CN111494629A

CN111494629A - 用端粒酶抑制剂治疗细胞增殖性病症的诊断标志物

Info

Publication number: CN111494629A
Application number: CN201911349502.4A
Authority: CN
Inventors: E·巴塞特; B·伯林顿; H·王; K·恩格
Original assignee: Geron Corp
Current assignee: Geron Corp
Priority date: 2012-11-30
Filing date: 2013-11-27
Publication date: 2020-08-07
Also published as: KR102174763B1; IL239035B; HUE054053T2; AU2013352105B2; HRP20181991T1; ES2703914T3; KR20210112394A; NZ708654A; AU2019283840A1; EP3882355B1; EP3882355C0; IL270636B; JP6359028B2; DK2925889T3; DK3495495T3; KR102348240B1; CA2892445A1; EP2925889A4; MX362094B; HRP20210451T1

Abstract

本发明涉及用端粒酶抑制剂治疗细胞增殖性病症的诊断标志物。本文中提供用于鉴定会受益于端粒酶抑制剂化合物治疗的诊断有细胞增殖性病症的个体的方法。本文中还提供用端粒酶抑制剂化合物治疗这些个体的方法。该方法包括鉴定会受益于所述治疗的个体，其基于来自所述个体的癌细胞中端粒的平均相对长度。

Description

用端粒酶抑制剂治疗细胞增殖性病症的诊断标志物

本申请是申请日为2013年11月27日、中国申请号为201380070816.5、发明名称为“用端粒酶抑制剂治疗细胞增殖性病症的诊断标志物”的发明申请的分案申请。

对相关申请的交叉引用

本申请要求2012年11月30日提交的美国临时专利申请No.61/732,263、2013年3月13日提交的美国临时专利申请No.61/780,851、2013年3月13日提交的美国专利申请No.13/802,035、2013年3月15日提交的美国临时专利申请No.61/798,478和2013年4月5日提交的美国临时专利申请No.61/809,228的优先权，通过提及将它们的公开内容完整收入本文。

发明领域

本发明涉及用于鉴定会受益于端粒酶抑制剂化合物治疗的具有或怀疑具有癌症的个体的方法及用于治疗这些个体的方法。

发明背景

癌症是全世界死亡的一种主要原因。尽管化学疗法领域有重大进展，但是许多最流行形式的癌症仍然抵抗化学治疗性干预。

端粒是存在于真核生物体的线性染色体末端处的重复核酸序列。端粒序列与端粒结合蛋白一起对染色体赋予稳定性。一般地，端粒由短串联重复构成，重复序列单元由对于生物体而言特定的酶端粒酶规定。端粒重复序列对于多种生物体是已知的。人端粒重复序列单元是(TTAGGG)_n。在双链重复序列外，一些端粒的3’端含有单链区，其对于人而言位于富含G的链上。

端粒酶是一种合成端粒DNA的核糖蛋白(riboprotein)。在缺乏端粒酶的情况中，端粒由于DNA聚合酶不能复制线性双链体DNA的末端而逐渐缩短。端粒的逐渐缩短最终导致细胞周期停滞或细胞死亡。在人中，由于出生前正常体细胞中的端粒酶阻抑、出生时和贯穿整个一生的初始端粒长度、和祖细胞或干细胞中端粒酶受紧密调节的表达，可发生细胞中的端粒长度依赖性死亡。人出生时具有“全长”端粒。由于端粒酶在体细胞组织中是下调的，这导致端粒DNA随细胞年龄和实足年龄而损失。如此，端粒起有丝分裂钟的作用，对正常人细胞赋予有限的分裂能力。短端粒修复干细胞增殖的能力。例如，表皮干细胞中的短端粒修复皮肤和毛发生长。

癌细胞一般经历重复轮次的细胞分裂，并且具有稳定但比正常细胞短的端粒。端粒酶活化对于大多数癌细胞无限复制是必需的，并且它实现肿瘤生长和转移(Kim et al.,Science 266:2011-2015；Shay JW and Wright WE.,Carcinogenesis 26:867-74(2005))。因而，认为抑制端粒酶是一种用于极其多种实体瘤类型和血液学恶性的有希望的治疗策略(Harley CB,Nature Rev.Cancer,8:167-179(2008))。

不幸地，许多癌症患者没有获得来自细胞毒剂或靶向疗法(诸如端粒酶抑制剂)的益处，但是仍然暴露于其毒性效应。出于这些原因，迫切需要用于鉴定会有利地响应这些治疗剂治疗的癌症患者的新颖方法。

贯穿本说明书，提及多篇专利、专利申请和其它类型的出版物(例如期刊文章)。在此通过提及完整收录本文中引用的所有专利、专利申请、和出版物的公开内容用于所有目的。

发明概述

本文中提供的发明公开了用于鉴定会受益于用端粒酶抑制剂疗法治疗的个体的方法和用于治疗该个体的方法，等等。

因而，在一个方面中，本文中提供了用于选择会受益于用端粒酶抑制剂治疗的诊断有或怀疑具有癌症的个体的方法，所述方法包括：通过分析来自所述个体的生物学样品中存在的癌细胞中端粒核酸的相对长度测定相对端粒长度；并在测定来自所述个体的生物学样品中存在的癌细胞中的平均相对端粒长度在自一种或多种已知标准品测定的相对端粒长度范围的第50个百分位数或更小中时，选择会受益于用端粒酶抑制剂治疗的个体。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，端粒酶抑制剂包含寡核苷酸。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸与端粒酶的RNA组分互补。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸的长度是10-20个碱基对。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸包含序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个N3’→P5’硫代氨基磷酸酯核苷间连接。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸包含N3’→P5’硫代氨基磷酸酯核苷间连接。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸包含与寡核苷酸的5’和/或3’端连接的脂质模块。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，脂质模块经由接头与寡核苷酸的5’和/或3’端连接。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，接头是甘油或氨基甘油接头。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，脂质模块是棕榈酰基(C16)模块。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，端粒酶抑制剂是伊美司他(Imetelstat)。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，癌症是小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、或血液学癌症。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，端粒酶抑制剂的施用导致降低的癌细胞增殖和/或肿瘤生长。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，端粒酶抑制剂的施用导致个体中延长的无进展存活。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，与药学可接受赋形剂一起施用端粒酶抑制剂。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，为口服、静脉内、皮下、肌肉内、表面、腹膜内、鼻内、吸入、肿瘤内、或眼内施用配制端粒酶抑制剂。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，施用治疗有效量的端粒酶抑制剂包括使一种或多种癌细胞与端粒酶抑制剂接触。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，施用治疗有效量的端粒酶抑制剂导致降低的细胞增殖、升高的凋亡、或细胞衰老中的一项或多项。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，所述方法进一步包括对所述个体施用治疗有效量的一种或多种别的癌症治疗剂。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，通过qPCR、telo-FISH、或Southern印迹测定平均端粒长度。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，个体是人。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，所述一种或多种已知标准品是经表征的细胞系。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，细胞系选自下组：M14Mel细胞、A549细胞、SK-Mel-5细胞、和Ovcar-5细胞。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，经表征的细胞系选自代表本文中公开的任何实施方案的生物学样品的类型的细胞系。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，经表征的细胞系是非小细胞肺癌细胞系、肝细胞细胞系、或卵巢细胞系。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，所述一种或多种已知标准品是自来自多个个体的多个天然发生肿瘤建立的端粒长度范围。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，所述来自多个天然发生肿瘤的癌细胞是与来自所述个体的生物学样品中存在的癌细胞属于相同类型的。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，确定所述生物学样品中存在的癌细胞的端粒长度在所述端粒长度范围的第40个百分位数、第35个百分位数、第30个百分位数、第25个百分位数、第20个百分位数、第15个百分位数、第10个百分位数、第5个百分位数、或更小中。

在另一个方面中，本文中提供了用于治疗诊断有或怀疑具有癌症的个体的方法，所述方法包括：通过分析来自所述个体的生物学样品中存在的癌细胞中端粒核酸的相对长度测定相对端粒长度；在测定来自所述个体的生物学样品中存在的癌细胞中的平均相对端粒长度在自一种或多种已知标准品测定的相对端粒长度范围的第50个百分位数或更小中时，选择会受益于用端粒酶抑制剂治疗的个体；并对所述个体施用治疗有效量的端粒酶抑制剂。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，端粒酶抑制剂包含寡核苷酸。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸与端粒酶的RNA组分互补。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸的长度是10-20个碱基对。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸包含序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个N3’→P5’硫代氨基磷酸酯核苷间连接。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸包含N3’→P5’硫代氨基磷酸酯核苷间连接。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸包含与寡核苷酸的5’和/或3’端连接的脂质模块。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，脂质模块经由接头与寡核苷酸的5’和/或3’端连接。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，接头是甘油或氨基甘油接头。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，脂质模块是棕榈酰基(C16)模块。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，端粒酶抑制剂是伊美司他。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，癌症是小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、或血液学癌症。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，端粒酶抑制剂的施用导致降低的癌细胞增殖和/或肿瘤生长。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，端粒酶抑制剂的施用导致个体中延长的无进展存活。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，与药学可接受赋形剂一起施用端粒酶抑制剂。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，为口服、静脉内、皮下、肌肉内、表面、腹膜内、鼻内、吸入、肿瘤内、或眼内施用配制端粒酶抑制剂。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，施用治疗有效量的端粒酶抑制剂包括使一种或多种癌细胞与端粒酶抑制剂接触。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，施用治疗有效量的端粒酶抑制剂导致降低的细胞增殖、升高的凋亡、或细胞衰老中的一项或多项。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，所述方法进一步包括对所述个体施用治疗有效量的一种或多种别的癌症治疗剂。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，通过qPCR、telo-FISH、或Southern印迹测定平均端粒长度。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，个体是人。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，所述一种或多种已知标准品是经表征的细胞系。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，细胞系选自下组：M14Mel细胞、A549细胞、SK-Mel-5细胞、和Ovcar-5细胞。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，经表征的细胞系选自代表本文中公开的任何实施方案的生物学样品的类型的细胞系。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，经表征的细胞系是非小细胞肺癌细胞系、肝细胞细胞系、或卵巢细胞系。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，所述一种或多种已知标准品是自来自多个个体的多个天然发生肿瘤建立的端粒长度范围。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，所述来自多个天然发生肿瘤的癌细胞是与来自所述个体的生物学样品中存在的癌细胞属于相同类型的。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，确定所述生物学样品中存在的癌细胞的端粒长度在所述端粒长度范围的第40个百分位数、第35个百分位数、第30个百分位数、第25个百分位数、第20个百分位数、第15个百分位数、第10个百分位数、第5个百分位数、或更小中。

在又一个方面中，本文中提供了用于治疗诊断有或怀疑具有癌症的个体的方法，所述方法包括：在测定来自所述个体的生物学样品中存在的癌细胞中的平均相对端粒长度在自一种或多种已知标准品测定的相对端粒长度范围的第50个百分位数或更小中时，对所述个体施用治疗有效量的端粒酶抑制剂。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，端粒酶抑制剂包含寡核苷酸。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸与端粒酶的RNA组分互补。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸的长度是10-20个碱基对。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸包含序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个N3’→P5’硫代氨基磷酸酯核苷间连接。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸包含N3’→P5’硫代氨基磷酸酯核苷间连接。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸包含与寡核苷酸的5’和/或3’端连接的脂质模块。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，脂质模块经由接头与寡核苷酸的5’和/或3’端连接。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，接头是甘油或氨基甘油接头。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，脂质模块是棕榈酰基(C16)模块。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，端粒酶抑制剂是伊美司他。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，癌症是小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、或血液学癌症。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，端粒酶抑制剂的施用导致降低的癌细胞增殖和/或肿瘤生长。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，端粒酶抑制剂的施用导致个体中延长的无进展存活。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，与药学可接受赋形剂一起施用端粒酶抑制剂。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，为口服、静脉内、皮下、肌肉内、表面、腹膜内、鼻内、吸入、肿瘤内、或眼内施用配制端粒酶抑制剂。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，施用治疗有效量的端粒酶抑制剂包括使一种或多种癌细胞与端粒酶抑制剂接触。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，施用治疗有效量的端粒酶抑制剂导致降低的细胞增殖、升高的凋亡、或细胞衰老中的下列一项或多项。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，所述方法进一步包括对所述个体施用治疗有效量的一种或多种别的癌症治疗剂。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，通过qPCR、telo-FISH、或Southern印迹测定平均端粒长度。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，个体是人。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，所述一种或多种已知标准品是经表征的细胞系。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，细胞系选自下组：M14Mel细胞、A549细胞、SK-Mel-5细胞、和Ovcar-5细胞。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，经表征的细胞系选自代表本文中公开的任何实施方案的生物学样品的类型的细胞系。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，经表征的细胞系是非小细胞肺癌细胞系、肝细胞细胞系、或卵巢细胞系。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，所述一种或多种已知标准品是自来自多个个体的多个天然发生肿瘤建立的端粒长度范围。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，所述来自多个天然发生肿瘤的癌细胞是与来自所述个体的生物学样品中存在的癌细胞属于相同类型的。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，确定所述生物学样品中存在的癌细胞的端粒长度在所述端粒长度范围的第40个百分位数、第35个百分位数、第30个百分位数、第25个百分位数、第20个百分位数、第15个百分位数、第10个百分位数、第5个百分位数、或更小中。

本申请涉及下述技术方案。

1.一种选择会受益于端粒酶抑制剂治疗的诊断有或怀疑具有癌症的个体的方法，该方法包括：

a.通过分析来自该个体的生物学样品中存在的癌细胞中端粒核酸的相对长度测定相对端粒长度；并

b.在确定来自该个体的生物学样品中存在的癌细胞中的平均相对端粒长度在自一种或多种已知标准品测定的相对端粒长度范围的第50个百分位数或更小中时，选择会受益于端粒酶抑制剂治疗的个体。

2.一种治疗诊断有或怀疑具有癌症的个体的方法，该方法包括：

a.通过分析来自该个体的生物学样品中存在的癌细胞中端粒核酸的相对长度测定相对端粒长度；

b.在确定来自该个体的生物学样品中存在的癌细胞中的平均相对端粒长度在自一种或多种已知标准品测定的相对端粒长度范围的第50个百分位数或更小中时，选择会受益于端粒酶抑制剂治疗的个体；并

c.对该个体施用治疗有效量的端粒酶抑制剂。

3.一种治疗诊断有或怀疑具有癌症的个体的方法，该方法包括：在确定来自该个体的生物学样品中存在的癌细胞中的平均相对端粒长度在自一种或多种已知标准品测定的相对端粒长度范围的第50个百分位数或更小中时，对该个体施用治疗有效量的端粒酶抑制剂。

4.实施方案2的方法，其中所述端粒酶抑制剂包含寡核苷酸。

5.实施方案4的方法，其中所述寡核苷酸与端粒酶的RNA组分互补。

6.实施方案5的方法，其中所述寡核苷酸的长度是10-20个碱基对，且包含至少一个N3’→P5’硫代氨基磷酸酯核苷间连接。

7.实施方案5的方法，其中所述端粒酶抑制剂是伊美司他(Imetelstat)。

8.实施方案1的方法，其中所述癌症是实体瘤。

9.实施方案1的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上胃肠道癌、胃癌、胆囊癌、卵巢癌、成胶质细胞瘤、肉瘤或血液学癌症。

