CN111499555B - 双光子荧光标记探针及其合成方法和新冠病毒诊断的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于双光子荧光标记探针及其应用技术领域,具体涉及双光子荧光标记探针及其合成方法和新冠病毒诊断的应用,本发明探针化学名称为3‑(N‑甲基‑N‑(6‑乙酰基‑2‑萘基)氨基)丙酸‑N‑羟基琥珀酰亚胺酯,该双光子荧光探针具有灵敏度高、检测快速、准确的优点,用其标记2019‑nCoV的N蛋白抗原后得到的荧光抗原,能够制成免疫层析试纸条或检测试剂盒,并用于新型冠状肺炎病毒的快速检测,且试纸条或试剂盒具有检测快速、检测一致性及稳定性高的优良特征。
Description
技术领域
本发明属于双光子荧光标记探针制作的技术领域,具体涉及用于新冠病毒快递诊断的双光子荧光标记探针、及其合成方法和制备免疫层析试纸条及试剂盒的应用。
背景技术
新型冠状病毒作为一种引起人类呼吸系统疾病(2019-nCoV)的病原,长期以来,套氏病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)的病毒一直与人类和动物密切相关。冠状病毒是RNA病毒家族中最大的病毒,基因组全长约27~32kb,有囊膜,病毒表面的刺突糖蛋白(Spike glycoprotein)形似“王冠(corona拉丁文)”,因此,将其命名为冠状病毒。新型冠状病毒属于β属的新型冠状病毒,有包膜,颗粒呈圆形或椭圆形,常为多形性,直径60-140nm,其基因特征与SARSr-CoV和MERSr-CoV有明显区别。根据武汉病毒所石正丽研究员最新研究成果发现,2019-nCoV与蝙蝠冠状病毒毒株RaTG13相似度非常高,整体基因组相似度达96.2%。另外,研究显示2019-nCoV与蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21)同源性也达85%以上。
在新型冠状病毒肺炎的联防联控的战役中,由于无症状感染者很难识别,增加了疾病防控的难度,因此,对待测对象进行核酸检测,快速甄别其是否感染新冠病毒,显得尤为重要。目前国家药品监督管理局已批准的2019-nCoV核酸诊断试剂盒应用的方法有荧光PCR法、联合探针锚定聚合测序法和恒温扩增法。一些新的实验室诊断方法也在开发中,如基于Cas核酸酶的诊断法和纳米孔测序法,再如在钟南山院士的指导下,呼吸疾病国家重点实验室联合中国科学院广州生物医药与健康研究院、广州再生医学与健康广东省实验室等单位共同研发新型冠状病毒IgM抗体快速检测试剂盒,该试剂盒应用胶体金免疫层析技术,采用间接法检测新型冠状病毒(2019-nCoV)IgM抗体;以及如复旦大学程训佳/隋国栋研究团队成功研发的新冠病毒荧光免疫层析快速检测试剂盒等。
又如,专利号CN202010060229.X公开了新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光定量PCR检测引物和探针、试剂盒和方法,采用单管双荧光通道同时检测新型冠状病毒2019-nCoV和内参基因Rnase P的存在,能检测肺泡灌洗液、鼻咽拭子、全血、血清、粪便和组织等标本中新型冠状病毒2019-nCoV RNA的存在,但荧光定量PCR检测成本高、人为操作影响大、不能检测片断大小,只用于一个特定目标基因;另外操作繁琐、检测周期长,易出现假阳性与假阴性,准确度大打折扣。专利号CN202010136909.5公开了检测冠状病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途,所述组合物包括:第一组:如SEQ ID NO:1所示的新型冠状病毒2019-nCoV上游引物、如SEQ ID NO:2所示的新型冠状病毒2019-nCoV下游引物,和如SEQ ID NO:3所示的新型冠状病毒2019-nCoV探针;如SEQ ID NO:4所示的冠状病毒NL63上游引物、如SEQID NO:5所示的冠状病毒NL63下游引物,和如SEQ ID NO:6所示的冠状病毒NL63探针;如SEQID NO:7所示的冠状病毒HKU1上游引物、如SEQ ID NO:8所示的冠状病毒HKU1下游引物,和如SEQ ID NO:9所示的冠状病毒HKU1探针;第二组:如SEQ ID NO:10所示的冠状病毒229E上游引物和如SEQ ID NO:11所示的冠状病毒229E下游引物;如SEQ ID NO:12所示的冠状病毒OC43上游引物和如SEQ ID NO:13所示的冠状病毒OC43下游引物;如SEQ ID NO:14所示的冠状病毒MERSr-CoV上游引物和如SEQ ID NO:15所示的冠状病毒MERSr-CoV下游引物;如SEQID NO:16所示的冠状病毒SARSr-CoV上游引物和如SEQ ID NO:17所示的冠状病毒SARSr-CoV下游引物;其中,第一组内的荧光基团彼此互不相同,并且第二组内的荧光基团彼此互不相同;所述化合物能够检测新型冠状病毒2019-nCoV,但实时PCR探针法,分子由荧光基团与淬灭基团通过一段核苷酸链连接面成,所以不发荧光,Taq酶(DNA聚合酶)有5’-3’外切核酸酶活性,能水解探针,因此随着PCR扩增,探针被切断增加,荧光也增强,但要合成引物链,与靶标链互补配对,使得造价相对较高。
