BR112015012507B1 - Método in vitro de seleção de um indivíduo diagnosticado ou suspeito de ter câncer - Google Patents

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Abstract

MÉTODO IN VITRO DE SELEÇÃO DE UM INDIVÍDUO DIAGNOSTICADO OU SUSPEITO DE TER CÂNCER E USO DE UM INIBIDOR DE TELOMERASE. São aqui fornecidos métodos para identificação de indivíduos diagnosticados com um distúrbio prolifer ativo celular que se beneficiarão do tratamento com um composto inibidor da telomerase. Também são aqui fornecidos métodos para o tratamento desses indivíduos com compostos inibidores da telomerase. Os métodos compreendem a identificação de indivíduos que se beneficiarão do referido tratamento com base no comprimento relativo médio de telômeros em células de câncer dos referidos indivíduos.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Esse pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente U.S. Provisório N° 61/732.263, depositado em 30 de novembro de 2012, Pedido de Patente U.S. Provisório N° 61/780.851, depositado em 13 de março de 2013, Pedido de Patente U.S. N° 13/802.035, depositado em 13 de março de 2013, Pedido de Patente U.S. Provisório N° 61/798.478, depositado em 15 de março de 2013 e Pedido de Patente U.S. Provisório N° 61/809.228, depositado em 5 de abril de 2013, cujas revelações são aqui incorporadas por referência em suas totalidades.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] Essa invenção está relacionada aos métodos para identificação de indivíduos que possuem ou são suspeitos de ter câncer que se beneficiariam de tratamento com compostos inibidores da telomerase, além, de métodos para o tratamento desses indivíduos.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[003] O câncer é uma causa importante de morte em todo o mundo. Apesar dos avanços significantes no campo de quimioterapia, muitas das formas mais prevalentes de câncer ainda resistem à intervenção quimioterápica.
[004] Telômeros são sequências de ácidos nucléicos repetitivas presentes nas extremidades dos cromossomos lineares de organismos eucarióticos. As sequências de telômero, juntamente com proteínas de ligação-telômero, conferem estabilidade aos cromossomos. Telômeros são geralmente compostos por repetições em tandem curtas com uma unidade de sequência de repetição especificada pela enzima telomerase particular para o organismo. São conhecidas sequências de repetição de telômero para diversos organismos. A unidade de sequência de repetição de telômero humano é (TTAGGG)n. Além das sequências de repetição de fita dupla, as extremidades 3’ de alguns telômeros contêm uma região de fita simples, que, para humanos, está localizada na fita rica em G.
[005] A telomerase é uma riboproteína que sintetiza DNA telomérico. Na ausência de telomerase, telômeros gradualmente encurtam, pois as DNA polimerases são incapazes de replicar as extremidades de DNA dúplex linear. O encurtamento gradual dos telômeros por fim leva à interrupção do ciclo celular ou à morte celular. Em humanos, a mortalidade dependente do comprimento do telômero em células ocorre por causa da repressão da telomerase em células somáticas normais antes do nascimento, de um comprimento de telômero inicial ao nascimento e por toda a vida, e da expressão rigorosamente regulada de telomerase em células progenitoras ou células- tronco. Humanos nascem com telômeros “de comprimento total”. Como a telomerase está infra-regulada em tecidos somáticos, isso leva à perda de DNA telomérico com envelhecimento celular e cronológico. Dessa forma, telômeros atuam como um relógio mitótico, conferindo uma capacidade finita para divisão em células humanas normais. Telômeros curtos prejudicam a habilidade de células-tronco para proliferar. Por exemplo, telômeros curtos em células- tronco epidérmicas prejudicam o crescimento da pele e dos cabelos.
[006] Células de câncer geralmente passam por rodadas repetidas de divisão celular e possuem telômeros que são estáveis, mas mais curtos do que aqueles em células normais. A ativação da telomerase é necessária para que a maioria das células de câncer replique indefinidamente, e seja capaz de crescimento tumoral e metástase (Kim e cols., Science 266: 2.011-2.015; Shay J.W. e Wright W.E., Carcinogenesis 26: 867-74 (2005)). Consequentemente, a inibição de telomerase é considerada uma estratégia de tratamento promissora para uma ampla variedade de tipos de tumores sólidos e malignidades hematológicas (Harley C.B., Nature Rev. Cancer, 8: 167-179 (2008)).
[007] Infelizmente, muitos pacientes com câncer não se beneficiam de agentes citotóxicos ou terapias direcionadas como, por exemplo, inibidores da telomerase, mas ainda estão expostos aos seus efeitos tóxicos. Por essas razões, novos métodos para identificação de pacientes com câncer responderão favoravelmente ao tratamento com essas substâncias terapêuticas são urgentemente necessários.
