CN111529710B - 一种治疗子宫内膜癌的联合用药物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种靶向EZH2和DNMT3B酶活的子宫内膜癌治疗方法，该方法采用EZH2酶活抑制剂和DNMT3B酶活抑制剂联合给药。该联合干预方案可取得更加显著的子宫内膜癌细胞增殖体外抑制效果和体内肿瘤抑制效果。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种以EZH2和DNMT3B为靶点治疗子宫内膜癌的联合用药物。
背景技术
子宫内膜癌是女性生殖道恶性肿瘤之一。全球数据显示子宫内膜癌发病率已由2002年的19.8/10万增至2008年的28.7/10万。我国子宫内膜癌的发生呈现发病率增高、发病年轻化及死亡率逐年增加趋势。虽然早期诊断的子宫内膜癌可以通过手术加辅助放疗或化疗得以治愈，但仍有约15％的患者会复发进展。中晚期子宫内膜癌患者（FIGO 2009分类为Ⅱ～Ⅳ期），尤其是特殊病理类型（如浆液性腺癌、透明细胞癌）的治疗效果及预后差，手术难度大，5 年生存率仅为25%~30%。化疗已逐渐成为治疗子宫内膜癌的一种重要的综合治疗措施之一，尤其对于晚期子宫内膜癌。但新辅助化疗在治疗子宫内膜癌的临床疗效、适应人群、化疗方案、化疗后手术时机的选择等方面仍然存在很多争议。因此，进一步拓展子宫内膜癌的化疗药物种类和治疗方案有助于提高子宫内膜癌临床治疗水平，具有重要的社会效益和经济效益。
EZH2作为多梳蛋白抑制复合物2（polycomb repressive complex 2，PRC2）的核心成分，广泛参与细胞分化、维持干细胞多能性、在肿瘤发生过程中发挥重要作用，EZH2正成为肿瘤分子治疗的新靶点。敲除EZH2基因可抑制子宫内膜癌细胞增殖、迁移和侵袭。在子宫内膜癌组织中，miRNA-101的表达可以抑制EZH2的表达，从而抑制子宫内膜癌的发生发展。我们前期研究发现，在子宫内膜癌细胞中敲除EZH2后可以引起转录因子TCF3（Transcription Factor 3，又名E2A）在mRNA水平和蛋白水平均一致上调。进一步染色质免疫共沉淀（ChIP）实验证实，EZH2可直接调节TCF3的基因表达。随后体外、体内实验我们进一步证实TCF3 作为关键转录因子介导了EZH2 对细胞增殖表型的调控，该表型调控建立在TCF3 介导EZH2对p21蛋白表达调控基础之上。 目前多数研究表明 TCF3 在正常细胞和肿瘤细胞增殖中扮演负调节因子。通过TCGA 数据库检索发现：TCF3 在子宫内膜癌肿瘤组织中表达水平与患者生存时间呈负相关，即表达水平越低，患者生存预后越差。子宫内膜癌组织芯片免疫组化结果证实TCF3在子宫内膜癌的癌组织中表达显著降低。TCF3在子宫内膜癌中扮演抑癌基因的角色。
综上所述，拓展更为有效的子宫内膜癌的化疗药物种类和治疗方案是本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗子宫内膜癌的联合用药物。
本发明的另一目的在于提供一种治疗子宫内膜癌的方法，该方法包括EZH2抑制剂和DNMT3B抑制剂的联合给药。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种治疗子宫内膜癌的联合用药物，它含有相同或者不同规格的同时或者分别给药的靶向第一靶点EZH2（组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶）酶活的抑制剂和靶向第二靶点DNMT3B（DNA甲基转移酶）酶活的抑制剂。
作为一种优选技术方案，所述靶向第一靶点EZH2酶活的抑制剂和靶向第二靶点DNMT3B酶活的抑制剂的摩尔比为0.1：10~10：0.1；优选的，靶向第一靶点EZH2酶活的抑制剂和靶向第二靶点DNMT3B酶活的抑制剂摩尔比为0.1：5~5：0.1；进一步优选的，靶向第一靶点EZH2酶活的抑制剂和靶向第二靶点DNMT3B酶活的抑制剂摩尔比为0.5：5~5：0.5；更进一步优选的，靶向第一靶点EZH2酶活的抑制剂和靶向第二靶点DNMT3B酶活的抑制剂摩尔比为1：5~5：1；最优选的，靶向第一靶点EZH2酶活的抑制剂和靶向第二靶点DNMT3B酶活的抑制剂的摩尔比为1:1。