荧光探针是研究复杂生物体系的重要工具,并且双光子探针具有深组织成像能力和低伤害性等优势。在文献《含N-羟基琥珀酰亚胺酯的三枝BODIPY荧光染料的合成和氨解》中指出了N-羟基琥珀酰亚胺酯是多肽合成中常用的中间体,它与氨基化合物反应时,具有标记条件温和、产物稳定、反应选择性好等特点,与氨基酸衍生化条件温和,通常在室温下进行,已报道的N-羟基琥珀酰亚胺酯类荧光探针如6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸酯(AQC),N-羟基琥珀酰亚胺-α-萘乙酸酯(SINA),2,6-二甲基喹啉基-4-N-羟基琥珀酰亚胺甲酸酯(DMQF-OSu),但上述N-羟基琥珀酰亚胺酯类荧光探针用于胺及氨基酸的化学衍生,须经反相液相色谱分离、荧光检测,并且均未公开N-羟基琥珀酰亚胺酯类荧光探针应用于病毒检测方面。
由于新冠病毒仍在蔓延,做到早诊断、早发现与早治疗是防患新冠病毒肺炎的主要举措,这完全仰赖于有效的检测工具;因此,开发新的检测试剂以有效缓解检测和诊断的压力,使病毒能够快速准确的甄别出来,是我们新型冠状病毒肺炎联防联控战役的重点工作。而本发明研究人员此前在对双光子荧光探针的研究过程中,针对细胞内汞离子、锌离子、银离子、钠离子等的检测,细胞内糖链抗原的活性检测以及温度传感检测等方面都进行了研究,但基于萘结构母体和羟基琥珀酰亚胺酯结合的用于新冠病毒2019-nCoV的抗原的活检的技术方案还未见报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足,提出了一种用于新冠病毒快速诊断的双光子荧光标记探针、及其合成方法和应用。所述应用包括制成用于检测/诊断的试纸条及试剂盒。
具体是通过以下技术方案来实现的:
技术方案1:一种双光子荧光标记探针LP,其化学名称为3-(N-甲基-N-(6-乙酰基-2-萘基)氨基)丙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯;其结构式如下:
技术方案2:前述结构式的双光子荧光标记探针,合成路线如下:
所述化合物1的化学名称是6-甲氧基-2-乙酰基萘;
所述化合物2的化学名称是6-乙酰基-2-萘酚;
所述化合物3的化学名称是2-乙酰基-6-甲氨基萘;
所述化合物4的化学名称是3-(N-甲基-N-(6-乙酰基-2-萘基)氨基)丙酸甲酯;
所述化合物5的化学名称是3-(N-甲基-N-(6-乙酰基-2-萘基)氨基)丙酸。
技术方案3:前述结构式的双光子荧光标记探针,合成方法如下:
1)化合物4的合成:在三口烧瓶中加入化合物3和乙腈,搅拌溶解后加入3-溴代丙酸甲酯、NaH2PO4和NaI,氮气保护下于90℃条件下反应后,经减压脱除溶剂后用CH2Cl2溶解,水洗,无水硫酸镁干燥,过滤,减压脱除溶剂后经柱分离,得得黄色粉末,即为3-(N-甲基-N-(6-乙酰基-2-萘基)氨基)丙酸甲酯,即化合物4;
2)化合物5的合成:于烧瓶中加入化合物4、NaOH、乙醇和水,室温下搅拌反应,将反应液倒入冰水中,边搅拌边缓慢滴加浓盐酸,析出沉淀,抽滤得固体,乙醇重结晶,得黄色粉末,即为3-(N-甲基-N-(6-乙酰基-2-萘基)氨基)丙酸,即化合物5;
3)LP的合成:用MeCN溶解化合物5,移至三口烧瓶中,冷却至0℃,然后加入三乙胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),于50℃条件下反应,减压脱除溶剂,CH2Cl2溶解,依次用10%稀盐酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤,收集有机相,无水MgSO4干燥,过滤,减压脱除溶剂,经柱分离,得黄色粉末3-(N-甲基-N-(6-乙酰基-2-萘基)氨基)丙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯,即为双光子荧光标记探针LP。
其中,步骤1)中所述的柱分离,其洗脱液为二氯甲烷。
步骤3)中所述的柱分离,其洗脱液为二氯甲烷、乙酸乙酯按体积比10:1组成。
步骤1)中所述化合物3、乙腈、3-溴代丙酸甲酯、NaH2PO4和NaI的用量质量比为3.22:86.05:4.07:3.43:1。
步骤2)中所述化合物4、NaOH、乙醇和水的用量质量比为2.39:1:24.46:16.13。
步骤3)中所述化合物5、三乙胺、EDCI、NHS的用量质量比为2.12:2.39:1.82:1。
技术方案4:前述的双光子荧光标记探针LP及合成路线和工艺获得的探针LP在标记2019-nCoV的N蛋白抗原方面的应用,所述的应用为非临床诊断的应用。
所述双光子荧光标记探针标记新冠病毒(即2019-nCoV)的N蛋白抗原(即Ag),采用Marsshall氏法,具体步骤如下:
1)取抗原溶液,依次加入碳酸盐缓冲液、含LP的DMF溶液,混匀,于摇床200转/分,25℃,反应2h;所述碳酸盐缓冲液由Na2CO38.6g,NaHCO317.3g,蒸馏水1000mL配制而成,其pH为9.3;
2)超滤纯化:取步骤1)所得液加入超滤管,加磷酸盐缓冲液(PB)至超滤管总体积的80%,然后于4℃、8000-10000转/min条件下离心5-20min,重复加PB并离心3-5次即可,即得荧光抗原,即为LP-Ag沉淀物。
技术方案5:前述的双光子荧光标记探针LP及合成路线和工艺获得的探针LP在制备用于新冠病毒快速诊断的产品方面的应用,所述产品包括试纸条、试剂盒。
技术方案6:一种用于新冠病毒快速检测的免疫层析试纸条,由样品垫、结合垫、检测G线、检测M线、质控C线、吸水纸、PVC底板组成;所述样品垫含滤血膜,所述结合垫包被含LP-Ag沉淀物的荧光抗原。
所述免疫层析试纸条的制作,包括如下步骤:
(1)检测线和质控线的制备
用喷膜机分别将纯化的抗人IgM二抗、抗人IgG二抗、羊抗鼠IgG抗体分别喷涂在硝酸纤维膜即为NC膜的检测M线、检测G线和质控C线上,经干燥后,4℃密封保存备用;
(2)结合垫包被荧光抗原
荧光抗原储存液重悬LP-Ag沉淀物,制备成荧光抗原溶液,于1~4℃保存备用;
将结合垫浸泡在缓冲溶液中15min,室温晾干备用;
晾干后的结合垫转入恒温鼓风干燥箱于35℃下干燥2d,再用喷膜机喷涂荧光抗原溶液于结合垫上,包被后转入恒温鼓风干燥箱于35℃下干燥;
(3)样品垫预处理
将样品垫浸泡在缓冲溶液中15min,室温晾干备用;将晾干后的样品垫转入恒温鼓风干燥箱于35℃下干燥1d;
(4)试纸条装配
于PVC底板上依次粘贴NC膜、吸收垫、结合垫和样品垫,相邻垫板间距为2mm;NC膜贴紧PVC底板,结合垫与吸收垫搭接在NC膜的两端,样品垫搭在结合垫的一端,如图2所示。
所述荧光抗原储存液与缓冲溶液相同,为含有5%蔗糖,5%葡萄糖,0.5%吐温20,30mmol/L MOPS,100mmol/L KCl,10mmol/L EGTA的水溶液,其pH为7.2。
所述MOPS为3-(N-吗啉代)丙磺酸。
所述EGTA为乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸。
所述免疫层析试纸条适用于全血、血清、血浆。
技术方案7:一种用于新冠病毒快速检测的试剂盒,由COVID-19IgM/IgG抗体检测卡/试纸条、双光子荧光探针冻干品、样品稀释液组成。所述样品稀释液为含有5%蔗糖、5%葡萄糖、0.5%吐温20、30mmol L-1MOPS、100mmol L-1KCl、10mmol L-1EGTA的水溶液,pH7.2。
本发明用于新冠病毒快速诊断的技术原理是:
双光子荧光标记探针LP标记2019-nCoV的N蛋白抗原Ag,采用Marsshall氏法,其原理如下面的反应式所示,即LP上的琥珀酰亚胺氧基(–ONS)在碱性缓冲液中极易被抗原蛋白的氨基酸上的氨基(–NH2)所取代,形成酰胺(–CONHR),发生化学反应(1)式;
LP+Ag→LP-Ag (1)
当血液中含有2019-nCoV的抗体时,抗体就会与LP-Ag荧光抗原发生免疫反应,生成抗原-抗体复合物LP-Ag·Ab,发出荧光,呈阳性,发生化学反应(2)式;
LP-Ag+Ab→LP-Ag·Ab (2)
当在免疫层析试纸条的样品孔中加入测试样品时,样品将沿着NC膜向前移动,若样品含有IgM抗体,抗体将与双光子荧光探针标记的抗原(新冠病毒N/S蛋白抗原)LP-Ag结合,它与包被的鼠抗人IgM单克隆抗体形成检测M线,表明2019新型冠状病毒IgM抗体呈阳性;若样品中含有IgG抗体,抗体将与LP-Ag沉淀物结合,形成的免疫复合物与包被的抗人IgG单克隆抗体形成检测G线,说明2019新型冠状病毒IgG抗体呈阳性;若测试没有形成检测G线和检测M线,则显示阴性结果;免疫层析试纸条还包含质控C线,固定N/S蛋白抗体,样品向前流动带动LP-Ag沉淀物向前移动,过量的LP-Ag沉淀物到达质控线后,其偶联的抗原与质控C线的抗体结合,大量积聚后显绿色,在检测中无论是否出现检测线,都应出现质控C线;若质控线未出现,则测试结果无效,样品需要重新测试。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