[008] Ao longo desse relatório descritivo, várias patentes, pedidos de patentes e outros tipos de publicações (por exemplo, artigos de revista) são citados. A revelação de todas as patentes, pedidos de patentes e publicações aqui citados são aqui incorporados por referência em sua totalidade para todas as finalidades.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[009] A invenção aqui fornecida revela, entre outras coisas, métodos para identificação de indivíduos que se beneficiarão de tratamento com terapia com inibidor da telomerase e métodos para o tratamento da mesma.
[010] Consequentemente, em um aspecto, são aqui fornecidos métodos para a seleção de um indivíduo diagnosticado ou suspeito de ter câncer que se beneficiará do tratamento com um inibidor da telomerase, o método compreendendo: determinação do comprimento relativo do telômero por análise do comprimento relativo de ácidos nucléicos teloméricos em células de câncer presentes em uma amostra biológica do indivíduo; e seleção de um indivíduo que se beneficiará do tratamento com um inibidor da telomerase quando o comprimento relativo médio do telômero nas células de câncer presentes em uma amostra biológica do indivíduo é determinado como estando no 50° percentil ou menos de uma faixa de comprimentos relativos de telômero determinada a partir de um ou mais padrões conhecidos. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o inibidor da telomerase compreende um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o oligonucleotídeo é complementar ao componente de RNA de telomerase. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o oligonucleotídeo tem 10 a 20 pares de bases de comprimento. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o oligonucleotídeo compreende a sequência TAGGGTTAGACAA (ID. DE SEQ. N°: 3). Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação tiofosforamidato internucleosídeos N3’^P5’. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o oligonucleotídeo compreende ligações tiofosforamidato internucleosídeos N3’^P5’. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o oligonucleotídeo compreende uma porção lipídica ligada à extremidade 5’ e/ou 3’ dos oligonucleotídeo. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, a porção lipídica está ligada à extremidade 5’ e/ou 3’ do oligonucleotídeo por meio de um vinculador. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o vinculador é um vinculador de glicerol ou de aminoglicerol. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, a porção lipídica é uma porção palmitoil (C16). Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o inibidor da telomerase é Imetelstat. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o câncer é câncer de pulmão de pequena célula, câncer de mama, câncer de próstata ou um câncer hematológico. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, a administração do inibidor da telomerase resulta em proliferação diminuída da célula de câncer e/ou do crescimento tumoral. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, a administração do inibidor da telomerase resulta em sobrevida livre de progressão aumentada no indivíduo. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o inibidor da telomerase é administrado com um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o inibidor da telomerase é formulado para administração oral, intravenosa, subcutânea, intramuscular, tópica, intraperitoneal, intranasal, por inalação, intratumoral ou intraocular. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, a administração da quantidade terapeuticamente eficaz do inibidor da telomerase compreende o contato de uma ou mais células de câncer com o inibidor da telomerase. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, a administração da quantidade terapeuticamente eficaz do inibidor da telomerase resulta em um ou mais de proliferação celular reduzida, apoptose ou senescência celular aumentada. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o método ainda compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais agentes terapêuticos anticâncer adicionais. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o comprimento do telômero médio é determinado por qPCR, telo-FISH ou Southern Blot. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o indivíduo é um humano. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, os referidos (um ou mais) padrões conhecidos são linhagens de células caracterizadas. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, as linhagens de células são selecionadas do grupo que consiste em: células M14Mel, células A549, células SK-Mel-5 e células Ovcar-5. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, as linhagens de células caracterizadas são selecionadas de linhagens de células representativas do tipo de amostra biológica de qualquer uma das modalidades aqui reveladas. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, as linhagens de células caracterizadas são linhagens de células de câncer de pulmão de célula não pequena, linhagens de células hepatocelulares ou linhagens de células ovarianas. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, os referidos (um ou mais dos) padrões conhecidos consistem em uma faixa de comprimentos de telômero estabelecida a partir de diversos tumores de ocorrência natural de diversos indivíduos. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, as referidas células de câncer de diversos tumores de ocorrência natural são do mesmo tipo que as células de câncer presentes na amostra biológica do indivíduo. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o comprimento do telômero nas células de câncer presentes na amostra biológica é determinado como estando no 40° percentil, 35° percentil, 30° percentil, 25° percentil, 20° percentil, 15° percentil, 10° percentil, 5° percentil ou menos do que a faixa de comprimentos de telômero.