10.实施方案2的方法，其中与药学可接受赋形剂一起施用所述端粒酶抑制剂。

11.实施方案1的方法，其进一步包括对该个体施用治疗有效量的一种或多种别的癌症治疗剂。

12.实施方案1的方法，其中通过qPCR、telo-FISH、或Southern印迹测定平均端粒长度。

13.实施方案1的方法，其中所述个体是人。

14.实施方案1的方法，其中所述一种或多种已知标准品是经表征的细胞系。

15.实施方案14的方法，其中所述细胞系选自下组：M14细胞、A549细胞、SK-5细胞、和Ovcar5细胞。

16.实施方案14的方法，其中所述经表征的细胞系选自代表实施方案1的生物学样品的类型的细胞系。

17.实施方案16的方法，其中所述经表征的细胞系是非小细胞肺癌细胞系、肝细胞细胞系、或卵巢细胞系。

18.实施方案1的方法，其中所述一种或多种已知标准品是自来自多个个体的多个天然发生肿瘤建立的端粒长度范围。

19.实施方案18的方法，其中所述来自多个天然发生肿瘤的癌细胞是与来自所述个体的生物学样品中存在的癌细胞属于相同类型的。

20.实施方案1的方法，其中确定所述生物学样品中存在的癌细胞中的端粒长度在所述端粒长度范围的第40个百分位数、第35个百分位数、第30个百分位数、第25个百分位数、第20个百分位数、第15个百分位数、第10个百分位数、第5个百分位数、或更小中。

附图简述

图1A描绘了基于使用定量PCR(qPCR)测定的平均端粒长度，伊美司他非小细胞(NSC)肺癌II期(CP14B-012)研究的短端粒亚组(33个百分位数)的无进展存活(PFS)分析，如实施例2中显示的。

图1B描绘了基于使用定量PCR(qPCR)测定的平均端粒长度，伊美司他非小细胞(NSC)肺癌II期(CP14B-012)研究的中等-长端粒亚组(相对端粒长度的较长67％)的无进展存活(PFS)分析，如实施例2中显示的。

图2描绘了来自伊美司他非小细胞(NSC)肺癌II期(CP14B-012)研究的伊美司他治疗分组中具有相对端粒长度的最短第25个百分位数的15名患者的数据的无进展存活(PFS)分析。使用端粒荧光原位杂交(Telo-FISH)完成这些患者的个体端粒长度的分析。

图3小图A描绘了福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)人肿瘤细胞系M14Mel、OVCAR-8、A549、SK-Mel-5、MDA-MB-231、MDA-MB435、OVCAR-5、A498和CAKI-1中的末端限制性片段(TRF)长度，如通过Southern印迹测定的。

图3小图B描绘了福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)人肿瘤细胞系M14Mel、OVCAR-8、A549、SK-Mel-5、MDA-MB-231、MDA-MB435、OVCAR-5、A498和Caki-1中的平均T/S比，如通过定量PCR(qPCR)测定的。

图4小图A描绘了福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)人肿瘤细胞系M14Mel、OVCAR-8、A549、SK-Mel-5、MDA-MB-231、MDA-MB435、OVCAR-5、A498和CAKI-1中的末端限制性片段(TRF)长度，如通过Southern印迹测定的。

图4小图B描绘了人细胞系M14Mel、A549、SK-Mel-5、和OVCAR-5(OV5)的Telo-FISH结果。

图5描绘了相对于患者端粒长度百分位数绘图的来自伊美司他非小细胞(NSC)肺癌II期(CP14B-012)研究的患者的无进展存活(PFS)危害比(HR)，其中通过定量PCR(qPCR)测定相对端粒长度。

图6描绘了相对于患者端粒长度百分位数绘图的来自伊美司他非小细胞(NSC)肺癌II期(CP14B-012)研究的患者的无进展存活(PFS)危害比(HR)，其中通过端粒荧光原位杂交(Telo-FISH)测定相对端粒长度。

图7描绘了基于使用前瞻性端粒荧光原位杂交(Telo-FISH)测定法测定的相对端粒长度，对伊美司他非小细胞肺癌II期(CP14B-012)研究的所有114名患者的无进展存活(PFS)分析。

图8小图A描绘了基于使用前瞻性Telo-FISH测定法测定的相对端粒长度，对伊美司他非小细胞肺癌II期(CP14B-012)研究的短端粒亚组(N＝20)的无进展存活(PFS)分析。

图8小图B描绘了基于使用前瞻性Telo-FISH测定法测定的相对端粒长度，对伊美司他非小细胞肺癌II期(CP14B-012)研究的中等-长端粒亚组(N＝39)的无进展存活(PFS)分析。

图9描绘了基于使用前瞻性Telo-FISH测定法测定的相对端粒长度，对伊美司他非小细胞肺癌II期(CP14B-012)研究中的所有患者(N＝114)的总体存活(OS)分析。

图10小图A描绘了基于使用前瞻性Telo-FISH测定法测定的相对端粒长度，对伊美司他非小细胞肺癌II期(CP14B-012)研究中的短端粒亚组(N＝20)的总体存活(OS)分析。

图10小图B描绘了基于使用前瞻性Telo-FISH测定法测定的相对端粒长度，对伊美司他非小细胞肺癌II期(CP14B-012)研究中的中等-长端粒亚组(N＝39)的总体存活(OS)分析。

图11小图A描绘了基于使用定量PCR(qPCR)测定的平均端粒长度，对伊美司他非小细胞(NSC)肺癌II期(CP14B-012)研究的短端粒亚组(33个百分位数)的无进展存活(PFS)分析，如实施例4中显示的。

图11小图B描绘了基于使用定量PCR(qPCR)测定的平均端粒长度，对伊美司他非小细胞(NSC)肺癌II期(CP14B-012)研究的中等-长端粒亚组(相对端粒长度的较长67％)的无进展存活(PFS)分析，如实施例4中显示的。

发明详述

本发明特别提供了用于鉴定会受益于用端粒酶抑制剂化合物治疗的怀疑具有或已经诊断有细胞增殖性病症的个体的方法以及用于治疗这些个体的方法。癌细胞中的端粒长度可以在肿瘤间变化。发明人已经观察到与具有较长端粒长度的癌细胞相比，具有较短端粒长度的癌细胞对用端粒酶抑制剂化合物(例如伊美司他)治疗更具响应性。因而，本文中提供了用于选择会受益于用端粒酶抑制剂治疗的诊断有或怀疑具有癌症的个体的方法。本文中还提供了在测定来自下述个体的生物学样品中存在的癌细胞中的平均相对端粒长度在自一种或多种已知标准品测定的相对端粒长度范围的第50个百分位数或更小中时，用端粒酶抑制剂治疗诊断有或怀疑具有癌症的个体的方法。

I.通用技术

除非另有指示，本发明的实施会采用核酸化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学、和免疫学中的常规技术，其是本领域技术人员公知的。在文献中完整解释了此类技术，所述文献诸如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Sambrook etal.,1989)和Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版(Sambrook and Russel,2001)(在本文中共同称为“Sambrook”)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.,eds.,1987,包括到2001的增刊)；PCR:The Polymerase ChainReaction,(Mullis et al.,eds.,1994)。可以通过公知的化学合成技术体外合成核酸，如记载于例如Carruthers(1982)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47:411-418；Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105:661；Belousov(1997)Nucleic Acids Res.25:3440-3444；Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19:373-380；Blommers(1994)Biochemistry 33:7886-7896；Narang(1979)Meth.Enzymol.68:90；Brown(1979)Meth.Enzymol.68:109；Beaucage(1981)Tetra.Lett.22:1859；Komberg and Baker,DNA Replication,2nd Ed.(Freeman,San Francisco,1992)；Scheit,Nucleotide Analogs(John Wiley,New York,1980)；Uhlmann and Peyman,Chemical Reviews,90:543-584,1990。

II.定义

术语“核苷”指具有下文表示的一般结构的模块，其中B代表核碱基，并且2’碳可以是取代的，如下文描述的。在掺入寡聚体或多聚体中时，3’碳与氧或氮原子进一步连接。

此结构包括2’-脱氧和2’-羟基(即脱氧核糖和核糖)形式及类似物。不太常见地，可以用5’-NH基团取代5’-氧。提及核苷的“类似物”包括具有经修饰的核碱基模块(见下述“核碱基”的定义)和/或经修饰的糖模块(诸如2’-氟糖)的合成核苷及其它类似物。此类类似物通常设计为影响结合特性，例如稳定性、特异性、等。术语核苷包括天然核苷，包括2’-脱氧和2’-羟基形式(例如如记载于Komberg and Baker,DNA Replication,2nd Ed.(Freeman,San Francisco,1992)的)及类似物。提及核苷的“类似物”包括具有经修饰的核碱基模块(见下述“核碱基”的定义)和/或经修饰的糖模块的合成核苷，例如一般由Scheit,Nucleotide Analogs(John Wiley,New York,1980)描述的。此类类似物包括设计为增强结合特性(例如稳定性、特异性、等)的合成核苷，诸如由Uhlmann and Peyman,ChemicalReviews 90:543-584,1990披露的。含有此类核苷并且通常含有合成核酸酶抗性核苷间连接的寡核苷酸自身可以称为“类似物”。

“多核苷酸”或“寡核苷酸”指具有约2个至约200个连续亚单元的核糖和/或脱氧核糖核苷亚单元多聚体或寡聚体。可以通过多种亚单元间连接(包括但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、P3’→N5’氨基磷酸酯、N3’→P5’氨基磷酸酯、N3→P5’硫代氨基磷酸酯、和硫代磷酸酯连接)连接核苷亚单元。该术语还包括具有本领域技术人员已知的对糖(例如2’取代)、碱基(见上述“核苷”的定义)、和3’和5’末端的修饰的此类多聚体或寡聚体。在寡核苷酸模块包括多个亚单元间连接的实施方案中，可以使用相同化学形成每个连接，或者可以使用混合的连接化学。在以字母序列(诸如“ATGUCCTG”)表示寡核苷酸时，应当理解核苷酸从左至右为5’→3’次序。以此方式表示寡核苷酸的碱基序列不暗示在寡核苷酸中使用任何特定类型的核苷间亚单元。

“核碱基”包括(i)天然的DNA和RNA核碱基(尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、和胞嘧啶)，(ii)经修饰的核碱基或核碱基类似物(例如5-甲基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、或次黄嘌呤/肌苷)和(iii)核碱基类似物。核碱基类似物是其分子结构模拟典型的DNA或RNA碱基的分子结构的化合物。

术语“脂质”在本文中广泛使用，涵盖在有机溶剂中可溶，但在水中略溶(即使有的话)的物质。术语脂质包括但不限于碳水化合物、油、脂肪(诸如脂肪酸和甘油酯)、固醇、类固醇和这些化合物的衍生物形式。在一些实施方案中，脂质是脂肪酸及其衍生物、碳水化合物及其衍生物、和固醇，诸如胆固醇。脂肪酸通常含有偶数数目的直链中的碳原子(通常12-24个碳)，并且可以是饱和的或不饱和的，并且可以含有或修饰为含有多个取代基基团。为了简明，术语“脂肪酸”还涵盖脂肪酸衍生物，诸如脂肪或酯。在一些实施方案中，术语“脂质”还包括含有脂质和亲水性模块两者的两亲性化合物。

如本文中使用的，“端粒核酸”意指双链或单链核酸上编码哺乳动物的端粒序列的核酸序列。在人中，端粒重复序列是一条链上的TTAGGG和另一条链上的CCCTAA。

“端粒酶抑制剂”是能够降低或抑制哺乳动物细胞中酶端粒酶逆转录酶活性的化合物。此类抑制剂可以是小分子化合物(诸如本文中描述的)或包括寡核苷酸的hTR模板抑制剂(诸如本文中描述的)。在一个方面中，端粒酶抑制剂是伊美司他。

“hTR模板抑制剂”是一种封闭人端粒酶的RNA组分的模板区(跨越本文中的SEQ IDNO:1的核苷酸30-67的区域)，由此抑制酶活性的化合物。抑制剂通常是能够与此区域杂交的寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与此区域的一个更具体的部分有效杂交的序列，该部分具有序列5’-CUAACCCUAAC-3’(SEQ ID NO:2)，其跨越本文中的SEQ ID NO:1的核苷酸46-56。

若在化合物存在下细胞的增殖小于在化合物缺乏下观察到的增殖，则说该化合物“抑制细胞增殖”。也就是说，细胞增殖在化合物存在下减缓或停止。例如，可以通过细胞数目的减少、细胞扩充速率的降低、肿瘤质量的减少、肿瘤生长速率的降低、或所治疗的受试者的存活率的升高证明对癌细胞增殖的抑制。

具有“核酸酶抗性连接”的寡核苷酸指其主链具有对由身体中的常见胞外和胞内核酸酶进行的核酸酶切割(处于非杂交的或杂交的形式)实质上有抗性的亚基连接的寡核苷酸；也就是说，寡核苷酸在身体中所暴露的正常核酸酶条件下显示很少或无核酸酶切割。下文所述的N3’→P5’氨基磷酸酯(NP)或N3’→P5’硫代氨基磷酸酯(NPS)连接是核酸酶抗性的。

“个体”可以是哺乳动物，诸如任何常见的实验室模型生物体。哺乳动物包括但不限于人和非人灵长类、家畜、运动动物、宠物、小鼠、大鼠、和其它啮齿类。在一些实施方案中，个体是人。

如本文中使用的，“治疗/处理”(及其语法变型)指设计为在临床病理学过程期间改变是治疗/处理的个体或细胞的天然过程的临床干预。治疗/处理的期望效果包括但不限于降低疾病进展速率、改善或减轻疾病状态、和消退或改善的预后。

如本文中使用的，“预防”包括就个体中疾病或与疾病有关的症状的发生或复发而言提供预防。个体可以对疾病有素因、对疾病易感、或有风险形成疾病，但是尚未诊断有疾病。

“有效量”或“治疗有效量”指治疗性化合物(诸如端粒酶抑制剂)作为单剂或系列剂的一部分对哺乳动物受试者施用时有效产生期望治疗效果的量。

“生物学样品”是自个体获得的组织、血液、淋巴液、或脑流体的样品。生物学样品可以是在自个体消除癌性生长期间获得的样品。生物学样品可以包括新鲜的组织或福尔马林固定、石蜡包埋的组织或冷冻的组织。

如本文中使用的，除非另有指示，单数形式“一个”、“一种”和“所述/该”包括复数提及物。

应当理解，本文中描述的发明的各方面和实施方案包括“包含”、“由……组成”、和“基本上由……组成”方面和实施方案。

贯穿此说明书给出的每个最大数值限度意图包括每个更低的数值限度，就像在本文中明确写出此类更低数值限度一样。贯穿此说明书给出的每个最小数值限度会包括每个更高数值显著，就像在本文中明确写出此类更高数值限度一样。贯穿此说明书给出的每个数值范围会包括落入此类较宽的数值范围内的每个较窄的数值范围，就像此类较窄的数值范围都在本文中明确写出一样。