本发明的双光子荧光探针制作成本低、工艺方法简单、分子体积相当较小、D-π-A(D:供电子基团;A:拉电子基团)结构鲜明简单,该探针3-(N-甲基-N-(6-乙酰基-2-萘基)氨基)丙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯是一个推拉电子体系,在萘环的两个反向位点上接有一个氨基(强供电子基团)与一个乙酰基(吸电子基团),含有的乙酰基具有如下作用:一是扩展π共轭电子体系(羰基碳氧双键的π键与萘环的大π键形成π-π共轭),提高双光子吸收截面及荧光量子产率;二是增加受体端的拉电子能力,以提高激发态偶极矩,即激发态分子内的电荷转移程度,增大分子的倍频效应,显著地提高双光子吸收性能;三是降低分子的对称性,有助于生成非中心对称的空间群,保证激发态较大的偶极矩。同时分子另一端的氨基与氰基的协同作用,加倍实现分子的强双光子吸收;氨基为强供电子基团,属于生色基团,不但使共轭体系的电子云密度大大增加,因而分子的吸收波长与发射波长也显著增大,荧光量子产率大为增加,还能使双光子吸收截面增加一个数量级。而双光子吸收截面越大,双光子荧光越强,成像与检测的准确度越高;再结合N-羟基琥珀酰亚胺作为羧基活化剂,羧基与N-羟基琥珀酰亚胺反应后容易遭受蛋白质的氨基的进攻,从而生成稳定的酰胺,有利于荧光物质与蛋白质的稳固连接。
本发明直接采用病毒荧光抗原来检测抗体,由于抗原与抗体间具备强大的亲合力,且专一性强,因此检测灵敏且不会出现假阴与假阳性的误诊;并且操作简单方便,检测快速;又由于采用双光子荧光技术能够有效避免生物自发荧光的干扰,更增加检测的准确度与灵敏度。本发明的探针还可用于实时动态生物成像。
该探针与2019-nCoV的N蛋白抗原结合后,对环境干扰变化不敏感,检测反应迅速、灵敏度和准确度高,制成试纸条或试剂盒后使用方便、结果清晰,使得该探针作为测定新冠病毒的试剂是极其有用的。本发明的探针能够标记IgM和IgG抗体,因此将双光子荧光探针制成双线检测的免疫层析试纸条,具有检测快速、一致性及稳定性高、检测精准的特点,且检测操作简单。
附图说明
图1:双光子荧光标记探针LP的合成路线图;
图2:免疫层析试纸条的结构图,其中1-样品垫、2-结合垫、3-检测G线、4-检测M线、5-质控C线、6-吸水纸、7-PVC底板;
图3:试纸条/试剂盒检测后的结果判定图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明,但本发明并不局限于这些实施方式,任何在本实施例基本精神上的改进或代替,仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
实施例1
双光子荧光标记探针LP的合成方法,包括如下步骤:
(1)6-乙酰基-2-萘酚(简称化合物2)的合成(参考文献进行):于三口烧瓶中依次加入20克6-甲氧基-2-乙酰基萘(简称化合物1)和200毫升冰乙酸,搅拌,然后加入86克氢溴酸,并于100℃搅拌回流12小时,黑色反应液于60℃减压脱除溶剂,加入10%碳酸氢钠溶液中和,用乙酸乙酯萃取,有机相用无水MgSO4干燥,过滤,减压脱除溶剂,经柱分离,得43.17mmol黄色粉末8.03g为化合物2,产率43%;其中,柱分离所用洗脱液为V(石油醚):V(乙酸乙酯)=2:1;所述化合物2的结构与文献(H.M.Kim,C.Jung,B.R.Kim,et al.,Angew.Chem.Int.Ed.,2007,46:3460–3463)报道一致;
(2)2-乙酰基-6-甲氨基萘(简称化合物3)的合成(参考文献进行):于高压釜中加入搅拌子、71.13mmol 6-乙酰基-2-萘酚13.23g、142.47mmol Na2S2O527.07g、356.25mmolNaOH14.25g、水400mL和358.96mmol CH3NH2HCl24.05g,迅速密封釜盖,釜内充氮气保护,于高温下搅拌反应43h,冷却打开釜盖,将块状固体研碎,用乙酸乙酯及饱和食盐水萃取,收集有机相,无水Na2CO3干燥,过滤减压脱除溶剂,经柱分离,27.79mmol得黄色粉末5.53g为化合物3,产率39%;其中,所述柱分离用洗脱液为:V(CH2Cl2):V(乙酸乙酯)=20:1;所述化合物3的结构与文献(H.M.Kim,C.Jung,B.R.Kim,et al.,Angew.Chem.Int.Ed.,2007,46:3460–3463)报道一致;
(3)3-(N-甲基-N-(6-乙酰基-2-萘基)氨基)丙酸甲酯(简称化合物4)的合成:在三口烧瓶中加入27.79mmol 2-乙酰基-6-甲氨基萘5.53g和乙腈190mL,搅拌溶解后加入42.17mmol 3-溴代丙酸甲酯7.00g、41.55mmol NaH2PO45.90g和11.47mmol NaI1.72g,氮气保护下于90℃反应38h;减压脱除溶剂后用CH2Cl2100mL溶解,水洗,无水硫酸镁干燥,过滤,减压脱除溶剂后经柱分离,得5.19mmol黄色粉末1.48g为化合物4,产率30%;所述洗脱液:CH2Cl2;
(m.p.247-248℃).(KBr,cm-1):1731(COOCH3),1665(CO).1H NMR(DMSO-d6)δ:8.47(s,1H),7.94(d,J=8.0Hz,1H),7.84(d,J=8.0Hz,1H),7.70(d,J=8.0Hz,1H),7.31(d,J=8.0Hz,1H),6.99(s,1H),3.81(t,J1=8.0Hz,J2=4.0Hz,2H,NCH2),3.61(s,3H,NCH3),3.05(s,3H,OCH3),2.64(s,3H,COCH3),2.65(t,J1=J2=8.0Hz,2H,COCH2).