[011] Em outro aspecto, são aqui fornecidos métodos para o tratamento de um indivíduo diagnosticado ou suspeito de ter câncer, o método compreendendo: determinação do comprimento relativo do telômero por análise do comprimento relativo de ácidos nucléicos teloméricos em células de câncer presentes em uma amostra biológica do indivíduo; seleção de um indivíduo que se beneficiará do tratamento com um inibidor da telomerase quando o comprimento relativo médio do telômero nas células de câncer presentes em uma amostra biológica do indivíduo é determinado como estando no 50° percentil ou menos de uma faixa de comprimentos relativos de telômero determinada a partir de um ou mais padrões conhecidos; e administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do inibidor da telomerase ao indivíduo. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o inibidor da telomerase compreende um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o oligonucleotídeo é complementar ao componente de RNA de telomerase. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o oligonucleotídeo tem 10 a 20 pares de bases de comprimento. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o oligonucleotídeo compreende a sequência TAGGGTTAGACAA (ID. DE SEQ. N°: 3). Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação tiofosforamidato internucleosídeos N3’^P5‘. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o oligonucleotídeo compreende ligações tiofosforamidato internucleosídeos N3’^P5‘. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o oligonucleotídeo compreende uma porção lipídica ligada à extremidade 5’ e/ou 3’ dos oligonucleotídeo. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, a porção lipídica está ligada à extremidade 5’ e/ou 3’ do oligonucleotídeo por meio de um vinculador. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o vinculador é um vinculador de glicerol ou de aminoglicerol. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, a porção lipídica é uma porção palmitoil (C16). Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o inibidor da telomerase é Imetelstat. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o câncer é câncer de pulmão de pequena célula, câncer de mama, câncer de próstata ou um câncer hematológico. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, a administração do inibidor da telomerase resulta em proliferação diminuída da célula de câncer e/ou do crescimento tumoral. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, a administração do inibidor da telomerase resulta em sobrevida livre de progressão aumentada no indivíduo. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o inibidor da telomerase é administrado com um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o inibidor da telomerase é formulado para administração oral, intravenosa, subcutânea, intramuscular, tópica, intraperitoneal, intranasal, por inalação, intratumoral ou intraocular. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, a administração da quantidade terapeuticamente eficaz do inibidor da telomerase compreende o contato de uma ou mais células de câncer com o inibidor da telomerase. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, a administração da quantidade terapeuticamente eficaz do inibidor da telomerase resulta em um ou mais de proliferação celular reduzida, apoptose ou senescência celular aumentada. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o método ainda compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais agentes terapêuticos anticâncer adicionais. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o comprimento do telômero médio é determinado por qPCR, telo-FISH ou Southern Blot. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o indivíduo é um humano. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, os referidos (um ou mais) padrões conhecidos são linhagens de células caracterizadas. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, as linhagens de células são selecionadas do grupo que consiste em: células M14Mel, células A549, células SK-Mel-5 e células Ovcar-5. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, as linhagens de células caracterizadas são selecionadas de linhagens de células representativas do tipo de amostra biológica de qualquer uma das modalidades aqui reveladas. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, as linhagens de células caracterizadas são linhagens de células de câncer de pulmão de célula não pequena, linhagens de células hepatocelulares ou linhagens de células ovarianas. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, os referidos (um ou mais dos) padrões conhecidos consistem em uma faixa de comprimentos de telômero estabelecida a partir de diversos tumores de ocorrência natural de diversos indivíduos. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, as referidas células de câncer de diversos tumores de ocorrência natural são do mesmo tipo que as células de câncer presentes na amostra biológica do indivíduo. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o comprimento do telômero nas células de câncer presentes na amostra biológica é determinado como estando no 40° percentil, 35° percentil, 30° percentil, 25° percentil, 20° percentil, 15° percentil, 10° percentil, 5° percentil ou menos do que a faixa de comprimentos de telômero.
