CN111518823B - 一种钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-1的制备方法和应用 - Google Patents

一种钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-1的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3‑1的制备方法和应用，属于分子生物学和免疫学技术领域。本发明通过PCR扩增含有超家族结构域480 bp LA_0697（601～1080），T‑A克隆、亚克隆建立原核表达系统，IPTG诱导表达、Ni‑NTA亲和层析纯化获得重组蛋白rvWFA3‑1，并试验证明了rvWFA3‑1在疫苗研发、钩端螺旋体感染抗体检测试剂盒研发。通过本发明方法可获得钩端螺旋体黏附重组蛋白rvWFA3‑1，印证了该重组蛋白rvWFA3‑1黏附特征，对致病问号钩端螺旋体菌株攻击有保护作用、产生高效价保护性抗体且产生的抗体具有交叉保护作用。

Description

一种钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-1的制备方法和应用
技术领域
本发明属于分子生物学和免疫学技术领域，具体涉及一种钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-1的制备方法和应用。
背景技术
侵袭力决定了微生物能否感染宿主，感染则是发病的先决条件，故侵袭力成为近年病原微生物致病机制的研究重点。众所周知，侵袭力的主要物质基础是侵袭性酶类，黏附是病原微生物致病的第一步，其本质是病原微生物黏附因子配体与宿主细胞受体结合的过程，使得病原微生物能在宿主体内定植，然后生长繁殖引起疾病。
接种疫苗是预防和控制传染病最为有效和经济的手段。基因工程疫苗因生产成本低、效果好而成为疫苗研究的重要方向。钩端螺旋体外膜蛋白被证明具有属特异性的抗原，我们在前期研究中也证明外膜蛋白质LipL21、LipL32和 LipL41等及其表位抗原具有一定的免疫保护性，可以作为疫苗候选抗原，但仍未得到满意的免疫效果。位于外膜的黏附因子，不仅与细菌的侵袭作用密切相关，同时还可诱导机体产生具有免疫保护作用的血清抗体。
血友病因子(von Willebrand factor，vWF)是人及哺乳动物血管内皮细胞及巨核细胞合成并分泌的一种糖蛋白，可与血小板膜糖蛋白GpIb和GpIIb-Ⅲa结合，引发血小板黏附和聚集。vWF是重要凝血因子，有12个功能区，其中A3区与血管损伤后暴露的基底膜胶原蛋白(collagen，COL)结合使血小板局部聚集，推测可能与黏附功能相关。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-1的制备方法和应用。本发明通过生物信息学分析A3区的LA_0697基因产物为无信号肽和跨膜区的胞外蛋白，213-347位氨基酸组成肽段为LA_0697基因产物vWFA3-1具有vWFA3超家族结构域，但无血小板GP-Ib 受体结合位点，我们推测vWFA3-1在问号钩体感染过程中发挥黏附因子作用。 PCR扩增含有超家族结构域480bp LA_0697(601～1080)片段，T-A克隆、亚克隆建立原核表达系统，IPTG诱导表达、Ni-NTA亲和层析纯化获得重组蛋白rvWFA3-1，并试验证明了rvWFA3-1的功能及应用。
一种钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-1的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)根据问号钩端螺旋体赖株LA_0697基因限制性核酸内切酶图谱分析、信号肽预测结果以及T-A克隆、亚克隆载体多克隆位点，设计含核酸内切酶Nde I或Xho I酶切位点的PCR引物，备用；
(2)提取问号钩端螺旋体赖株DNA；
(3)采用步骤(1)得到的PCR引物和步骤(2)得到的问号钩端螺旋体赖株DNA，扩增LA_0697基因中von Willebrand凝血因子A3区超家族结构域片段，得到扩增片段，以溴乙锭预染色的1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段后，采用T-A克隆试剂盒将上述目的基因扩增片段与pMD19-T连接，连接过夜后采用氯化钙法将其转化入E.coli DH5α形成E.coli DH5αpMD19-T0697，蓝白筛选后提取重组质粒pMD19-T0697测序。
(4)将步骤(3)得到的序列正确的重组质粒pMD19-T0697与表达载体pET42a 用限制性核酸内切酶Nde I和Xho I酶切后回收，T4DNA连接酶连接形成目的基因重组原核表达质粒pET42a0697；