13C NMR(CDCl3,100MHz)δ:197.86,172.44,148.47,137.69,131.00,130.98,130.35,126.26,125.23,124.53,116.07,105.63,51.88,48.46,38.49,31.84,26.45.
HRMS(EI)m/z:285.8953(calcd for C17H19NO3:285.3377).Anal.Calcd forC17H19NO3:C,71.56;H,6.71;N,4.91;O,16.82.Found:C,71.72;H,6.83;N,4.95;O,16.50.
(4)3-(N-甲基-N-(6-乙酰基-2-萘基)氨基)丙酸(简称化合物5)的合成:于烧瓶中加入5.19mmol 3-(N-甲基-N-(6-乙酰基-2-萘基)氨基)丙酸甲酯1.48g、11.07mmolNaOH0.62g、乙醇50mL和水10mL,室温下搅拌反应20h,将反应液倒入100毫升冰水中,边搅拌边缓慢滴加浓盐酸,析出沉淀,抽滤得固体,乙醇重结晶,得5.17mmol黄色粉末1.40g为化合物5,产率99.6%;
(m.p.285-284℃).(KBr,cm-1):3387(OH),1699(COOH),1645(CO).1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:8.46(s,1H),7.94(d,J=8.0Hz,1H),7.84(d,J=12.0Hz,1H),7.70(d,J=8.0Hz,1H),7.32(d,J=12.0Hz,1H),6.99(s,1H),3.77(t,J1=J2=8.0Hz,2H,NCH2),3.06(s,3H,NCH3),2.64(s,3H,COCH3),2.55(t,J1=8.0Hz,J2=4.0Hz,2H,CH2CO).
13C NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:197.55,173.72,149.13,137.79,131.25,130.93,130.56,126.38,125.02,124.44,116.80,105.31,48.24,38.47,32.00,26.85.
HRMS(EI)m/z:271.9996(calcd for C16H17NO3:271.1208).Anal.Calcd forC16H17NO3:C,70.83;H,6.32;N,5.16;O,17.69.Found:C,70.92;H,6.43;N,5.31;O,17.34.
(5)3-(N-甲基-N-(6-乙酰基-2-萘基)氨基)丙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯即LP的合成:用MeCN55mL溶解,5.17mmol 3-(N-甲基-N-(6-乙酰基-2-萘基)氨基)丙酸1.40g,移至三口烧瓶中,冷却至0℃,然后加入15.64mmol三乙胺1.58g、6.26mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐即EDCI 1.20g和5.74mmol N-羟基琥珀酰亚胺即NHS 0.66g,于50℃反应4h;减压脱除溶剂,CH2Cl2溶解,依次用10%稀盐酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤,收集有机相,无水MgSO4干燥,过滤,减压脱除溶剂,经柱分离,得2.72mmol黄色粉末1.00g为LP,产率52%;所述柱分离用洗脱液为:V(CH2Cl2):V(乙酸乙酯)=10:1;
(m.p.263-265℃).(KBr,cm-1):1621~1743(CO).1H NMR(CDCl3,400MHz)δ:8.34(s,1H),7.95(d,J=8.0Hz,1H),7.85(d,J=4.0Hz,1H),7.67(d,J=8.0Hz,1H),7.18(d,J=8.0Hz,1H),6.93(s,1H),3.94(t,J1=8.0Hz,J2=4.0Hz,2H,NCH2),3.14(s,3H,NCH3),2.95(t,J1=4.0Hz,J2=8.0Hz,2H,COCH2),2.86(s,4H,2CH2CO),2.68(s,3H,COCH3).13C NMR(CDCl3,100MHz)δ:197.77,168.96,167.16,147.87,137.58,131.32,131.18,130.30,126.41,125.54,124.79,115.99,106.16,60.42,48.18,38.85,28.95,26.49,25.60,21.08
HRMS(EI)m/z:368.9676(calcd for C20H20N2O5:368.1372).Anal.Calcd forC20H20N2O5:C,65.21;H,5.47;N,7.60;O,21.72.Found:C,65.36;H,5.53;N,7.30;O,21.81.