[012] Ainda em outros aspectos, são aqui fornecidos métodos para o tratamento de um indivíduo diagnosticado ou suspeito de ter câncer, o método compreendendo: administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor da telomerase ao indivíduo quando o comprimento relativo médio do telômero em células de câncer presentes em uma amostra biológica do indivíduo foi determinado como estando no 50° percentil ou menos de uma faixa de comprimentos relativos de telômero determinada a partir de um ou mais padrões conhecidos. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o inibidor da telomerase compreende um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o oligonucleotídeo é complementar ao componente de RNA de telomerase. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o oligonucleotídeo tem 10 a 20 pares de bases de comprimento. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o oligonucleotídeo compreende a sequência TAGGGTTAGACAA (ID. DE SEQ. N°: 3). Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação tiofosforamidato internucleosídeos N3’^P5’. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o oligonucleotídeo compreende ligações tiofosforamidato internucleosídeos N3’^P5’. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o oligonucleotídeo compreende uma porção lipídica ligada à extremidade 5’ e/ou 3’ dos oligonucleotídeo. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, a porção lipídica está ligada à extremidade 5’ e/ou 3’ do oligonucleotídeo por meio de um vinculador. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o vinculador é um vinculador de glicerol ou de aminoglicerol. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, a porção lipídica é uma porção palmitoil (C16). Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o inibidor da telomerase é Imetelstat. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o câncer é câncer de pulmão de pequena célula, câncer de mama, câncer de próstata ou um câncer hematológico. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, a administração do inibidor da telomerase resulta em proliferação diminuída da célula de câncer e/ou do crescimento tumoral. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, a administração do inibidor da telomerase resulta em sobrevida livre de progressão aumentada no indivíduo. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o inibidor da telomerase é administrado com um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o inibidor da telomerase é formulado para administração oral, intravenosa, subcutânea, intramuscular, tópica, intraperitoneal, intranasal, por inalação, intratumoral ou intraocular. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, a administração da quantidade terapeuticamente eficaz do inibidor da telomerase compreende o contato de uma ou mais células de câncer com o inibidor da telomerase. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, a administração da quantidade terapeuticamente eficaz do inibidor da telomerase resulta em um ou mais de proliferação celular reduzida, apoptose ou senescência celular aumentada. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o método ainda compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais agentes terapêuticos anticâncer adicionais. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o comprimento do telômero médio é determinado por qPCR, telo-FISH ou Southern Blot. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o indivíduo é um humano. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, os referidos (um ou mais) padrões conhecidos são linhagens de células caracterizadas. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, as linhagens de células são selecionadas do grupo que consiste em: células M14Mel, células A549, células SK-Mel-5 e células Ovcar-5. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, as linhagens de células caracterizadas são selecionadas de linhagens de células representativas do tipo de amostra biológica de qualquer uma das modalidades aqui reveladas. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, as linhagens de células caracterizadas são linhagens de células de câncer de pulmão de célula não pequena, linhagens de células hepatocelulares ou linhagens de células ovarianas. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, os referidos (um ou mais dos) padrões conhecidos consistem em uma faixa de comprimentos de telômero estabelecida a partir de diversos tumores de ocorrência natural de diversos indivíduos. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, as referidas células de câncer de diversos tumores de ocorrência natural são do mesmo tipo que as células de câncer presentes na amostra biológica do indivíduo. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades aqui reveladas, o comprimento do telômero nas células de câncer presentes na amostra biológica é determinado como estando no 40° percentil, 35° percentil, 30° percentil, 25° percentil, 20° percentil, 15° percentil, 10° percentil, 5° percentil ou menos do que a faixa de comprimentos de telômero.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[013] A Figura 1A revela a análise da sobrevida livre de progressão (PFS) do subgrupo de telômero curto (percentil 33) do Estudo de Fase II (CP14B-012) de Câncer de Pulmão de Célula Não-Pequena (NSC) de Imetelstat com base nos comprimentos de telômero médios determinados usando PCR quantitativa (qPCR), como mostrado no Exemplo 2.
[014] A Figura 1B revela a análise da sobrevida livre de progressão (PFS) do subgrupo de telômero médio-longo (mais longo 67% de comprimento relativo do telômero) do Estudo de Fase II (CP14B-012) de Câncer de Pulmão de Célula Não-Pequena (NSC) de Imetelstat com base nos comprimentos de telômero médios determinados usando PCR quantitativa (qPCR), como mostrado no Exemplo 2.
[015] A Figura 2 revela a análise da sobrevida livre de progressão (PFS) de dados dos 15 pacientes no braço tratado com Imetelstat do Estudo de Fase II (CP14B-012) de Câncer de Pulmão de Célula Não-Pequena (NSC) de Imetelstat que possuem o 25° percentil mais curto de comprimentos relativos de telômero. A análise de comprimentos de telômero individuais desses pacientes foi feita usando Hibridização In Situ Fluorescente de Telômero (Telo-FISH).
[016] A Figura 3A revela o comprimento do fragmento de restrição terminal (TRF) em linhagens de células tumorais humanas fixadas em formalina-embebidas em parafina (FFPE) M14Mel, OVCAR-8, A549, SK-Mel-5, MDA-MB- 231, MDA-MB435, OVCAR-5, A498 e CAKI-1, como determinado por Southern Blotting.
[017] A Figura 3B revela proporções T/S médias em linhagens de células tumorais humanas fixadas em formalina- embebidas em parafina (FFPE) M14Mel, OVCAR-8, A549, SK-Mel- 5, MDA-MB-231, MDA-MB435, OVCAR-5, A498 e Caki-1, como determinadas por PCR quantitativa (qPCR).