进一步优选的，所述的靶向第一靶点EZH2酶活的抑制剂为GSK126、GSK343及EPZ-6438等商业化小分子抑制剂中的至少一种；所述的靶向第二靶点DNMT3B酶活的抑制剂为Decitabine (5-Aza-2'-deoxycytidine，简称5-Aza)、Azacitidine及RG108等商业化小分子抑制剂中的至少一种。更进一步优选的，所述的靶向第一靶点EZH2酶活的抑制剂为GSK126，所述的靶向第二靶点DNMT3B酶活的抑制剂为Decitabine（以下统称为5-Aza）。
一种治疗子宫内膜癌的药物组合物，它是以靶向第一靶点EZH2酶活的抑制剂和靶向第二靶点DNMT3B酶活的抑制剂为有效成分。作为一种优选技术方案，以靶向第一靶点EZH2酶活的抑制剂和靶向第二靶点DNMT3B酶活的抑制剂为有效成分，加上药学上可接受的辅助性成分制备而成。
一种治疗子宫内膜癌的方法，采用靶向第一靶点EZH2酶活的抑制剂和靶向第二靶点DNMT3B酶活的抑制剂联合给药。
本发明技术人员的研究结果显示：TCF3的转录和翻译水平同时受到由EZH2介导的组蛋白H3K27me3修饰和DNMT3B介导的启动子DNA甲基化修饰，并且两种表观遗传修饰相互独立。该结果深刻的阐述了转录因子TCF3的精细调控机制，为以 TCF3 作为分子靶点的抗子宫内膜癌相关药物开发及临床治疗提供新的策略。
本发明的有益效果：本发明提出基于EZH2介导的组蛋白H3K27me3修饰和DNMT3B介导的DNA甲基化修饰采取的联合干预方案可取得更加显著的子宫内膜癌细胞增殖体外抑制效果和体内肿瘤抑制效果。
附图说明
图1为小分子抑制剂GSK126与5-Aza联合化学干预的协同效应观察。
其中，A：GSK126与5-Aza不同浓度组合抑制ISK细胞增殖能力色阶图；B：固定GSK126（5 μM）与梯度5-Aza（0 μM、0.1 μM、0.5 μM、5 μM、1 μM、5 μM、10 μM）联合指数曲线图；C：GSK126与5-Aza不同浓度组合抑制KLE细胞增殖能力色阶图；D：固定5-Aza（5 μM）与梯度GSK126（0 μM、0.1 μM、0.5 μM、5 μM、1 μM、5 μM、10 μM）联合指数曲线图。
图2为GSK126与5-Aza联合化学干预对子宫内膜癌细胞体外增殖影响。
其中，A：GSK126、5-Aza及GSK126与5-Aza联合干预对ISK细胞体外生长的影响；B：GSK126、5-Aza及GSK126与5-Aza联合干预对KLE细胞体外生长的影响；C：GSK126、5-Aza及GSK126与5-Aza联合干预对ISK细胞单克隆形成能力的影响；D：GSK126、5-Aza及GSK126与5-Aza联合干预对KLE细胞单克隆形成能力的影响。
图3为GSK126与5-Aza联合化学干预对子宫内膜癌细胞TCF3及p21蛋白水平影响。
其中，A：免疫印迹检测GSK126（5 μM）与5-Aza（5 μM）联合干预ISK细胞对TCF3、p21及EZH2蛋白表达水平的影响；B：免疫印迹检测GSK126（5 μM）与5-Aza（5 μM）联合干预KLE细胞对TCF3、p21及EZH2蛋白表达水平的影响。
图4为GSK126与5-Aza联合化学干预对肿瘤细胞裸鼠皮下移植瘤增殖能力影响。
其中，A：裸鼠皮下肿瘤生长曲线绘制，每隔2天测量皮下肿瘤大小一次，公式为：V= 0.52×a×b2；a为长径，b为短径；B：裸鼠体重变化曲线：每隔2天称量荷瘤老鼠体重一次；C：为小分子抑制剂GSK126及5-Aza单独或者联合作用于Ishikawa细胞异种移植瘤模型小鼠，治疗结束后处死小鼠，剥离皮下肿瘤观察并拍照记录；D：处死裸鼠后称量瘤体重量绘制柱状图，***，与对照组（Vehicle）比较，P < 0.001；###，与联合治疗组（GSK126 + 5-Aza）比较，P < 0.001。