(5)采用氯化钙法将步骤(4)得到的pET42a0697转化入感受态E.coli BL21DE3中，形成E.coli BL21DE3pET42a-0697工程菌株，接种于50μg/mL卡那霉素LB琼脂平板上分离培养，0.5mmol/L的IPTG诱导，获得目的重组蛋白 rvWFA3-1，采用Ni-NTA亲和层析柱提纯rvWFA3-1。
所述的一种钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-1的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中PCR引物中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
所述的一种钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-1的制备方法，其特征在于所述步骤(2)的具体方法为：将问号钩端螺旋体赖株培养物以转速12000r/min温度4℃离心15min，得到沉淀，用0.01mol/L、pH7.2灭菌PBS洗涤后按上述方法离心，重复2次，得到问号钩端螺旋体沉淀，用细菌基因组DNA制备试剂盒提取DNA。
所述的一种钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-1的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中扩增方法为：采用EX-Taq高保真PCR试剂盒进行扩增，PCR参数为 94°С5min，94°С30s，50°С30s，72°С90s，30个循环，72°С7min。
所述的一种钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-1的制备方法，其特征在于所述步骤(5)中分离培养和IPTG诱导条件为：以转速220r/min、37°С震荡培养，至 A600值为0.6～0.8时加入0.5mmol/L的IPTG，以上述条件继续培养6h，诱导目的重组蛋白rvWFA3-1表达。
钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-1在制备治疗问号钩端螺旋体感染疫苗中的应用。
钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-1在制备钩端螺旋体感染抗体检测试剂盒中的应用。
本发明具有的有益效果：本发明通过基因工程构建480bp LA_0697(601～ 1080)基因无跨膜区的胞外片段重组表达系统，IPTG诱导、Ni-NTA亲和层析法提纯获得重组蛋白rvWFA3-1。该黏附因子重组蛋白rvWFA3-1对致病问号钩端螺旋体菌株攻击有保护作用，且能产生高效价保护性抗体且产生的抗体具有交叉保护作用，可用于疫苗研发、钩端螺旋体感染抗体检测试剂盒研发。
附图说明
图1为LA_0697基因产物生物学信息分析结果图；
图2为rvWFA3-1与hCOL1/3/4/6结合ELISA检测结果图；
图3为rvWFA3-1与hCOL3/6结合SPR检测结果图；
图4为问号钩端螺旋体赖株感染细胞时Lep0697-mRNA水平升高图；
图5为问号钩端螺旋体赖株感染细胞时Lep0697表达增强图。
具体实施方式
以下将通过具体实施例和附图对本发明做进一步描述。实施例通过基因工程手段构建了vWFA3-1蛋白编码基因的原核表达系统，诱导纯化获得了重组蛋白rvWFA3-1，并作了进一步的应用研究。
实施例：
一、材料
1、菌株来源及培养
黄疸出血群赖型赖株、流感伤寒群流感伤寒型临6株、秋季群秋季型临4株、波摩那群波摩那型罗株、澳洲群澳洲型65-9株、七日热群七日热型56069株、犬群犬型林株、塞罗群乌尔夫型L183株和爪哇群爪哇型M10株均由浙江大学病原生物系保存，菌株复苏并EMJH培养基28℃传代保存。E.coli BL21DE3和E.coli DH5α(Novagen)采用LB培养基37℃传代培养。
2、细胞株来源及培养
人脐静脉血管内皮细胞株(HUVEC)和小鼠血管内皮瘤细胞株(EOMA) 购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库，分别采用含10％胎牛血清(FCS) (GiBco)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(Sigma)RPMI-1640培养基和DMEM高糖培养基(GiBco)5％CO2、37℃传代培养。
3、rLep–MauG、血清标本和酶标抗体来源