实施例2双光子荧光标记探针标记N蛋白抗原即Ag
采用Marsshall氏法,具体步骤如下:
1)取5mg/mL N蛋白抗原溶液50μL,依次加入碳酸盐缓冲液5μL、2mg/mL含LP的DMF溶液15μL,混匀,于摇床200转/分,25℃,反应2h;所述碳酸盐缓冲液由Na2CO38.6g,NaHCO317.3g,蒸馏水1000mL配制而成,其pH为9.3;
2)超滤纯化:取步骤1)所得液加入超滤管,加0.02mol/L、pH为7.2的磷酸盐缓冲液即PB至超滤管总体积的80%,然后于4℃、8000-10000转/min条件下离心5-20min,重复加PB并离心3-5次即得荧光抗原即LP-Ag沉淀物。
实施例3用于新冠病毒快速检测的免疫层析试纸条
试纸条的组成:样品垫、结合垫、检测G线、检测M线、质控C线、吸水纸、PVC底板;所述样品垫含滤血膜,结合垫包被实施例2所得的荧光抗原。
制作方法步骤如下:
(1)检测线和质控线的制备
用Bio-Dot XYZ-3050自动喷膜机分别将1mg/mL纯化的抗人IgM二抗、抗人IgG二抗、羊抗鼠IgG抗体分别喷涂在硝酸纤维膜即NC膜上的检测M线、检测G线和质控C线位置,划线速度为0.80μL/cm,35℃干燥5h后,4℃密封保存备用;
(2)结合垫包被荧光抗原
荧光抗原(LP-Ag)储存液800μL重悬标记后的LP-Ag沉淀物,制备成2mg/mL的荧光抗原溶液,于1~4℃保存备用;
将结合垫浸泡在缓冲溶液中15min,室温晾干备用;
晾干后的结合垫转入恒温鼓风干燥箱于35℃下干燥2d,用喷膜机以0.20μl/mm划线速度喷涂荧光抗原LP-Ag于结合垫上,包被后转入恒温鼓风干燥箱于35℃下干燥1d;
(3)样品垫预处理
将样品垫浸泡在缓冲溶液中15min,室温晾干备用;将晾干后的样品垫转入恒温鼓风干燥箱于35℃下干燥1d;
(4)试纸条装配
于PVC底板上依次粘贴NC膜、吸收垫、结合垫和样品垫,相邻垫板间距为2mm;NC膜贴紧PVC底板,结合垫与吸收垫搭接在NC膜的两端,样品垫搭在结合垫的一端,如图2所示,即得新冠病毒检测免疫层析试纸条。
前述制备方法中,荧光抗原储存液和缓冲液相同,均为含有5%蔗糖、5%葡萄糖、0.5%吐温20、30mmol L-1MOPS、100mmol L-1KCl、10mmol L-1EGTA的水溶液,其pH为7.2;所述MOPS为3-(N-吗啉代)丙磺酸;所述EGTA为乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸;
实验例试剂盒的组成及应用评价
1、新型冠状病毒2019-nCoV双光子荧光检测试剂盒的组成如下表所示:
2、应用评价
我们将制作的新型冠状病毒2019-nCoV双光子荧光检测试剂盒(荧光免疫层析法)按《体外诊断试剂注册管理办法(试行)》的要求进行临床验证。评价该试剂盒的临床应用性、有效性及适用性。
考核试剂:本发明新型冠状病毒2019-nCoV双光子荧光检测试剂盒(荧光免疫层析法);
对照试剂1:新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)(上海之江生物科技股份有限公司);
对照试剂2:新型冠状病毒(2019-nCoV)抗体检测试剂盒(胶体金法)(广州万孚生物技术股份有限公司)。
具体考核方法、考核结果及分析评价如下:
2.1临床标本收集及储存
(1)本试剂盒适用血清、EDTA抗凝血浆和EDTA抗凝全血样本,建议使用新鲜样本,试剂盒中的免疫层析试纸条采用实施例3方法制备;
(2)血清和血浆样本在2~8℃保存7天,全血样本在2~8℃保存2天,血清、血浆和全血样本在-20±5℃冷冻保存3个月;避免反复冻融;-20±5℃条件下,运输时间不得超过7天;
(3)检测前样本必须恢复至室温;冷冻保存的样本需完全融化、复温、混合均匀后方可使用;避免反复冻融。
(4)样本中加入防腐剂1%proclin300,对实验结果不会产生干扰;
(5)样本中:胆红素≤50mg/dL,血红蛋白≤1000mg/dL,乳糜≤1000mg/dL,不会对试验产生干扰;
2.2判断标准
当在免疫层析试纸条的样品孔中加入测试样品后,出现检测M线和质控C线,未出现检测G线,则IgM呈阳性,IgG呈阴性;
当在免疫层析试纸条的样品孔中加入测试样品后,出现检测G线和质控C线,未出现检测M线,则IgG呈阳性,IgM呈阴性;
当在免疫层析试纸条的样品孔中加入测试样品后,出现检测M线、检测G线和质控C线,则IgG和IgM均呈阳性;
当在免疫层析试纸条的样品孔中加入测试样品后,未出现检测M线和检测G线,但出现质控C线,则IgG和IgM均呈阴性;
当在免疫层析试纸条的样品孔中加入测试样品后,未出现质控C线,则检测结果无效;
2.3临床研究结果及分析