III.端粒酶抑制剂化合物

端粒酶是一种催化对染色体末端添加端粒重复序列(在人中具有序列5’-TTAGGG-3’)的核糖核蛋白。见例如Blackburn,1992,Ann.Rev.Biochem.61:113-129。该酶在大多数癌细胞中而不在成熟的体细胞中表达。端粒DNA的损失在触发细胞衰老中可以发挥作用；见Harley,1991,Mutation Research 256:271-282。已经显示了多种癌细胞呈端粒酶阳性，包括来自皮肤、结缔组织、脂肪、乳腺、肺、胃、胰腺、卵巢、宫颈、子宫、肾、膀胱、结肠、前列腺、中枢神经系统(CNS)、视网膜癌和血液学肿瘤(诸如骨髓瘤、白血病和淋巴瘤)的细胞。端粒酶的靶向能有效提供以较高程度区分恶性和正常细胞的治疗，这避免可以伴随不加区分地靶向分裂细胞的化疗方案的许多有害副作用。

至今鉴定的端粒酶抑制剂包括寡核苷酸(例如具有核酸酶抗性连接的寡核苷酸)及小分子化合物。关于端粒酶抑制剂化合物的进一步信息可以参见美国专利No.7,998,938，通过提及将其公开内容完整收入本文。

A.小分子化合物

端粒酶的小分子抑制剂包括例如BRACO19(9-(4-(N,N-二甲基氨基)苯基氨基)-3,6-二(3-吡咯烷基丙酰胺基)吖啶，9-(4-(N,N-dimethylamino)phenylamino)-3,6-bis(3-pyrrolodino propionamido)acridine)(见Mol.Pharmacol.61(5):1154-62,2002)；DODC(二乙基氧杂二羰花青，diethyloxadicarbocyanine)、和telomestatin。这些化合物可以起G四联体(G-quad)稳定剂的作用，促进端粒酶的RNA组分中无活性G四联体构型的形成。端粒酶的其它小分子抑制剂包括BIBR1532(2-[(E)-3-萘亚甲-2-基丁-2-烯酰基氨基]苯甲酸，2-[(E)-3-naphthen-2-yl but-2-enoylamino]benzoic acid)(见Ward&Autexier,Mol.Pharmacol.68:779-786,2005；还可见J.Biol.Chem.277(18):15566-72,2002)；AZT和其它核苷类似物，诸如ddG和ara-G(见例如美国专利No.5,695,932和6,368,789)、和某些硫代吡啶(thiopyridine)、苯并[b]噻吩、和吡啶并[b]噻吩衍生物，其记载于Gaeta等人的美国专利No.5,767,278、5,770,613、5,863,936、5,656,638和5,760,062，通过提及将其公开内容收入本文。另一个例子是3-氯苯并[b]噻吩-2-羧基-2’-[(2,5-二氯苯基氨基)硫代]肼(3-chlorobenzo[b]thiophene-2-carboxy-2'-[(2,5-dichlorophenylamino)thia]hydrazine)，其记载于美国专利No.5,760,062，通过提及将其收入本文。

B.基于寡核苷酸的端粒酶抑制剂：序列和组成

已经克隆并测序编码人端粒酶的蛋白质和RNA组分两者的基因(分别见美国专利No.6,261,836和5,583,016，通过提及将这两篇收入本文)。寡核苷酸可以靶向性针对编码端粒酶蛋白组分(其人形式称为人端粒酶逆转录酶，或hTERT)的mRNA或端粒酶全酶的RNA组分(其人形式称为人端粒酶RNA，或hTR)。

在所附序列表(SEQ ID NO:1)中以5’→3’方向显示了人端粒酶的RNA组分(hTR)的核苷酸序列。使用核糖核苷酸的标准缩写显示序列；本领域技术人员会认识到序列还代表cDNA的序列，其中用脱氧核糖核苷酸替换核糖核苷酸，其中用胸苷(T)替换尿苷(U)。RNA组分的模板序列位于以核苷酸46-56(5’-CUAACCCUAAC-3’)(SEQ ID NO:2)限定的区域内，该区域与由约一又三分之二的端粒重复单元构成的端粒序列互补。模板区功能为规定端粒酶对染色体末端添加的端粒重复的序列并且对于酶端粒酶的活性是至关重要的(见例如Chenet al.,Cell 100:503-514,2000；Kim et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(14):7982-7987,2001)。为了抑制mRNA或引起mRNA破坏的反义、核酶或小干扰RNA(siRNA)剂设计是公知的(见例如Lebedeva,I.et al.,Annual Review of Pharmacology and Toxicology,Vol.41:403-419,April 2001；Macejak,D.et al.,Journal of Virology,Vol.73(9):7745-7751,September 1999；Zeng,Y.et al.,PNAS Vol.100(17)p.9779-9784,Aug.19,2003)，并且此类药剂可以设计为靶向hTERT mRNA，并且由此抑制靶细胞(诸如癌细胞)中的hTERT蛋白生成(见例如美国专利No.6,444,650和6,331,399)。

靶向hTR(也就是说，酶的RNA组分)的寡核苷酸通过阻断或以其它方式干扰hTR与hTERT蛋白的相互作用来起端粒酶酶活性的抑制剂作用，所述相互作用对于端粒酶功能是必需的(见例如Villeponteau等人的美国专利No.6,548,298)。

hTR的一个优选靶区域是模板区，其跨越SEQ ID NO:1(GGGUUGCGGAGGGUGGGCCUGGGAGGGGUGGUGGCCAUUUUUUGUCUAACCCUAACUGAGAAGGGCGUAGGCGCCGUGCUUUUGCUCCCCGCGCGCUGUUUUUCUCGCUGACUUUCAGCGGGCGGAAAAGCCUCGGCCUGCCGCCUUCCACCGUUCAUUCUAGAGCAAACAAAAAAUGUCAGCUGCUGGCCCGUUCGCCUCCCGGGGACCUGCGGCGGGUCGCCUGCCCAGCCCCCGAACCCCGCCUGGAGCCGCGGUCGGCCCGGGGCUUCUCCGGAGGCACCCACUGCCACCGCGAAGAGUUGGGCUCUGUCAGCCGCGGGUCUCUCGGGGGCGAGGGCGAGGUUCACCGUUUCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGUCCCGCCGCGGCGCGAUUCCCUGAGCUGUGGGACGUGCACCCAGGACUCGGCUCACACAUGCAGUUCGCUUUCCUGUUGGUGGGGGGAACGCCGAUCGUGCGCAUCCGUCACCCCUCGCCGGCAGUGGGGGCUUGUGAACCCCCAAACCUGACUGACUGGGCCAGUGUGCU)的核苷酸30-67。靶向此区域的寡核苷酸在本文中称为“hTR模板抑制剂”(见例如Herbertet al.,Oncogene 21(4):638-42(2002))。优选地，此类寡核苷酸包括与具有序列5’-CUAACCCUAAC-3’(SEQ ID NO:2)(其跨越SEQ ID NO:1的核苷酸46-56)的11个核苷酸的区域的一些部分互补或近互补的序列。

另一个优选的靶区域是跨越hTR的核苷酸137-179的区域(见Pruzan et al.,Nucl.Acids Research,30:559-568,2002)。在此区域内，跨越141-153的序列是一个优选的靶物。PCT公开文本WO 98/28442描述了长度为至少7个核苷酸的寡核苷酸抑制端粒酶的用途，其中寡核苷酸设计为与hTR序列中在模板区以外的易接近部分(包括hTR的核苷酸137-196、290-319、和350-380)互补。

优选地，治疗性寡核苷酸中靶向hTR序列的区域与相应的hTR序列完全互补。虽然错配在某些情况中可以是耐受的，但是预期它们降低所得寡核苷酸缀合物的特异性和活性。在具体的实施方案中，选择寡核苷酸的碱基序列使得包括与hTR靶物完全互补的至少5个核苷酸的序列，并且若采用长度增加的互补序列，诸如与hTR靶物完全互补的至少8、至少10、至少12、至少13或至少15个核苷酸，则可以获得增强的端粒酶抑制。在其它实施方案中，寡核苷酸的序列包括与hTR靶序列完全互补的至少5至20、至少8至20、至少10至20或至少10至15个核苷酸的序列。

在寡核苷酸的全长选择为与hTR靶序列互补时可以获得最佳端粒酶抑制活性。然而，寡核苷酸的全长与靶序列完全互补不是必要的，并且寡核苷酸序列可以包含不与靶序列互补的区域。例如，可以添加此类区域以对化合物赋予其它特性，诸如便于纯化的序列。或者，寡核苷酸可以包括与hTR靶序列互补的序列的多个重复。

若寡核苷酸要包括不与靶序列互补的区域，则此类区域通常位于5’或3’端之一或两者。靶向人端粒酶RNA(hTR)的例示性序列包括下列各项：

寡核苷酸中的核苷间连接可以包含任何可用的寡核苷酸化学，例如磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、P3’→N5’氨基磷酸酯、N3’→P5’氨基磷酸酯、N3’→P5’硫代氨基磷酸酯、和硫代磷酸酯。通常但不必要，寡核苷酸内的所有核苷间连接会是相同类型的，尽管可以使用不同连接的混合来合成寡核苷酸组分。

在一些实施方案中，寡核苷酸具有至少一个N3’→P5’氨基磷酸酯(NP)或N3’→P5’硫代氨基磷酸酯(NPS)连接，该连接可以以下述结构表示：3’-(-NH--P(＝O)(--XR)--O-)-5’，其中X是O或S，且R选自下组：氢、烃基、和芳基；及其药学可接受盐，此时XR是OH或SH。在其它实施方案中，寡核苷酸包括所有NP或(在一些实施方案中)所有NPS连接。

在一个实施方案中，hTR模板抑制剂寡核苷酸的序列是与上述SEQ ID NO:1的核苷酸42-54互补的序列。具有此序列(TAGGGTTAGACAA；SEQ ID NO:3)和N3’→P5’硫代氨基磷酸酯(NPS)连接的寡核苷酸在本文中称为GRN163。见例如Asai et al.,Cancer Research 63:3931-3939(2003)及Gryaznov et al.,Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 22(5-8):577-81(2003)。

单独施用的寡核苷酸GRN163已经在细胞培养物(包括表皮样癌、乳房上皮、肾癌、肾腺癌、胰腺、脑、结肠、前列腺、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、表皮、宫颈、卵巢和肝癌细胞)中显示了体外抑制活性。

还已经测试寡核苷酸GRN163，并且显示了其在多种动物肿瘤模型中是治疗有效的，所述动物肿瘤模型包括卵巢和肺(小细胞和非小细胞两者)(见例如美国专利No.7,998,938，通过提及收录其公开内容)。

C.脂质-寡核苷酸缀合物

在一些方面，本文中公开的基于寡核苷酸的端粒酶抑制剂包含至少一个共价连接的脂质基团(见美国公开文本No.2005/0113325，通过提及将其收入本文)。此修饰提供卓越的细胞摄取特性，使得与未修饰的形式相比可以使用更小量的缀合寡核苷酸获得等同的生物学效果。在应用于人治疗背景时，这可以转变为降低的毒性风险和成本节约。

脂质基团L通常是脂肪族碳氢化合物或脂肪酸，包括碳氢化合物和脂肪酸的衍生物，例子是具有14-20个碳的饱和直链化合物，诸如肉豆蔻(十四烷)酸、棕榈(十六烷)酸、和硬脂(十八烷)酸、及其相应的脂肪族碳氢化合物形式，即十四烷、十六烷和十八烷。可以采用的其它合适脂质基团的例子是固醇(诸如胆固醇)，和取代的脂肪酸和碳氢化合物，特别是这些基团的多氟化形式。脂质基团L的范围包括衍生物，诸如胺、酰胺、酯和氨基甲酸酯衍生物。经常通过与寡核苷酸连接的模式确定衍生物的类型，如下文例示的。

在一种例示性的结构中，脂质模块是经由氨基甘油接头与NPS连接的寡核苷酸的5’硫代磷酸酯基团缀合的棕榈酰基酰胺(自棕榈酸衍生)。具有对GRN163显示的序列并且以此方式缀合的NPS寡核苷酸(如下文显示)在本文中称作GRN163L(伊美司他)。在第二种例示性的结构中，经由NPS寡核苷酸的末端3’氨基基团缀合脂质(作为棕榈酰基酰胺)。

D.药物组合物

在本发明的一些方面中，在作为药物采用时，可以用药学可接受赋形剂或载剂配制本文中公开的端粒酶抑制剂化合物以配制为药物组合物。

在作为药物采用时，可以以药物组合物的形式施用端粒酶抑制剂化合物。可以通过多种路径(包括口服、直肠、经皮、皮下、静脉内、肌肉内、和鼻内)施用这些化合物。这些化合物作为可注射和口服组合物两者是有效的。此类组合物以药学领域中公知的方式制备，并且包含至少一种活性化合物。在作为口服组合物采用时，通过药学可接受保护剂保护本文中公开的端粒酶抑制剂化合物免于胃中的酸消化。

本发明还包括药物组合物，其含有与一种或多种药学可接受赋形剂或载剂联合的作为活性成分的端粒酶抑制剂化合物。在生成本发明的组合物中，通常将活性成分与赋形剂或载剂混合，通过赋形剂或载剂稀释或封闭在此类赋形剂或载剂内，可以为胶囊、囊剂、纸或其它容器形式。在赋形剂或载剂充当稀释剂时，它可以是固体、半固体、或液体材料，其起活性成分的媒介、载剂或介质的作用。如此，组合物可以为片剂、丸剂、粉剂、锭剂、囊剂、扁囊剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂(作为固体或在液体介质中)、含有例如按重量计多至10％的活性化合物的软膏剂、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌可注射溶液、和无菌包装粉剂形式。

在制备配制剂中，可能有必要碾磨活性冻干化合物以提供合适的粒度，之后与其它成分组合。若活性化合物是基本上不溶的，则通常将它碾磨至小于200目的粒度。若活性化合物是基本上水溶性的，则通常通过碾磨调节粒度以提供配制剂中的基本上均一的分布，例如约40目。

合适的赋形剂或载剂的一些例子包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆、和甲基纤维素。另外，配制剂可以包含：润滑剂，诸如滑石、硬脂酸镁、和矿物油；湿润剂；乳化和悬浮剂；防腐剂，诸如苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯；甜味剂；和芳香剂。可以配制本发明的组合物，从而在通过采用本领域中已知规程对患者施用后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。