问号钩端螺旋体重组细胞色素C过氧化酶(rLep-MauG)由浙江大学病原生物系制备。兔抗钩端螺旋体全菌血清购自中国药品生物制品检定所。HRP标记羊抗人IgG和HRP标记羊抗人IgM购自Jackson ImmunoResearch公司。
二、方法与结果
1、生物信息学分析
采用TMHMM-2.0、SignalP-4.1和NCBI-Batch CD-Search NCBI软件分析问号钩端螺旋体赖株LA_0697基因(GenBank accession No.:NC_004342.2)产物跨膜区、信号肽和功能结构域。
生物信息学分析结果：LA_0697基因产物为无信号肽和跨膜区的胞外蛋白，含有超家族结构域和金属离子依赖性黏附位点(metal ion-dependent adhesion sites，MIDAS)，如图1。
2、PCR及其产物测序
根据GenBank中问号钩端螺旋体赖株LA_0697基因限制性核酸内切酶图谱分析、信号肽预测结果以及T-A克隆、亚克隆载体pET42a(Novagen)多克隆位点，设计含核酸内切酶Nde I或Xho I酶切位点的PCR引物，用于扩增480bp LA_0697(601～1080)基因超家族结构域片段。引物由上海Invitrogen公司合成。LA_0697基因上游引物：5’-CGC CAT ATG(Nde I)CAT TCC AGA ACT CAT CGT TCT ATG-3’，如SEQ ID NO.1所示，下游引物：5’-CGC CTC GAG(Xho I) CAT CGC GGC TAT TTC TGC TCC TAC-3’，如SEQ ID NO.2所示。黄疸出血群赖型赖株LA_0697(601～1080)基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。问号钩端螺旋体赖株培养物12000r/min 4℃离心15min，问号钩端螺旋体沉淀用0.01mol/L灭菌PBS(pH7.2)洗涤后按上法离心，重复2次，问号钩端螺旋体沉淀用细菌基因组DNA制备试剂盒(Axygen)提取DNA。
采用EX-Taq高保真PCR试剂盒(TaKaRa)扩增LA_0697基因中von Willebrand凝血因子A3区超家族结构域片段。PCR参数：94°С5min；94°С30 s，50°С30s，72°С90s，30个循环；72°С7min。采用溴乙锭预染色的1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，采用T-A克隆试剂盒(TaKaRa)分别将目的基因扩增片段与pMD19-T连接，连接过夜后采用氯化钙法将其转化入E.coli DH5α形成E.coli DH5αpMD19-T0697，蓝白筛选后采用细菌质粒制备试剂盒(Axygen)提取T-A克隆pMD19-T0697质粒委托上海Invitrogen公司测序。
3、原核表达系统构建与鉴定：提取序列正确的T-A克隆质粒pMD19-T0697和原核表达载体pET42a用限制性核酸内切酶Nde I和Xho I(TaKaRa)酶切后回收，在T4DNA连接酶(TaKaRa)作用下连接形成重组原核表达载体 pET42a0697，连接物转化入感受态E.coliBL21DE3中形成E.coli BL21DE3pET42a-0697工程菌株，然后接种于50μg/mL卡那霉素(Sigma)LB琼脂平板上分离培养。挑取单个菌落在50μg/mL卡那霉素LB培养液中增菌，按上法提取pET42a0697再次委托上海Invitrogen公司测序。
T-A克隆、亚克隆结果：LA_0697基因片段PCR扩增产物T-A克隆、亚克隆工程菌提取质粒测序结果与预期完全一致。
4、目的重组蛋白表达及提纯
E.coli BL21DE3pET42a-0697接种于50μg/mL卡那霉素LB培养液中220r/min、 37℃震荡培养，至A600值为0.6～0.8时加入0.5mmol/L的IPTG(Sigma)，按上法继续培养6h，诱导目的重组蛋白rvWFA3-1表达。采用Ni-NTA亲和层析柱(BioColor)提纯rvWFA3-1，15％分离胶SDS-PAGE检测其纯度，BCA蛋白定量试剂盒(Thermo Scientific)测定蛋白浓度。
重组合成蛋白的表达及纯化结果：用终浓度0.5mmoL/L的IPTG诱导 E.coliBL21DE3pET42a-0697后能有效表达rvWFA3-1。菌体超声波破碎后上清与沉淀、Ni-NTA纯化超声波破碎的菌体SDS-PAGE显示上清中有约18.4kDa大小的特异性条带，为包涵体，与重组蛋白预期的分子质量相符。
vWFA3-1蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
5、rvWFA3-1复性
