在贴近临界面倏逝场极小的范围内荧光基团才能被激发照亮，对于样品其他更深层的荧光基团不能被激发，这使得全内荧光反射显微术非常适合于单分子病毒的检测。这种成像方式极大地抑制了背景荧光信号使得背景对于单分子检测范围内的影响显著排除，极大提高了单分子检测的信噪比。

本发明单分子水平上SARS-CoV-2捕获的原理如下：

ssDNA是由四种脱氧核苷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dAMP)、胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTMP)、胞嘧啶脱氧核苷酸(dCMP)、鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGMP)组成的长链大分子聚合物。脱氧核苷酸由碱基、脱氧核糖和磷酸基团构成。磷酸基团带有负电性，所以ssDNA带有负电。对于SARS-CoV-2是一种具有包膜的病毒，病毒粒子外包着囊膜，这是一层包裹在蛋白质外衣壳外的一层膜，主要来源于宿主细胞膜，也包含病毒自身的糖蛋白。所以，包膜有磷脂层、膜蛋白和具有抗原性的糖蛋白。包膜由于表面磷脂而带负电荷。离子型卤化物一般在物理场的能量作用下，原子或者分子获得一个正电荷或负电荷或失去电子而形成离子发生电离。以CaCl₂为例，其电离方程为：

CaCl₂→Ca²⁺+2Cl^- (4)

离子型卤化物可以通过电离反应提供正价离子。在同一溶液环境中，由于电子的极性分布不同会出现静电相互作用，这一作用主要体现在分子间的原子间。根据库伦公式将电荷分配在各原子上，其大小为：

其中，q_i和q_j为发生相互作用两原子i、j的部分电荷，r_ij为两原子的间距，在溶液中ε常为基于距离的介电常数。根据经典力学，这种长程作用力对于第i个原子所受的力为：

其中，U(q)为体系的总势能。基于这种长程的相互经典作用力即可实现ssDNA 磷酸基团(修饰荧光探针)与所述的包膜病毒脂膜极性头(待测溶液中SARS-CoV-2) 在室温下的快速结合。

本发明单分子水平上SARS-CoV-2扩散系数与粒径采集与分析的原理如下：

在本发明中，单分子动力学指纹信号是基于扩散系数与粒径的双重验证来确保方案的可行性。单分子水平上SARS-CoV-2荧光点信号的追踪绘制单粒子的二维路径，由此扩散系数计算为：

其中，Δx为追踪单粒子的扩散路径位移，Δt为扩散位移所需的时间，a为修正系数。SARS-CoV-2满足球形、刚性体的假设，在离子型卤化物溶液中的扩散可以看成是独立的、与溶剂分子不相关的个体行为。粘度与扩散系数之间的关系满足斯托克斯-爱因斯坦(Stocks-Einstein)方程：

其中，d(H)为粒径(流体力学直径)，用于对于SARS-CoV-2辨识的第二重验证， k为玻尔兹曼常数，T为绝对温度，η为溶液介质的粘度。对于扩散系数和流体力学直径的双重验证确保本发明方法具有可行性。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供一种单分子定位追踪与成像的方式，利用高辨识度的单分子动力学指纹信号，对于检测液中SARS-COV-2基于静电结合进行荧光标记识别，实现 SARS-COV-2快速检测，是一种更加快速、简单、经济、普适的方法。

(一)本发明采用荧光标记ssDNA与SARS-CoV-2静电结合的方法，整个检测过程简便快捷。整个检测仅需1-3分钟，相对于其他检测方法更加快速，适合大规模应用。

(二)本发明采用原液进行检测，无需任何的扩增和纯化步骤，对待测 SARS-CoV-2实现单分子水平上的快速定位与精确统计，整个检测过程无样品前处理要求，更加简单便捷。

(三)本发明采用目前单分子成像与追踪技术常用的全内反射荧光显微法，所用仪器、材料、试剂等，均为常用的仪器和试剂。该方法普适性高，整体设备与现有高精度检测方法相比总体成本低廉。

