CN111514949A - 一种微流控芯片及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微流控芯片及其制备方法。芯片包括经过疏水改性的芯片基底，芯片基底上覆有磷脂膜，磷脂膜上镶嵌有经过核苷酸修饰物修饰后的跨膜蛋白。经疏水改性的芯片基底在电解质溶液浸润后，可以实现与磷脂膜的稳定结合；经稳定化处理的两性磷脂分子具有更高的成膜率，其在芯片基底形成磷脂膜后，具有更好的稳定性，可实现更长时间的测序工作；经核苷酸修饰的跨膜蛋白可嵌入磷脂膜，作为生物纳米孔实现基因测序工作，经过核苷酸化修饰，其在基因测序的效率及准确性上都有较大的提升。采用本发明所述的生物纳米孔微流芯片系统，可大大提升自动化基因测序速度，测序准确性并有效降低测序成本。

Description

一种微流控芯片及其制备方法
技术领域
本发明属于生物科学技术领域，具体涉及一种微流控芯片及其制备方法。
背景技术
近年来，随着“精准医疗”概念的提出以及大数据时代的到来，对人类基因的测序工作在提升国民健康水平的过程中占有越来越重的地位。其中，生物纳米孔基因测序技术因其良好的测序准确性，高效的测序速度以及低廉的测序成本获到广泛重视。
作为生物纳米孔基因测序技术的核心，微流芯片系统在纳米孔测序技术的研发中占有至关重要的地位。然而，该类型芯片的研发还未成熟，在准确性、稳定性以及使用寿命等方面仍需不断改善以满足临床测试要求。因此，如何提升微流芯片系统的稳定性，准确性以及使用寿命，已成为影响其在生物医疗行业中得到进一步应用的重要因素之一。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供一种微流控芯片及其制备方法，以解决现有的微流芯片稳定性、准确性及使用寿命不理想的问题。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种微流控芯片，包括经过疏水改性的芯片基底，芯片基底上覆有磷脂膜，磷脂膜上镶嵌有经过核苷酸修饰物修饰后的跨膜蛋白。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，跨膜蛋白为α-HL、Msp A或phi29；核苷酸修饰物为亲水聚合物和核苷酸的复合物，亲水聚合物和核苷酸通过共价键连接。
对跨膜蛋白进行核苷酸修饰，可以提高基因测序的灵敏度和准确率。通过在亲水聚合物的端基修饰生物素等能够和蛋白反应的官能团，从而实现聚合物-核苷酸复合物对跨膜蛋白的共价修饰。
进一步，亲水聚合物为聚赖氨酸、聚谷氨酸或聚乙二醇；核苷酸为腺嘌呤核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸、胞嘧啶核苷酸或鸟嘌呤核苷酸。
本发明还要求保护一种微流控芯片的制备方法，本发明中微流控芯片的制备方法包括以下步骤：
S1：对芯片基底进行疏水改性；
S2：在疏水改性后的芯片基底上形成磷脂膜；
S3：采用核苷酸修饰物对跨膜蛋白进行修饰改性；
S4：将改性后的跨膜蛋白嵌装到磷脂膜上，完成微流控芯片的制备。
在上述技术方案的基础上，本发明中的制备方法还可以做如下改进。
进一步，芯片基底疏水改性包括以下步骤：
SS1：用Su-8对基片表面进行预处理；
SS2：在预处理后的基片上进行环氧开环；
SS3：将全氟化物接枝到环氧开环后的基片上，得疏水改性芯片基底；
所用基片的材料为聚苯乙烯或聚碳酸酯。
本发明基片的环氧开环将预处理后的基片在氨基乙醇中浸泡即可实现，环氧开环是基片和氨基乙醇反应，从而在基片表面引入羟基官能团，羟基基团再与全氟化合物上的官能团进行化学反应，将全氟化物接枝到基片上，得到疏水改性的基底。全氟化物修饰芯片基底可以更好的稳定磷脂膜，实现长效、稳定的基因测序。
进一步，全氟化物为全氟癸基乙烯、全氟十一烷酸、十七氟十一酰氯、全氟十二烷氨、全氟癸基三甲氧基硅烷和全氟癸基二甲基氯硅烷中的至少一种。