可以以单位剂量形式配制组合物，每个剂量含有约5mg至约100mg或更多，诸如约1mg至约5mg、1mg至约10mg、约1mg至约20mg、约1mg至约30mg、约1mg至约40mg、约1mg至约50mg、约1mg至约60mg、约1mg至约70mg、约1mg至约80mg、或约1mg至约90mg(包括端点在内)中任一项(包括这些数值间的任何范围)的活性成分。术语“单位剂量形式”指适合作为个体的单个剂量的物理离散单元，每个单元含有与合适的药用赋形剂或载剂联合的计算为产生期望治疗效果的预先确定量的活性材料。

端粒酶抑制剂化合物在宽剂量范围里是有效的，并且一般以治疗有效量施用。然而，应当理解，内科医生会根据相关情况(包括要治疗的状况、选择的施用路径、施用的实际化合物、个体患者的年龄、重量和响应、患者症状的严重性、等)确定实际施用的端粒酶抑制剂化合物量。

为了制备固体组合物(诸如片剂)，混合主要活性成分端粒酶抑制剂化合物与药用赋形剂或载剂以形成含有本发明化合物的均质混合物的固体预配制组合物。在这些预配制组合物称为均质时，意味着活性成分是遍及组合物均匀分散的，从而能容易将组合物细分成同等有效的单位剂量形式，诸如片剂、丸剂和胶囊。

本发明的片剂或丸剂可以包衣或以其它方式复合以提供给予延长作用并且保护端粒酶抑制剂化合物免于胃中酸水解的优点的剂量形式。例如，片剂或丸剂可以包含内部剂量和外部剂量组分，后一种为前一种上的包层形式。两种组分可以以肠层分开，所述肠层用来抵抗胃中的崩解，并且容许内部组分完整进入十二指肠中或者在释放上延迟。可以对此类肠层或涂层材料使用多种材料，此类材料包括许多聚合酸(polymeric acid)和聚合酸与诸如虫漆、鲸蜡醇、和乙酸纤维素等材料的混合物。

可以掺入本发明的新颖组合物以口服或通过注射施用的液体形式包括水性溶液、适当调味的糖浆、水性或油悬浮液、和具有食用油(诸如玉米油、棉籽油、芝麻油、椰子油、或花生油)的调味乳剂、及酏剂和类似的药用媒介。

用于吸入或吹入的组合物包括药学可接受水性或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液，以及粉末。液体或固体组合物可以含有合适的药学可接受赋形剂，如上文描述的。可以通过口服或鼻呼吸路径施用组合物以实现局部或系统性效果。可以通过使用惰性气体喷雾药学可接受溶剂中的组合物。可以自喷雾装置直接吸入喷雾溶液或者可以将喷雾装置与面罩帐，或间歇正压呼吸机附接。也可以自以合适方式投递配制剂的装置口服或鼻施用溶液、悬浮液、或粉末组合物。

IV.本发明的方法

在一些方面中，本文中提供了用于选择会受益于用端粒酶抑制剂治疗的诊断有或怀疑具有癌症的个体的方法。这些方法基于测定来自个体的生物学样品中存在的癌细胞中端粒的平均相对长度。若测定来自个体的生物学样品中存在的癌细胞中的平均端粒长度在自一种或多种已知标准品测定的相对端粒长度范围的第50个百分位数或更小中，则诊断有或怀疑具有癌症的个体会受益于用端粒酶抑制剂(诸如本文中提供的任何端粒酶抑制剂)治疗。在其它方面中，在测定来自个体的生物学样品中存在的癌细胞中的平均相对端粒长度在自一种或多种已知标准品测定的相对端粒长度范围的第50个百分位数或更小中时，可以使用本文中公开的端粒酶抑制剂化合物来治疗和/或预防细胞增殖性病症(诸如癌症)。

A.细胞增殖性病症

“增殖性病症”是细胞比正常组织生长更快速增殖的任何细胞病症。如此，“增殖细胞”是比正常细胞更快速增殖的细胞。增殖性病症包括但不限于新生物。“新生物(neoplasm)”是异常的组织生长，一般形成独特的块，其通过细胞增殖比正常组织生长更快速而生长。新生物显示正常组织的结构构造和功能协调的部分或完全缺乏。可以将这些广泛分类成三种主要类型。源自上皮结构的恶性新生物称作癌，源自结缔组织(诸如肌肉、软骨、脂肪或骨)的恶性新生物称作肉瘤，并且影响包括免疫系统组分在内的造血结构(属于血液细胞形成的结构)的恶性肿瘤称作白血病和淋巴瘤。肿瘤是疾病癌症的新生性生长。如本文中使用的，新生物(又称为“肿瘤”)意图涵盖造血新生物及实体新生物。其它增殖性病症包括但不限于神经纤维瘤病(neurofibromatosis)。

本文中提供的端粒酶抑制剂化合物(诸如在组合物中)可用于调控与端粒长度失调有关的疾病状态。在一些实施方案中，细胞增殖性病症与升高的端粒酶表达或活性或细胞生长或两者有关。在一些实施方案中，细胞增殖是癌症。

本文中描述的方法也可用于治疗实体瘤(诸如晚期实体瘤)。在一些实施方案中，提供了治疗肺癌的方法，包括例如非小细胞肺癌(NSCLC，诸如晚期NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC，诸如晚期SCLC)、和肺中的晚期实体瘤恶性。在一些实施方案中，提供了治疗卵巢癌、头和颈癌、胃恶性(诸如胃癌)、胃肠癌(诸如上胃肠道癌)、胆囊癌、膀胱癌、成胶质细胞瘤、肉瘤(诸如骨肉瘤)、尤因(Ewing)肉瘤和脑(脊)膜肉瘤、黑素瘤(包括转移性黑素瘤和恶性黑素瘤)、结肠直肠癌、和胰腺癌中任一项的方法。

在一些实施方案中，所述方法可用于治疗下列一项或多项：皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、白血病、滤泡性淋巴瘤、何杰金(Hodgkin)淋巴瘤、和急性髓样白血病。

在一些实施方案中，疾病是下列任一项的癌症：基底细胞癌(basal cellcarcinoma)、髓母细胞瘤(medulloblastoma)、成胶质细胞瘤(glioblastoma)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma)、慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)、急性髓性白血病(acute myelogenous leukemia)、胰腺癌(pancreatic cancer)、肺癌(lungcancer)(小细胞肺癌(small cell lung cancer)和非小细胞肺癌(non-small cell lungcancer))、食管癌(esophageal cancer)、胃癌(stomach cancer)、胆癌(billary cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、肝癌(liver cancer)、肝细胞癌(hepatocellular cancer)、胃肠癌(gastrointestinal cancer)、胃癌(gastric cancer)、胆囊癌(gallbladdercancer)、卵巢癌(ovarian cancer)和膀胱癌(bladder cancer)。在一些实施方案中，癌症选自下组：胰腺导管腺癌(pancreas ductal adenocarcinoma)、结肠腺癌(colonadenocarcinoma)、和卵巢囊腺癌(ovary cystadenocarcinoma)。在一些实施方案中，癌症是胰腺导管腺癌。在一些实施方案中，癌症是不良灌注和/或不良血管化的肿瘤。

在一些实施方案中，癌症是胰腺癌，包括例如胰腺腺癌(pancreaticadenocarcinoma)、胰腺腺鳞状癌(pancreatic adenosquamous carcinoma)、胰腺鳞状细胞癌(pancreatic squamous cell carcinoma)、和胰腺巨细胞癌(pancreatic giant cellcarcinoma)。在一些实施方案中，胰腺癌是外分泌胰腺癌。在一些实施方案中，胰腺癌是内分泌胰腺癌(诸如胰岛细胞癌)。在一些实施方案中，胰腺癌是晚期转移性胰腺癌。

可以通过本发明的方法治疗的癌症的其它例子包括但不限于肾上腺皮质癌(adenocortical carcinoma)、原因不明性髓样化生(agnogenic myeloid metaplasia)、AIDS相关癌症(例如AIDS相关淋巴瘤)、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤(astrocytoma)(例如小脑和脑)、基底细胞癌、胆管癌(例如肝外)、膀胱癌、骨癌(骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤(malignant fibrous histiocytoma))、脑肿瘤(例如胶质瘤(glioma)、脑干胶质瘤(brainstem glioma)、小脑或脑星形细胞瘤(例如纤维状细胞性星形细胞瘤(pilocyticastrocytoma)、弥漫性星形细胞瘤(diffuse astrocytoma)、间变性(恶性)星形细胞瘤)、恶性胶质瘤、室管膜瘤(ependymoma)、少突神经胶质瘤(oligodenglioma)、脑膜瘤(meningioma)、脑膜肉瘤(meningiosarcoma)、颅咽管瘤(craniopharyngioma)、成血管细胞瘤(haemangioblastomas)、髓母细胞瘤(medulloblastoma)、幕上原始神经外胚层肿瘤(supratentorial primitive neuroectodermal tumor)、视通路和下丘脑胶质瘤(visualpathway and hypothalamic glioma)、和成胶质细胞瘤)、乳腺癌、支气管腺瘤(bronchialadenoma)/类癌(carcinoid)、类癌肿瘤(例如胃肠类癌肿瘤)、原发不明癌(carcinoma ofunknown primary)、中枢神经系统淋巴瘤(central nervous system lymphoma)、宫颈癌(cervical cancer)、结肠癌(colon cancer)、结肠直肠癌(colorectal cancer)、慢性骨髓增生性病症(chronic myeloproliferative disorder)、子宫内膜癌(endometrialcancer)(例如子宫癌(uterine cancer))、室管膜瘤(ependymoma)、食管癌(esophagealcancer)、尤因氏肿瘤家族(Ewing’s family of tumor)、眼癌(eye cancer)(例如眼内黑素瘤和视网膜母细胞瘤(retinoblastoma))、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠基质肿瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤(germ cell tumor)(例如颅外、性腺外、卵巢)、妊娠滋养细胞肿瘤(gestational trophoblastic tumor)、头和颈癌(head and neck cancer)、肝细胞(肝)癌(例如肝癌和肝瘤(heptoma))、下咽癌(hypopharyngeal cancer)、胰岛细胞癌(islet cellcarcinoma)(内分泌胰腺)、喉癌(laryngeal cancer)、喉癌、白血病、唇与口腔癌(lip andoral cavity cancer)、口癌(oral cancer)、肝癌(liver cancer)、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌(adenocarcinoma of the lung)、和肺鳞状癌(squamous carcinomaof the lung))、淋巴样新生物(lymphoid neoplasm)(例如淋巴瘤)、髓母细胞瘤、卵巢癌、间皮瘤(mesothelioma)、转移性鳞状颈癌(metastatic squamous neck cancer)、口腔癌(mouth cancer)、多发性内分泌肿瘤综合征(multiple endocrine neoplasia syndrome)、骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes)、骨髓增生异常/骨髓增殖性疾病、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌(nasopharyngeal cancer)、成神经细胞瘤(neuroblastoma)、神经内分泌癌(neuroendocrine cancer)、口咽癌(oropharyngeal cancer)、卵巢癌(例如卵巢上皮癌(ovarian epithelial cancer)、卵巢生殖细胞肿瘤(ovarian germ cell tumor)、卵巢低恶性潜能肿瘤(ovarian low malignant potential tumor))、胰腺癌、甲状旁腺癌(parathyroid cancer)、阴茎癌(penile cancer)、腹膜癌(cancer of the peritoneal)、咽癌(pharyngeal cancer)、嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma)、成松果体细胞瘤(pineoblastoma)和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体瘤(pituitary tumor)、胸膜肺母细胞瘤(pleuropulmonary blastoma)、淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤(小神经胶质细胞瘤(microglioma))、肺淋巴管肌瘤病(pulmonary lymphangiomyomatosis)、直肠癌(rectalcancer)、肾癌(renal cancer)、肾盂和输尿管癌(移行细胞癌)、横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、唾液腺癌(salivary gland cancer)、皮肤癌(skin cancer)(例如非黑素瘤(例如鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma))、黑素瘤、和梅克尔(Merkel)细胞癌)、小肠癌、鳞状细胞癌、睾丸癌、喉癌(throat cancer)、胸腺瘤(thymoma)和胸腺癌(thymic carcinoma)、甲状腺癌(thyroid cancer)、结节性硬化症(tuberous sclerosis)、尿道癌(urethral cancer)、阴道癌(vaginal cancer)、外阴癌(vulvar cancer)、维尔姆斯(Wilms)肿瘤、和移植后淋巴增殖性病症(post-transplant lymphoproliferativedisorder,PTLD)、与斑痣性错构瘤病(phakomatoses)有关的异常血管增殖、水肿(诸如与脑肿瘤有关的)、和梅格斯(Meigs)氏综合征。

在一些实施方案中，癌症是实体瘤(诸如晚期实体瘤)。实体瘤包括但不限于肉瘤和癌瘤，诸如纤维肉瘤(fibrosarcoma)、粘液肉瘤(myxosarcoma)、脂肪肉瘤(liposarcoma)、软骨肉瘤(chondrosarcoma)、成骨性肉瘤(osteogenic sarcoma)、骨肉瘤(osteosarcoma)、脊索瘤(chordoma)、血管肉瘤(angiosarcoma)、内皮肉瘤(endotheliosarcoma)、淋巴管肉瘤(lymphangiosarcoma)、淋巴管内皮肉瘤(lymphangioendotheliosarcoma)、卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、软组织肉瘤(softtissue sarcoma)、子宫滑膜肉瘤(uterine sacronomasynovioma)、间皮瘤(mesothelioma)、尤因(Ewing)氏肿瘤、平滑肌肉瘤(leiomyosarcoma)、横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、脑(脊)膜肉瘤(meningiosarcoma)、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌(cystadenocarcinoma)、髓样癌(medullary carcinoma)、支气管癌、肾细胞癌(包括例如腺癌、透明细胞肾细胞癌、乳头状肾细胞癌、嫌色细胞肾细胞癌、收集管肾细胞癌、粒状肾细胞癌、混合粒状肾细胞癌、肾血管肌脂瘤、或纺锤肾细胞癌)、肝瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯(Wilm)氏肿瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、和视网膜母细胞瘤

在一些实施方案中，淋巴样新生物(例如淋巴瘤)是B细胞新生物。B细胞新生物的例子包括但不限于前体B细胞新生物(例如前体B成淋巴细胞性白血病/淋巴瘤)和外周B细胞新生物(例如B细胞慢性淋巴细胞性白血病/幼淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤(小淋巴细胞性(SL)NHL)、淋巴浆细胞样淋巴瘤/免疫细胞瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡中心淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤(例如细胞学等级：I(小细胞)、II(混合的小细胞和大细胞)、III(大细胞)和/或亚型：弥漫性和主要地小细胞型)、低级/滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、中级/滤泡性NHL、边缘区B细胞淋巴瘤(例如结外(例如MALT型+/-单核细胞样B细胞)和/或节(例如+/-单核细胞样B细胞))、脾边缘区淋巴瘤(例如+/-绒毛淋巴细胞)、毛细胞白血病、浆细胞瘤/浆细胞骨髓瘤(例如骨髓瘤和多发性骨髓瘤)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(例如原发性纵隔(胸腺)B细胞淋巴瘤)、中级弥漫性NHL、伯基特(Burkitt)氏淋巴瘤、高级B-细胞淋巴瘤、伯基特样、高级成免疫细胞NHL、高级成淋巴细胞NHL、高级小无核裂细胞NHL、大块病NHL、AIDS相关淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦(Waldenstrom)氏巨球蛋白血症)。