图5为GSK126与5-Aza联合化学干预对人源组织裸鼠皮下移植瘤增殖能力影响。
其中，A：裸鼠皮下肿瘤生长曲线，每隔2天测量皮下肿瘤大小一次，公式为：V =0.52×a×b2；a为长径，b为短径；B：裸鼠体重变化曲线：每隔2天称量荷瘤老鼠体重一次；C：为小分子抑制剂GSK126及5-Aza单独或者联合作用于人源性组织（子宫内膜癌临床样本）异种移植模型小鼠，治疗结束后处死小鼠，剥离皮下肿瘤观察并拍照记录；D：处死裸鼠后瘤体重量比较分析，***，与对照组（Vehicle）比较，P < 0.001；###，与联合治疗组（GSK126 + 5-Aza）比较，P < 0.001。
图6为GSK126与5-Aza联合干预对子宫内膜癌肿瘤组织TCF3及p21蛋白水平影响。
其中，A：免疫印迹检测Ishikawa细胞异种移植瘤模型小鼠不同干预组皮下肿瘤组织中小分子抑制剂相关靶点（H3K27me3、Histone H3、EZH2、TCF3、p21）蛋白水平表达变化；B：免疫印迹检测人源性组织（子宫内膜癌临床样本）异种移植模型小鼠不同干预组皮下肿瘤组织中小分子抑制剂相关靶点（H3K27me3、Histone H3、EZH2、TCF3、p21）蛋白水平表达变化。
具体实施方式
结合实验对本发明作进一步描述：
实施例1
观察不同浓度GSK126（Selleck品牌，货号S7061）及5-Aza（Selleck品牌，货号S1200）的组合对子宫内膜癌细胞 (ISK 和KLE) 增值的影响。色截图显示GSK126与5-Aza联用比单独使用GSK126或者5-Aza能显著增强抑制细胞增殖效果（如图1A、图1C所示）。通过分析固定GSK126（5 μM）与梯度5-Aza（0 μM、0.1 μM、0.5 μM、5 μM、1 μM、5 μM、10 μM）及固定5-Aza（5 μM）与梯度GSK126（0 μM、0.1 μM、0.5 μM、5 μM、1 μM、5 μM、10 μM）的联合指数（CI）曲线图（如图1B、图1D所示），结果显示GSK126与5-Aza联用时CI值均小于0.8，证明GSK126与5-Aza联用时具有明显的协同效应。
实施例2
观察联合使用GSK126（5μM）与5-Aza（5μM）对子宫内膜癌细胞 (ISK 和KLE) 体外增殖和单细胞克隆形成能力影响。结果显示GSK126与5-Aza联用比单独使用GSK126或者5-Aza更能显著抑制细胞体增殖能力（如图2A、图2C所示）和单细胞克隆形成（如图2B、图2D所示），证明GSK126与5-Aza联用对抑制子宫内膜癌细胞增殖和单克隆形成具有协同效应。
实施例3
观察联合使用GSK126（5 μM）与5-Aza（5 μM）对子宫内膜癌细胞 (ISK 和KLE)内TCF3、p21及EZH2蛋白表达水平的影响，免疫印迹结果显示GSK126与5-Aza联用比单独使用GSK126或者5-Aza更能显著激活TCF3及下游基因p21蛋白表达水平（如图3A、图3B所示），证明GSK126与5-Aza联合干预对激活TCF3及下游基因p21蛋白表达水平具有协同效应。
实施例4
人源子宫内膜癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型构建与药物干预：使用含10%胎牛血清的1640培养基体外培养状态良好的子宫内膜癌ISK细胞，逐步扩大培养至10 cm细胞培养皿，用于裸鼠皮下种植；当获得足够数量细胞时用胰酶消化细胞，温和吹打分散细胞，收集细胞悬液，800 rpm离心5 min弃上清，然后用预冷PBS洗涤细胞两遍；无血清1640培养基重悬细胞，添加20% Matrigel基质胶，细胞计数板计数后调整细胞密度至4×107个/mL；细胞消化后0.5小时内接种到6-8周龄裸鼠皮下，用注射器将细胞悬液按每只裸鼠200 μL（即8×106个细胞）接种在BALB/c裸鼠腋窝中后部皮下；当裸鼠皮下移植瘤平均体积达50 - 100mm3时随机分为4组进行化学干预，每组6只。