KR20230137343A - 활성화 분해 및 계수 (acc) 기술을 사용하는 핵산 서열의특이적 검출 - Google Patents
활성화 분해 및 계수 (acc) 기술을 사용하는 핵산 서열의특이적 검출 Download PDFInfo
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Abstract
본 개시는 무증폭 접근법에서 광 공진기 흡수 현미경(PRAM)에 결합된 간단한 단일 단계 실온 활성화 절단 및 계수(ACC) 검정을 제공한다. 본원에 개시된 검정, 및 관련 시스템 및 방법은 치료 시점에 암과 같은 질환뿐만 아니라 바이러스 및 박테리아 병원체의 검출을 가능하게 한다.
Description
2019년 12월, SARS-CoV-2(COVID-19) 바이러스가 동물전염원으로부터 인간을 공격한 이래, 바이러스는 전 세계적으로 급속히 확산되어, 사망, 질병, 일상 생활의 파괴, 기업과 개인에 대한 경제적 손실을 초래하였다. 모든 국가에 걸쳐 의료 시스템의 주된 어려움은, 제한된 수의 이용 가능한 시험 키트, 제한된 수의 인증된 테스트 시설을 포함하는 기여 인자로 질환을 신속하고 정확하게 진단하는 능력과 더불어 결과를 얻고 환자에게 정보를 제공하는 데 필요한 시간이었다. 신속한 진단 시험과 관련된 어려움은 어느 개인이 격리되어야 하는지 여부, 부족한 전염병학적 정보, 지역사회 내에서/지역 전체에 걸쳐 병원균 전염을 신속하게 추적할 수 없음을 둘러싼 불확실성에 기인한다. COVID-19 진단의 기전에 있는 어려움은 이미 새롭게 출현한 전염병과 대유행병에 직면했을 때부터 이미 잘 알려져 있으며, 모기 매개 질환(지카, 뎅기열, 치쿤구니야, 말라리아), HIV 및 기타 질환의 진단에 내재되어 있는 어려움으로 나타나기도 한다. 이미 광범위한 검사를 수행하는 능력은, 이를 구현하여 격리 대상에 관한 정확한 정보를 제공하는 한국과 같이 국가들에게 명확한 혜택이 있음을 보여주었으며, 이는 결과적으로 질병 전파를 보다 시의 적절하게 통제하게 된다. COVID-19 감염증의 초기 첫 번째 파동 이후에도, 지속적인 감시가 계속될 것으로 예상되며, 이는 여행, 고용, 및 개인 간 밀접한 상호작용이 필요한 많은 상황의 일상적인 양태가 될 가능성이 높다.
그러나, (기기, 자본, 장비, 및 시약의 측면에서) 이용 가능한 기술은 여전히 비싸고, 기술적으로 어려우며, 노동 집약적이다. 따라서, 치료 시점에 감염성 질환에 대한 신속하고, 정확하며, 다중화된 진단을 제공할 수 있는 저비용 휴대용 플랫폼에 대한 긴급한 필요성이 존재한다. 중합효소 연쇄반응(PCR)[1][2][3] 및 관련 접근법은 적은 양의 출발 물질(바이러스 입자당 하나의 게놈 카피), RNA 추출 공정의 불안정성, 시험 샘플 내 억제 물질, 및 많은 시약의 품질 관리 실패의 조합으로 인한 높은 위음성률의 어려움을 겪고 있다[4][5]. 또한, 효소적 DNA/RNA 증폭 기술은 치료 시점에 최소로 가공된 샘플로 작업해야 하는 경우에, 프라이머 이량체화 및 이상적인 완충액 조건의 파괴로 인한 위양성률의 어려움을 겪고 있다[6].
또한, 질환 검출은 유사한 한계로 인한 어려움을 겪는다. 예를 들어, 암 진단을 위해서는 암의 존재를 정확하게 검출하기 위한 고가의, 복잡하고, 시간 소모적인 검사가 필요하다. 이는 환자에게 불필요한 신체적 및 정서적 부담을 초래하고 의료 비용을 상승시킨다.
따라서, 당업계에서는 암과 같은 감염성 질환 및 병리의 검출을 위한 저비용 휴대용 플랫폼으로서, 신뢰성 있고, 신속하며, 저렴한 플랫폼을 제공할 필요가 있다.
일 양태에서, 예시적인 구현예는 샘플에서 핵산을 검출하기 위한 시스템을 제공한다. 시스템은 뉴클레오티드 테더에 의해 소스 기판의 표면에 결합된 스트렙트아비딘 결합 나노입자를 갖는 소스 기판; 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소를 포함하는 검정 배지로서, 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소는 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 샘플에 노출될 때 CRISPR/Cas 복합체를 형성할 수 있는, 검정 배지; 비오틴화된 바이오센서; 및 이미징 플랫폼을 포함한다. 가이드 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소에 결합하여 CRISPR/Cas 복합체를 형성하고, Cas 효소는 뉴클레오티드 테더를 절단하여 스트렙트아비딘 결합 나노입자를 방출시키고, 방출된 스트렙트아비딘 결합 나노입자는 비오틴화된 바이오센서에 결합할 수 있고, 이어서 비오틴화된 바이오센서에 결합된 스트렙트아비딘 결합 나노입자의 수를 정량화하도록 구성되는 이미징 플랫폼을 사용한다.
또 다른 양태에서, 예시적인 구현예는 소스 기판; 비오틴화된 바이오센서; 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소, 스트렙트아비딘 결합 나노입자의 집단을 포함하는 검정 배지; 및 복수의 뉴클레오티드 테더를 포함하는 생물학적 검정을 제공하며, 여기서 스트렙트아비딘 결합 나노입자는 복수의 뉴클레오티드 테더를 사용하여 바이오센서에 결합되고, 뉴클레오티드 테더는 핵산 서열로 구성된다.
또 다른 양태에서, 예시적인 구현예는 샘플에서 핵산을 검출하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 스트렙트아비딘은 나노입자에 결합되어 스트렙트아비딘 함유 나노입자을 생성한다. 스트렙트아비딘 함유 나노입자는 뉴클레오티드 테더를 사용하여 소스 기판의 표면에 결합되어 검정 표면을 생성한다. 비오틴화된 바이오센서는 비오틴으로 바이오센서를 코팅함으로써 생산된다. 활성화된 Cas 효소는 시험 샘플을 검정 배지에 첨가함으로써 생성되며, 여기서 검정 배지는 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소를 포함하고, 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소는 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 시험 샘플에 노출될 때 활성화된 CRISPR/Cas 복합체를 형성할 수 있다. 그런 다음, 활성화된 Cas 효소 및 분석 표면의 인큐베이션 후 절단된 스트렙트아비딘 함유 나노입자를 포획하고; 바이오티닐화된 바이오센서와 함께 인큐베이션하고; 비오틴화된 바이오센서에 결합하는 스트렙트아비딘 함유 나노입자의 수를 이미징 플랫폼을 사용해 정량화한다.
일 양태에서, 예시적인 구현예는 샘플에서 핵산을 검출하기 위한 시스템을 제공하며, 상기 시스템은 뉴클레오티드 테더에 의해 유리 부유 극미립자에 결합된 스트렙트아비딘 결합 나노입자를 포함한다. 상기 시스템은 또한 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소를 포함하는 검정 배지; 비오틴화된 바이오센서; 및 이미징 플랫폼을 포함하며, 여기서 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소는 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 샘플에 노출될 때 CRISPR/Cas 복합체를 형성할 수 있다. 상기 시스템에서, 가이드 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소에 결합하여 CRISPR/Cas 복합체를 형성하며, 여기서 Cas 효소는 뉴클레오티드 테더를 절단하여 스트렙트아비딘 결합 나노입자를 방출시키도록 구성된다. 그런 다음, 스트렙트아비딘 결합 나노입자는 비오틴화된 바이오센서에 결합하고, 이미징 플랫폼은 비오틴화된 바이오센서에 결합된 스트렙트아비딘 결합 나노입자의 수를 정량화하도록 구성된다.
추가의 양태는 생물학적 검정이며, 상기 생물학적 검정은 스트렙트아비딘 결합 나노입자; 유리 부유 극미립자; 바이오틴화된 바이오센서; 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소를 포함하는 검정 배지; 스트렙트아비딘 결합 나노입자 집단; 및 복수의 뉴클레오티드 테더를 포함한다. 스트렙트아비딘 결합 나노입자는 복수의 뉴클레오티드 테더를 사용하여 유리 부유 극미립자에 결합되며, 뉴클레오티드 테더는 핵산 서열로 구성된다.
또 다른 양태는 샘플에서 핵산을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 스트렙트아비딘을 나노입자에 결합하여 스트렙트아비딘 함유 나노입자을 생성하는 단계, 및 뉴클레오티드 테더를 사용하여 스트렙트아비딘 함유 나노입자를 유리 부유 극미립자에 테더링하는 단계를 포함한다. 비오틴화된 바이오센서는 비오틴으로 바이오센서를 코팅함으로써 생성된다. 활성화된 Cas 효소는 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소를 포함하는 검정 배지에 시험 샘플을 첨가함으로써 생성된다. 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소는, 활성화된 Cas 효소의 인큐베이션 후에 절단된 스트렙트아비딘 함유 나노입자 및 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 시험 샘플에 노출될 때 활성화된 CRISPR/Cas 복합체를 형성할 수 있으며, 유리 부유 극미립자는 비오틴화된 바이오센서에 의해 절단된 나노입자 함유 스트렙트아비딘과 함께 포획되어 인큐베이션된다. 그런 다음, 이미징 플랫폼을 사용하여 비오틴화된 바이오센서에 결합하는 스트렙트아비딘 함유 나노입자가 정량화된다.