(1)与对照试剂1即新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(PCR法)的比较,如表1所示:
表1 240例样本检测结果:
①阴阳性符合率、总符合率及其95%置信区间:
阳性符合率:78/(78+1)×100%=98.73%
95%CI:p±1.96×[p(1-p)/n]1/2=[96.27%,100.00%]
阴性符合率:159/(2+159)×100%=98.76%
95%CI:p±1.96×[p(1-p)/n]1/2=[97.05%,100.00%]
总体符合率:(78+159)/(78+1+2+159)×100%=98.75%
95%CI:p±1.96×[p(1-p)/n]1/2=[97.34%,100.00%]
式中CI(confidence interval)为置信区间。
②一致性系数Kappa值(K):Kappa=0.972(K>0.75),可以认为本发明免疫层析试纸条和对照试剂检测结果一致性好(K=0.972>0.75);Kappa采用SPSS软件计算;
待考核试剂与对照试剂的【新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(PCR法)】检测结果不存在统计学意义上的差异,一致性分析Kappa=0.972,两种试剂的检测结果具有高度一致性;
③灵敏度(SE),特异度(SP)和准确度(AC)
SE=78/(78+1)×100%=98.73%
SP=159/(2+159)×100%=98.76%
AC=(78+159)/240×100%=98.75%
(2)与对照试剂2即新型冠状病毒(2019-nCoV)抗体检测试剂盒(胶体金法)的比较,如表2所示;
表2 240例样本检测结果:
①阴阳性符合率、总符合率及其95%置信区间:
阳性符合率:113/(113+2)×100%=98.26%
95%CI:p±1.96×[p(1-p)/n]1/2=[95.87%,100.00%]
阴性符合率:124/(1+124)×100%=99.20%
95%CI:p±1.96×[p(1-p)/n]1/2=[97.64%,100.00%]
总体符合率:(113+124)/(113+1+2+124)×100%=98.75%
95%CI:p±1.96×[p(1-p)/n]1/2=[97.34%,100.00%]
②一致性系数Kappa值(K):Kappa=0.975(K>0.75),可认为本发明免疫层析试纸条和对照试剂检测结果一致性好(K=0.975>0.75);
待考核试剂与对照试剂的【新型冠状病毒(2019-nCoV)抗体检测试剂盒(胶体金法)】检测结果不存在统计学意义上的差异,一致性分析Kappa=0.975,两种试剂的检测结果具有高度一致性;
结果显示:本发明免疫层析试纸条及试剂盒与对照试剂的检测结果不存在统计学意义上的差异,一致性分析Kappa>0.75,两种试剂的检测结果具有高度一致性;可认为本发明免疫层析试纸条与上海之江生物科技股份有限公司生产的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)和广州万孚生物技术股份有限公司生产的新型冠状病毒(2019-nCoV)抗体检测试剂盒(胶体金法)检测结果一致性好(K>0.75)。因此,本发明的利用双光子探针LP标记Ag后制成的新型冠状病毒2019-nCoV双光子荧光检测试纸条及试剂盒,可分别测定人全血、血浆、血清中的新型冠状病毒2019-nCoV,通过比较两种检测系统的测定结果,验证本发明的产品和现有核酸检测、抗体检测的试剂盒具有等效性,扩展了新冠病毒检测的途径和手段,具有良好的应用前景。
③灵敏度(SE),特异度(SP)和准确度(AC)
SE=113/(113+2)×100%=98.26%
SP=124/(1+124)×100%=99.20%
AC=(113+124)/240×100%=98.75%。
Claims (9)
3.一种如权利要求1所述的双光子荧光标记探针LP的合成方法,其特征在于,所述合成方法步骤如下:
1)化合物4的合成:在三口烧瓶中加入化合物3和乙腈,搅拌溶解后加入3-溴代丙酸甲酯、NaH2PO4和NaI,氮气保护下于90℃条件下反应后,经减压脱除溶剂后用CH2Cl2溶解,水洗,无水硫酸镁干燥,过滤,减压脱除溶剂后经柱分离,得得黄色粉末,即为3-(N-甲基-N-(6-乙酰基-2-萘基)氨基)丙酸甲酯,即化合物4;所述化合物3、乙腈、3-溴代丙酸甲酯、NaH2PO4和NaI的用量质量比为3.22:86.05:4.07:3.43:1;