进一步，S2中磷脂膜的形成包括以下步骤：
SS1：将磷脂分子、疏水单体和光引发剂按1:0.5～3:0.5～3的摩尔比混合，得稳定化的两性磷脂分子；
SS2：将稳定化的两性磷脂分子溶于电解质溶液中，得两性磷脂分子溶液；
SS3：将疏水改性后的芯片基底在两性磷脂分子溶液中浸润，然后紫外辐照10～60min，即得。
进一步，稳定化的两性磷脂分子中磷脂分子、疏水单体和光引发剂的摩尔比为1:1:1。
进一步，磷脂分子为二植烷酰基磷脂酰胆碱或二植烷酰基磷脂酰乙醇胺；疏水单体为甲基丙烯酸正丁酯或二甲基丙烯酸乙二醇酯；光引发剂为2,2-二乙氧基-1-苯己酮或2-羟基-2-甲基-1-苯基丙酮。
进一步，改性后的跨膜蛋白通过自组装的方式嵌装到磷脂膜上。
跨膜蛋白在电解质溶液中可以自发形成组装结构，因此，本发明中的微流控芯片制备方法简便，可以快速得到性能优良的微流芯片。
本发明的有益效果是：本发明创造性的在芯片基底、磷脂分子以及跨膜蛋白方面进行了改进，提升芯片基底对磷脂膜的结合力、磷脂膜的成膜稳定性以及跨膜蛋白纳米孔对基因序列的识别能力，从而实现更加精准、稳定、持久的基因测序工作。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例一
一种微流控芯片，包括经过疏水改性的芯片基底，芯片基底中的基片用聚苯乙烯制成；芯片基底上覆有磷脂膜，磷脂膜上镶嵌有经过PEG-腺嘌呤核苷酸复合物修饰后的跨膜蛋白α-HL。本实施例中的微流控芯片经过以下步骤制得：
S1：先用Su-8对聚苯乙烯基片表面进行预处理；然后用氨基乙醇浸泡预处理后的基片，以在基片上进行环氧开环；再用全氟癸基二甲基氯硅烷进行氟化修饰，得到疏水改性的芯片基底；
S2：将二植烷酰基磷脂酰乙醇胺(DPhPE)、甲基丙烯酸正丁酯(BMA)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)和2,2-二乙氧基-1-苯己酮(DEAP)按1:1:1:1的摩尔比混合，得稳定化的两性磷脂分子，然后将稳定化的两性磷脂分子溶于PBS溶液中，得两性磷脂分子溶液；
S3：将疏水改性的芯片基底在两性磷脂分子溶液中浸润，然后紫外辐照30min，在芯片基底上形成稳定的磷脂膜；
S4：用PEG-腺嘌呤核苷酸复合物修饰α-HL跨膜蛋白，制备基因测序准确性更高的蛋白纳米孔；
S5：将核苷酸化修饰的α-HL跨膜蛋白嵌入磷脂膜，构建得到微流控芯片。
实施例二
一种微流控芯片，包括经过疏水改性的芯片基底，芯片基底中的基片用聚苯乙烯制成；芯片基底上覆有磷脂膜，磷脂膜上镶嵌有经过PEG-胸腺嘧啶核苷酸复合物修饰后的跨膜蛋白Msp A。本实施例中的微流控芯片经过以下步骤制得：
S1：先用Su-8对聚苯乙烯基片表面进行预处理；然后用氨基乙醇浸泡预处理后的基片，以在基片上进行环氧开环；再用全全氟癸基三甲氧基硅烷进行氟化修饰，得到疏水改性的芯片基底；
S2：将二植烷酰基磷脂酰乙醇胺(DPhPE)、甲基丙烯酸正丁酯(BMA)和2,2-二乙氧基-1-苯己酮(DEAP)按1:1:1的摩尔比混合，得稳定化的两性磷脂分子，然后将稳定化的两性磷脂分子溶于生理盐水中，得两性磷脂分子溶液；
S3：将疏水改性的芯片基底在两性磷脂分子溶液中浸润，然后紫外辐照30min，在芯片基底上形成稳定的磷脂膜；
S4：用PEG-胸腺嘧啶核苷酸复合物修饰Msp A跨膜蛋白，制备基因测序准确性更高的蛋白纳米孔；
S5：将核苷酸化修饰的Msp A跨膜蛋白嵌入磷脂膜，构建得到微流控芯片。
实施例三
一种微流控芯片，包括经过疏水改性的芯片基底，芯片基底中的基片用聚苯乙烯制成；芯片基底上覆有磷脂膜，磷脂膜上镶嵌有经过聚赖氨酸-腺嘌呤核苷酸复合物修饰后的跨膜蛋白α-HL。本实施例中的微流控芯片经过以下步骤制得：