[018] A Figura 4A revela o comprimento do fragmento de restrição terminal (TRF) em linhagens de células tumorais humanas fixadas em formalina-embebidas em parafina (FFPE) M14Mel, OVCAR-8, A549, SK-Mel-5, MDA-MB- 231, MDA-MB435, OVCAR-5, A498 e CAKI-1, como determinado por Southern Blotting.
[019] A Figura 4B revela resultados de Telo-FISH para linhagens de células humanas M14Mel, A549, SK-Mel-5, e OVCAR-5 (OV5).
[020] A Figura 5 revela razões de risco (HR) da sobrevida livre de progressão (PFS) para pacientes do Estudo de Fase II (CP14B-012) de Câncer de Pulmão de Célula Não-Pequena (NSC) de Imetelstat tabuladas contra percentis do comprimento do telômero do paciente, em que o comprimento relativo do telômero foi determinado por PCR quantitativa (qPCR).
[021] A Figura 6 revela razões de risco (HR) da sobrevida livre de progressão (PFS) para pacientes do Estudo de Fase II (CP14B-012) de Câncer de Pulmão de Célula Não-Pequena (NSC) de Imetelstat tabuladas contra percentis do comprimento do telômero do paciente, em que o comprimento relativo do telômero foi determinado por Hibridização In Situ Fluorescente de Telômero (Telo-FISH).
[022] A Figura 7 revela a análise da sobrevida livre de progressão (PFS) para todos os 114 pacientes do Estudo de Fase II (CP14B-012) de Câncer de Pulmão de Célula Não- Pequena de Imetelstat com base nos comprimentos relativos de telômero determinados usando um ensaio de Hibridização In Situ Fluorescente de Telômero (Telo-FISH) prospectivo.
[023] A Figura 8A revela a análise da sobrevida livre de progressão (PFS) do subgrupo de telômero curto (N=20) do Estudo de Fase II (CP14B-012) de Câncer de Pulmão de Célula Não-Pequena de Imetelstat com base nos comprimentos relativos de telômero determinados usando um ensaio Telo- FISH prospectivo.
[024] A Figura 8B revela a análise da sobrevida livre de progressão (PFS) do subgrupo de telômero médio-longo (N=39) do Estudo de Fase II (CP14B-012) de Câncer de Pulmão de Célula Não-Pequena de Imetelstat com base nos comprimentos relativos de telômero determinados usando um ensaio Telo-FISH prospectivo.
[025] A Figura 9 revela a análise da sobrevida global (OS) para todos os pacientes (N=114) no Estudo de Fase II (CP14B-012) de Câncer de Pulmão de Célula Não-Pequena de Imetelstat com base nos comprimentos relativos de telômero determinados usando um ensaio Telo-FISH prospectivo.
[026] A Figura 10A revela a análise da sobrevida global (OS) para o subgrupo de telômero curto (N=20) no Estudo de Fase II (CP14B-012) de Câncer de Pulmão de Célula Não- Pequena de Imetelstat com base nos comprimentos relativos de telômero determinados usando um ensaio Telo-FISH prospectivo.
[027] A Figura 10B revela a análise da sobrevida global (OS) para o subgrupo de telômero médio-longo (N=39) no Estudo de Fase II (CP14B-012) de Câncer de Pulmão de Célula Não-Pequena de Imetelstat com base nos comprimentos relativos de telômero determinados usando um ensaio Telo- FISH prospectivo.
[028] A Figura 11A revela a análise da sobrevida livre de progressão (PFS) do subgrupo de telômero curto (percentil 33) do Estudo de Fase II (CP14B-012) de Câncer de Pulmão de Célula Não-Pequena (NSC) de Imetelstat com base nos comprimentos de telômero médios determinados usando PCR quantitativa (qPCR), como mostrado no Exemplo 4.
[029] A Figura 11B revela a análise da sobrevida livre de progressão (PFS) do subgrupo de telômero médio-longo (mais longo 67% de comprimento relativo do telômero) do Estudo de Fase II (CP14B-012) de Câncer de Pulmão de Célula Não-Pequena (NSC) de Imetelstat com base nos comprimentos de telômero médios determinados usando PCR quantitativa (qPCR), como mostrado no Exemplo 4.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[030] Essa invenção fornece, entre outras coisas, métodos para identificação de indivíduos suspeitos de ter ou que foram diagnosticados com um distúrbio proliferativo celular que se beneficiarão do tratamento com um composto inibidor da telomerase, bem como métodos para o tratamento desses indivíduos. O comprimento do telômero em células de câncer pode variar de tumor para tumor. Os inventores observaram que células de câncer com comprimentos de telômero mais curtos são mais responsivos ao tratamento com compostos inibidores da telomerase (por exemplo, Imetelstat) em comparação com células de câncer que possuem comprimentos de telômero mais longos. Consequentemente, são aqui fornecidos métodos para a seleção de um indivíduo diagnosticado ou suspeito de ter câncer que se beneficiará do tratamento com um inibidor da telomerase. Também são aqui fornecidos métodos para o tratamento de um indivíduo diagnosticado ou suspeito de ter câncer com um inibidor da telomerase, quando o comprimento relativo médio do telômero nas células de câncer presentes em uma amostra biológica do indivíduo é determinado como estando no 50° percentil ou menos de uma faixa de comprimentos relativos de telômero determinada a partir de um ou mais padrões conhecidos.