在一些实施方案中，淋巴样新生物(例如淋巴瘤)是T细胞和/或推定的NK细胞新生物。T细胞和/或推定的NK细胞新生物的例子包括但不限于前体T细胞新生物(前体T成淋巴细胞性淋巴瘤/白血病)和外周T细胞和NK细胞新生物(例如T细胞慢性淋巴细胞性白血病/幼淋巴细胞性白血病和大颗粒淋巴细胞白血病(LGL)(例如T细胞型和/或NK细胞型)、皮肤T细胞淋巴瘤(例如蕈样真菌病(mycosis fimgoids)/塞扎里(Sezary)综合征)、未说明异的原发性T细胞淋巴瘤(例如细胞学类别(例如中等大小的细胞、混合的中等细胞和大细胞)、大细胞、淋巴上皮样细胞、亚型肝脾γδT细胞淋巴瘤、和皮下脂膜炎性(panniculitic)T细胞淋巴瘤)、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AILD)、血管中心淋巴瘤、肠T细胞淋巴瘤(例如+/-肠病相关的)、成人T细胞淋巴瘤/白血病(ATL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)(例如CD30+、T和裸细胞型)、间变性大细胞淋巴瘤、和何杰金氏淋巴瘤)。

在一些实施方案中，淋巴样新生物(例如淋巴瘤)是何杰金氏病。例如，何杰金氏病可以是淋巴细胞为主型、结节硬化性、混合细胞性、淋巴细胞消减性和/或淋巴细胞富集性。

在一些实施方案中，癌症是白血病。在一些实施方案中，白血病是慢性白血病。慢性白血病的例子包括但不限于慢性髓细胞性I(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病、和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。在一些实施方案中，白血病是急性白血病。急性白血病的例子包括但不限于急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓样白血病、急性淋巴细胞性白血病、和急性髓细胞性白血病(例如成髓细胞性、前髓细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性、和红白血病(erythroleukemia))。

在一些实施方案中，癌症是液状瘤(liquid tumor)或浆细胞瘤。浆细胞瘤包括但不限于骨髓瘤。骨髓瘤包括但不限于髓外浆细胞瘤(extramedullary plasmacytoma)、孤立性骨髓瘤(solitary myeloma)、和多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，浆细胞瘤是多发性骨髓瘤。

在一些实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤。多发性骨髓瘤的例子包括但不限于IgG多发性骨髓瘤、IgA多发性骨髓瘤、IgD多发性骨髓瘤、IgE多发性骨髓瘤、和非分泌性多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，多发性骨髓瘤是IgG多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，多发性骨髓瘤是IgA多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，多发性骨髓瘤是郁积型或无痛性多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，多发性骨髓瘤是进行性多发性骨髓瘤。在一些实施方式中，多发性骨髓瘤对药物(诸如但不限于硼替佐米、地塞米松(Dex)、阿霉素(Dox)和美法仑(LR))可以是有抗性的。

B.用于选择会受益于端粒酶抑制剂治疗的个体的方法

本文中提供了用于选择会受益于用端粒酶抑制剂治疗的诊断有或怀疑具有癌症的个体的方法。通过分析来自个体的生物学样品中存在的癌细胞中端粒核苷酸的长度来测定端粒长度。“益处”意指与尚未用本发明的端粒酶抑制剂化合物治疗的个体相比已经用本发明的端粒酶抑制剂化合物治疗的个体中用于评估此类个体的至少一种临床或生物学得分(诸如但不限于无进展存活)、数值、或度量的严重性或发生率上有正面或有益的差异。

1.获得生物学样品

可以以各种方式获得来自诊断有或怀疑具有细胞增殖性病症(诸如癌症)的个体的生物学样品。例如，可以自实体瘤(它可以是皮下易接近的肿瘤，或活组织检查或手术取出易接近的任何其它类型的癌性实体瘤)获得生物学样品。可以通过本领域中已知的任何方法(包括但不限于针或中心活组织检查或细针抽吸)获得生物学样品。另外，在测定端粒长度前，生物学样品可以是固定的、经石蜡包埋的、新鲜的、或冷冻的。在一些实施方案中，将生物学样品用福尔马林固定，然后在石蜡中包埋。在一些实施方案中，个体具有或怀疑具有血传性癌症(blood-borne cancer)(即血液学癌症，诸如但不限于白血病、淋巴瘤、等)。在此情况中，可以自患者的血液获得生物学样品。

2.测量生物学样品中的端粒长度

本领域中有许多方法可用于依照本文中公开的方法测定来自生物学样品中的细胞的端粒长度。

在一个方面，可以通过测量末端限制性片段(TRF)的均值长度来测定端粒长度。TRF定义为源自用不切割端粒序列内的核酸的限制酶完全消化基因组DNA的片段的长度(一般是平均长度)。通常，用频繁在基因组DNA内切割但是不在端粒序列内切割的限制酶消化DNA。通常，限制酶具有四碱基识别序列(例如AluI、HinfI、RsaI、和Sau3A1)，并且单独或组合使用。所得的末端限制性片段含有端粒重复和亚端粒DNA两者。如本文中使用的，亚端粒DNA是与端粒序列的串联重复相邻的DNA序列，并且含有散布有可变端粒样序列的端粒重复序列。通过电泳将经过消化的DNA分开，并将其印迹至支持物(诸如膜)上。通过使探针(即经标记的重复序列)与膜杂交来检测含有端粒序列的片段。在显现含有端粒的片段后，可以计算末端限制性片段的均值长度(Harley,C.B.et al.,Nature.345(6274):458-60(1990)，在此通过提及将收录)。通过Southern印迹进行的TRF评估给出细胞或组织中端粒长度的分布，及如此给出所有细胞的均值端粒长度。

对于本文中描述的各种方法，可以使用多种杂交条件，包括高、中等、和低严格性条件(见例如Sambrook,J.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Ed.,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)；Ausubel,F.M.etal.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons(updates to 2002)；在此通过提及将其收录)。严格性条件是序列依赖性的，并且在不同情况(包括探针或引物的长度、错配的数目、G/C含量、和离子强度)中会是不同的。在Tijssen,P.“Overview ofPrinciples of Hybridization and the Strategy of Nucleic Acid Assays,”于Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology:Hybridizationwith Nucleic Acid Probes,Vol 24,Elsevier Publishers,Amsterdam(1993)中提供了核酸杂交的指导。一般地，严格条件选择为比特定杂合物在限定温度在限定溶液条件下(此时50％的探针或引物与靶核酸杂交平衡)的热解链温度(即T_m)低约5-10℃。由于严格性程度一般是由杂交温度和T_m的差异决定的，尽管杂交的溶液条件有变化，仍然可以维持特定的严格性程度，只要温度与T_m的差异得到维持。杂交条件也可以随核酸主链类型(例如核糖核酸或肽核酸主链)而变化。

在另一个方面，可以通过流式细胞术测量端粒长度(Hultdin,M.et al.,NucleicAcids Res.26:3651-3656(1998)；Rufer,N.et al.,Nat.Biotechnol.16:743-747(1998)；通过提及将其收入本文)。流式细胞术方法是FISH技术的变型。若起始材料是组织，则一般通过机械分离和/或蛋白酶处理生成细胞悬浮液。将细胞用固定剂固定，并与用荧光标记物标记的端粒序列特异性探针(优选PNA探针)杂交。杂交后，清洗细胞，然后通过FACS进行分析。在适当扣除背景荧光后对Go/G1中的细胞测量荧光信号。此技术适合于对大量样品快速评估端粒长度。与TRF类似，端粒长度是细胞内端粒的平均长度。

在其它方面，经由定量PCR(qPCR)或端粒荧光原位杂交(telo-FISH)测定来自生物学样品内的细胞的端粒的平均长度。

a.福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)样品中的qPCR

在一些方面，使用qPCR从自福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)生物学样品提取的DNA测定端粒长度。

在qPCR中，DNA结合染料结合所有双链DNA，引起染料的荧光。PCR反应期间DNA产物的增加导致荧光强度的升高，并且在PCR反应的每个循环时测量。这容许量化DNA浓度。通过在半对数标度上相对于PCR循环数目绘制荧光水平来测定反应的指数阶段期间存在的DNA的相对浓度。测定用于检测高于背景的荧光的阈值。来自样品的荧光与阈值相交的循环称作循环阈值(Ct)。由于DNA的数量在指数阶段期间每个循环在理论上加倍，可以计算DNA的相对量。基线是PCR的初始循环，其中荧光信号有很少的变化。

阈值是ΔRn的水平，其通过Sequence Detection Systems软件自动测定或手动设置，并且用于在实时测定法中进行Ct测定。水平设置为高于基线，并且低得足以在扩增曲线的指数增长区内。阈值是其与扩增曲线的交点限定Ct的线。Ct是荧光通过阈值的分数循环数目。通过自端粒聚合酶链式反应的阈值循环扣除参照样品的阈值循环(ΔCt_样品＝Ct_端粒-Ct_参照)来测定样品的阈值循环。还用针对作为参照的单拷贝数基因的引物实施聚合酶链式反应以测定单拷贝数基因的阈值循环。单拷贝基因与端粒聚合酶链式反应的平均循环数差异会决定端粒长度(ΔCt＝Ct_端粒-Ct_{单拷贝基因})。

可以使用温和提取方法自福尔马林固定、石蜡包埋生物学样品提取端粒核酸。例如，可以使用去污剂、超声处理、电穿孔、变性剂、等处理样品来破坏细胞。可以在需要时纯化靶核酸。已经发现了不使用柱来分离核酸的温和提取方法是有利的，因为这些方法在最终的核酸制备物中保留核酸的较小片段(小DNA片段在FFPE样品中找到，并且可以在柱提取期间丧失)。在一些实施方案中，提取方法保留至少50bp、至少60bp、至少70bp、至少80bp的端粒靶核酸片段的大部。在一个实施方案中，提取方法保留小于60bp、小于70bp、小于80bp、小于90bp、小于100bp、小于110bp的核酸片段。在一个实施方案中，温和DNA提取方法不使用柱来分离DNA片段。在一个实施方案中，核酸提取方法是BioChain FFPE组织DNA提取试剂盒。

在一个实施方案中，可以在DNA提取前使FFPE样品脱石蜡。在另一个实施方案中，可以在没有FFPE样品的在先脱石蜡的情况中自FFPE样品提取DNA。在此实施方案中，没有自FFPE样品除去石蜡。在一个实施方案中，将提取的核酸加热至至少88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃达至少1分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟。

在DNA提取后，用荧光染料(诸如SYBR Green I,Invitrogen,Carlsbad,CA)标记DNA。在一些实施方案中，用约0.04倍、0.06倍、0.08倍、0.1倍、0.15倍、0.2倍、0.25倍、0.3倍、0.35倍、0.4倍、0.45倍、0.5倍、0.55倍、0.60倍、0.65倍、0.70倍、0.75倍、0.8倍、0.9倍、1.0倍、或1.1倍(包括端点在内)中任一项(包括这些数字间的任何数值)的SYBR Green I染料标记DNA。在DNA标记后，使用自经福尔马林固定的石蜡生物学样品提取的靶单拷贝核酸(包含基本上互补的第一和第二链)、第一单拷贝基因引物(其中第一单拷贝基因引物能够(i)与靶单拷贝基因核酸的第一链杂交并且(ii)受DNA聚合酶延伸以形成延伸的单拷贝基因引物)、和第二单拷贝基因引物(其中第二单拷贝基因引物能够(i)与延伸的第一单拷贝基因引物和/或靶DNA杂交并且(ii)受DNA聚合酶延伸)来实施聚合酶链式反应，并且容许聚合酶链式反应在变性和延伸的循环中行进并鉴定通过阈值PCR信号的复制循环。

在三个阶段中用聚合酶链式反应扩增端粒序列。在足以活化DNA聚合酶的条件下进行阶段1。在足以生成PCR产物的条件下进行阶段2，所述PCR产物会起模板作用，用于随后的扩增循环。在一个实施方案中，阶段2的循环数目是2至8个循环、或3至6个循环或3至5个循环。在一个实施方案中，解离温度的范围为90℃至98℃、或92℃至97℃或94℃至96℃，持续10秒至20秒的时段。在一个实施方案中，结合温度的范围为45℃至60℃、49℃至58℃、50℃至55℃，持续5秒至20秒的时段。在足以扩增模板的条件下进行阶段3。在一个实施方案中，阶段3的循环数目是20至40个循环，或25至35个循环。在一个实施方案中，解离温度的范围为90℃至98℃，或92℃至97℃或94℃至96℃，持续10秒至20秒的时段。在一个实施方案中，结合温度的范围为45℃至70℃、49℃至68℃、50℃至60℃，持续5秒至20秒的时段。

在一个实施方案中，与在第二块板上进行的端粒扩增qPCR相比，在不同的板上且在不同的条件下进行单拷贝基因扩增qPCR。在另一个实施方案中，在第一个孔中进行单拷贝基因扩增qPCR，并且在同一块板上的第二个孔中且在相同的条件下进行端粒扩增qPCR。可以对来自同一患者肿瘤的1、2或更多份组织样品进行qPCR端粒分析。

在一个实施方案中，PCR反应中的单拷贝基因扩增子的大小与端粒PCR反应的扩增子的大小相似。在一个实施方案中，通过延伸第一和第二引物生成的单基因扩增子是约50至100个核苷酸、60至90个核苷酸、70至80个核苷酸。

通过自端粒定量聚合酶链式反应的阈值循环扣除单基因拷贝定量PCR的阈值循环来测定端粒长度(ΔCt_样品＝Ct_端粒-Ct_{单拷贝基因})。单拷贝基因与端粒聚合酶链式反应的平均循环数目差异会决定端粒长度(ΔCt＝Ct_端粒-Ct_{t单拷贝基因})。对个体测定端粒长度，并且将其与在个体的群体中或对参照个体观察到的端粒长度关联起来。在一个实施方案中，个体的群体与所测试个体的年龄是年龄匹配的。对于人，年龄匹配的群体在个体年龄的约10岁内，或在5岁内或在1岁内。在另一个实施方案中，依照癌细胞类型(诸如但不限于肺癌、前列腺癌、白血病、等)，个体的群体是匹配的。

端粒长度表示为针对单拷贝基因产物标准化的端粒产物。换言之，样品的相对端粒长度是实验样品与参照DNA样品在其端粒重复拷贝数与单基因拷贝数比上相差的因数。以会使实验和参照样品就在PCR扩增的指数阶段期间生成给定量的端粒PCR产物需要的PCR循环数目而言等同的任意选择的参照DNA样品的稀释水平测量每份实验样品中端粒重复的数量。类似地，以使参照DNA样品与实验样品就在PCR的指数阶段期间生成给定量的单拷贝基因PCR产物需要的PCR循环数目而言匹配需要的参照DNA样品的稀释水平表示每份实验样品中单拷贝基因的相对数量。