采用Refolding-CA试剂盒(TaKaRa)将提纯的rvWFA3-1复性，BCA蛋白定量试剂盒(Thermo Scientific)测定蛋白浓度。
6、rvWFA–IgG制备和效价测定
1mg rvWFA3-1与弗氏佐剂充分混匀后多点皮内注射于家兔背部4次，每次间隔一周。末次免疫后第15d采心血分离血清。采用饱和硫酸铵沉淀和DEAE-52 (Sigma)离子交换层析法提取血清IgG，免疫双扩散法检测rvWFA-1-IgG效价。
rvWFA–IgG效价结果：rvWFA-1-IgG效价为1:4，提示rvWFA3-1有良好的抗原性。
7、ELISA检测
人I、III、IV、VI型胶原蛋白(hCOL1/3/4/6，Sigma)溶于0.5mol/L乙酸- 生理盐水后4℃包被聚苯乙烯96孔板(Costar)过夜，每孔2μg蛋白。0.05％ Tween20-PBS洗板5次，然后用3％FCS-PBS 4℃封闭过夜。按上法洗板后加入 100μL rvWFA3-1，37℃孵育1h后洗板。以1:200稀释的rvWFA3-1-IgG为一抗， 1:5000稀释的辣根过氧化酶(HRP)标记羊抗兔IgG(Abcam)为二抗，37℃孵育2h后洗板，每孔加入TMB显色液100μL(Abcam)，室温避光显色1h，每孔加入100μL终止液，采用M5型多功能酶标仪(Molecular Devices，USA)检测450nm吸光值(OD450)。实验中设置不加抗体的空白对照和加等量问号钩端螺旋体重组细胞色素C过氧化酶(rLep-MauG)的阴性对照。
ELISA检测结果：rvWFA3-1与hCOL3/6呈强结合，但与hCOL1/4结合能力微弱，如图2。
8、表面等离子共振(SPR)检测
hCOL1/3/4/6溶于10mmol/L乙酸钠(pH4.5)配制成100μg/mL蛋白溶液，采用氨基偶联法将其固定于CM5芯片上。rvWFA3-1溶于流动相缓冲液(10 mmol/L HEPES、150mmol/LNaCl、3mmol/L EDTA、0.05％P20，pH7.4)使其终浓度分别为4、8、16、32或64nmol/L。采用t200型BiaCore仪(GE)检测不同浓度rvWFA3-1流经hCOL1/3/4/6结合的CM5芯片时的结合情况，获得的数据用Evaluation-3.0软件进行kinetics拟合分析，采用平衡结合常数(KD)反映不同蛋白之间结合情况。实验中设置不加问号钩端螺旋体重组蛋白的空白对照。
SPR检测结果：rvWFA3-1快速结合hCOL3/6但快速解离，其KD值分别为 5.71×10-8和5.89×10-8M快速结合(图3)。KD大小在10-6～10-7间呈中等强度结合。
9、实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)
采用Primer Premier 5.0软件设计LA_0697基因实时荧光定量RT-PCR (qRT-PCR)引物，LA_0697上游引物：5’-CTC CTC CCT TCA AAC TCA TT-3’，下游引物：5’-CTG CCA TTTCCT TGT CAT AG-3’。EMJH培养基中的问号钩端螺旋体按上法离心和PBS洗涤，然后用Petroff-Hausser计数板在暗视野显微镜下计数。6孔细胞培养板每孔接种105HUVEC或EOMA细胞，2.5％FCS RPMI-1640或DMEM培养液中37℃预培养12h。按问号钩端螺旋体:细胞＝100:1 比例分别感染HUVEC和EOMA细胞1、2、4、8、12或24h，0.25％胰酶消化后1000r/min 4℃离心15min，去除细胞沉淀，上清12000r/min 4℃离心15min 获得胞外问号钩端螺旋体沉淀。采用TRIzol细菌RNA制备试剂盒(TaKaRa) 提取问号钩端螺旋体总RNA，gDNA清除试剂盒(TaKaRa)去除残留的DNA，紫外分光光度法测定RNA浓度。以1μg总RNA为模板，用PrimeScriptTM试剂盒(TaKaRa)将其逆转录为cDNA，然后用
Figure BDA0002465472700000091
Premix Ex-TaqTM荧光定量 PCR试剂盒和实时荧光定量RT-PCR仪(API，USA)检测LA_0697基因mRNA 水平，反应参数：95℃30s；95℃5s、60℃30s，40个循环。实验中以问号钩端螺旋体赖株16S rRNA基因为内参，上游引物：5’-CTT TCG TGC CTC AGC GTC AGT-3’，下游引物：5’-CGC AGC CTG CAC TTGAAA CTA-3’。实验中设置等量未感染或RPMI-1640或DMEM培养基中孵育相同时间的问号钩端螺旋体为对照，qRT-PCR数据用ΔΔCt数学模式和REST-2005软件分析。