(四)本发明所采用的直接反映SARS-COV-2存在的单分子动力学指纹信号，是基于单分子定位、二维路径绘制、扩散系数统计和平均粒径验证而得到的。 SARS-COV-2是一种正义单链RNA病毒，复制中的自然突变率为10^-5～10^-8，而各种物理、化学诱变剂(Mutagens)下突变率更高，已有研究表明SARS-COV-2于近期已产生了149个突变点，演化出L亚型和S亚型，L亚型具有更高的亲和力，使得感染力更强。基于单分子动力学指纹信号可以重新进行标定，对于SARS-COV-2变异病毒同样可以实现快速检测。

附图说明

图1为本发明用于SARS-COV-2检测的全内反射荧光成像装置的示意图；其中， 11：盖玻片；12：物镜；13：二向色镜；14：发射滤光片；15：反射镜；21：激光器；31：电荷耦合器件；32：计算机；4：微流控样品池。

图2为本发明实施例2中单分子成像与追踪的示意图。

图3为本发明实施例2中荧光探针与SARS-COV-2静电结合产生的单分子动力学指纹信号示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1用于SARS-COV-2检测的全内反射荧光成像装置

本发明提供一种用于SARS-COV-2检测的全内反射荧光成像装置，如图1所示，包括：光学显微系统、荧光激发系统、信号采集系统以及微流控样品池。如图所示，光学显微系统包括11：盖玻片，12：物镜，13：二向色镜，14：发射滤光片，15：反射镜。荧光激发系统包括21：激光器。信号采集系统包括31：电荷耦合器件，32：计算机。荧光激发系统用于提供激发光光源。信号采集系统用于接收荧光信号，并将所述荧光信号转换为对应的数据信号。微流控样品池用于贮存待测溶液并将所述待测溶液驱动至光学信号检测区。

在本实施例中，微流控样品池4放置于盖玻片3上方，并使得微流控样品池4上的荧光信号检测区位于物镜12穿透的激光光路上，由激光器21发射的激光通过二向色镜13反射到物镜12，大数值孔径物镜12产生倏逝波，同时也将产生的荧光信号透过二向色镜13，经过反射滤光片14达到电荷耦合器件31。当待测溶液驱动至光学信号检测区后开启荧光激发系统，由大数值孔径物镜12产生倏逝波照射到光学信号检测区域，电荷耦合器件31接收到检测区域在激发光照射下受激产生的荧光信号，并将该荧光信号转换成对应的数据信号，最后通过计算机32对于产生的荧光信号进行分析。

进一步地，用于SARS-COV-2检测的全内反射荧光成像装置还包括：蠕动泵系统，用于将所述待测溶液以恒定速度驱动至所述微流控样品池的储液槽。

所述蠕动泵系统包括依次连接的蠕动泵、泵管以及抽吸针管。所述蠕动泵根据实际流速将所述的抽吸针管中的待测溶液匀速驱动至储液槽的光学信号检测区域。所述泵管用于存储和运送所述待测溶液。

实施例2基于单分子荧光成像技术的SARS-CoV-2的快速检测方法

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)快速检测的方法。所述方法包括如下步骤：(1) 对短链ssDNA(single－stranded DNA，无特异性要求)进行荧光标记。(2)将所述荧光标记ssDNA加入含离子型卤化物的检测溶液中，所述荧光标记探针与所述待测 SARS-CoV-2发生静电结合。(3)将所述待测溶液置于实施例1的用于SARS-CoV-2检测的全内反射荧光成像装置上进行荧光点信号检测。(4)使用荧光点坐标定位与最小二乘法算法追踪实现扩散系数统计。(5)将扩散系数作为“单分子动力学指纹信号”进行病毒平均流体力学直径的计算，双重验证直接反映SARS-CoV-2的存在与否。

1、荧光标记探针与SARS-COV-2的静电结合

对短链ssDNA(single－stranded DNA，无特异性要求)进行荧光标记。将所述荧光标记ssDNA加入含离子型卤化物的检测溶液中，所述荧光标记探针与所述待测 SARS-COV-2发生静电结合。SARS-COV-2的包膜极性头磷酸基团具有负电性，ssDNA 磷酸基团也具有负电性，离子型卤化物可提供正价离子，基于电荷相互作用的静电力作用可产生明亮且缓慢扩散的荧光粒子。