其中：溶媒对照组（20% SBE-β-CD）、GSK126组（100 mg/kg）、5-Aza（2.5 mg/kg）及联合治疗组（100 mg/kg GSK126 + 2.5 mg/kg 5-Aza），每隔天给药一次，持续治疗16天（植瘤后第8、10、12、14、16、18、20、22天给药，共8次给药）。每隔两天称量裸鼠体重、游标卡尺测量皮下瘤瘤体积大小绘制裸鼠皮下肿瘤生长曲线及裸鼠体重变化曲线。统计分析结果表明：单独给予100 mg/kg GSK126组肿瘤抑制率（Tumorgrowth inhibition rate，TGI）为41.3%，单独给予2.5 mg/kg 5-Aza组TGI为29.0%，联合干预组TGI为78.7%。通过计算联合指数CI值进一步分析两者联合干预是否具有协同效应。CI=TGI联合干预/（TGI 100 mg/kg GSK126 + TGI 2.5 mg/kg 5-Aza）=78.7%/（41.3%+29.0%）=1.12 > 1，结果表明100 mg/kg GSK126 与 2.5 mg/kg 5-Aza联合干预子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤具有协同杀伤肿瘤效应（如图4A）。此外，各组之间小鼠体重在各个观察时间点并无显著差异（P > 0.05）（如图4B），提示荷瘤小鼠对小分子抑制剂单独或联合治疗均耐受。给药结束后处死裸鼠，剥离肿瘤组织拍照并称重。肉眼可见100 mg/kg GSK126组、2.5 mg/kg 5-Aza组及联合干预组（GSK126 + 5-Aza）治疗结束后肿瘤体积大小变小，尤其以联合干预组体积变小最为明显（如图4C）。通过称量离体肿瘤组织重量证实100 mg/kg GSK126组（P< 0.01）、2.5 mg/kg 5-Aza组（P < 0.01）及联合干预组（GSK126 + 5-Aza）治疗结束后肿瘤体重大小显著变小，并且以联合干预组肿瘤体积最小，统计学差异显著（P < 0.001）（如图4D）。
实施例5
人子宫内膜癌组织裸鼠皮下移植瘤（PDX）模型构建与药物干预：取新鲜子宫内膜癌癌组织（女，54岁，术后病例证实为子宫底子宫内膜样癌，FIGO分期为Ⅱ级）放入预冷的含保护液的采集管中，封口放入冰包迅速转移至实验室。在超净工作台内将组织剪成大小为1cm × 1 cm × 1 cm的组织小块。经0.4%台盼蓝染料染色（染色1 min）检测组织活性，无血清基础培养基冲洗去除组织块上的多余染料，组织块活性大于50%方可进行实验。碘伏浸泡组织30 s消毒，无菌PBS冲洗多余碘伏，修剪组织去除活性不好的坏死部分，最后将组织剪成2 mm × 2 mm × 2 mm大小的组织小块并放入含有基础培养液的EP管，装入冰盒传递至动物房。在无菌条件下，准备接种BALB/c裸鼠腋窝中后部皮下。当裸鼠皮下移植瘤平均体积达50 - 100 mm3时随机分为4组进行化学干预，每组6只。其中：溶媒对照组（20% SBE-β-CD）、GSK126组（100 mg/kg）、5-Aza（2.5 mg/kg）及联合治疗组（100 mg/kg GSK126 + 2.5mg/kg 5-Aza），每隔天给药一次，持续治疗16天（植瘤后第8、10、12、14、16、18、20、22天给药，共8次给药）。每隔两天称量裸鼠体重、游标卡尺测量皮下瘤瘤体积大小绘制裸鼠皮下肿瘤生长曲线及裸鼠体重变化曲线。结果表明：单独给予100 mg/kg GSK126组TGI为45.8%，单独给予2.5 mg/kg 5-Aza组TGI为21.7%，联合干预组TGI为80.2%。