S1：先用Su-8对聚苯乙烯基片表面进行预处理；然后用氨基乙醇浸泡预处理后的基片，以在基片上进行环氧开环；再用全氟癸基二甲基氯硅烷进行氟化修饰，得到疏水改性的芯片基底；
S2：将二植烷酰基磷脂酰乙醇胺(DPhPE)、甲基丙烯酸正丁酯(BMA)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)和2,2-二乙氧基-1-苯己酮(DEAP)按1:1:1:1的摩尔比混合，得稳定化的两性磷脂分子，然后将稳定化的两性磷脂分子溶于PBS溶液中，得两性磷脂分子溶液；
S3：将疏水改性的芯片基底在两性磷脂分子溶液中浸润；
S4：用聚赖氨酸-腺嘌呤核苷酸复合物修饰α-HL跨膜蛋白，制备基因测序准确性更高的蛋白纳米孔，然后将核苷酸化修饰的α-HL跨膜蛋白接枝到芯片基底表面的两性磷脂分子上；
S5：紫外辐照30min，得到微流控芯片。
实施例四
一种微流控芯片，包括经过疏水改性的芯片基底，芯片基底中的基片用聚苯乙烯制成；芯片基底上覆有磷脂膜，磷脂膜上镶嵌有经过PEG-腺嘌呤核苷酸复合物修饰后的跨膜蛋白phi29。本实施例中的微流控芯片经过以下步骤制得：
S1：先用Su-8对聚苯乙烯基片表面进行预处理；然后用氨基乙醇浸泡预处理后的基片，以在基片上进行环氧开环；再用十七氟十一酰氯进行氟化修饰，得到疏水改性的芯片基底；
S2：将二植烷酰基磷脂酰乙醇胺(DPhPE)、甲基丙烯酸正丁酯(BMA)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)和2,2-二乙氧基-1-苯己酮(DEAP)按1:1:1:1的摩尔比混合，得稳定化的两性磷脂分子，然后将稳定化的两性磷脂分子溶于PBS溶液中，得两性磷脂分子溶液；
S3：将疏水改性的芯片基底在两性磷脂分子溶液中浸润，然后紫外辐照40min，在芯片基底上形成稳定的磷脂膜；
S4：用PEG-腺嘌呤核苷酸复合物修饰phi29跨膜蛋白，制备基因测序准确性更高的蛋白纳米孔；
S5：将核苷酸化修饰的phi29跨膜蛋白嵌入磷脂膜，构建得到微流控芯片。
实施例五
一种微流控芯片，包括经过疏水改性的芯片基底，芯片基底中的基片用聚苯乙烯制成；芯片基底上覆有磷脂膜，磷脂膜上镶嵌有经过聚谷氨酸-腺嘌呤核苷酸复合物修饰后的跨膜蛋白α-HL。本实施例中的微流控芯片经过以下步骤制得：
S1：先用Su-8对聚苯乙烯基片表面进行预处理；然后用氨基乙醇浸泡预处理后的基片，以在基片上进行环氧开环；再用全氟癸基二甲基氯硅烷进行氟化修饰，得到疏水改性的芯片基底；
S2：将二植烷酰基磷脂酰乙醇胺(DPhPE)、甲基丙烯酸正丁酯(BMA)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)和2,2-二乙氧基-1-苯己酮(DEAP)按1:2:2:2的摩尔比混合，得稳定化的两性磷脂分子，然后将稳定化的两性磷脂分子溶于生理盐水中，得两性磷脂分子溶液；
S3：将疏水改性的芯片基底在两性磷脂分子溶液中浸润；
S4：用聚谷氨酸-腺嘌呤核苷酸复合物修饰α-HL跨膜蛋白，制备基因测序准确性更高的蛋白纳米孔，然后将核苷酸化修饰的α-HL跨膜蛋白接枝到芯片基底表面的两性磷脂分子上；
S5：紫外辐照30min，得到微流控芯片。
实施例六
一种微流控芯片，包括经过疏水改性的芯片基底，芯片基底中的基片用聚苯乙烯制成；芯片基底上覆有磷脂膜，磷脂膜上镶嵌有经过聚赖氨酸-鸟嘌呤核苷酸复合物修饰后的跨膜蛋白Msp A。本实施例中的微流控芯片经过以下步骤制得：
S1：先用Su-8对聚苯乙烯基片表面进行预处理；然后用氨基乙醇浸泡预处理后的基片，以在基片上进行环氧开环；再用全氟癸基三甲氧基硅氧烷进行氟化修饰，得到疏水改性的芯片基底；
S2：将二植烷酰基磷脂酰乙醇胺(DPhPE)、甲基丙烯酸正丁酯(BMA)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)和2,2-二乙氧基-1-苯己酮(DEAP)按1:0.5:0.5:0.5的摩尔比混合，得稳定化的两性磷脂分子，然后将稳定化的两性磷脂分子溶于PBS溶液中，得两性磷脂分子溶液；