DNA为短链的、DNA荧光染料标记的、非特异性的单链DNA序列。例如，荧光探针为一段3’端带有荧光标记的单链DNA序列，其长度一般为18-22个碱基。室温下，在高浓度离子型卤化物存在的环境下荧光探针与SARS-COV-2病毒发生静电结合，如图2所示。

2、基于单分子成像与追踪实现SARS-COV-2检测

将所述静电结合的溶液置于用于SARS-COV-2检测的全内反射荧光成像装置上进行检测。使用信号采集系统采集荧光信号。在全内反射荧光激发下，一段时间内，静电结合表现出有规律的荧光粒子缓慢扩散信号。通过不同所述待测荧光信号的局域化提取，建立临近局域化荧光信号的关联，重建所述待测溶液中所述荧光标记SARS-COV-2扩散的二维路径实现单粒子追踪。使用SARS-CoV-2检测软件实现扩散系数统计，如图3所示。扩散系数作为“单分子动力学指纹信号”，通过斯托克斯-爱因斯坦(Stocks-Einstein)方程实现病毒平均粒径的计算，直接反映SARS-CoV-2的存在。

进一步地，SARS-COV-2检测软件，包括单分子定位模块、二维路径绘制模块、扩散系数统计模块。

本发明中，荧光探针与SARS-COV-2静电结合产生的单分子动力学指纹信号统计呈现正态分布，即一段时间内，荧光标记粒子扩散的二维路径呈现出的扩散系数在统计上集中于某一值，且该值接近目标物SARS-COV-2定标的扩散系数(图3)，同时通过粒径验证与SARS-COV-2物理特性一致，则判定是目标物(SARS-COV-2)。

实施例3单分子水平上SARS-CoV-2追踪与定量检测

自动目标识别跟踪系统是通过成像系统CCD的图像自动提取目标并进行识别与追踪，其主要算法包括图像数据的预处理、图像分割、目标检测、特征提取、目标追踪等。在本实施例中，单分子水平上SARS-CoV-2追踪的实现是通过用于 SARS-COV-2检测的全内反射荧光成像装置中的CCD元件对荧光信号进行成像，对于荧光信号的识别是首先基于对目标和背景有效地进行局域像素的分割，将其处理成灰度图像并进行二值化。对于亮点的荧光信号目标，二值化处理为：

其中，g(x,y)为像素点(x,y)坐标处的灰度值，T_h为灰度阈值。根据该结果将SARS-CoV-2的位置确定为(x,y)，由此实现不同所述待测荧光信号的局域化提取。对于其匹配算法主要是建立临近局域化荧光信号的关联，重建所述待测溶液中所述荧光标记SARS-CoV-2扩散的二维路径来实现单粒子追踪。根据最小二乘法对于相邻时间间隔的荧光点信号的位置进行确认与关联，定义均值为：

相关函数为：

其中，M为提取局域信号长、宽方向的像点数。当R(x,y)达到最小值时，即认为该荧光信号为目标SARS-CoV-2下一时刻的目标点，可以实现追踪与预测。根据追踪荧光信号相位点的动态变化可以实现单分子的二维路径追踪与预测。

基于本发明的方法同样可实现定量检测。具体地，通过用于SARS-COV-2检测的全内反射荧光成像装置和单分子水平上SARS-CoV-2追踪算法可实现目标视野下 SARS-CoV-2的二维路径追踪，对其二维路径数量进行统计，即可对检测视野内 SARS-CoV-2的总量进行统计计数。

实施例4 SARS-CoV-2的快速检测

1、标定

室温下配制0.5M CaCl₂溶液，并将其与1nM ssDNA混合，配制成混合溶液，ssDNA荧光探针序列(5’-3’)为：TGATAAGCTAAACGACGAAA-SYBR Green II。