일 양태에서, 예시적인 구현예는 샘플에서 핵산을 검출하기 위한 시스템을 제공한다. 상기 시스템은 뉴클레오티드 테더에 의해 나노입자가 표면에 결합된 바이오센서; 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소를 포함하는 검정 배지로서, 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소는 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 샘플에 노출될 때 CRISPR/Cas 복합체를 형성할 수 있는, 검정 배지; 및 이미징 플랫폼을 포함한다. 가이드 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소에 결합하여 CRISPR/Cas 복합체를 형성한다. Cas 효소는 뉴클레오티드 테더를 절단하여 나노입자를 방출시키도록 구성된다. 이미징 플랫폼은 샘플의 첨가 전후에 바이오센서에 테더링된 나노입자의 수를 정량화하도록 구성된다.
추가의 양태에서, 예시적인 구현예는 다음을 포함하는 생물학적 검정을 제공한다: 바이오센서; 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소를 포함하는 검정 배지; 나노입자 집단; 및 복수의 뉴클레오티드 테더. 나노입자는 복수의 뉴클레오티드 테더를 사용하여 바이오센서 표면에 결합되고, 뉴클레오티드 테더는 핵산 서열로 구성된다.
또 다른 양태에서, 예시적인 구현예는 샘플에서 핵산을 검출하기 위한 방법을 제공한다. 검출은 뉴클레오티드 테더를 사용하여 나노입자를 바이오센서 표면에 테더링하여 검정 표면을 생성함으로써 달성된다. 그런 다음, 검정 배지를 분석 표면에 첨가한다. 검정 배지는 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소를 포함하며, 여기서 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소는 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 샘플에 노출될 때 CRISPR/Cas 복합체를 형성할 수 있다. 상기 방법은 표적 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있는 생물학적 샘플을 검정에 첨가하여 CRISPR/Cas 복합체를 형성하는 단계, 및 이미징 플랫폼을 사용하여 샘플을 첨가하기 전후에 바이오센서에 테더링된 나노입자의 수를 정량화하는 단계를 추가로 포함한다.
도 1a는 금 나노입자(AuNP)가 상방으로부터 부착되는 동안 하방으로부터 광결정(PC)을 비추기 위한 휴대용 PRAM 검출 기기의 개략도이다.
도 1b는 부착된 AuNP의 피크 강도 값(PIV) 이미지이다.
도 1c는 하나의 AuNP로 인해 PC의 공진 반사 강도가 감소하는 것을 보여준다.
도 2는 활성화 절단 및 계수(ACC) 검정의 개념을 도시한다. 활성화된 CRISPR/Cas RNP 복합체는 PC 표면 상에서 DNA 테더를 절단하여 AuNP를 분리시키고 신호 변화를 야기한다.
도 3a는 100 nM N 유전자가 존재할 때 RNP 복합체에 의해 야기된 리포터 유전자의 무분별한 절단을 도시한다.
도 3b는 100 nM E 유전자가 존재할 때 RNP 복합체에 의해 야기된 리포터 유전자의 무분별한 절단을 도시한다.
도 3c는 표적 유전자 각각을 100 nM 첨가한 후 FAM으로부터 형광 방출이 증가하는 것을 도시한다.
도 3d는 형광 방출 강도를 표적 N 유전자 농도의 함수로서 도시한다.
도 4a는 SARS-CoV-2 게놈의 N 유전자(100 nM)를 표적으로 하는 RNP 복합체를 첨가한 후 DNA 테더가 절단되고 나노입자가 제거되는 것을 보여준다.
도 4b는 SARS-CoV-2 게놈의 E 유전자(100 nM)를 표적으로 하는 RNP 복합체를 첨가한 후 DNA 테더가 절단되고 나노입자가 제거되는 것을 보여준다.
도 5a는 N 유전자 및 E 유전자 각각에 대한 대조군 샘플(불활성화된 Cas12a /gRNA 복합체)을 첨가하기 전후에 PC 상의 AuNP 수의 변화를 보여준다.
도 5b는 N 유전자, 대조군(N 유전자), E 유전자, 및 대조군(E 유전자)을 각각 함유하는 RNP 복합체가 존재할 때 AuNP의 상대 변화를 나타내는 비교 차트이다.
도 6은 비오틴화된 PEG를 이용하여 AuNP를 포획하여 활성화 절단하고, 스트렙트아비딘 결합 AuNP가 방출되어 비오틴화된 바이오센서에 결합하는 것을 계수하는 것의 개략도이다.
도 7a~7f는 저농도 연구로의 투여량 반응 곡선이다. 목표 농도 대비 결합된 AuNP의 투여량 반응 곡선이 0.1 aM (시험 샘플 내 약 300카피의 표적 분자) (도 7a), 1 aM (시험 샘플 내 약 3,000카피의 표적 분자) (도 7b), 10 aM (시험 샘플 내 약 30,000카피의 표적 분자) (도 7c), 100 aM (시험 샘플 내 약 300,000카피의 표적 분자) (도 7d), 및 1 fM (시험 샘플 내 약 3,000,000카피의 표적 분자)(도 7e)에 대해 도시되어 있다. 개별 결합 곡선을 표적 농도 대비 결합된 AuNP의 투여량 반응 곡선 상에 그래프화하였다(도 7f).
도 8. ACC 투여량 반응 및 목표 선택도(데이터 세트 1/2). (도 8a) 1 zM, (도 8b) 10 zM, (도 8c) 100 zM, 또는 (도 8d) 1 aM EGFR 유전자 단편으로 활성화되고 Cas12a에 의해 방출된 후 PC 표면에 포획된 AuNP의 이미지. 좌측 및 우측 패널은 각각 EGFRWT 및 EGFRL858R을 사용하여 포획된 AuNP를 보여준다. (도 8e) 각 이미지 세트에서 AuNP 계수 도표(도 8a~8d).
도 9. ACC 투여량 반응 및 목표 선택도(데이터 세트 2/2). (도 9a) 1 zM, (도 9b) 10 zM, (도 9c) 100 zM, 또는 (도 9d) 1 aM EGFR 유전자 단편으로 활성화되고 Cas12a에 의해 방출된 후 PC 표면에 포획된 AuNP의 이미지. 좌측 및 우측 패널은 각각 EGFRWT 및 EGFRL858R을 사용하여 포획된 AuNP를 보여준다. (도 9e) 각 이미지 세트에서 AuNP 계수 도표(도 9a~9d).
도 1b는 부착된 AuNP의 피크 강도 값(PIV) 이미지이다.
도 1c는 하나의 AuNP로 인해 PC의 공진 반사 강도가 감소하는 것을 보여준다.
도 2는 활성화 절단 및 계수(ACC) 검정의 개념을 도시한다. 활성화된 CRISPR/Cas RNP 복합체는 PC 표면 상에서 DNA 테더를 절단하여 AuNP를 분리시키고 신호 변화를 야기한다.
도 3a는 100 nM N 유전자가 존재할 때 RNP 복합체에 의해 야기된 리포터 유전자의 무분별한 절단을 도시한다.
도 3b는 100 nM E 유전자가 존재할 때 RNP 복합체에 의해 야기된 리포터 유전자의 무분별한 절단을 도시한다.
도 3c는 표적 유전자 각각을 100 nM 첨가한 후 FAM으로부터 형광 방출이 증가하는 것을 도시한다.
도 3d는 형광 방출 강도를 표적 N 유전자 농도의 함수로서 도시한다.
도 4a는 SARS-CoV-2 게놈의 N 유전자(100 nM)를 표적으로 하는 RNP 복합체를 첨가한 후 DNA 테더가 절단되고 나노입자가 제거되는 것을 보여준다.
도 4b는 SARS-CoV-2 게놈의 E 유전자(100 nM)를 표적으로 하는 RNP 복합체를 첨가한 후 DNA 테더가 절단되고 나노입자가 제거되는 것을 보여준다.
도 5a는 N 유전자 및 E 유전자 각각에 대한 대조군 샘플(불활성화된 Cas12a /gRNA 복합체)을 첨가하기 전후에 PC 상의 AuNP 수의 변화를 보여준다.
도 5b는 N 유전자, 대조군(N 유전자), E 유전자, 및 대조군(E 유전자)을 각각 함유하는 RNP 복합체가 존재할 때 AuNP의 상대 변화를 나타내는 비교 차트이다.
도 6은 비오틴화된 PEG를 이용하여 AuNP를 포획하여 활성화 절단하고, 스트렙트아비딘 결합 AuNP가 방출되어 비오틴화된 바이오센서에 결합하는 것을 계수하는 것의 개략도이다.
도 7a~7f는 저농도 연구로의 투여량 반응 곡선이다. 목표 농도 대비 결합된 AuNP의 투여량 반응 곡선이 0.1 aM (시험 샘플 내 약 300카피의 표적 분자) (도 7a), 1 aM (시험 샘플 내 약 3,000카피의 표적 분자) (도 7b), 10 aM (시험 샘플 내 약 30,000카피의 표적 분자) (도 7c), 100 aM (시험 샘플 내 약 300,000카피의 표적 분자) (도 7d), 및 1 fM (시험 샘플 내 약 3,000,000카피의 표적 분자)(도 7e)에 대해 도시되어 있다. 개별 결합 곡선을 표적 농도 대비 결합된 AuNP의 투여량 반응 곡선 상에 그래프화하였다(도 7f).