联合指数CI = TGI联合干预/（TGI100 mg/kg GSK126+ TGI2.5 mg/kg 5-Aza）=80.2%/（45.8%+27.1%）= 1.19 > 1，结果表明100 mg/kg GSK126与2.5 mg/kg 5-Aza联合干预人子宫内膜PDX模型小鼠具有协同杀伤肿瘤效应（如图5A）。此外，各组之间小鼠体重在各个观察时间点并无显著差异（P >0.05）（如图5B），提示荷瘤小鼠对小分子抑制剂单独或联合治疗均耐受。给药结束后处死裸鼠，剥离肿瘤组织拍照并称重。肉眼可见100 mg/kg GSK126组、2.5 mg/kg 5-Aza组及联合干预组（GSK126 + 5-Aza）治疗结束后肿瘤体积大小变小，尤其以联合干预组体积变小最为明显（如图5C）。通过称量离体肿瘤组织重量证实100 mg/kg GSK126组（P < 0.01）、2.5 mg/kg 5-Aza组（P < 0.01）及联合干预组（GSK126 + 5-Aza）治疗结束后肿瘤体重大小显著变小，并且以联合干预组肿瘤体积最小，统计学差异显著（P < 0.001）（如图5D）。
实施例6
人源子宫内膜癌细胞或组织裸鼠皮下移植瘤模型化学干预（给药）结束后处死裸鼠，剥离肿瘤组织一部分冷冻于-80 ℃保存，解冻后使用组织匀浆仪提取肿瘤组织蛋白，每组小鼠随机抽取2个样本进行蛋白印迹检测，分析Histone H3、H3K27me3、EZH2、TCF3、p21蛋白水平在不同干预组之间表达变化。蛋白印迹检测结果表明：GSK126单独干预和联合干预均可以有效抑制裸鼠皮下肿瘤H3K27me3水平，但不影响EZH2蛋白表达水平；GSK126、5-Aza分别单独干预均可以提高裸鼠皮下肿瘤TCF3及p21蛋白表达水平；联合干预（GSK126 + 5-Aza）相比GSK126、5-Aza单独干预更明显激活TCF3及p21蛋白表达水平（如图6A、图6B）。
以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。
Claims (5)
1.一种治疗子宫内膜癌的联合用药物，其特征在于，它含有相同或者不同规格的同时或者分别给药的靶向第一靶点EZH2酶活的抑制剂和靶向第二靶点DNMT3B酶活的抑制剂；所述的靶向第一靶点EZH2酶活的抑制剂为GSK126，所述的靶向第二靶点DNMT3B酶活的抑制剂为Decitabine。
2.根据权利要求1所述的治疗子宫内膜癌的联合用药物，其特征在于，所述靶向第一靶点EZH2酶活的抑制剂和靶向第二靶点DNMT3B酶活的抑制剂的用量摩尔比为0.1：10~10：0.1。
3.一种治疗子宫内膜癌的药物组合物，其特征在于，它是以靶向第一靶点EZH2酶活的抑制剂和靶向第二靶点DNMT3B酶活的抑制剂为有效成分；所述的靶向第一靶点EZH2酶活的抑制剂为GSK126，所述的靶向第二靶点DNMT3B酶活的抑制剂为Decitabine。
4.根据权利要求3所述的治疗子宫内膜癌的药物组合物，其特征在于，所述靶向第一靶点EZH2酶活的抑制剂和靶向第二靶点DNMT3B酶活的抑制剂的用量摩尔比为0.1：10~10：0.1。
5.根据权利要求3所述的治疗子宫内膜癌的药物组合物，其特征在于，以靶向第一靶点EZH2酶活的抑制剂和靶向第二靶点DNMT3B酶活的抑制剂为有效成分，加上药学上可接受的辅助性成分制备而成。
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| Identification of co-existence of DNA methylation and H3K27me3 specifically in cancer cells as a promising target for epigenetic therapy;Hideyuki Takeshima等;《Carcinogenesis》;20141204;第36卷(第2期);第192–201页 * |
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