用移液枪向微流控样品池中加入5μL浓度为1×10⁸PFU/ml SARS-CoV-2标准品，再加入混合溶液至20μL，混匀作为待测溶液。

将待测溶液置于全内反射荧光成像装置上进行荧光信号检测。激发波长为497nm，发射波长为520nm，物镜为放大倍数为100倍的油镜系物镜。拍摄记录微流控样品池上荧光点信号，曝光时间为100ms，记录1min。利用所追踪荧光信号相位点的动态变化计算扩散系数，以扩散系数作为病毒粒子的单分子动力学指纹信号，利用Stocks-Einstein方程计算得到病毒平均流体力学直径，可以得到SARS-CoV-2标准品的单分子动力学指纹信号和平均流体力学直径。

2、检测

取5μL待测咽拭子样本替换上述标准品，按照相同的操作方法获得单分子动力学指纹信号和平均流体力学直径，若与标定实验中的病毒单分子动力学指纹信号和平均流体力学直径相符合，如图3所示，则表明待测病毒样本中含有SARS-CoV-2。通过单分子动力学指纹信号计数可实现定量检测。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献:

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Claims (4)

1.基于单分子全内反射荧光成像技术的SARS-CoV-2快速检测方法，所述方法为非诊断目的，其特征在于，包括以下步骤：

A、以离子型卤化物溶液为试剂配制一定浓度的SARS-CoV-2病毒标准品溶液，向病毒标准品溶液中加入荧光标记的核酸探针，混匀作为待测溶液；

其中，所述荧光标记的核酸探针为3’端带有荧光标记的单链DNA序列，其长度为18～22个碱基；

B、将待测溶液置于全内反射荧光成像装置上进行荧光信号检测，根据所追踪荧光信号相位点的动态变化计算扩散系数，以扩散系数作为病毒粒子的单分子动力学指纹信号，利用Stocks-Einstein方程计算得到病毒平均流体力学直径；

C、用待测病毒样本替换步骤A中的SARS-CoV-2病毒标准品，按照相同的操作方法获得待测病毒的单分子动力学指纹信号和流体力学直径，若与上述病毒的单分子动力学指纹信号和平均流体力学直径相符，则表明待测病毒样本中含有与步骤A相同的病毒；

单分子水平上SARS-CoV-2追踪的实现是通过用于SARS-COV-2检测的全内反射荧光成像装置中的CCD元件对荧光信号进行成像，对于荧光信号的识别是首先基于对目标和背景有效地进行局域像素的分割，将其处理成灰度图像并进行二值化；对于亮点的荧光信号目标，二值化处理为：

其中，g(x,y)为像素点(x,y)坐标处的灰度值，T_h为灰度阈值；根据该结果将SARS-CoV-2的位置确定为(x,y)，由此实现不同所述待测荧光信号的局域化提取；对于其匹配算法主要是建立临近局域化荧光信号的关联，重建待测溶液中荧光标记SARS-CoV-2扩散的二维路径来实现单粒子追踪；根据最小二乘法对于相邻时间间隔的荧光点信号的位置进行确认与关联，定义均值为：

相关函数为：

其中，M为提取局域信号长、宽方向的像点数；当R(x,y)达到最小值时，即认为该荧光信号为目标SARS-CoV-2下一时刻的目标点，以实现追踪与预测；根据追踪荧光信号相位点的动态变化实现单分子的二维路径追踪与预测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离子型卤化物选自CaCl₂、MgCl₂、NaCl、KCl中的至少一种。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述全内反射荧光成像装置包括光学显微系统、荧光激发系统、信号采集系统和微流控样品池；

所述光学显微系统包括盖玻片、物镜、二向色镜、发射滤光片和反射镜；

所述荧光激发系统包括激光器，用于提供激发光光源；

所述信号采集系统包括电荷耦合器件和计算机，用于接收荧光信号，并将所述荧光信号转换为对应的图像数据信号；

所述微流控样品池用于贮存待测溶液并将所述待测溶液驱动至光学显微系统的检测区。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述全内反射荧光成像装置还包括蠕动泵系统；

所述蠕动泵系统包括依次连接的蠕动泵、泵管以及抽吸针管，用于将所述待测溶液以恒定速度驱动至所述微流控样品池的储液槽内。

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