qRT-PCR结果：问号钩端螺旋体赖株感染HUVEC和EOMA细胞后， Lep0697-mRNA水平迅速显著升高(P<0.05)，不同细胞培养基对其转录水平无影响，如图4，其中*：与感染前Lep0697-mRNA水平比较P<0.05，推测vWFA3-1 在钩端螺旋体感染中发挥黏附因子作用。
10、Western Blot检测
按上法用问号钩端螺旋体赖株感染HUVEC或EOMA细胞1、2、4、8、12 或24h后离心沉淀胞外问号钩端螺旋体。问号钩端螺旋体沉淀悬于灭菌双蒸水中，冰浴中超声破碎后12000r/min 4℃离心15min，取上清用终浓度为10％ (W/V)三氯乙酸(TCA)(Sigma)冰浴60min沉淀蛋白，预冷丙酮洗涤蛋白两次以去除TCA。蛋白沉淀溶于灭菌双蒸水中，采用BCA法测定蛋白浓度。以 1:200稀释的兔抗rvWFA3-1-IgG为一抗、1:3000稀释的辣根过氧化物酶(HRP) 标记羊抗兔IgG(Abcam)为二抗，采用Western Blot法检测样本中基因表达产物，采用Bio-Rad凝胶成像系统观察阳性杂交条带。
Western Blot检测结果：问号钩端螺旋体赖株感染HUVEC和EOMA细胞后， WesternBlot检测结果与qRT-PCR相似vWFA3-1-mRNA水平迅速显著升高(p<0.05)，不同细胞培养基对其转录水平无影响，如图5。
11、重组蛋白rvWFA3-1的免疫活性分析
分别以1：1000稀释的兔抗钩端螺旋体全菌血清和rvWFA3-1抗血清为一抗， 1：5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗进行Western blot分析。用1mg/ml的纯化重组蛋白rvWFA3-1包被96孔板，37℃静置1h，然后4℃以6％的小牛血清封闭过夜。
rvWFA3-1的免疫活性检测结果：分别以兔抗钩端螺旋体全菌血清和兔抗 -rvWFA3-1血清为一抗Western-blot结果显示，重组蛋白对应位置出现杂交条带，提示大肠杆菌表达的重组蛋白具有免疫活性。
12、最低致死量测定(MLD)
问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株、流感伤寒群流感伤寒型临6株和波摩那群波摩那型罗株对金地100％最低致死量测定。①上述菌株腹腔内接种金地鼠，感染2-3天后采集心血分离各问号钩端螺旋体，在含8％的兔血清，以达到问号钩端螺旋体增强毒力的效果；②新鲜培养的黄疸出血群赖型赖株、流感伤寒群流感伤寒型临6株和波摩那群波摩那型罗株12000r/min离心15min(4℃)，沉淀的钩端螺旋体用不同体积的EMJH培养液重悬，Petroff-Hausser counting chamber计数，配制成不同浓度钩端螺旋体悬液；③将30只金地鼠分为5组，每组6只，其中4组分别腹腔注射107、108、109或1010问号钩端螺旋体赖株悬液1ml，另一组注射等体积EMJH培养液作为对照，常规饲养条件下观察7天；④以观察期内所有金地鼠均死亡的最低问号钩端螺旋体浓度为该血清群问号钩端螺旋100％最低致死量(MLD)。上述实验动物饲养温度21±2℃，相对湿度 30％-7％，光照周期14/10h。
MLD结果：问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株、流感伤寒群流感伤寒型临6株和波摩那群波摩那型罗株对金地100％MLD分别为1.5×108、3.0×109、1.5×109。
13、rvWFA3-1疫苗免疫保护试验
200μg的rvWFA3-1与1mg氢氧化铝佐剂混合成rvWFA3-1疫苗，200μg BSA (Sigma)与1mg氢氧化铝为阴性对照混合物，vWFA3-1与氢氧化铝佐剂混合乳化为rvWFA3-1疫苗。用4周龄雄性金地鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)分成6组，每组15只。检测rvWFA3-1疫苗免疫对我国主要流行的致病性问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株、流感伤寒群流感伤寒型临6株和波摩那群波摩那型罗株保护效果。①第1-3组于一侧腹股沟皮下注射rvWFA3-1疫苗0.1ml，第4-6组于一侧腹股沟皮下注射阴性对照混合物0.1ml；②2周后在腹股沟另一侧重复上述免疫；③末次免疫后4周，第1和第4组用2倍MLD的问号钩端螺旋体赖株(3.0×108)悬液1ml，第2和第5组用2倍MLD的流感伤寒群流感伤寒型临6株 (6.0×109)悬液1ml，第3和6组用2倍MLD的波摩那群波摩那型罗株(3.0×109) 悬液1ml；④上述金地鼠常规饲养条件下观察7天，记录各组死亡情况。上述实验动物饲养温度21±2℃，相对湿度30％-7％，光照周期14/10h。