I. TÉCNICAS GERAIS
[031] A prática da invenção empregará, a menos que indicado de forma diferente, técnicas convencionais em química de ácido nucléico, biologia molecular, microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que são bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Essas técnicas estão totalmente explicadas na literatura, por exemplo, em “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Segunda Edição (Sambrook e cols., 1989) e “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Terceira Edição (Sambrook e Russel, 2001), (conjuntamente aqui denominados “Sambrook”); “Current Protocols in Molecular Biology” (F.M. Ausubel e cols., eds., 1987, incluindo suplementos até 2001); “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis e cols., eds., 1994). Ácidos nucléicos podem ser sintetizados in vitro por técnicas de síntese química bem conhecidas, como descrito, por exemplo, em Carruthers (1982) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47: 411-418; Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105: 661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 5 25: 3.4403.444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19: 373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33: 7.886-7.896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68: 90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68: 109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22: 1.859; Komberg e Baker, DNA Replication, 2a Edição (Freeman, San Francisco, 1992); Scheit, “Nucleotide Analogs” (John Wiley, Nova York, 1980); Uhlmann e Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584, 1990.
II. DEFINIÇÕES
[032] O termo “nucleosídeo” se refere a uma porção que possui a estrutura geral representada abaixo, em que B representa um nucleobase e o carbono 2’ pode ser substituído como descrito abaixo. Quando incorporado em um oligômero ou polímero, o carbono 3’ é ainda ligado a um átomo de oxigênio ou nitrogênio.
Figure img0001
[033] Essa estrutura inclui formas 2’-desóxi e 2’- hidroxil (ou seja, desoxirribose e ribose), e análogos. Menos comumente, um grupo 5’-NH pode substituir o 5’- oxigênio. “Análogos”, em referência a nucleosídeos, inclui nucleosídeos sintéticos que possuem porções de nucleobase modificadas (veja a definição de “nucleobase” abaixo) e/ou porções de açúcar modificadas, por exemplo, açúcares 2’- flúor, e análogos adicionais. Esses análogos são tipicamente projetados para afetar as propriedades de ligação, por exemplo, estabilidade, especificidade, ou semelhantes. O termo “nucleosídeo” inclui os nucleosídeos naturais, incluindo formas 2’-desóxi e 2’-hidroxil, por exemplo, como descrito em Komberg e Baker, “DNA Replication”, 2a Edição (Freeman, San Francisco, 1992), e análogos. “Análogos”, em referência a nucleosídeos, inclui nucleosídeos sintéticos que possuem porções de nucleobase modificadas (veja a definição de “nucleobase”, infra) e/ou porções de açúcar modificadas, por exemplo, descrito geralmente por Scheit, “Nucleotide Analogs” (John Wiley, Nova York, 1980). Esses análogos incluem nucleosídeos sintéticos projetados para aprimorar as propriedades de ligação, por exemplo, estabilidade, especificidade, ou semelhantes, por exemplo, como revelado por Uhlmann e Peyman, Chemical Reviews 90: 543-584, 1990). Um oligonucleotídeo que contém esses nucleosídeos, e que tipicamente contém ligações internucleosídeos sintéticas resistentes à nuclease pode, ele mesmo, ser denominado um “análogo”.
[034] O termo “polinucleotídeo” ou “oligonucleotídeo” se refere a um polímero ou oligômero de subunidade de nucleosídeo de ribose e/ou desoxirribose que possui entre cerca de 2 e cerca de 200 subunidades contíguas. As subunidades de nucleosídeo podem ser unidas por diversas ligações intersubunidades incluindo, sem limitação, ligações fosfodiéster, fosfotriéster, metilfosfonato, fosforamidato P3’^N5‘, fosforamidato N3’^P5’, tiofosforamidato N3^P5’ e fosforotioato. O termo também inclui polímeros ou oligômeros que possuem modificações, conhecidas por aqueles habilitados na técnica, para o açúcar (por exemplo, substituições 2’), a base (veja a definição de “nucleosídeo”, supra) e os terminais 3’ e 5’. Em modalidades nas quais a porção de oligonucleotídeo inclui diversas ligações intersubunidades, cada ligação pode ser formada usando a mesma química, ou uma mistura de químicas de ligação pode ser usada. Quando um oligonucleotídeo é representado por uma sequência de letras, por exemplo, “ATGUCCTG”, será subentendido que os nucleotídeos estão em ordem 5’^3’ da esquerda para a direita. A representação da sequência de base do oligonucleotídeo dessa forma não implica no uso de nenhum tipo de subunidade de internucleosídeo particular no oligonucleotídeo.