도 8. ACC 투여량 반응 및 목표 선택도(데이터 세트 1/2). (도 8a) 1 zM, (도 8b) 10 zM, (도 8c) 100 zM, 또는 (도 8d) 1 aM EGFR 유전자 단편으로 활성화되고 Cas12a에 의해 방출된 후 PC 표면에 포획된 AuNP의 이미지. 좌측 및 우측 패널은 각각 EGFRWT 및 EGFRL858R을 사용하여 포획된 AuNP를 보여준다. (도 8e) 각 이미지 세트에서 AuNP 계수 도표(도 8a~8d).
도 9. ACC 투여량 반응 및 목표 선택도(데이터 세트 2/2). (도 9a) 1 zM, (도 9b) 10 zM, (도 9c) 100 zM, 또는 (도 9d) 1 aM EGFR 유전자 단편으로 활성화되고 Cas12a에 의해 방출된 후 PC 표면에 포획된 AuNP의 이미지. 좌측 및 우측 패널은 각각 EGFRWT 및 EGFRL858R을 사용하여 포획된 AuNP를 보여준다. (도 9e) 각 이미지 세트에서 AuNP 계수 도표(도 9a~9d).
본 명세서의 특정 양태가 본원에 기술되지만, 이는 제시된 특정 양태에 한정되지 않고 달라질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 또한, 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 양태를 기술하기 위한 것이며, 본원에서 구체적으로 달리 정의되지 않는 한, 한정하도록 의도되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 또한, 당업자가 인식할 수 있듯이, 본원에 개시된 특정 구현예는 본원에 개시된 다른 구현예와 제한없이 조합될 수 있다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥에 의해 구체적으로 달리 표시되지 않는 한, 용어 "포함하는(comprise 및 include)" 및 이들의 변형된 표현(예: "포함하는(comprises, comprising, includes, 및 including)")은 언급된 구성 요소, 특징, 요소, 또는 단계, 또는 구성 요소, 특징, 요소, 또는 단계의 군을 포함하지만, 다른 구성 요소, 특징, 요소, 또는 단계, 또는 구성 요소, 특징, 요소, 또는 단계의 군을 제외하지는 않음을 나타내는 것으로 이해해야 한다. 용어 "포함하는(comprising)", "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)", 및 "구성되는(consisting of)" 중 어느 하나는, 이들의 통상적인 의미를 유지하면서, 다른 두 용어 중 어느 하나로 대체될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태("a", "an", 및 "the")는 문맥상 달리 명시되지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다.
달리 지시되거나 문맥으로부터 및 당업자의 이해로부터 달리 명백하지 않는 한, 범위로서 표현되는 본원의 값은, 문맥에 의해 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 본 개시의 상이한 구현예에서 언급된 범위 내의 임의의 특정 값 또는 하위 범위를, 해당 범위의 하한 단위의 10분의 1까지 가정할 수 있다.
본원에서 및 도면에서 사용되는 바와 같이, 범위 및 양은 "약" 특정 값 또는 범위로서 표현될 수 있다. "약"은 정확한 양도 포함한다. 예를 들어, "약 5%"는 "약 5%" 및 "5%"를 또한 의미한다. 용어 "약"은 또한 주어진 값 또는 값의 범위의 ±10%를 지칭할 수 있다. 따라서, 약 5%는 예를 들어 4.5% 내지 5.5%를 또한 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "샘플"은 뉴클레오티드 서열을 함유하는 임의의 유형의 샘플을 지칭하며, 생물학적 샘플을 포함한다. "생물학적 샘플"은 본원에 기술된 하나 이상의 질환 및/또는 장애에 걸렸거나 이에 걸릴 가능성이 있는 온혈 동물, 예컨대 포유동물, 바람직하게는 인간의 신체 조직(기관 천공물 또는 조직 생검물을 포함하지만 이에 한정되지는 않음), 또는 체액(혈액, 뇌척수액, 혈장, 또는 타액을 포함하지만 이에 한정되지는 않음)의 샘플을 지칭한다. 생물학적 샘플은 비인간 포유동물 및 다른 동물로부터 수득된 조직 또는 혈액 샘플을 지칭할 수도 있다.
본 개시의 관점에서, 본원에 기술된 방법 및 조성물은 원하는 요구를 충족하도록 당업자에 의해 구성될 수 있다.
1.
개요
본 개시는 표적 핵산 서열의 효소 증폭을 사용하지 않는 접근법에서 광 공진기 흡수 현미경(PRAM)과 결합된 일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복서열(CRISPR)-기반 핵산 검출을 사용하여, 2개의 독립적이고 고유한 게놈 절편을 표적화함으로써 SARS-CoV-2를 검출하기 위한 저렴한 휴대용 기기에 결합된 간단한 활성화 절단 및 계수(ACC) 검정을 제공한다. 개시된 검정 및 검출 기기는 SARS-CoV-2 이외의 광범위한 감염원의 존재뿐만 아니라 암과 같은 병리학적 질환을 검출하도록 구성될 수도 있다. PRAM 기기는 미국 특허 출원 제16/170,111호에 기술되어 있고, 광 결정(PC) 바이오센서의 다양한 양태는 미국 특허 제7,479,404호, 제7,521,769호, 제7,531,786호, 제7,737,392호, 제7,742,662호 및 제7,968,836호에 기술되어 있으며, 이들 모두는 참조로서 본원에 통합된다.
미생물 CRISPR 및 CRISPR-연관(CRISPR/Cas) 적응 면역 시스템은 CRISPR-기반 진단에 활용될 수 있는 프로그램 가능한 엔도뉴클레아제를 함유한다 [7][8]. 본원에 기술된 시스템, 검정, 및 방법은 효소-가이드 RNA 복합체(RNP라고 함)가 특이적 표적에 결합한 후 단일 가닥 핵산을 무차별적으로 절단하는 능력(RNP 활성화)을 이용하여 신호 변화를 생성한다. 그러나, 현재의 플랫폼은 CRISPR 단계로부터의 감염성 질병 간이검사(lateral flow test) 스트립 또는 형광계 상에서 측정 가능한 변화가 검출되도록 서열 특이적 프라이머 및 DNA 중합효소를 사용하는 사전 증폭 단계를 필요로 한다. 본 개시는 PRMA 바이오센서 이미징 플랫폼을 사용해, 핵산 테더[9]에 의해 광 결정(PC) 나노구조 표면에 결합된 AuNP 또는 비오틴화된 바이오센서에 결합된 스트렙트아비딘 결합 AuNP를 포함하여, 나노입자의 디지털 계수를 수행하여, 특정 표적 핵산 서열의 신속한 검출을 수행한다.
2.
PRAM 작동 원리
PRAM 바이오센싱 플랫폼의 휴대용 버전이 도 1a에 도시되어 있다. 포트 1은 섬유 결합형 617nm LED 광원(M617F2, Thorlabs)에 커플링되며, 먼저 렌즈 군(F810SMA-635, Thorlabs)을 사용해 출력 빔을 시준한다. Zero-order 반파장판(WPH10M-633, Thorlabs)은 PC 공동의 TM 공명 모드를 여기시키기 위해 시준된 빔의 편광을 회전시킨다. 그런 다음, 평면-볼록 렌즈(LA1509-A-ML, Thorlabs)는 Olympus plan-fluorite 대물렌즈 20Х/0.5 개구수(NA) 대물렌즈의 후방 초점면 상으로 빔을 포커싱하는데, 여기서 시준된 빔은 수직 입사 시 PC 표면에 충돌한다. 수동 3축 스테이지(PT3, Thorlabs)를 사용해 대물 렌즈의 초점면에 PC 샘플을 고정시킨다. PC 공진기로부터의 반사된 광은 동일한 대물렌즈에 의해 수집되고 50/50 비편광 빔-스플리터(CCM1- BS013, Thorlabs)에 의해 방향이 바뀐다. 더블릿(AC254-200-A-ML, Thorlabs)은 이미지 평면을 전하 결합 장치(CCD) 카메라(GS3-U3-51S5M-C, Point Grey) 상에 177 nm/픽셀의 해상도로 투사한다. 도 1c에 도시된 바와 같이, 특정 공진 파장 및 입사각에서는 완전한 간섭이 발생하고 광이 투과되지 않아 반사 효율은 거의 100%가 된다. 공진 반사율 크기는 PC 표면 상에 흡수 AuNP를 첨가함으로써 극적으로 감소되어(도 1c), LED로부터의 빛을 비추고 반사 강도의 이미지를 만들어(도 1b) 각 AuNP를 관찰할 수 있는 능력을 생성한다. 광 공진기 흡수 현미경(PRAM)으로 불리는 현미경 접근법을 사용하여 PC 전체에 걸쳐 픽셀 단위로 공진 피크 강도 값(PIV)을 측정함으로써, PC의 전방 표면이 수성 배지에 침지된 상태로 투명 기판을 통해 시준된 광대역 광을 구조에 비추어 부착된 AuNP의 PIV 이미지를 수집할 수 있다.
2.
검정 작동 원리
활성화 절단 및 계수 검정("검정")은 PRAM 바이오센서 이미징 플랫폼에 결합된 CRISPR-Cas 기반의 무증폭 생물학적 검정이다. 제1 예시적인 구현예에서, 플랫폼은 비오틴화된 바이오센서에 결합하는 스트렙트아비딘 결합 금 나노입자(AuNP)의 디지털 계수를 수행한다. 제2 예시적인 구현예에서, 플랫폼은 표적 핵산 서열이 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소와 상호작용하여 활성화된 복합체를 형성할 때 광결정 표면으로부터 방출된 AuNP의 디지털 계수를 수행한다.