在一个实施方案中，对于每份实验样品，稀释因数的比是相对端粒与单拷贝基因(T/S)比。如此，在未知DNA在其端粒重复拷贝数与单拷贝数比上与参照DNA相同时T/S＝1。参照DNA样品(与其比较给定研究中的所有实验样品)可以来自单一个体，或者它可以是来自多个个体的合并样品，或者它可以来自一种或多种具有已知长度的端粒的细胞系。相对于参照个体或合并样品或细胞系的T/S比而言一个个体的T/S比对应于来自该个体的DNA的相对端粒长度。在一个实施方案中，细胞系选自下组：M14Mel细胞、A549细胞、SK-Mel-5细胞、和Ovcar-5细胞。

在另一个实施方案中，对于每份实验样品，稀释因数的比是log₂单拷贝基因与相对端粒(log₂S/T)比。参照DNA样品(与其比较给定研究中的所有实验样品)可以来自单一个体，或者它可以是来自多个个体的合并样品，或者它可以来自一种或多种具有已知长度的端粒的细胞系。相对于参照个体或合并样品或细胞系的log₂S/T比而言一个个体的log₂S/T比对应于来自该个体的DNA的相对端粒长度。在一个实施方案中，细胞系选自下组：M14Mel细胞、A549细胞、SK-Mel-5细胞、和Ovcar-5细胞。

通过各种统计学方法(诸如存活分析，包括Cox比例危险回归模型、Kaplan-Meier存活分布评估、Peto Wilcoxon检验、最大似然分析、多元回归分析等)检查个体和群体的测量端粒长度的相关性。

也可以使用本文中描述的qPCR方法来测量个体对用端粒酶抑制剂(诸如本文中公开的任何端粒酶抑制剂)治疗的反应。测量相对端粒长度在实体瘤中随治疗时间而缩短的速率以测定个体对端粒酶抑制剂的反应。

另外，可以对PCR反应添加多种药剂以推动最佳杂交、扩增和检测。这些包括盐、缓冲剂、中性蛋白质、去污剂、等。可以添加其它药剂以改善反应的效率，诸如蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、抗微生物剂、等。

与经由qPCR评估端粒长度相关的进一步信息可以参见美国专利申请公开文本No.2006/0210980、2010/0151477、和2011/0207128及国际专利申请公开文本No.WO 2010/075413和WO 2012/0135125，通过提及将每篇的公开内容收入本文。

b.端粒荧光原位杂交(telo-FISH)

在一些方面，使用telo-FISH测定端粒长度。在此方法中，将细胞固定，并与同荧光标记物(例如Cy-3、荧光素、罗丹明、等)缀合的探针杂交。用于此方法的探针是设计为与端粒序列特异性杂交的寡核苷酸。一般地，探针的长度是8或更多个核苷酸，诸如长度是12-20或更多个核苷酸。在一个方面，探针是包含天然存在的核苷酸的寡核苷酸。在一个方面，探针是肽核酸，其具有比类似的天然序列更高的T_m，并且如此容许使用更严格的杂交条件。可以用药剂(诸如秋水仙酰胺)处理细胞以诱导细胞周期停滞于中期，提供中期染色体以进行杂交和分析。在一些实施方案中，也可以用荧光染料4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色细胞DNA。

获得完整中期染色体的数字图像，并且定量与端粒杂交的探针的荧光强度。这容许在细胞中的平均端粒长度外测量个别染色体的端粒长度，并且避免与亚端粒DNA的存在有关的问题(Zjilmans,J.M.et al.,Proc.Natl.Acad Sci.USA 94:7423-7428(1997)；Blasco,M.A.et al.,Cell 91:25-34(1997)；通过提及将它们收录)。荧光信号的强度与端粒的长度相关联，荧光信号越亮指示端粒越长。

在一些方面，利用软件(诸如IN Cell developer Toolbox 1.9,GE Corp.)定量来自自生物学样品获得并进行telo-FISH的细胞的平均端粒长度。在一个实施方案中，使用软件来画出一条或多条围绕(i)细胞核(其基于DAPI染剂的位置确定)和(ii)端粒的线。一旦每个核和端粒被包围，软件就能计算细胞中每个端粒个体的强度，由此为自生物学样品衍生的细胞测定平均端粒长度。在一些实施方案中，使用方程式计算端粒长度：

1.376x log₂(强度)–6.215x√(面积)[方程式1]

其中“强度”定义为端粒的强度，而“面积”定义为以围绕它画出的线限定的端粒的面积。

在另一个实施方案中，对于每份实验样品，针对自单一个体或自来自多个个体的合并样品或自一种或多种具有已知长度的端粒的细胞系计算的数值标准化使用方程式1计算的数值。相对于使用方程式1自参照个体或合并样品或细胞系计算的数值而言使用方程式1计算的数值对应于来自个体的DNA的相对端粒长度。在一个实施方案中，细胞系选自下组：M14Mel细胞、A549细胞、SK-Mel-5细胞、和Ovcar-5细胞。

3.选择会受益于用端粒酶抑制剂治疗的诊断有或怀疑具有癌症的个体

在一些方面，本文中提供了用于选择会受益于用端粒酶抑制剂治疗的诊断有或怀疑具有癌症的个体的方法，所述方法包括：通过分析来自所述个体的生物学样品中存在的癌细胞中端粒核酸的相对长度测定相对端粒长度；并在测定来自所述个体的生物学样品中存在的癌细胞中的平均相对端粒长度在自一种或多种已知标准品测定的相对端粒长度范围的第50个百分位数或更小中时，选择会受益于用端粒酶抑制剂治疗的个体。在一些实施方案中，端粒酶抑制剂包含寡核苷酸。在一些实施方案中，端粒酶抑制剂是伊美司他。在另一个实施方案中，癌症是小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、或血液学癌症。在仍有其它实施方案中，个体是人。

可以使用任何方法来测定个体中的相对端粒长度，包括本文中描述的任何方法。在一个实施方案中，使用qPCR从自福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)生物学样品提取的DNA测定端粒核酸的相对长度。在使用此方法时，短语“相对端粒长度”定义为(i)相对端粒与单拷贝基因(T/S)比或(ii)log₂单拷贝基因与相对端粒(log₂S/T)比。在一些实施方案中，所述一种或多种已知标准品是经表征的细胞系。“经表征的细胞系”意指细胞系中的细胞的端粒核酸的相对长度是已知且相对恒定的。经表征的细胞系的非限制性例子包括M14Mel细胞、A549细胞、SK-Mel-5细胞、和Ovcar-5细胞。在另一个实施方案中，经表征的细胞系选自代表来自个体的生物学样品的细胞系。这些细胞系的非限制性例子可以包括非小细胞肺癌细胞系、肝细胞细胞系、或卵巢细胞系。在还有其它实施方案中，所述一种或多种已知标准品是自来自多个个体的多个天然发生肿瘤建立的端粒长度范围。在一个实施方案中，来自多个天然发生肿瘤的癌细胞可以是与来自个体的生物学样品中存在的癌细胞属于相同类型的。在一些实施方案中，测定生物学样品中存在的癌细胞中的端粒长度在端粒长度范围的第45个百分位数、第40个百分位数、第35个百分位数、第30个百分位数、第25个百分位数、第20个百分位数、第15个百分位数、第10个百分位数、第5个百分位数，或更小(包括端点在内)(包括这些数字间的任何百分位数)的任一项中。

在仍有其它实施方案中，使用qPCR从自福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)生物学样品提取的DNA测定端粒核酸的相对长度，并且短语“相对端粒长度”定义为log₂单拷贝基因与相对端粒(log₂S/T)比。在一些实施方案中，log₂S/T比率小于约0、-0.1、-0.2、-0.3、-0.4、-0.5、-0.6、-0.7、-0.8、-0.9、-1.0、-1.1、-1.2、-1.3、-1.4、-1.5、-1.6、-1.7、-1.8、-1.9、-2.0，或更多中的任一项。

在另一个实施方案，使用telo-FISH测定端粒核酸的相对长度。在使用此方法时，短语“相对端粒长度”定义为在上文描述的方法中使用方程式1确定的数值。在一些实施方案中，所述一种或多种已知标准品是经表征的细胞系。“经表征的细胞系”意指细胞系中的细胞的相对端粒核酸是已知且相对恒定的。经表征的细胞系的非限制性例子包括M14Mel细胞、A549细胞、SK-Mel-5细胞、和Ovcar-5细胞。在另一个实施方案中，经表征的细胞系选自代表来自个体的生物学样品的细胞系。这些细胞系的非限制性例子可以包括非小细胞肺癌细胞系、肝细胞细胞系、或卵巢细胞系。在还有其它实施方案中，所述一种或多种已知标准品是自来自多个个体的多个天然发生肿瘤建立的端粒长度范围。在一个实施方案中，来自多个天然发生肿瘤的癌细胞可以是与来自个体的生物学样品中存在的癌细胞属于相同类型的。在一些实施方案中，测定生物学样品中存在的癌细胞中的端粒长度在端粒长度范围的第45个百分位数、第40个百分位数、第35个百分位数、第30个百分位数、第25个百分位数、第20个百分位数、第15个百分位数、第10个百分位数、第5个百分位数，或更小(包括端点在内)(包括这些数字间的任何百分位数)的任一项中。在其它实施方案中，如在上文描述的方法中使用方程式1确定的相对端粒长度小于约0、-0.1、-0.2、-0.3、-0.4、-0.5、-0.6、-0.7、-0.8、-0.9、-1.0、-1.5、-2.0、-2.5、-3.0、-3.5、-4.0、-4.5、-5.0、-5.5、-6.0、-6.5、-7.0、-7.5、-8.0、-8.5、-9.0、-9.5、-10.0或更多(包括端点在内)(包括这些数值间的任何数字)中的任一项。

C.使用端粒酶抑制剂治疗细胞增殖性病症的方法

在一些方面，本发明涉及用于抑制与如上文详细描述的细胞增殖性病症(诸如癌症)有关的症状或状况(失能、损伤)的方法。因此，尽管当前公开的方法的效果很可能延伸至对患者的显著治疗益处，但是不需要状况的所有作用是完全阻止或反转的。因此，治疗益处不必是源自细胞增殖性病症(诸如癌症)的特定状况的完全阻止或治愈，而是可以涵盖包括降低或预防源自细胞增殖性病症的症状、降低或预防此类症状的发生(定量或定性)、降低此类症状或其生理学效应的严重性、和/或增强经历细胞增殖性病症症状后个体恢复的结果。

特别地，本发明的组合物(诸如本文中公开的任何端粒酶抑制剂化合物)在对个体施用时能治疗或预防一种或多种与细胞增殖性病症(诸如癌症)有关的症状或状况和/或减少或减轻与此病症有关的症状或状况。因此，保护个体免于源自细胞增殖性病症(诸如癌症)的作用或症状包括阻止或降低病症作用的发生和/或严重性和治疗病症作用已经发生或开始发生的患者两者。本领域普通技术人员和/或正在治疗患者的经过训练的临床医生能容易地评估有益效果。优选地，与尚未用本发明的方法治疗的患者相比已经用本发明的方法治疗的患者中用于评估此类患者的至少一种临床或生物学得分、数值、或度量的严重性或发生率上有正面或有益的差异。

可以在辅助背景中实施所述方法。“辅助背景”指个体已经具有增殖性疾病(特别是癌症)的历史，并且一般(但不是必须)已经响应疗法的临床背景，所述疗法包括但不限于手术(诸如手术切除)、放射疗法、和化学疗法。然而，由于其增殖性疾病(诸如癌症)的历史，认为这些个体有风险形成疾病。“辅助背景”中的治疗或施用指随后的治疗模式。风险程度(即在认为辅助背景中的个体是“高风险”或“低风险”时)取决于几项因素，最通常是在第一次治疗时的疾病程度。

也可以在“新辅助背景”中实施本文中提供的方法，即可以在主要/确定疗法前实施所述方法。在一些实施方案中，先前已经治疗个体。在一些实施方案中，先前尚未治疗个体。在一些实施方案中，所述治疗是一线疗法。

因而，在一些方面，本文中提供了用于治疗诊断有或怀疑具有癌症的个体的方法，所述方法包括：通过分析来自所述个体的生物学样品中存在的癌细胞中端粒核酸的相对长度测定相对端粒长度；在测定来自所述个体的生物学样品中存在的癌细胞中的平均相对端粒长度在自一种或多种已知标准品测定的相对端粒长度范围的第50个百分位数或更小中时，选择会受益于用端粒酶抑制剂治疗的个体；并对所述个体施用治疗有效量的端粒酶抑制剂。在一些实施方案中，端粒酶抑制剂包含寡核苷酸。在一些实施方案中，端粒酶抑制剂是伊美司他。在另一个实施方案，癌症是小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、或血液学癌症。在仍有其它实施方案中，个体是人。

在其它方面，本文中提供了用于治疗诊断有或怀疑具有癌症的个体的方法，所述方法包括：在测定来自所述个体的生物学样品中存在的癌细胞中的平均相对端粒长度在自一种或多种已知标准品测定的相对端粒长度范围的第50个百分位数或更小中时，对所述个体施用治疗有效量的端粒酶抑制剂。在一些实施方案中，端粒酶抑制剂是伊美司他。在另一个实施方案，癌症是小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、或血液学癌症。在仍有其它实施方案中，个体是人。

在另一个实施方案，使用telo-FISH测定端粒核酸的相对长度。在使用此方法时，短语“相对端粒长度”定义为在上文描述的方法中使用方程式1确定的数值。在一些实施方案中，所述一种或多种已知标准品是经表征的细胞系。经表征的细胞系的非限制性例子包括M14Mel细胞、A549细胞、SK-Mel-5细胞、和Ovcar-5细胞。在另一个实施方案中，经表征的细胞系选自代表来自个体的生物学样品的细胞系。这些细胞系的非限制性例子可以包括非小细胞肺癌细胞系、肝细胞细胞系、或卵巢细胞系。在还有其它实施方案中，所述一种或多种已知标准品是自来自多个个体的多个天然发生肿瘤建立的端粒长度范围。在一个实施方案中，来自多个天然发生肿瘤的癌细胞可以是与来自个体的生物学样品中存在的癌细胞属于相同类型的。在一些实施方案中，测定生物学样品中存在的癌细胞中的端粒长度在端粒长度范围的第45个百分位数、第40个百分位数、第35个百分位数、第30个百分位数、第25个百分位数、第20个百分位数、第15个百分位数、第10个百分位数、第5个百分位数，或更小(包括端点在内)(包括这些数字间的任何百分位数)的任一项中。