S3：将疏水改性的芯片基底在两性磷脂分子溶液中浸润；
S4：用聚赖氨酸-鸟嘌呤核苷酸复合物修饰Msp A跨膜蛋白，制备基因测序准确性更高的蛋白纳米孔，然后将核苷酸化修饰的Msp A跨膜蛋白接枝到芯片基底表面的两性磷脂分子上；
S5：紫外辐照30min，得到微流控芯片。
虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

Claims (10)

1.一种微流控芯片，其特征在于：包括经过疏水改性的芯片基底，所述芯片基底上覆有磷脂膜，所述磷脂膜上镶嵌有经过核苷酸修饰物修饰后的跨膜蛋白。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述跨膜蛋白为α-HL、Msp A或phi29；所述核苷酸修饰物为亲水聚合物和核苷酸的复合物，所述复合物中亲水聚合物和核苷酸通过共价键连接。
3.根据权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于：所述亲水聚合物为聚赖氨酸、聚谷氨酸或聚乙二醇；所述核苷酸为腺嘌呤核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸、胞嘧啶核苷酸或鸟嘌呤核苷酸。
4.如权利要求1～3任一项所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：对芯片基底进行疏水改性；
S2：在疏水改性后的芯片基底上形成磷脂膜；
S3：采用核苷酸修饰物对跨膜蛋白进行修饰改性；
S4：将改性后的跨膜蛋白嵌装到磷脂膜上，完成微流控芯片的制备。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，芯片基底疏水改性包括以下步骤：
SS1：用Su-8对基片表面进行预处理；
SS2：在预处理后的基片上进行环氧开环；
SS3：将全氟化物接枝到环氧开环后的基片上，得疏水改性芯片基底；
所述基片材料为聚苯乙烯或聚碳酸酯。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述全氟化物为全氟癸基乙烯、全氟十一烷酸、十七氟十一酰氯、全氟十二烷氨、全氟癸基三甲氧基硅烷和全氟癸基二甲基氯硅烷中的至少一种。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，S2中磷脂膜的形成包括以下步骤：
SS1：将磷脂分子、疏水单体和光引发剂按1:0.5～3:0.5～3的摩尔比混合，得稳定化的两性磷脂分子；
SS2：将稳定化的两性磷脂分子溶于电解质溶液中，得两性磷脂分子溶液；
SS3：将疏水改性后的芯片基底在两性磷脂分子溶液中浸润，然后紫外辐照10～60min，即得。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述稳定化的两性磷脂分子中磷脂分子、疏水单体和光引发剂的摩尔比为1:1:1。
9.采用权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于：所述磷脂分子为二植烷酰基磷脂酰胆碱和/或二植烷酰基磷脂酰乙醇胺；所述疏水单体为甲基丙烯酸正丁酯和/或二甲基丙烯酸乙二醇酯；所述光引发剂为2,2-二乙氧基-1-苯己酮和/或2-羟基-2-甲基-1-苯基丙酮。
10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：改性后的跨膜蛋白通过自组装的方式嵌装到磷脂膜上。
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