검정의 제1 구현예는 PRAM 기기를 사용해 비오틴화된 바이오센서에 결합하는 스트렙트아비딘 결합 나노입자의 수를 검출하는 비오틴화된 나노입자 포획 검정이다. 비오틴화된 나노입자 포획 검정은 소스 기판, 비오틴 결합을 위한 개방 포켓을 갖는 스트렙트아비딘에 연결된 나노입자 집단, 복수의 뉴클레오티드 테더, 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소를 포함하는 검정 배지, 및 비오틴화된 바이오센서로 구성된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "개방 포켓(open pocket)"은 비오틴 결합에 이용할 수 있는 스트렙트아비딘 상의 비오틴 결합 부위 중 하나 이상을 지칭한다. 보다 구체적으로, 소스 기판은 스트렙트아비딘 결합 나노입자 집단을 함유하며, 여기서 나노입자는 복수의 뉴클레오티드 테더를 통해 소스 기판에 결합된다. 용어 "소스 기판(source substrate)"은 유리(산화규소), 플라스틱(폴리에스테르, 폴리스티렌, 아크릴), 금속(금, 은), 또는 유전체(질화규소 또는 산화티타늄)를 포함하는 물질로부터 선택된 임의의 생물학적으로 불활성인 고형 물질을 지칭한다. 소스 기판은 하나 이상의 ssDNA 테더를 통해 나노입자를 기판 표면의 밀접한 근위에 보유할 수 있는 표면이다. 일 구현예에서, 소스 기판은 PC 바이오센서이다.
나노입자는 광범위한 물질로 구성될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 나노입자는 금 나노입자(AuNP)이다. 다른 구현예에서, 나노입자 물질은 양자 도트, 금속 계열 나노입자, 자성 나노입자, 또는 SiO2 또는 TiO2와 같은 유전체 물질로 이루어진 나노입자이다. 자성-플라스몬 나노입자 태그가 사용되어 바이오센서가 나노입자에 결합하는 데 필요한 시간을 감소시킬 수도 있는데, 이는 방출된 나노입자와 비오틴화된 바이오센서 사이에 인력 자기장을 인가함으로써 감소된다. 본 개시의 스트렙트아비딘 함유 나노입자은 비특이적 뉴클레오티드 서열로 이루어진 DNA 뉴클레오티드 테더를 사용하여 소스 기판에 테더링된다. 이와 일관되게, 테더는 거의 모든 단일 가닥 DNA 서열일 수 있다. 도 6에 도시된 바와 같이, 테더의 일부는 dsDNA일 수도 있는데, 이는 강성을 부여하고, 나노입자와 기판 사이의 높이 변위를 조절할 수 있게 한다. 뉴클레오티드 테더는 서열 및 비-특이적 길이에 있어서 균질하거나 비균질할 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 테더는 약 5 내지 200 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 구현예에서, 테더는 약 5~50, 약 51~100, 약 101~150, 또는 약 15~200 뉴클레오티드의 길이이다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오티드 테더는 약 5~25, 약 26~50, 약 51~75, 약 76~100, 약 101~125, 약 126~150, 약 151~175, 또는 약 176~200 뉴클레오티드의 길이이다. 테더의 양 단부는 화학적 작용기로 제조될 수 있는데, 이는 소스 기판과 및 테더의 대향 단부 상의 나노입자와 공유 화학 결합 또는 비오틴-스트렙트아비딘 결합을 형성하는 것을 용이하게 한다.
예시적인 구현예에서, 스트렙트아비딘은 PEG화를 사용하거나 스트렙트아비딘의 공유 또는 비공유 부착을 위한 당업계에 알려진 다른 방법을 사용해 나노입자, 바람직하게는 AuNP에 연결되거나 부착된다. 스트렙트아비딘 상의 제2 비오틴 결합 부위를 이용하여 뉴클레오티드 테더를 결합시킴으로써, 도 6에 제시된 바와 같이, 나노입자-뉴클레오티드 테더-소스 기판 연결을 생성한다. 바람직한 구현예에서, 테더, 바람직하게는 ssDNA는 스트렙트아비딘 결합 AuNP를 이소시아네이트를 통해 소스 기판에 테더링한다. 대안적인 구현예에서, ssDNA는 알킬 할로겐화물, 설폰산염, 알데히드, 카르복시산, 또는 에폭시드를 통해, AuNP와 같은 스트렙트아비딘 결합 나노입자에 테더링된다.
본원에 개시된 비오틴화된 나노입자 포획 검정은, 질환에 대한 바이오마커인 서열을 가진 하나 이상의 표적 RNA 또는 DNA 분자의 존재, 바이러스 병원체의 존재, 또는 박테리아 병원체의 존재를 검출할 수 있게 한다. 이와 일관되게, 예시적인 구현예에서, 표적 뉴클레오티드 서열을 가짐으로써 가이드 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 것으로 의심되는 샘플 및/또는 생물학적 샘플로서, 활성화된 CRISPR/Cas 복합체를 형성할 수 있는 샘플 및/또는 생물학적 샘플을 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소와 함께 인큐베이션한다. 샘플에 표적 분자가 존재하면 Cas가 활성화되며, 활성화된 Cas의 농도는 표적 분자의 농도에 정비례한다. Cas 함유 샘플은 활성화된 Cas 및 활성화되지 않은 Cas 둘 다를 함유할 수 있다. 적절한 음성 및 양성 대조군도 반응에 포함될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "Cas 효소"는 Cas/CRISPR 복합체를 형성할 수 있는 임의의 Cas 효소를 포함할 수 있다. 당업자는 Cas 효소가 클래스 I 및 클래스 II로 분류된다는 것을 이해할 것이다. 바람직한 구현예에서, Cas 효소는 클래스 II 효소, 보다 구체적으로는 Cas9, Cas12a, Cas12b, 또는 Cas13a이다. 그러나, 다음을 포함하지만 이에 한정되지 않는 대안적인 클래스 II Cas 효소가 검정의 일부로서 사용될 수도 있다: Csn2, Cas4, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12f, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas12k, C2c4, C2c8, C2c9, Cas13b, Cas13c, 또는 Cas13d. 바람직한 구현예에서, Cas9는 전령 RNA를 검출하는 데 사용되고, Cas12는 이중 가닥 DNA를 검출하는 데 사용되며, Cas13은 마이크로RNA를 검출하는 데 사용된다.
비오틴화된 나노입자 포획 검정에서, 활성화된 Cas 샘플을 테더링된 스트렙트아비딘 결합 AuNP를 함유하는 소스 기판과 함께 인큐베이션한다. 활성화된 Cas는 ssDNA 테더를 절단하여 스트렙트아비딘 결합 AuNP를 검정 배지 내로 방출한다. 스트렙트아비딘 결합 AuNP를 함유하는 검정 배지를 비오틴화된 바이오센서와 함께 인큐베이션하면, 개방 포켓을 통해 스트렙트아비딘-비오틴을 결합시킬 수 있고, 이어서 PRAM 기기를 통해 스트렙트아비딘-비오틴 결합을 정량화할 수 있다. 결합된 입자의 정량적 변화는 샘플 또는 생물학적 샘플에서 질환, 바이러스 병원체, 또는 박테리아 병원체의 존재 또는 부재를 나타낸다. 비오틴화된 나노입자 포획 검정의 검출 한계는, 표적 ctDNA 서열의 경우 1 zM인데(도 7~9), 이는 시험 샘플에서 표적 DNA 서열의 약 3 카피를 나타낸다. 150 μL의 용액에 현탁된 유전자 표적의 3 카피는 3.33 x 10-20 M(33 zM)과 같다. 임상 혈장 샘플이 일반적으로 5 mL의 부피이기 때문에, 5 mL의 부피 중 유전자 표적의 3 카피는 1.00 x 10-21(1 zM)과 같다. 혈장 DNA 추출 키트가 최대 5 mL의 인간 혈장으로부터 100 μL의 정제된 DNA를 용리하므로, 본원에서 보고되는 검출 한계는 1 zM이다. 따라서, 1 zM의 보고된 검출 한계는 5 mL의 혈장에 존재하는 표적 유전자의 카피 수에 상응하며, 이에 따라 샘플에 존재하는 모든 DNA가 100 μL의 용리 부피로 단리된 다음, 후속 절단 단계를 위해 150 μL로 최종 희석된다고 가정한다.
바람직하게는, 바이오센서는 광 결정이다. 바이오센서는 위스퍼링 갤러리 모드 바이오센서, 즉 링 공진기, 마이크로토로이드, 또는 마이크로스피어일 수도 있다. 추가의 구현예에서, 바이오센서는 광이 측방향으로 이동하는 도파관 구조, 음향 바이오센서, 광음향 바이오센서, 또는 표면 플라스몬 공진 바이오센서이다. 또 다른 구현예에서, 소스 기판으로부터 방출된 AuNP는 이어서 기판 상에 포획되고, 이는 포획된 나노입자를 계수하는 다른 형태의 현미경, 예컨대 전자 현미경, 암시야 현미경, 또는 반사 간섭 현미경에 의해 측정된다. 나노입자가 양자 도트 또는 인광 나노입자와 같은 광자 이미터인 경우, 현미경 시스템은 형광 현미경 또는 내부 전반사 형광 현미경일 수 있다. 도 6은 AuNP 포획 검정의 개요를 제공한다.