D.端粒酶抑制剂的施用

在一些实施方案中，以注射形式施用端粒酶抑制剂(诸如本文中公开的任何端粒酶抑制剂化合物)。注射液可以包含与水性可注射赋形剂或载剂组合的化合物。合适的水性可注射赋形剂或载剂的非限制性例子是本领域普通技术人员公知的，并且它们及配制配制剂的方法可以参见标准参考文献，诸如Alfonso AR:Remington’s PharmaceuticalSciences,17th ed.,Mack Publishing Company,Easton Pa.,1985。合适的水性可注射赋形剂或载剂包括水、水性盐水溶液、水性右旋糖溶液、等，任选地其含有溶解增强剂，诸如10％甘露醇或其它糖、10％甘氨酸、或其它氨基酸。可以在皮下、腹膜内、或静脉内注射组合物。

在一些实施方案中，使用静脉内施用，并且它可以是在几分钟至1小时或更多的时段里(诸如15分钟左右)连续静脉内输注。施用的量可以随端粒酶抑制剂的类型、单位剂量的大小、赋形剂或载剂的种类、和本领域普通技术人员公知的其它因素而广泛变化。端粒酶抑制剂可以包含例如约0.001％至约10％(w/w)、约0.01％至约1％、约0.1％至约0.8％、或其中的任何范围，剩余物包含赋形剂或载剂。

对于口服施用，端粒酶抑制剂可以采用例如通过常规手段用药学可接受赋形剂或载剂(诸如粘合剂；填充剂；润滑剂；崩解剂；或湿润剂)制备的片剂或胶囊形式。用于口服施用的液体制剂可以采用例如溶液、糖浆剂或悬浮液形式，或者它们可以以干产物呈现以在使用前用水或其它合适的媒介构建。可以通过常规手段用药学可接受添加剂(诸如悬浮剂(例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯树胶)；非水性媒介(例如杏仁油(ationd oil)、油性酯、乙醇或分级植物油)；和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)制备此类液体制剂。在适当时，制剂还可以含有缓冲剂盐、调味剂、和着色剂。

在一些实施方案中，可以经由气溶胶喷射或喷雾器(其可以包含合适的推进剂，诸如例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳、或其组合)通过吸入施用端粒酶抑制剂。在一个非限制性例子中，可以经由计量阀投递加压气雾剂的剂量单位。在另一个实施方案，可以例如在吸入器中使用明胶的药筒和胶囊，并且可以将其配制为含有化合物与合适的粉末基材(诸如例如淀粉或乳糖)的粉末化混合物。

在一些实施方案中，组合物(诸如药物组合物)中端粒酶抑制剂的量包括在任何下述范围中：约0.5至约5mg、约5至约10mg、约10至约15mg、约15至约20mg、约20至约25mg、约20至约50mg、约25至约50mg、约50至约75mg、约50至约100mg、约75至约100mg、约100至约125mg、约125至约150mg、约150至约175mg、约175至约200mg、约200至约225mg、约225至约250mg、约250至约300mg、约300至约350mg、约350至约400mg、约400至约450mg、或约450至约500mg。在一些实施方案中，有效量的药物组合物(例如单位剂量形式)中端粒酶抑制剂的量在约5mg至约500mg诸如约30mg至约300mg或约50mg至约200mg的范围中。在一些实施方案中，药物组合物中端粒酶抑制剂的浓度是稀释的(约0.1mg/ml)或浓缩的(约100mg/ml)，包括例如约0.1至约50mg/ml、约0.1至约20mg/ml、约1至约10mg/ml、约2至约8mg/ml、约4至约6mg/ml、约5mg/ml中的任一项。在一些实施方案中，端粒酶抑制剂的浓度是至少约0.5mg/ml、1.3mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、或50mg/ml中任一项。

药物组合物中端粒酶抑制剂的例示性有效量包括但不限于至少约25mg/m²、30mg/m²、50mg/m²、60mg/m²、75mg/m²、80mg/m²、90mg/m²、100mg/m²、120mg/m²、125mg/m²、150mg/m²、160mg/m²、175mg/m²、180mg/m²、200mg/m²、210mg/m²、220mg/m²、250mg/m²、260mg/m²、300mg/m²、350mg/m²、400mg/m²、500mg/m²、540mg/m²、750mg/m²、1000mg/m²、或1080mg/m²中任一项。在多个实施方案中，药物组合物包含小于约350mg/m²、300mg/m²、250mg/m²、200mg/m²、150mg/m²、120mg/m²、100mg/m²、90mg/m²、50mg/m²、或30mg/m²中任一项的端粒酶抑制剂。在一些实施方案中，每次施用的端粒酶抑制剂的量小于约25mg/m²、22mg/m²、20mg/m²、18mg/m²、15mg/m²、14mg/m²、13mg/m²、12mg/m²、11mg/m²、10mg/m²、9mg/m²、8mg/m²、7mg/m²、6mg/m²、5mg/m²、4mg/m²、3mg/m²、2mg/m²、或1mg/m²中任一项。在一些实施方案中，药物组合物中端粒酶抑制剂的有效量包括在任何下述范围中：约1至约5mg/m²、约5至约10mg/m²、约10至约25mg/m²、约25至约50mg/m²、约50至约75mg/m²、约75至约100mg/m²、约100至约125mg/m²、约125至约150mg/m²、约150至约175mg/m²、约175至约200mg/m²、约200至约225mg/m²、约225至约250mg/m²、约250至约300mg/m²、约300至约350mg/m²、或约350至约400mg/m²。在一些实施方案中，药物组合物中端粒酶抑制剂的有效量是约5至约300mg/m²，诸如约20至约300mg/m²、约50至约250mg/m²、约100至约150mg/m²、约120mg/m²、约130mg/m²、或约140mg/m²、或约260mg/m²。

在任何上述方面的一些实施方案中，药物组合物中端粒酶抑制剂的有效量包括至少约1mg/kg、2.5mg/kg、3.5mg/kg、5mg/kg、6.5mg/kg、7.5mg/kg、9.4mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、或20mg/kg中任一项。在多个实施方案中，药物组合物中端粒酶抑制剂的有效量包括小于约350mg/kg、300mg/kg、250mg/kg、200mg/kg、150mg/kg、100mg/kg、50mg/kg、30mg/kg、25mg/kg、20mg/kg、10mg/kg、9.4mg/kg、7.5mg/kg、6.5mg/kg、5mg/kg、3.5mg/kg、2.5mg/kg、或1mg/kg中任一项的端粒酶抑制剂。

药物组合物(诸如含有本文中公开的任何端粒酶抑制剂的药物组合物)的例示性剂量给药频率包括但不限于每日；隔天；每周两次；每周三次；在没有中断情况下每周；四周中的三周每周；每三周一次；每两周一次；三周中的两周每周。在一些实施方案中，约每2周一次、每3周一次、每4周一次、每6周一次、或每8周一次施用药物组合物。在一些实施方案中，以至少约一周1次、2次、3次、4次、5次、6次、或7次(即每天)、或每天三次、每天两次中任一项施用组合物。在一些实施方案中，每次施用间的时间间隔小于约6个月、3个月、1个月、20天、15天、12天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、或1天中任一项。在一些实施方案中，每次施用间的时间间隔超过约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、或12个月中任一项。在一些实施方案中，剂量给药日程表中没有中断。在一些实施方案中，每次施用间的时间间隔不超过约1周。

可以在延长的时间段(诸如约1个月直至约7年)里延长药物组合物的施用。在一些实施方案中，在至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、30、36、48、60、72、或84个月中任一项的时段里施用组合物。

实施例

实施例1：寡核苷酸N3’→P5’氨基磷酸酯(NP)或N3’→P5’硫代氨基磷酸酯(NPS)的制备和脂质缀合

此实施例显示了如何合成缀合有脂质的寡核苷酸N3’→P5’氨基磷酸酯(NP)或N3’→P5’硫代氨基磷酸酯(NPS)。

材料和方法

起始化合物

可以如例如McCurdy et al.,Tetrahedron Letters 38:207-210(1997)或Pongracz&Gryaznov,Tetrahedron Letters 49:7661-7664(1999)中描述的那样制备这些化合物。可以如Nelson et al.,J.Org.Chem.62:7278-7287(1997)中描述的那样或者通过Gryaznov等人的美国申请公开文本No.2006/0009636中描述的方法制备起始3’-氨基核苷单体。

脂质附着

根据选择的连接的性质，可以使用多种合成方法将脂质模块L与寡核苷酸缀合；见例如Mishra et al.,Biochim.et Biophys.Acta 1264:229-237(1995)，Shea et al.,Nucleic Acids Res.18:3777-3783(1995)，或Rump et al.,Bioconj.Chem.9:341-349(1995)。通常，经由在寡核苷酸末端使用合适的官能团实现缀合。例如，可以使用合适的偶联催化剂使在NP和NPS寡核苷酸的3’末端存在的3’-氨基基团与羧酸、酸性氯化物(acidchloride)、酸酐和活性酯起反应，以形成酰胺连接。硫醇基团作为官能团也是合适的(见Kupihar et al.,Bioorg.Med.Chem.9:1241-1247(2001))。不同链长度的各种氨基和硫醇功能化的修饰剂对于寡核苷酸合成是商品化的。

用于将脂质基团附着于NP或NPS寡核苷酸末端的具体方法包括那些记载于美国申请公开文本No.2005/0113325的，通过提及将其完整收入本文。在上文记载的酰胺连接外，例如也可以使用脂质的亚磷酰胺衍生物将脂质附着于寡核苷酸链，以产生连接脂质和寡核苷酸的氨基磷酸酯或硫代氨基磷酸酯连接。也可以使完全受保护的支持物结合的寡核苷酸的游离3’-氨基与合适的脂质醛起反应，接着用氰基硼氢化钠还原，这产生胺连接。

为了将脂质附着于5’末端(也如记载于美国申请公开文本No.2005/0113325的)，可以使用经修饰的含有脂质的固体支持物合成寡核苷酸。3’-氨基-1,2-丙二醇与脂肪酰氯(RC(O)Cl)反应，接着是伯醇的二甲氧基三苯甲基化和仲醇的琥珀酰化，提供了中间体，然后经由游离的琥珀酰羧基基团将该中间体与固体支持物偶联。下文显示了经修饰的支持物的一个例子，其中S—代表长链烷基胺CPG支持物，而R代表脂质。

此规程继之以以5’至3’方向合成寡核苷酸，如记载于例如Pongracz&Gryaznov(1999)的，以–ODMT基团的脱保护和磷酸化(phosphitylation)开始。例如，这在自固体支持物切割后有效产生下述结构：

上述结构在—R是—(CH₂)₁₄CH₃(棕榈酰基)时在本文中称为GRN163L(伊美司他)。

FlashPlate^TM测定法

基本上如Asai et al.,Cancer Research 63:3931-3939(2003)中描述的那样实施此测定法。简言之，该测定法通过测量对生物素化的端粒酶底物引物的TTAGGG端粒重复添加来检测和/或测量端粒酶活性。在经链霉亲合素包被的微量滴定板上捕捉生物素化的产物，并且使用与3.5个端粒重复互补的寡核苷酸探针(用33P标记)来测量端粒酶产物。通过清洗除去未结合的探针，并且通过闪烁计数测定与捕获的端粒酶产物退火的探针的量。

实施例2：对来自伊美司他NSC II期(CP14B-012)研究的福尔马林固定、石蜡包埋样品的qPCR

此实施例演示定量聚合酶链式反应用于测定FFPE NSC II期(CP14B-012)研究组织样品的相对端粒长度的性能。

材料和方法

临床试验设计

NSC II期(CP14B-012)研究的目的是评估伊美司他(GRN163L)作为维持疗法对于在4个周期的基于铂的疗法后尚未进展的具有晚期阶段非小细胞肺癌的患者的功效和安全性。将参与者以2:1比率随机化至伊美司他及标准护理对单独的标准护理。与其诱导化学疗法一起接受贝伐单抗的参与者在此研究中继续接受贝伐单抗。

主要结果测量是无进展存活，其定义为从随机化至证明的疾病进展或死亡(以较早发生者为准)的时间，如依照RECIST(实体瘤响应评估标准(Response EvaluationCriteria in Solid Tumors))通过调查者的评估测定的。次要结果测量是客观响应、所有原因死亡前时间、和安全性和可耐受性(通过不利事件的发生率、性质、和严重性、实验室异常、和生命体征评估)。

将患者分成两个分组。在实验分组中，患者接受伊美司他及标准护理(贝伐单抗或观察)。具体地，在每个21天周期的第1天和第8天在2小时IV输注里对患者给予9.4mg/kg伊美司他(GRN163L)，直至疾病进展。若施用，则以依照FDA批准的贝伐单抗包装插页的剂量和持续时间在每个21天周期的第1天给予贝伐单抗。

在对照分组中，患者接受贝伐单抗或观察。若施用，则以依照FDA批准的贝伐单抗包装插页的剂量和持续时间在每个21天周期的第1天给予贝伐单抗。

自在NSC II期(CP14B-012)研究中登记的116名患者中的61名获得了样品，其中，57名产生了用于无进展存活(PFS)分析的可评估测定结果。

福尔马林固定和石蜡包埋

使用HistoGel试剂盒(产品目录编号R904012:Richard Allen Scientific,ThermoFisher(Kalamazoo,MI)的子公司)制备福尔马林固定、石蜡包埋样品。将细胞培养至80-90％汇合。首先将细胞团粒(10⁶/团粒)在200-500μL于50±5℃熔解的HistoGel中温和混合，然后在冰上冷却以固化。在固化后，快速旋转样品以除去残留液体。对胶凝的团粒添加10mL 4％福尔马林，并且将细胞团粒于室温固定48小时。然后，在位于Hayward(CA)的Histo-Tec实验室使用标准组织学技术包埋经固定的细胞团粒，然后将其于-80℃冷冻。

DNA提取

使用由BioChain(BioChain Institute,产品目录编号K5019100,Hayward,CA)生产的FFPE DNA提取试剂盒依照制造商的用法说明自FFPE加工样品分离NSCLC II期研究样品的基因组DNA。在170μL试剂盒缓冲液和30μL蛋白酶K中混合组织。将混合物于56℃温育1小时，然后将温度提高至90℃达60分钟，然后98℃达2分钟，并在冰上放置2分钟。将混合物于4℃以14,000rpm离心10分钟，并且获得上清液。通过Quant-iT Pico Green dsDNA测定试剂盒(Invitrogen,产品目录编号P7589,Carlsbad,CA)测定DNA浓度。用H₂O将上清液中的DNA浓度调节至0.1ng/μL。

定量PCR(qPCR)

使用ABI Prism 7900HT序列检测系统(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)实施所有定量PCR反应。对每份样品实施两项PCR，一项用于测定端粒(T)扩增的循环阈(Ct)值，另一项用于测定用于扩增单拷贝基因(酸性核糖体磷蛋白P，36B4)的Ct值。

用于端粒扩增的引物序列是Telg 5’-ACA CTA AGG TTT GGG TTT GGG TTT GGGTTT GGG TTA GTG T(SEQ ID NO:4)和Telc 5’-TGT TAG GTA TCC CTA TCC CTA TCC CTATCC CTA TCC CTA ACA(SEQ ID NO:5)(Cawthon,2009)；而用于36B4的引物序列是36B4u:5’-CAG CAA GTG GGA AGG TGT AAT CC(SEQ ID NO:6)和36B4d:5’-CCC ATT CTA TCA TCATCA ACG GGT ACA A(SEQ ID NO:7)(Cawthon,2002)。