2)化合物5的合成:于烧瓶中加入化合物4、NaOH、乙醇和水,室温下搅拌反应,将反应液倒入冰水中,边搅拌边缓慢滴加浓盐酸,析出沉淀,抽滤得固体,乙醇重结晶,得黄色粉末,即为3-(N-甲基-N-(6-乙酰基-2-萘基)氨基)丙酸,即化合物5;所述化合物4、NaOH、乙醇和水的用量质量比为2.39:1:24.46:16.13;
3)LP的合成:用MeCN溶解化合物5,移至三口烧瓶中,冷却至0℃,然后加入三乙胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),于50℃条件下反应,减压脱除溶剂,CH2Cl2溶解,依次用10 %稀盐酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤,收集有机相,无水MgSO4干燥,过滤,减压脱除溶剂,经柱分离,得黄色粉末3-(N-甲基-N-(6-乙酰基-2-萘基)氨基)丙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯,即为双光子荧光标记探针LP;所述化合物5、三乙胺、EDCI、NHS的用量质量比为2.12:2.39:1.82:1。
4.如权利要求3所述的合成方法,其特征在于,步骤1)中所述的柱分离,其洗脱液为二氯甲烷;步骤2)中所述的柱分离,其洗脱液为二氯甲烷、乙酸乙酯按体积比10:1组成。
5.如权利要求1所述的双光子荧光标记探针LP或如权利要求2、3中任一项所述的合成方法得到的探针LP在制备用于新冠病毒快速检测的产品方面的应用,所述用于新冠病毒快速检测的产品为免疫层析试纸条和试剂盒。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述的应用为利用装载LP的检测产品对2019-nCoV的N蛋白抗原进行标记;所述2019-nCoV的N蛋白抗原即为Ag;所述的标记采用Marsshall氏法,具体步骤如下:
1)取抗原溶液,依次加入碳酸盐缓冲液、含LP的DMF溶液,混匀,于摇床200转/分,25℃,反应2h;所述碳酸盐缓冲液由Na2CO3 8.6g, NaHCO3 17.3g, 蒸馏水1000mL配制而成,其pH为9.3;
2)超滤纯化:取步骤1)所得溶液加入超滤管,加磷酸盐缓冲液PBS (Phosphate BufferSolution) (KH2PO4 2 mM, Na2HPO4 8 mM, NaCl 136 mM, KCl 2.6 mM, pH 7.2)至超滤管总体积的80%,然后于4℃、8000-10000转/min条件下离心5-20min,重复加PBS并离心3-5 次即可,即得荧光抗原,即为LP-Ag沉淀物。
7.一种用于新冠病毒快速检测的免疫层析试纸条,由样品垫、结合垫、检测G线、检测M线、质控C线、吸水纸、PVC底板组成;其特征在于,所述样品垫含滤血膜,所述结合垫包被LP-Ag沉淀物。
8.如权利要求7所述的用于新冠病毒快速检测的免疫层析试纸条,其特征在于,所述免疫层析试纸条的制作包括如下步骤:
(1)检测线和质控线的制备
用喷膜机分别将纯化的抗人IgM二抗、抗人IgG二抗、羊抗鼠IgG抗体分别喷涂在硝酸纤维膜即NC膜的检测M线、检测G线和质控C线上,经干燥后,4℃密封保存备用;
(2)结合垫包被荧光抗原
取荧光抗原储存液重悬LP-Ag沉淀物,制备成荧光抗原溶液,于1~4℃保存备用;
将结合垫浸泡在缓冲溶液中15 min,室温晾干备用;
晾干后的结合垫转入恒温鼓风干燥箱于35℃下干燥2d,再用喷膜机喷涂荧光抗原溶液于结合垫上,包被后转入恒温鼓风干燥箱于35℃下干燥;
(3)样品垫预处理
将样品垫浸泡在缓冲溶液中15min,室温晾干备用;将晾干后的样品垫转入恒温鼓风干燥箱于35℃下干燥1d;
(4)试纸条装配
于PVC底板上依次粘贴NC膜、吸收垫、结合垫和样品垫,相邻垫板间距为2mm;NC膜贴紧PVC底板,结合垫与吸收垫搭接在NC膜的两端,样品垫搭在结合垫的一端;
所述荧光抗原储存液与缓冲溶液相同,为含有5%蔗糖、5%葡萄糖、0.5%吐温20、30 mmolL-1 MOPS、100 mmol L-1 KCl、10 mmol L-1 EGTA的水溶液,pH 7.2。
9.一种用于新冠病毒快速检测的试剂盒,由COVID-19 IgM/IgG抗体检测卡/试纸条、如权利要求1所述双光子荧光探针LP冻干品、样品稀释液、产品说明书组成;所述样品稀释液为含有5%蔗糖、5%葡萄糖、0.5%吐温20、30 mmol L-1 MOPS、100 mmol L-1 KCl、10 mmol L-1EGTA的水溶液,pH7.2。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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