스트렙트아비딘-결합 나노입자는 활성화된 Cas가 포함된 용액에서 유리 부유하는 마이크로미터 크기의 입자에 테더링될 수도 있다. 본원에서 사용되는 용어 "극미립자"는 직경이 약 2~75 마이크로미터, 약 2~70 마이크로미터, 약 2~65 마이크로미터, 약 2~60 마이크로미터, 약 2~55 마이크로미터, 약 2~50 마이크로미터, 약 2~45 마이크로미터, 약 2~40 마이크로미터, 약 2~35 마이크로미터, 약 2~30 마이크로미터, 약 2~25 마이크로미터, 약 2~20 마이크로미터, 약 2~15 마이크로미터, 약 2~10 마이크로미터, 약 5~75 마이크로미터, 약 5~70 마이크로미터, 약 5~65 마이크로미터, 약 5~60 마이크로미터, 약 5~55 마이크로미터, 약 5~50 마이크로미터, 약 5~45 마이크로미터, 약 5~40 마이크로미터, 약 5~35 마이크로미터, 약 5~30 마이크로미터, 약 5~25 마이크로미터, 약 5~20 마이크로미터, 약 5~15 마이크로미터, 또는 약 5~20 마이크로미터의 크기 범위인 중합체 비드, 자성 비드, 또는 유리 비드(산화규소)인 극미립자를 지칭한다. 유리 부유하는 마이크로미터 크기 입자는 유리 용액에서 미세입자 및 Cas를 확산시켜, 더 많은 ssDNA 테더와 Cas의 접촉시킬 수 있고, 더 짧은 시간 내에 ssDNA를 절단할 수 있다. 본 구현예에서, 유리 부유 극미립자를 사용하기 위해서는 ssDNA 절단 후에, 원심분리 또는 자석을 사용하여 극미립자를 용액으로부터 분리하여, 방출된 스트렙트아비딘-연결 나노입자를 상청액에서 분리하는 추가 단계를 필요로 한다. 그런 다음, 스트렙트아비딘 결합 나노입자를 함유하는 상청액을 비오틴화된 바이오센서와 함께 인큐베이션하여, 개방 포켓을 통해 스트렙트아비딘-비오틴을 결합시킨 다음, PRAM 기기를 통해 스트렙트아비딘-비오틴 결합을 정량화할 수 있다. 결합된 입자의 정량적 변화는 샘플 또는 생물학적 샘플에서 질환, 바이러스 병원체, 또는 박테리아 병원체의 존재 또는 부재를 나타낸다.
제2 구현예에서, 본원에 개시된 검정은 CRISPR/Cas 효소-가이드 RNA 복합체(RNP라고 함)가 특이적 표적에 결합한 후(RNP 활성화) 단일 가닥 핵산을 무차별적으로 절단하는 능력의 원리로 작동하여 신호 변화를 생성한다. 본 구현예에서, AuNP는 DNA 테더를 통해 광 결정(PC)의 표면에 부착된다. 특이적 SARS-CoV-2 RNA에 결합한 후, 활성화된 RNP 복합체는 비특이적으로 및 반복적으로 DNA 테더를 절단하여, PC 표면으로부터 금 나노입자를 방출시킨다. 그런 다음, PRAM 기기는 각각의 표면 방출된 금 나노입자를 검출하고 계수하여, 도 2에 도시된 바와 같이, 시험 샘플에서 SARS-CoV-2 RNA의 존재를 즉시 판독한다.
생물학적 검정의 제2 구현예는 바이오센서; 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소, 나노입자의 집단을 포함하는 검정 배지; 및 복수의 뉴클레오티드 테더로 구성된다. 바이오센서는 복수의 뉴클레오티드 테더를 사용하여 표면에 결합된 나노입자를 함유한다. 나노입자는 광범위한 물질로 구성될 수 있고, 일 구현예에서 나노입자는 금이다. 다른 구현예에서, 나노입자 물질은 양자 도트, 금속 계열 나노입자, 자성 나노입자, SiO2 또는 TiO2와 같은 유전체 물질로 이루어진 나노입자, 또는 자성-플라스몬 나노입자이다. 테더는 임의의 RNA/DNA 서열일 수 있다.
나노입자는 비특이적 뉴클레오티드 서열로 이루어진 테더를 사용하여 바이오센서 표면에 테더링된다. 일 구현예에서, 소스 기판은 PC 바이오센서이다. 뉴클레오티드 테더는 서열 및 비-특이적 길이에 있어서 균질하거나 비균질할 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 테더는 약 5 내지 200 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 구현예에서, 테더는 약 5~50, 약 51~100, 약 101~150, 또는 약 15~200 뉴클레오티드의 길이이다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오티드 테더는 약 5~25, 약 26~50, 약 51~75, 약 76~100, 약 101~125, 약 126~150, 약 151~175, 또는 약 176~200 뉴클레오티드의 길이이다.
바이오센서는 광 결정일 수 있다. 바이오센서는 위스퍼링 갤러리 모드 바이오센서, 즉 링 공진기, 마이크로토로이드, 또는 마이크로스피어일 수도 있다. 추가의 구현예에서, 바이오센서는 광이 측방향으로 이동하는 도파관 구조, 음향 바이오센서, 또는 광음향 바이오센서이다.
전술한 바와 같이, 본원에서 사용되는 "Cas 효소"는 Cas/CRISPR 복합체를 형성할 수 있는 임의의 Cas 효소를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, Cas 효소는 클래스 II 효소, 보다 구체적으로는 Cas9, Cas12a, Cas12b, 또는 Cas13a이지만, 다음을 포함하지만 이에 한정되지 않는 대안적인 클래스 II Cas 효소가 검정의 일부로서 사용될 수도 있다: Csn2, Cas4, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12f, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas12k, C2c4, C2c8, C2c9, Cas13b, Cas13c, 또는 Cas13d. 바람직한 구현예에서, Cas9는 전령 RNA를 검출하는 데 사용되고, Cas12는 이중 가닥 DNA를 검출하는 데 사용되며, Cas13은 마이크로RNA를 검출하는 데 사용된다.
본원에 개시된 검정의 제2 구현예는, 질환에 대한 바이오마커인 서열을 가진 하나 이상의 표적 RNA 또는 DNA 분자의 존재, 바이러스 병원체의 존재, 또는 박테리아 병원체의 존재를 검출할 수 있게 한다. 이와 일관되게, 표적 뉴클레오티드 서열을 가짐으로써 가이드 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 것으로 의심되는 샘플 및/또는 생물학적 샘플로서, 활성화된 CRISPR/Cas 복합체를 형성할 수 있는 샘플 및/또는 생물학적 샘플이 검정에 첨가된다. 그런 다음, 활성화된 복합체가 뉴클레오티드 테더를 절단하면, 결합된 나노입자 수량의 변화를 PRAM 기기를 사용해 결정한다. 결합된 입자의 정량적 변화는 샘플 또는 생물학적 샘플에서 질환, 바이러스 병원체, 또는 박테리아 병원체의 존재 또는 부재를 나타낸다. 보다 구체적으로, 정량적 차이는 샘플을 첨가하기 전후에 바이오센서의 표면에 테더링된 나노입자의 차이로서 계산된다. 테더링된 나노입자의 수가 감소한 것은, 질환의 바이오마커인 서열을 가진 RNA 또는 DNA 분자, 바이러스 병원체, 또는 박테리아 병원체가 존재함을 나타낸다. 또한, 관심 뉴클레오티드 서열은 질환의 존재를 나타낼 수 있다. SARS-CoV-2 및 암은 본원에 개시된 시스템, 검정, 및/또는 방법을 사용하여 검출할 수 있는 예시적인 바이러스 병원체 및 질환이다. 테더링된 나노입자를 정량화한 후, 나노입자를 바이오센서 표면으로부터 제거하여 바이오센서를 재사용할 수 있다. 나노입자는 검정 완충액을 교환하거나 검정 완충액을 교반함으로써 검정 완충액을 교환하지 않고도 바이오센서 표면으로부터 제거될 수 있다. 나노입자가 자성인 경우, 이는 자기장을 인가함으로써 바이오센서 표면으로부터 제거될 수도 있다. 본원에 기술된 검정은 샘플에서 핵산을 검출하기 위한 시스템의 일부일 수도 있다. 본 개시의 시스템은 하나 이상의 소스 기판; 뉴클레오티드 테더에 의해 나노입자가 표면에 결합된 바이오센서 또는 비오틴화된 바이오센서; 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 뉴클레오티드 테더를 절단하도록 구성된 Cas 효소를 포함하는 검정 배지로서, 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소는 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 샘플이 검정에 첨가될 때 CRISPR/Cas 복합체를 형성할 수 있는, 검정 배지; 및 샘플의 첨가 전후에 바이오센서에 테더링된 나노입자의 수를 정량화하도록 구성된 PRAM 이미징 플랫폼으로 구성된다.