使用1ng/10μL样品(0.1ng/μL)和40μL PCR混合物实施用于端粒扩增的每个PCR反应，所述PCR混合物含有1.25U Hotstart DNA Taq聚合酶(BioChain)、150nM 6-ROX荧光染料、0.04x SYBR Green I核酸染剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)、50mM KCl、2mM MgCl₂、0.2mM每种脱氧核苷三磷酸(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)、5mM二硫苏糖醇、1％二甲亚砜、和15mM Tris-HCl pH8.0和引物对Telg和Telc(两者为900nM)。由于高浓度的引物容许多个退火位点，在使用FFPE DNA时对端粒DNA优选较高的引物浓度。

在三个阶段中扩增端粒序列。阶段1：95℃持续10分钟以活化Hotstart DNA Taq聚合酶(BioChain)；阶段2：5个循环的95℃ 15秒钟、50℃ 10秒钟以生成PCR产物，其会起模板的作用以进行随后的扩增循环。阶段2的退火温度的范围可以是49℃至58℃。阶段3：25个循环的95℃ 15秒钟、60℃ 15秒钟，于60℃采集信号。总运行时间是70分钟。

如下使用Power SYBR Green PCR大师级混合物(Applied Biosystems)进行单拷贝36B4基因的扩增：95℃持续10分钟以活化大师级混合物(Applied Biosystems)中的DNA聚合酶，接着是40个循环的95℃ 15秒钟、58℃ 1分钟，于58℃采集信号。使用1ng/10μL样品(0.1ng/μL)、40μL Power SYBR Green大师级混合物(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)和引物对36B4d(300nM)和36B4u(300nM)实施36B4扩增。

将阶段2的端粒序列PCR的循环数目修改成5个循环以在每个PCR反应中使用1ngDNA时具有适当的ΔCt值(ΔCt_样品＝Ct_端粒-Ct_参照)。每个反应1ng-10ng DNA在再现性研究中具有>94％的PCR效率。单拷贝基因PCR的循环数目需要比端粒PCR的循环数目高9个循环以生成足够的单拷贝基因PCR产物。

样品间单拷贝基因与端粒的平均循环数目差异(Ct_36B4-Ct_端粒，或ΔCt)范围为9.208至14.500。

来自FFPE样品的基因组DNA中的DNA交联和片段化提出一个独特的挑战，尤其对于扩增长的重复端粒序列，而扩增相同样品中酸性核糖体磷蛋白P(在此文件中称作36B4)的单拷贝基因的76bp片段经常不受影响。为了解决此问题，改变数项PCR条件(即PCR引物的选择、PCR反应缓冲液条件和热循环条件)以实现缩短端粒扩增子大小并改善PCR扩增效率的目标。

结果

通过Southern印迹测定的人肿瘤细胞系中的平均端粒长度与通过qPCR(测定标准)获得的结果相关联(图3小图A和B)。

通过qPCR获得的端粒长度亚组中的无进展存活分析指示用伊美司他治疗的具有短端粒的患者比具有中等-长端粒的患者显著更具与对照相比的响应性(图1A和1B)。

57份样品中的19份(33％)具有短端粒(图1A)。对于这些，无进展存活分析指示下述内容：对照事件/N是7/8，并且伊美司他事件/N是8/11(图1A)；对照中值(95％CI)是1.48(1.18,2.76)，并且伊美司他中值(95％CI)是4.05(1.25,NA)(图1A)；时序(log rank)P值是0.042，并且危害比(95％CI)是0.32(0.1,1.02)(图1A)。

57份样品中的38份(67％)具有中等-长端粒(图1B)。对于这些，无进展存活分析指示下述内容：对照事件/N是8/12，并且伊美司他事件/N是21/26(图1B)；对照中值(95％CI)是2.7(1.09,3.59)，并且伊美司他中值(95％CI)是2.8(1.51,4.18)(图1B)；时序P值是0.623，并且危害比(95％CI)是0.83(0.36,1.89)(图1B)。

治疗效果随降低肿瘤端粒长度以非线性方式升高(图5)。

实施例3：对来自NSC II期(CP14B)研究的福尔马林固定、石蜡包埋样品的Telo- FISH

自在上文描述的NSC II期(CP14B-012)研究中登记的116名患者中的61名获得了样品。在这61份患者样品中，59份产生了用于PFS分析的可评估Telo-FISH测定法结果。每次测定产生来自载玻片上6个区域(“领域”)的7-14545个焦点的数据。对每个焦点记录面积和荧光强度。

材料和方法

通过常规的组织学方法制备未染色的FFPE组织载玻片(厚5μm的组织切片)。于65℃预加热组织载玻片6分钟以熔解石蜡，然后加载至载玻片架上。将加载的载玻片架在染色罐中的100mL二甲苯中浸没3分钟2次(3分钟x2)以除去石蜡。

然后，经由分级的乙醇系列在3分钟增量中水合载玻片：100％EtOH(3分钟x2)、95％EtOH(3分钟x2)、和70％EtOH(3分钟x2)。在此乙醇浸没后，将载玻片在去离子水中浸没3分钟，并且在含1％Tween-20去污剂的去离子水中再浸没3分钟。

将载玻片短暂浸入水中以洗去Tween-20，然后印迹并浸没入含有Vector靶物揭示溶液(以100倍稀释入H₂O中)的100mL 1X柠檬酸盐缓冲液罐中。将整个罐放置在预热(煮沸)的蒸气发生器中，并且蒸35分钟，然后自蒸气发生器取出，并于室温冷却至少30分钟。接着，将载玻片在去离子水中浸没3分钟，然后在70％乙醇中两次，在95％乙醇中两次，并风干。

使用以下试剂和体积制备杂交探针：

在杂交缓冲液中以适当的稀释因数(例如5倍)稀释10ug/mL PNA端粒探针TelC-Cy3(PNA Bio Inc.)CCCTAACCCTAACCCTAA(SEQ ID NO:8)储液。将30-50μL稀释的PNA探针添加至标本上，然后在不引入气泡的情况中应用盖玻片。将载玻片在载玻片温箱的表面上于84℃放置6分钟以变性端粒DNA。

将载玻片移至黑暗的密闭容器，并于室温杂交2小时。通过添加水或湿的Kimwipe使容器潮湿以防止干燥。

使用下述试剂和体积制备用于PNA端粒探针的清洗缓冲液：

在除去盖玻片后，用PNA清洗缓冲液在温和搅动的情况中于室温将载玻片清洗15分钟两次(15分钟x2)。接着，排干载玻片，并用1ug/ml DAPI溶液将核复染色5分钟(在水中对5mg/mL DAPI储备溶液以1:5000稀释；例如在100mL H₂O中20μL 5mg/mL DAPI储液)。

接着，将载玻片在蒸馏水中清洗3分钟四次(3分钟x4)，然后排干，并风干。在避免气泡的情况中使用抗褪色封固介质溶液在载玻片上封固盖玻片。在使载玻片避光的黑暗位置中将封固的载玻片保持过夜，之后在显微镜下测试。在IN Cell Analyzer 2000(GECorp.)中筛选染色的载玻片以收集DAPI(核)和Cy3(端粒)的荧光信号强度和荧光信号面积。

利用IN Cell developer Toolbox 1.9(GE Corp.)来定量来自自生物学样品获得并进行telo-FISH的细胞的平均端粒长度。使用此软件基于DAPI染剂的位置画出围绕细胞核的线，并且基于端粒特异性荧光的位置画出围绕细胞端粒的线。一旦每个核和端粒被包围，软件就计算细胞中每个端粒个体的强度和面积，并且依照方程式1为自生物学样品衍生的细胞确定平均端粒长度：1.376x log₂(强度)–6.215x√(面积)[方程式1]。

最初结果

通过Southern印迹测定的人肿瘤细胞系中的端粒长度与通过Telo-FISH(测定标准)获得的结果相关联(图4小图A和B)。

通过Telo-FISH IN Cell-四分位数拆分分开获得的端粒长度亚组中的无进展存活分析指示大的面积和低的强度(即低的强度与面积比)与较好的伊美司他功效有关(图2)。

无进展存活分析指示下述内容：事件/N是9/15；对照中值(95％CI)是1.18(1.09,NA)，并且伊美司他中值(95％CI)是4.7(1.41,NA)(图2)；时序P值是0.044，并且危害比(95％CI)是0.26(0.06,1.1)(图2)。

用伊美司他治疗的患者中无进展存活的Telo-FISH多变量预测产生下述数据：

来自多变量模型的PFS风险的四分位数拆分(小的强度/面积比)：

小的强度/面积
	15/59(25.4％)

治疗效果随降低肿瘤端粒长度以非线性方式升高(图6)。

后来的结果

在一个后来的时间点进行了患者群体的进一步分析。在图7到10中描绘了此后来的数据。

图7显示了所有患者的无进展存活分析(N＝全部114名患者，具有92个无进展存活事件和2.6个月的中值随访)，而图8小图A和B分别显示具有短端粒和中等-长端粒的患者的无进展存活分析。对于具有短端粒的患者，前瞻性Telo-FISH测定法预示无进展存活(图8小图A)。

图9中显示了所有患者的总体存活分析(全部114名患者，具有66个总体存活事件和10.5个月的中值随访)，其证明了与对照相比接受伊美司他的患者朝向总体存活益处的趋势。图10小图A中显示了具有短端粒的患者的总体存活分析，而图10小图B中显示了具有中等-长端粒的患者的总体存活分析。

实施例4：对来自伊美司他NSC II期(CP14B-012)研究的福尔马林固定、石蜡包埋样品的qPCR

此实施例演示第二种定量聚合酶链式反应用于测定FFPE NSC II期(CP14B-012)研究组织样品的相对端粒长度的性能。

此实施例在对qPCR方案的下述变化的情况中遵循实施例2中的所有规程。

定量PCR(qPCR)

使用ABI Prism 7900HT序列检测系统(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)实施所有定量PCR反应。实施了一种PCR。

用于端粒扩增的引物序列是Telg 5’-ACA CTA AGG TTT GGG TTT GGG TTT GGGTTT GGG TTA GTG T(SEQ ID NO:4)和Telc 5’-TGT TAG GTA TCC CTA TCC CTA TCC CTATCC CTA TCC CTA ACA(SEQ ID NO:5)(Cawthon,2009)；并且用于36B4的引物序列是36B4u:5’-CAG CAA GTG GGA AGG TGT AAT CC(SEQ ID NO:6)和36B4d:5’-CCC ATT CTA TCA TCATCA ACG GGT ACAA(SEQ ID NO:7)(Cawthon,2002)。

还使用DNA标准品作为测定法/板对照。端粒长度双链模板的DNA标准品的序列是5’-TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGGTTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG-3’(SEQ ID NO:9)，并且单拷贝基因双链模板的序列是：5’-CTT TTC AGC AAG TGG GAA GGT GTA ATC CGT CTC CAC AGA CAA GGC CAGGAC TCG TTT GTA CCC GTT GAT GAT AGA ATG GGG TAC-3’(SEQ ID NO:10)(两者都来自Integrated DNA Technologies)。

使用1ng/10μL样品(0.1ng/μL)和40μL PCR混合物实施用于对来自FFPE样品的DNA或寡核苷酸端粒标准品扩增端粒的每个PCR，所述PCR混合物含有1.25U Hotstart DNA Taq聚合酶(BioChain)、150nM 6-ROX荧光染料、0.4x SYBR Green I核酸染剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)、50mM KCl、2mM MgCl₂、0.2mM每种脱氧核苷三磷酸(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)、5mM二硫苏糖醇、1％二甲亚砜、和15mM Tris-HCl pH8.0和引物对Telg和Telc(两者都为900nM)。由于高浓度的引物容许多个退火位点，在使用FFPE DNA时对端粒DNA优选较高的引物浓度。

使用Power SYBR Green PCR大师级混合物(Applied Biosystems)进行单拷贝36B4基因标准品和FFPE样品中单拷贝基因的扩增。使用1ng/10μL样品(0.1ng/μL)、40μLPower SYBR Green大师级混合物(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)和引物对36B4d(300nM)和36B4u(300nM)实施36B4扩增。

在板上的不同孔中放置用于扩增端粒序列的来自FFPE样品的DNA和用于扩增单拷贝基因的来自FFPE样品的DNA。在同一块板上的不同孔中放置用于扩增端粒序列和用于扩增单拷贝36B4基因的DNA标准品，并且均在三个阶段中扩增。阶段1：95℃持续10分钟以活化DNA Taq聚合酶；阶段2：3个循环的95℃ 15秒钟、50℃ 10秒钟以生成PCR产物，其会起模板作用以进行随后的扩增循环。阶段3：35个循环的95℃ 15秒钟、60℃ 15秒钟，于60℃采集信号。总运行时间是90分钟。

阶段2的循环数目是3个循环以在每个PCR反应中使用10ng FFPE样品DNA时具有适当的ΔCt值(ΔCt_样品＝Ct_端粒-Ct_参照)。每个反应1ng-10ng FFPE样品DNA在再现性研究中具有>94％的PCR效率。

结果

通过回顾性qPCR获得的端粒长度亚组中的无进展存活分析指示用伊美司他治疗的具有短端粒的患者比具有中等-长端粒的患者显著更具与对照相比的响应性(图11小图A和B)。

52份样品中的18份(35％)具有短端粒(图11小图A)。对于这些，无进展存活分析指示下述内容：事件/N是13/18(图11小图A)；对照中值(95％CI)是2.57(1.18,NA)，并且伊美司他中值(95％CI)是1.91(1.22,NA)(图11小图A)；时序P值是0.325，并且危害比(95％CI)是0.55(0.17,1.84)(图11小图A)。

52份样品中的34份(65％)具有中等-长端粒(图11小图B)。对于这些，无进展存活分析指示下述内容：事件/N是26/34(图11小图B)；对照中值(95％CI)是2.66(0.92,NA)，并且伊美司他中值(95％CI)是3.03(1.58,4.47)(图11小图B)；时序P值是0.309，并且危害比(95％CI)是0.65(0.27,1.56)(图11小图B)。

实施例(其意图是本发明的纯粹例示，并且因此不应认为是以任何方式限制本发明)也描述并详述了上文讨论的发明的各方面和实施方案。前述实施例和详细描述作为例示而非作为限制提供。通过提及将本说明书中引用的所有出版物、专利申请、专利收入本文，就像具体且单独指出通过提及收录每篇个别的出版物、专利申请、或专利一样。特别地，为了描述并公开可以与本发明结合使用的组合物和方法，通过提及将本文中引用的所有出版物明确收入本文。虽然为了理解清楚的目的通过例示和实施例较为详细地描述了前述发明，但是根据本发明的教导对于本领域普通技术人员显而易见的是，可以在不偏离所附权利要求书的精神或范围的前提下对其做出某些改变和修改。

Claims

c.对该个体施用治疗有效量的端粒酶抑制剂。