rvWFA3-1疫苗免疫保护效果：rvWFA3-1疫苗金地鼠免疫保护试验结果见表1。rvWFA3-1疫苗免疫金地鼠被2倍MLD的黄疸出血群赖型赖株、流感伤寒群流感伤寒型临6株和波摩那群波摩那型罗株攻击后存活率分别为73.33％、80.00％和 66.67％，对照组没有rvWFA3-1疫苗免疫金地鼠黄疸出血群赖型赖株、流感伤寒群流感伤寒型临6株和波摩那群波摩那型罗株2倍MLD攻击后存活率分别为 6.67％、0和6.67％。rvWFA3-1疫苗免疫金地鼠被致病问号钩端螺旋体攻击后存活率明显高于阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，提示rvWFA3-1疫苗对金地鼠有免疫保护作用。
表1 rvWFA3-1疫苗免疫金地鼠免疫保护试验结果
Figure BDA0002465472700000111
Figure BDA0002465472700000121
14、显微凝集试验(MAT)
采集上述动物保护试验中存活的rvWFA3-1疫苗免疫金地鼠心脏采血分离血清。血清用PBS进行1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600稀释，分别取0.1ml 与等量新鲜培养的9群9型致病性钩端螺旋体(钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株、流感伤寒群流感伤寒型临6株、秋季群秋季型临4株、波摩那群波摩那型罗株、澳洲群澳洲型65-9株、七日热群七日热型56069株、犬群犬型林株、塞罗群乌尔夫型L183株)混合，37℃孵育1h，然后在暗视野显微镜下观察，以50％钩端螺旋体被凝集的血清最高稀释度作为效价判断终点。实验中用正常金地鼠血清作为对照。
MAT结果：结果见表2。获得免疫存活的金地鼠血清抗体能与9群9型问号钩端螺旋体菌株凝集，MAT血清抗体效价为1:50-1:400，提示rvWFA3-1免疫能产生效价保护性抗体且具有交叉保护作用。
表2 rvWFA3-1疫苗免疫金地鼠血清MAT检测结果
Figure BDA0002465472700000122
Figure BDA0002465472700000131
LA_0697(601～1080)基因片段扩增引物
上游引物：5’-CGCCATATG(Nde I)CATTCCAGAACTCATCGTTCTATG-3’，
下游引物：5’-CGCCTCGAG(Xho I)CATCGCGGCTATTTCTGCTCCTAC-3’。
黄疸出血群赖型赖株LA_0697(601～1080)基因片段核苷酸序列(1)…(480)，
vWFA3-1蛋白氨基酸序列(1)…(160)
(1)
Figure BDA0002465472700000132
(1)
Figure BDA0002465472700000133
(49)
Figure BDA0002465472700000134
(17)
Figure BDA0002465472700000135
(97)
Figure BDA0002465472700000136
(33)
Figure BDA0002465472700000137
(145)
Figure BDA0002465472700000138
(48)
Figure BDA0002465472700000139
(193)
Figure BDA00024654727000001310
(65)
Figure BDA00024654727000001311
(241)
Figure BDA0002465472700000143
(81)
Figure BDA0002465472700000144
(289)
Figure BDA0002465472700000145
(97)
Figure BDA0002465472700000146
(337)
Figure BDA0002465472700000147
(113)
Figure BDA0002465472700000148
(385)
Figure BDA0002465472700000149
(129)
Figure BDA00024654727000001410
(433)
Figure BDA0002465472700000141
(145)
Figure BDA0002465472700000142
注：□内为引物序列；下划线为LA_0697基因超家族结构域序列。
序列表
<110> 杭州医学院
<120> 一种钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-1的制备方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 上游引物(forward primer)
<400> 1