본 개시는 또한, 샘플에서 관심 핵산 서열, 예컨대 감염원, 병원체, 또는 질환과 연관된 핵산 서열을 검출하는 데 있어서 검정을 사용하는 방법을 제공한다. 제1 예시적인 구현예에서, 샘플에서 핵산을 검출하기 위한 방법이 제공된다. 스트렙트아비딘은 PEG화 또는 당업계에서 일반적으로 이해되는 다른 부착 기술을 사용해 나노입자에 연결된다. 스트렙트아비딘 함유 나노입자은 뉴클레오티드 테더를 사용하여 소스 기판의 표면에 테더링되어, 검정 표면 및 비오틴으로 코팅된 바이오센서를 생성한다. 검정 배지가 검정 표면에 첨가되는데, 여기서 검정 배지는 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소를 포함하고, 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소는 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 샘플에 노출될 때 활성화된 CRISPR/Cas 복합체를 형성할 수 있다. 표적 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있는 생물학적 샘플을 검정에 첨가하여, 스트렙트아비딘 함유 나노입자을 방출하는 활성화된 CRISPR/Cas 복합체를 형성한다. 방출 후, 스트렙트아비딘 함유 나노입자을 함유하는 샘플을 비오틴화된 바이오센서에 첨가한 다음, 이미징 플랫폼을 사용하여, 비오틴화된 바이오센서에 결합하는 스트렙트아비딘 함유 나노입자의 수를 정량화한다.
검정의 제2 예시적인 구현예에서, 상기 방법의 나노입자는 뉴클레오티드 테더를 사용하여 바이오센서의 표면에 테더링된다. 그런 다음, 검정 배지를 분석에 첨가한다. 검정 배지는 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소를 포함하며, 여기서 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소는 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 샘플에 노출될 때 CRISPR/Cas 복합체를 형성할 수 있거나, 검정에 첨가될 때에도 CRISPR/Cas 복합체를 형성할 수 있다. 또한, 당업자는 검정 배지가 수집된 샘플 및/또는 생물학적 샘플을 수확, 저장, 또는 보존하는데 필요한 성분을 함유할 수도 있음을 이해할 것이다. 샘플 및/또는 생물학적 샘플은 뉴클레오티드 서열을 함유하는 것으로 의심되는 임의의 샘플일 수 있다. 당업자는, 여기에 임의의 포유동물의 조직 및/또는 체액이 포함하지만 이에 한정되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 바람직한 구현예에서, 샘플은 인간의 샘플이다. 일부 구현예에서, 샘플은 표적 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있는 비-포유동물 숙주의 샘플이다. 표적 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있는 샘플을 검정에 첨가한 후, CRISPR/Cas 복합체가 형성되고, 이어서 이미징 플랫폼을 사용하여 샘플을 첨가하기 전후에 바이오센서에 테더링된 나노입자의 수를 정량화한다. 바람직한 구현예에서, 이미징 시스템은 PRAM 이미징 플랫폼이다. 이미징 플랫폼은 대안적인 비-이미징 검출 기기를 추가로 포함할 수 있다. 이미징 플랫폼은 형광 현미경, TIRF 현미경, 암시야 현미경, 전자 현미경, 원자력 현미경, 또는 반사 간섭 현미경일 수도 있다.
또한, 본원에 제공된 제2 구현예는, 표적 분자의 농도가 충분히 높을 때, 바이러스 감염 또는 질환의 존재를 신속하게 검출할 수 있게 하는 본원에 개시된 시스템, 검정, 또는 방법의 일부로서 PRAM 이미징 시스템을 사용할 때 20분 미만 내에 결과를 제공하는 추가적인 놀라운 기술적 효과를 갖는다. 이와 같이, 본원에 기술된 시스템, 검정, 및 방법은 치료 시점에 사용될 수 있다.
실시예
이어지는 실시예는 본 발명의 특정 구현예 및 이의 다양한 용도를 예시한다. 이들은 단지 설명을 목적으로 제시되며, 어떠한 방식으로도 본 개시의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
방법
PC 표면 실란화
광 결정(PC)의 외부 산화티타늄 층을 화학적으로 활성화시키기 위해 산소 플라즈마를 사용하여 표면 관능화를 달성하였다. 이어서, 플라즈마 처리에 의해 생성된 반응성 하이드록실기를 무수 테트라하이드로푸란(THF)에 현탁된 실란 혼합물을 사용하여 실온에서 30분 동안 액상 실란화에 의해 유도체화하였다. 50 mL 용액은 49 mL의 THF, 900 uL의 3-(트리에톡시실릴)프로필 이소시아네이트, 50 uL의 부틸(클로로)디메틸실란, 및 50 uL의 클로로(디메틸)옥틸실란으로 구성하였다. 실란화 후, 절단된 AuNP를 포획하는 데 사용된 PC 표면을, 0.5% N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA)을 함유하는 인산염 완충 식염수 중 10 mg/mL의 농도의 아민-PEG11- 비오틴과 반응시켜 실온에서 12시간 동안 2차로 관능화시켰다.
AuNP 표면 제조
아민/비오틴-캡핑된 ssDNA 테더를 1 mM 하이드로퀴논(뉴클레아제-무함유수에 현탁됨)에서 스트렙트아비딘-접합 금 나노입자(AuNP)와 함께 30℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 10분 동안 1,200 rcf로 원심분리 후 단리하였다. 그런 다음, ssDNA-접합된 AuNP를 1 mM 하이드로퀴논에 재현탁하고 30초 동안 초음파 처리하였다.
PC 표면 상에 AuNP의 고정
150 uL의 1 mM 하이드로퀴논 완충액에 현탁된 ssDNA-접합 AuNP를 실란화된 PC 표면과 실온에서 30분 동안 공동 배양하여 실란화된 PC 표면 상에 고정시켰다. 고정 후, PC 표면을 1 mM 하이드로퀴논의 50 mL 분취물로 4회 순차적으로 세척하였다.
Cas12a-sgRNA 복합체의 조립
동일한 부피의 100 nM 효소(EnGen® Lba Cas12a ) 및 125 nM sgRNA를 1X CutSmart® 완충액(뉴클레아 무함유수에 희석함)에서 함께 혼합하였다. 용액을 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 Cas12a-sgRNA 복합체를 조립하였다.
Cas12a-sgRNA 복합체의 표적 활성화
조립된 Cas12a-sgRNA 복합체를 37℃에서 150 uL의 1X CutSmart® 완충액에서 합성 돌연변이체 dsDNA EGFR 유전자 단편과 공동 인큐베이션하여 활성화시켰다. 그런 다음, 활성화된 복합체의 각 분취액을 AuNP가 고정된 3x4 mm PC를 함유하는 별도의 1.5 mL Eppendorf 원심분리 튜브에 첨가하였다.
AuNP의 표면 절단 및 포획
표적-활성화된 Cas12a-sgRNA 용액에 침지시킨 PC를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음 용액으로부터 제거하였다. 그런 다음, 절단으로 방출된 AuNP를 함유하는 표적-활성화된 용액을 아민-PEG11-비오틴 관능화된 포획 PC를 함유하는 별도의 1.5 mL Eppendorf 튜브에 옮겼다. 방출된 AuNP를 함유하는 용액에서 포획 PC를 1시간 동안 인큐베이션하고, 세척한 후, 이미징하였다.
표면 이미징 및 입자 계수
세척 후, AuNP 포획에 사용된 PC 표면에 617 nm 레이저를 조사하고 50X 현미경 대물렌즈 하에 이미징하였다. 획득된 이미지의 사후 처리 후 입자 수를 측정하였다.
실시예 1: 형광 시험에서 CRISPR 검정 성분의 예비 검증은 리포터 서열을 절단하는 RNP 복합체의 능력을 입증한다.
CRISPR 검정 성분의 예비 검증은 일 단부가 6-카르복시플루오레세인(6-FAM)이고 타 단부가 블랙홀 퀀처(Black Hole Quencher, BHQ)인 리포터 서열의 존재 하에 수행하였다. SARS-CoV-2 게놈의 두 절편에 모두에 대해 활성화된 RNP 복합체(각각 도 3a 및 도 3b에서 N 및 E 유전자로 표시됨)는 리포터 서열을 절단하는 능력을 입증하였다. 결과적으로, FAM 리포터의 형광 방출 강도의 유의한 증가가 도 3c에서 관찰되었다. 표적 N-유전자 농도를 변경하면서 동일한 검정을 반복하였다. 도 3d에 도시된 바와 같이, 표적 유전자 농도가 1 fM 내지 10 nM 사이에서 변화했을 때, 형광 방출 강도에서의 특이적 패턴은 관찰되지 않았다.
실시예 2: CRISPR 검정은 활성화된 RNP 복합체가 존재할 때 DNA 테더가 성공적인 절단됨을 보여준다.
CRISPR 성분의 예비 검증 후, 도 2에 도시된 원리를 사용하여 PC 상에서 검정을 수행하였다. 검출 검정은 다음 성분으로 구성하였다: (i) DNA 테더를 통해 부착된 AuNP로 관능화된 PC; (ii) 활성화된 RNP 복합체: Cas 12a + 정의된 표적에 대한 가이드 RNA + 표적 유전자; (iii) 분리된 AuNP를 세척하기 위한 분자 등급수. 활성화된 RNP 복합체를 폴리디메틸실록산(PDMS) 웰에 첨가하여 PC에 부착시키고, 10분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 웰을 분자 등급수로 3회 세척하였다. 활성화된 RNP 복합체의 첨가 전 및 물로 세척한 후의 AuNP 이미지를 휴대용 PRAM을 사용하여 포획하였다. SARS-CoV-2 게놈의 두 절편 모두에 대해, 활성화된 RNP 복합체를 첨가한 후 AuNP 계수의 감소가 관찰되었다. 이러한 현상은, 활성화된 RNP 복합체가 존재할 때, PC 표면 상에서 AuNP를 연결하는 DNA 테더의 성공적인 절단으로 인한 것이었다. 표적 N 유전자 및 표적 E 유전자에 대한 AuNP 계수 결과의 변화는 도 4a 및 도 4b에 각각 도시되어 있다.