[035] Uma “nucleobase” inclui (i) nucleobases de DNA e RNA nativas (uracil, timina, adenina, guanina e citosina), (ii) nucleobases modificadas ou análogos de nucleobase (por exemplo, 5-metilcitosina, 5-bromouracil ou inosina) e (iii) análogos de nucleobase. Um análogo de nucleobase é um composto cuja estrutura molecular mimetiza aquela de uma base de DNA ou RNA típica.
[036] O termo “lipídeo” é aqui usado de forma ampla para englobar substâncias que são solúveis em solventes orgânicos, mas pouco solúveis, ou insolúveis, em água. O termo “lipídeo” inclui, sem limitação, hidrocarbonetos, óleos, gorduras (por exemplo, ácidos graxos e glicerídeos), esteróis, esteróides e formas derivadas desses compostos. Em algumas modalidades, lipídeos são ácidos graxos e seus derivados, hidrocarbonetos e seus derivados, e esteróis, por exemplo, colesterol. Ácidos graxos normalmente contêm números pares de átomos de carbono em uma cadeia linear (comumente 12 a 24 carbonos) e podem ser saturados ou insaturados, e podem conter, ou serem modificados para conter, diversos grupos substituintes. Para simplificar, o termo “ácido graxo” também engloba derivados de ácido graxo, por exemplo, ésteres graxos. Em algumas modalidades, o termo “lipídeo” também inclui compostos anfipáticos que contêm tanto lipídeo quanto porções hidrofílicas.
[037] Como aqui usado, o termo “ácidos nucléicos teloméricos” significa uma sequência de ácido nucléico em um ácido nucléico de fita dupla ou de fita simples que codifica a sequência do telômero do mamífero. Em humanos, a sequência de repetição telomérica é TTAGGG em uma fita e CCCTAA na outra fita.
[038] Um “inibidor da telomerase” é um composto que é capaz de reduzir ou inibir a atividade da enzima transcriptase reversa telomerase em uma célula mamífera. Esse inibidor pode ser um composto de pequena molécula, como aqui descrito, ou um inibidor de modelo de hTR, incluindo um oligonucleotídeo, como aqui descrito. Em um aspecto, o inibidor da telomerase é Imetelstat.
[039] Um “inibidor de modelo de hTR” é um composto que bloqueia a região de modelo (a região que traspõe os nucleotídeos 30 a 67 do ID. DE SEQ. N°: 1 nesse relatório descritivo) do componente de RNA da telomerase humana inibindo, dessa forma, a atividade da enzima. O inibidor é tipicamente um oligonucleotídeo que é capaz de hibridizar para essa região. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo inclui uma sequência eficaz para hibridizar para uma porção mais específica dessa região, que possui a sequência 5’ -CUAACCCUAAC-3 ’ (ID. DE SEQ. N°: 2), que transpõe os nucleotídeos 46 a 56 do ID. DE SEQ. N°: 1 nesse relatório descritivo.
[040] É dito que um composto “inibe a proliferação de células” se a proliferação de células na presença do composto é menor do que aquela observada na ausência do composto. Ou seja, a proliferação das células é tornada mais lenta ou impedida na presença do composto. A inibição da proliferação de células de câncer pode ser evidenciada, por exemplo, por redução no número de células ou taxa de expansão de células, redução na massa tumoral ou na taxa de crescimento tumoral, ou aumento na taxa de sobrevida de um indivíduo que está sendo tratado.
[041] Um oligonucleotídeo que possui “ligações resistentes à nuclease” se refere àquele oligonucleotídeo cujo arcabouço possui ligações de subunidades que são substancialmente resistentes à clivagem por nuclease, em forma não hibridizada ou hibridizada, por nucleases extracelulares e intracelulares comuns no corpo; ou seja, o oligonucleotídeo mostra pouca ou nenhuma clivagem por nuclease sob condições de nuclease normais no corpo às quais o oligonucleotídeo é exposto. As ligações fosforamidato N3’^P5‘ (NP) ou tiofosforamidato N3’^P5’ (NPS) descritas abaixo são resistentes à nuclease.