cgccatatgc attccagaac tcatcgttct atg 33
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 下游引物(downstream primer)
<400> 2
cgcctcgagc atcgcggcta tttctgctcc tac 33
<210> 3
<211> 480
<212> DNA
<213> rvWFA3-1核苷酸序列(rvWFA3-1 nucleotide sequence)
<400> 3
cattccagaa ctcatcgttc tatggcagaa cgttggcatt tgatcatttt agtggatcaa 60
tccggaagta tgttagacag tgtcatccat tctgcggtta cagcttctat cttttgggga 120
attaaatcga ttaaaaccag tttgatttta tttgataccg aaatcgtgga cgttaccgac 180
cattgttctg atccagtaga aactctcatg aaagtgcagt taggtggtgg tacagatatt 240
ggctcggcgc tattatacgc agaaggaaaa gttgaaaatc cgcgcagaac cataattata 300
ttgattagcg atttttgcga aggggctcct cccttcaaac tcatttccaa tactcatcac 360
ttggtagaaa gcggagtaaa agtgctagga ttagcagcat tagacgaaac tgcaaatcct 420
agctatgaca aggaaatggc agagaaactc gttaaagtag gagcagaaat agccgcgatg 480
<210> 4
<211> 160
<212> PRT
<213> rvWFA3-1氨基酸序列(rvWFA3-1 amino acid sequence)
<400> 4
His Ser Arg Thr His Arg Ser Met Ala Glu Arg Trp His Leu Ile Ile
1 5 10 15
Leu Val Asp Gln Ser Gly Ser Met Leu Asp Ser Val Ile His Ser Ala
20 25 30
Val Thr Ala Ser Ile Phe Trp Gly Ile Lys Ser Ile Lys Thr Ser Leu
35 40 45
Ile Leu Phe Asp Thr Glu Ile Val Asp Val Thr Asp His Cys Ser Asp
50 55 60
Pro Val Glu Thr Leu Met Lys Val Gln Leu Gly Gly Gly Thr Asp Ile
65 70 75 80
Gly Ser Ala Leu Leu Tyr Ala Glu Gly Lys Val Glu Asn Pro Arg Arg
85 90 95
Thr Ile Ile Ile Leu Ile Ser Asp Phe Cys Glu Gly Ala Pro Pro Phe
100 105 110
Lys Leu Ile Ser Asn Thr His His Leu Val Glu Ser Gly Val Lys Val
115 120 125
Leu Gly Leu Ala Ala Leu Asp Glu Thr Ala Asn Pro Ser Tyr Asp Lys
130 135 140
Glu Met Ala Glu Lys Leu Val Lys Val Gly Ala Glu Ile Ala Ala Met
145 150 155 160

Claims (2)

1.钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-1在制备治疗问号钩端螺旋体感染疫苗中的应用，所述钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-1通过以下步骤制备得到：
（1）根据问号钩端螺旋体赖株LA_0697基因限制性核酸内切酶图谱分析、信号肽预测结果以及T-A克隆、亚克隆载体多克隆位点，设计含核酸内切酶Nde I或Xho I酶切位点的PCR引物，备用，PCR引物中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
（2）提取问号钩端螺旋体赖株DNA，具体方法为：将问号钩端螺旋体赖株培养物以转速12000 r/min温度4℃离心15 min，得到沉淀，用0.01 mol/L、pH7.2灭菌PBS洗涤后按上述方法离心，重复2次，得到问号钩端螺旋体沉淀，用细菌基因组DNA制备试剂盒提取DNA；