활성화된 RNP 복합체의 절단 활성을 활성화되지 않은 복합체의 절단 활성과 비교함으로써 검정의 특이성을 시험하였다. 활성화된 복합체는 표적 유전자로 구성되었지만, (도 5a, 5b에서 대조군으로서 표시된) 활성화되지 않은 복합체에는 표적 유전자가 없었다. 도 5a에서 관찰된 바와 같이, SARS-CoV-2 게놈의 두 절편 모두에 대해, 불활성화된 CRISPR 복합체를 PC 상에 첨가하기 전과 후에 AuNP 계수에 있어서 유의한 변화가 없었다. 도 5b에 도시된 차트는, 활성화된 RNP 복합체가 존재할 때, 약 95%의 AuNP가 제거되었지만, 대조군 샘플에 표적 유전자가 없을 때, AuNP의 약 12%의 변화가 관찰되었음을 보여준다.
실시예 3: Cas12a 테더 절단에 의해 방출된 나노입자의 포획.
RNP 복합체의 표적 활성화로 포획-기반 검정을 시작하고, 이어서 농도가 알려지지 않은 표적 유전자와 150 μL의 RNP 복합체가 담긴 별도의 1.5 mL 튜브 내부의 개별 3x4 mm PC에서 발견된 ssDNA 테더링된 AuNP를 37℃에서 1시간 동안 절단하였다. 인큐베이션 후, 150 μL의 RNP 복합체, 유전자 단편, 및 방출된 AuNP의 용액을, 비오틴화된 PEG로 관능화된 포획 PC 표면가 담긴 200 μL 부피 용량의 8x8 mm 원형 웰 내로 옮겼다. 150 uL 용액에 현탁된 AuNP를 포획 PC가 담긴 웰에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 이를 용액으로부터 제거하고, 50X 대물렌즈를 사용하여 휴대용 PRAM 상에서 이미징하였다. 표적 유전자 단편을 함유하지 않는 RNP 복합체와 함께 인큐베이션한 음성 대조군 PC를 이미징하여 비특이적 절단(배경 신호)과 관련된 AuNP 계수를 결정하였다. RNP 복합체 및 유전자 단편(EGFRWT(대조군) 또는 EGFRL858R(돌연변이체))을 함유하는 샘플과 함께 인큐베이션한 각각의 포획 PC를 이미징하여 AuNP 계수를 수득하였다. 음성 대조군 PC를 이미징하여 측정된 평균 배경 신호를 차감한 후, 농도(mol/L) 및 서열 동일성(EGFRWT 또는 EGFRL858R) 각각에 대한 절대 AuNP 계수를 각 PC 별로 수득하였다. 그런 다음, 각각의 AuNP 계수를 사용하여 각 유전자 단편(대조군 및 돌연변이체)에 대한 투여량 반응 곡선을 작제하였다. 대조군 샘플에 대해서는 투여량 반응이 관찰되지 않았지만, 돌연변이체 유전자 단편의 경우, 1 zM 내지 1 fM의 농도 범위에 걸쳐 선형 투여량 반응이 달성되었다(도 7~9).
결론
본 개시는 PRAM PC 기반 바이오센싱 플랫폼 상에서 SARS-CoV-2 게놈의 다양한 절편을 성공적으로 및 신속하게 검출하였음을 입증한다. CRISPR 검정 성분의 유연한 특성은, 감염성 질환 및 감염원 뿐만 아니라 인간의 건강에 영향을 미치는 인간 암과 같은 병리학적 병태를 검출하기 위한 본원에 기술된 시스템, 검정, 및 방법의 사용을 강조한다.
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Claims (66)
- 샘플에서 핵산을 검출하기 위한 시스템으로서,
뉴클레오티드 테더에 의해 소스 기판의 표면에 결합된 스트렙트아비딘 결합 나노입자를 갖는 소스 기판;
가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소를 포함하는 검정 배지로서, 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소는 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 샘플에 노출될 때 CRISPR/Cas 복합체를 형성할 수 있는, 검정 배지;
비오틴화된 바이오센서;
및 이미징 플랫폼을 포함하되,
상기 가이드 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소에 결합하여 CRISPR/Cas 복합체를 형성하고;
상기 Cas 효소는 뉴클레오티드 테더를 절단하여 스트렙트아미딘 결합 나노입자를 방출시키도록 구성되고;
상기 스트렙트아비딘 결합 나노입자는 비오틴화된 바이오센서에 결합하며;
상기 이미징 플랫폼은 상기 비오틴화 바이오센서에 결합된 스트렙트아비딘 결합 나노입자의 수를 정량화하도록 구성되는, 시스템. - 제1항에 있어서, 상기 기판 소스는 생물학적으로 불활성인 고형 물질인, 시스템.
- 제2항에 있어서, 상기 불활성 고형 물질은 유리(산화규소)인, 시스템.
- 제2항에 있어서, 상기 불활성 고형 물질은 폴리에스테르, 폴리스티렌, 또는 아크릴 중 하나 이상으로 이루어진 플라스틱인, 시스템.
- 제2항에 있어서, 상기 불활성 고형 물질은 금 또는 은인, 시스템.
- 제2항에 있어서, 상기 불활성 고형 물질은 질화규소 또는 산화티타늄인, 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 Cas는 Cas 9, Cas12a, Cas12b, 또는 Cas13인, 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 표적 뉴클레오티드 서열은 SARS-CoV2를 나타내는, 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 표적 뉴클레오티드 서열은 암을 나타내는, 시스템.
- 제9항에 있어서, 상기 암은 고형 종양인, 시스템.
- 제10항에 있어서, 상기 암은 혈액성 암인, 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 바이오센서는 광결정을 포함하고, 상기 이미징 플랫폼은 상기 광결정의 공명을 여기시키도록 구성된 광원, 및 상기 광결정으로부터 반사된 광을 검출하도록 구성된 검출기를 포함하는, 시스템.
- 제12항에 있어서, 상기 이미징 플랫폼은 상기 광결정 전체에 걸쳐 픽셀 단위로 측정된 공진 피크 강도 값을 정량화하도록 구성되는, 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 이미징 플랫폼은 비-이미징 검출 기기를 포함하는, 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 바이오센서는 위스퍼링 갤러리 모드(whispering gallery mode) 바이오센서인, 시스템.
- 제15항에 있어서, 상기 위스퍼링 갤러리 바이오센서는 링 공진기, 마이크로토로이드(microtoroid), 또는 마이크로스피어(microsphere)인, 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 바이오센서는 광이 측방향으로 이동하는 도파관 구조를 포함하는, 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 바이오센서는 음향 바이오센서인, 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 바이오센서는 광음향 바이오센서인, 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 바이오센서는 표면 플라스몬 공명 바이오센서인, 시스템.
- 생물학적 검정으로서,
소스 기판;
비오틴화된 바이오센서;
가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소,
스트렙트아비딘 결합 나노입자 집단을 포함하는 검정 배지; 및
복수의 뉴클레오티드 테더를 포함하되,
상기 스트렙트아비딘 결합 나노입자는 상기 복수의 뉴클레오티드 테더를 사용하여 상기 바이오센서에 결합되고, 상기 뉴클레오티드 테더는 핵산 서열로 구성되는, 생물학적 검정. - 제21항에 있어서, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인, 검출을 위한 뉴클레오티드 표적 서열을 함유하는 샘플이 상기 검정에 첨가되고, 이는 활성화된 CRISPR/Cas 복합체를 형성할 수 있는, 생물학적 검정.
- 제21항에 있어서, 상기 Cas 효소는 Cas9이고, 검출을 위한 상기 뉴클레오티드 표적 서열은 메신저 RNA(mRNA)인, 생물학적 검정.
- 제21항에 있어서, 상기 Cas 효소는 Cas 13이고, 검출을 위한 상기 뉴클레오티드 표적 서열은 마이크로RNA(miRNA)인, 생물학적 검정.
- 제21항에 있어서, 상기 Cas 효소는 Cas 12이고, 검출을 위한 상기 뉴클레오티드 표적 서열은 이중 가닥 DNA(dsDNA)인, 생물학적 검정.
- 제21항에 있어서, 상기 나노입자는 금 나노입자, 양자 도트, 금속계 나노입자, 자성 나노입자, 자성-플라즈몬 나노입자, 인광 나노입자, 또는 SiO2 또는 TiO2와 같은 유전체 물질로 이루어진 나노입자인, 생물학적 검정.
- 제21항에 있어서, 상기 바이오센서는 광결정을 포함하고, 상기 광결정 전체에 걸쳐 픽셀 단위로 측정된 공진 피크 강도 값을 정량화하도록 구성된 이미징 플랫폼을 추가로 포함하는, 생물학적 검정.
- 제21항에 있어서, 상기 바이오센서는 비-이미징 검출 기기를 포함하는, 생물학적 검정.
- 제21항에 있어서, 상기 바이오센서는 위스퍼링 갤러리 모드 바이오센서인, 생물학적 검정.
- 제29항에 있어서, 상기 위스퍼링 갤러리 바이오센서는 링 공진기, 마이크로토로이드, 또는 마이크로스피어인, 생물학적 검정.
- 제21항에 있어서, 상기 바이오센서는 광이 측방향으로 이동하는 도파관 구조를 포함하는, 생물학적 검정.
- 제21항에 있어서, 상기 바이오센서는 음향 바이오센서인, 생물학적 검정.
- 제21항에 있어서, 상기 바이오센서는 광음향 바이오센서인, 생물학적 검정.
- 제21항에 있어서, 상기 바이오센서는 표면 플라스몬 공명 바이오센서인, 생물학적 검정.
- 제21항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 테더는 길이가 4 내지 100 뉴클레오티드인 뉴클레오티드 서열로 구성되는, 생물학적 검정.
- 제35항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 테더는 뉴클레오티드 길이가 균일한, 생물학적 검정.
- 제35항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 테더는 뉴클레오티드 길이가 불균일한, 생물학적 검정.
- 제21항에 있어서, 상기 CAS 효소는 Cas 9, Cas12a, 또는 Cas13a인, 생물학적 검정.
- 제21항에 있어서, 상기 생물학적 검정은 실온에서 안정한, 생물학적 검정.
- 샘플에서 핵산을 검출하기 위한 방법으로서,
스트렙트아비딘을 나노입자에 결합시켜 스트렙트아비딘 함유 나노입자을 생성하는 단계;
뉴클레오티드 테더를 사용하여 스트렙트아비딘 함유 나노입자을 소스 기판의 표면에 테더링하여 검정 표면을 생성하는 단계;
바이오센서를 비오틴으로 코팅하여 비오틴화된 바이오센서를 생성하는 단계;
시험 샘플을 검정 배지에 첨가하여 활성화된 Cas 효소를 생성하는 단계로서,
상기 검정 배지는 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소를 포함하고, 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소는 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 시험 샘플에 노출될 때 활성화된 CRISPR/Cas 복합체를 형성하는, 단계;
상기 활성화된 Cas 효소 및 검정 표면을 인큐베이션한 후 절단된 스트렙트아비딘 함유 나노입자을 포획하는 단계;
상기 절단된 스트렙트아비딘 함유 나노입자를 상기 비오틴화된 바이오센서와 함께 인큐베이션하는 단계; 및
이미징 플랫폼을 사용하여 상기 비오틴화된 바이오센서에 결합하는 스트렙트아비딘 함유 나노입자의 수를 정량화하는 단계를 포함하는, 방법. - 제40항에 있어서, 상기 Cas 효소는 Cas 9, Cas12, 또는 Cas13인, 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 비오틴화된 바이오센서에 결합된 스트렙트아비딘 함유 나노입자의 양은 질환에 대한 바이오마커인 서열을 가진 표적 RNA 또는 DNA 분자의 존재, 바이러스 병원체의 존재, 또는 박테리아 병원체의 존재를 나타내는 것인, 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 표적 뉴클레오티드 서열은 SARS-CoV2를 나타내는, 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 표적 뉴클레오티드 서열은 암을 나타내는, 방법.
- 제44항에 있어서, 상기 암은 고형 종양인, 방법.
- 제44항에 있어서, 상기 암은 혈액성 암인, 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 바이오센서는 광결정을 포함하고, 상기 이미징 플랫폼은 상기 광결정의 공명을 여기시키도록 구성된 광원, 및 상기 광결정으로부터 반사된 광을 검출하도록 구성된 검출기를 포함하는, 방법.
- 제47항에 있어서, 상기 이미징 플랫폼은 상기 광결정 전체에 걸쳐 픽셀 단위로 측정된 공진 피크 강도 값을 정량화하도록 구성되는, 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 이미징 플랫폼은 비-이미징 검출 기기를 포함하는, 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 이미징 플랫폼은 형광 현미경, TIRF 현미경, 암시야 현미경, 전자 현미경, 원자력 현미경, 반사 간섭 현미경인, 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 바이오센서는 위스퍼링 갤러리 모드 바이오센서인, 방법.
- 제51항에 있어서, 상기 위스퍼링 갤러리 바이오센서는 링 공진기, 마이크로토로이드, 또는 마이크로스피어인, 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 바이오센서는 광이 측방향으로 이동하는 도파관 구조를 포함하는, 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 바이오센서는 음향 바이오센서인, 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 바이오센서는 광음향 바이오센서인, 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 나노입자는 금 나노입자, 양자 도트, 금속계 나노입자, 자성 나노입자, 자성-플라즈몬 나노입자 태그, 또는 SiO2 또는 TiO2와 같은 유전체 물질로 이루어진 나노입자인, 방법.
- 샘플에서 핵산을 검출하기 위한 시스템으로서,
뉴클레오티드 테더에 의해 유리 부유 극미립자에 결합된 스트렙트아비딘 결합 나노입자;
가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소를 포함하는 검정 배지로서, 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소는 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 샘플에 노출될 때 CRISPR/Cas 복합체를 형성할 수 있는, 검정 배지;
비오틴화된 바이오센서;
및 이미징 플랫폼을 포함하되,
상기 가이드 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소에 결합하여 CRISPR/Cas 복합체를 형성하고;
상기 Cas 효소는 뉴클레오티드 테더를 절단하여 스트렙트아미딘 결합 나노입자를 방출시키도록 구성되고;
상기 스트렙트아비딘 결합 나노입자는 비오틴화된 바이오센서에 결합하며;
상기 이미징 플랫폼은 상기 비오틴화 바이오센서에 결합된 스트렙트아비딘 결합 나노입자의 수를 정량화하도록 구성되는, 시스템. - 생물학적 검정으로서,
스트렙트아비딘 결합 나노입자;
유리 부유 극미립자;
비오틴화된 바이오센서;
가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소,
스트렙트아비딘 결합 나노입자를 포함하는 검정 배지; 및
복수의 뉴클레오티드 테더를 포함하되,
상기 스트렙트아비딘 결합 나노입자는 복수의 뉴클레오티드 테더를 사용하여 유리 부유 극미립자에 결합되며, 상기 뉴클레오티드 테더는 핵산 서열로 구성되는, 방법. - 샘플에서 핵산을 검출하기 위한 방법으로서,
스트렙트아비딘을 나노입자에 결합시켜 스트렙트아비딘 함유 나노입자을 생성하는 단계;
뉴클레오타이드 테더를 사용하여, 스트렙트아비딘 함유 나노입자을 유리 부유 극미립자에 결합시키는 단계,
바이오센서를 비오틴으로 코팅하여 비오틴화된 바이오센서를 생성하는 단계;
시험 샘플을 검정 배지에 첨가하여 활성화된 Cas 효소를 생성하는 단계로서, 상기 검정 배지는 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소를 포함하고, 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소는 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 시험 샘플에 노출될 때 활성화된 CRISPR/Cas 복합체를 형성하는, 단계;
상기 활성화된 Cas 효소 및 유리 부유 극미립자를 인큐베이션한 후 절단된 스트렙트아비딘 함유 나노입자을 포획하는 단계;
상기 절단된 스트렙트아비딘 함유 나노입자를 상기 비오틴화된 바이오센서와 함께 인큐베이션하는 단계; 및
이미징 플랫폼을 사용하여 상기 비오틴화된 바이오센서에 결합하는 스트렙트아비딘 함유 나노입자의 수를 정량화하는 단계를 포함하는, 방법. - 샘플에서 핵산을 검출하기 위한 시스템으로서,
뉴클레오티드 테더에 의해 나노입자가 표면에 결합된 바이오센서;
가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소를 포함하는 검정 배지로서, 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소는 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 샘플에 노출될 때 CRISPR/Cas 복합체를 형성할 수 있는, 검정 배지; 및
및 이미징 플랫폼을 포함하되,
상기 가이드 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소에 결합하여 CRISPR/Cas 복합체를 형성하고;
Cas 효소는 뉴클레오티드 테더를 절단하여 나노입자를 방출시키도록 구성되고; 및
상기 이미징 플랫폼은 샘플의 첨가 전후에 상기 바이오센서에 테더링된 나노입자의 수를 정량화하도록 구성되는, 시스템. - 생물학적 검정으로서,
바이오센서;
가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소,
나노입자 집단을 포함하는 검정 배지; 및
복수의 뉴클레오티드 테더를 포함하되,
상기 나노입자는 복수의 뉴클레오티드 테더를 사용하여 상기 바이오센서 표면에 결합되고, 상기 뉴클레오티드 테더는 핵산 서열로 구성되는, 생물학적 검정. - 샘플에서 핵산을 검출하기 위한 방법으로서,
뉴클레오티드 테더를 사용하여 나노입자를 바이오센서 표면에 테더링하여 검정 표면을 생성하는 단계;
검정 배지를 상기 검정 표면에 첨가하는 단계로서, 상기 검정 배지는 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소를 포함하고, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드 서열 및 Cas 효소는 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 샘플에 노출될 때 CRISPR/Cas 복합체를 형성할 수 있는, 단계;
상기 표적 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있는 생물학적 샘플을 상기 검정에 첨가하여 CRISPR/Cas 복합체를 형성하는 단계; 및
이미징 플랫폼을 사용하여 상기 샘플의 첨가 전후에 상기 바이오센서에 테더링된 나노입자의 수를 정량화하는 단계를 포함하는, 방법. - 제62항에 있어서, 상기 테더링된 나노입자를 정량화한 후, 상기 나노입자는 상기 바이오센서 표면으로부터 제거되는, 방법.
- 62항에 있어서, 상기 나노입자는 상기 검정 완충액을 교체함으로써 상기 바이오센서 표면으로부터 제거되는, 방법.
- 제62항에 있어서, 상기 나노입자는 상기 검정 완충액을 교반함으로써, 상기 검정 완충액을 교체하지 않고도 상기 바이오센서 표면으로부터 제거되는, 방법.
- 제62항에 있어서, 상기 나노입자가 자성 나노입자인 경우, 상기 나노입자는 자기장의 인가에 의해 상기 바이오센서 표면으로부터 제거되는, 방법.
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