（3）采用步骤（1）得到的PCR引物和步骤（2）得到的问号钩端螺旋体赖株DNA，扩增LA_0697基因中von Willebrand凝血因子A3区超家族结构域片段，得到扩增片段，扩增方法为：采用EX-Taq高保真PCR试剂盒进行扩增，PCR参数为94℃ 5 min，94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 90 s，30个循环，72℃ 7 min，以溴乙锭预染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段后，采用T-A克隆试剂盒将上述目的基因扩增片段与pMD19-T连接，连接过夜后采用氯化钙法将其转化入E. coli DH5α形成E. coli DH5αpMD19-T0697，蓝白筛选后提取重组质粒pMD19-T0697测序；
（4）将步骤（3）得到的序列正确的重组质粒pMD19-T0697与表达载体pET42a用限制性核酸内切酶Nde I和Xho I酶切后回收，T4 DNA连接酶连接形成目的基因重组原核表达质粒pET42a0697；
（5）采用氯化钙法将步骤（4）得到pET42a0697转化入感受态E. coli BL21DE3中，形成E.coli BL21DE3pET42a-0697工程菌株，接种于50 μg/mL卡那霉素LB琼脂平板上分离培养，0.5mmol/L的IPTG诱导，分离培养和IPTG诱导条件为：以转速220 r/min、37℃震荡培养，至A600值为0.6～0.8时加入0.5mmol/L的IPTG，以上述条件继续培养6 h，诱导目的重组蛋白rvWFA3-1表达，获得目的重组蛋白 rvWFA3-1，采用Ni-NTA亲和层析柱提纯rvWFA3-1。
2.钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-1在制备钩端螺旋体感染抗体检测试剂盒中的应用，所述钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-1通过以下步骤制备得到：
（1）根据问号钩端螺旋体赖株LA_0697基因限制性核酸内切酶图谱分析、信号肽预测结果以及T-A克隆、亚克隆载体多克隆位点，设计含核酸内切酶Nde I或Xho I酶切位点的PCR引物，备用，PCR引物中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
（2）提取问号钩端螺旋体赖株DNA，具体方法为：将问号钩端螺旋体赖株培养物以转速12000 r/min温度4℃离心15 min，得到沉淀，用0.01 mol/L、pH7.2灭菌PBS洗涤后按上述方法离心，重复2次，得到问号钩端螺旋体沉淀，用细菌基因组DNA制备试剂盒提取DNA；
（3）采用步骤（1）得到的PCR引物和步骤（2）得到的问号钩端螺旋体赖株DNA，扩增LA_0697基因中von Willebrand凝血因子A3区超家族结构域片段，得到扩增片段，扩增方法为：采用EX-Taq高保真PCR试剂盒进行扩增，PCR参数为94℃ 5 min，94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 90 s，30个循环，72℃ 7 min，以溴乙锭预染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段后，采用T-A克隆试剂盒将上述目的基因扩增片段与pMD19-T连接，连接过夜后采用氯化钙法将其转化入E. coli DH5α形成E. coli DH5αpMD19-T0697，蓝白筛选后提取重组质粒pMD19-T0697测序；
（4）将步骤（3）得到的序列正确的重组质粒pMD19-T0697与表达载体pET42a用限制性核酸内切酶Nde I和Xho I酶切后回收，T4 DNA连接酶连接形成目的基因重组原核表达质粒pET42a0697；
（5）采用氯化钙法将步骤（4）得到pET42a0697转化入感受态E. coli BL21DE3中，形成E.coli BL21DE3pET42a-0697工程菌株，接种于50 μg/mL卡那霉素LB琼脂平板上分离培养，0.5mmol/L的IPTG诱导，分离培养和IPTG诱导条件为：以转速220 r/min、37℃震荡培养，至A600值为0.6～0.8时加入0.5mmol/L的IPTG，以上述条件继续培养6 h，诱导目的重组蛋白rvWFA3-1表达，获得目的重组蛋白 rvWFA3-1，采用Ni-NTA亲和层析柱提纯rvWFA3-1。
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