[042] Um “indivíduo” pode ser um mamífero, por exemplo, qualquer organismo-modelo laboratorial comum. Mamíferos incluem, sem limitação, humanos e primatas não humanos, animais de criação, animais de esporte, animais de estimação, camundongos, ratos, e outros roedores. Em algumas modalidades, um indivíduo é um humano.
[043] Como aqui usado, o termo “tratamento” (e variações gramaticais deste como, por exemplo, “tratar” ou “que trata”) se refere à intervenção clínica planejada para alterar a evolução natural do indivíduo ou célula que está sendo tratada durante a evolução da patologia clínica. Efeitos de tratamento desejáveis incluem, sem limitação, diminuição da taxa de progressão da doença, melhora ou atenuação do estado de doença, e remissão ou prognóstico melhorado.
[044] Como aqui usado, o termo “prevenção” inclui fornecimento de profilaxia com relação à ocorrência ou recorrência de uma doença ou dos sintomas associados a uma doença em um indivíduo. Um indivíduo pode estar predisposto, suscetível ou em risco para o desenvolvimento de um a doença, mas ainda não foi diagnosticado com a doença.
[045] Uma “quantidade eficaz” ou “quantidade terapeuticamente eficaz” se refere a uma quantidade de um composto terapêutico, por exemplo, um inibidor da telomerase, administrada a um indivíduo mamífero, como uma dose única ou como parte de uma série de doses, que é eficaz para produzir um efeito terapêutico desejado.
[046] Uma “amostra biológica” é uma amostra de tecido, sangue, fluido linfático ou fluido cerebral obtida do indivíduo. A amostra biológica pode ser uma amostra obtida durante a remoção de um crescimento canceroso do indivíduo. A amostra biológica poderia incluir tecido fresco ou tecido fixado em formalina e embebido em parafina ou tecido congelado.
[047] Como aqui usadas, as formas no singular “um”, “o”, “uma” e “a” incluem referências no plural, a menos que indicado de forma diferente.
[048] É subentendido que aspectos e modalidades da invenção aqui descritos incluem “que compreende”, “que consiste” e “que consiste basicamente em” aspectos e modalidades.
[049] Deseja-se que cada limitação numérica máxima dada ao longo desse relatório descritivo inclua cada limitação numérica inferior, como se cada uma das limitações numéricas inferiores fosse expressamente aqui escrita. Cada limitação numérica mínima dada ao longo desse relatório descritivo incluirá cada limitação numérica maior, como se essas limitações numéricas maiores fossem expressamente aqui escritas. Cada faixa numérica dada ao longo desse relatório descritivo incluirá cada faixa numérica mais estreita que caia dentro dessa faixa numérica mais ampla, como se essas faixas numéricas mais estreitas fossem, todas, expressamente aqui escritas.
III. COMPOSTOS INIBIDORES DA TELOMERASE
[050] A telomerase é uma ribonucleoproteína que catalisa a adição de sequências de repetição telomérica (que possuem a sequência 5’-TTAGGG-3’ em humanos) às extremidades do cromossomo. Veja, por exemplo, Blackburn, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61: 113-129. A enzima é expressa na maioria das células de câncer, mas não em células somáticas maduras. A perda de DNA telomérico pode participar do desencadeamento de senescência celular; veja Harley, 1991, Mutation Research 256: 271-282. Diversas células de câncer demonstraram ser telomerase-positiva, incluindo células de câncer da pele, tecido conjuntivo, tecido adiposo, da mama, pulmão, estômago, pâncreas, ovário, cérvice, útero, rim, bexiga, cólon, próstata, sistema nervoso central (CNS), retina e tumores hematológicos (por exemplo, mieloma, leucemia e linfoma). O direcionamento de telomerase pode ser eficaz no fornecimento de tratamentos que discriminam entre células malignas e normais em um grau elevado, evitando muitos dos efeitos colaterais deletérios que podem acompanhar regimes quimioterápicos que visam células em divisão indiscriminadamente.
[051] Os inibidores de telomerase identificados até hoje incluem oligonucleotídeos (por exemplo, oligonucleotídeos que possuem ligações resistentes à nuclease), bem como compostos de pequena molécula. Mais informações em relação aos compostos inibidores da telomerase podem ser encontradas na Patente U.S. N° 7.998938, cuja revelação é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
A. Compostos de pequena molécula
[052] Inibidores de telomerase de pequena molécula incluem, por exemplo, BRACO19 ((9-(4-(N,N- dimetilamino)fenilamino)-3,6-bis(3-pirrolodino propionamido)acridina (veja Mol. Pharmacol. 61(5): 1.15462, 2002); DODC (dietiloxadicarbocianina) e telomestatina. Esses compostos podem atuar como estabilizantes de G-quad, que promovem a formação de uma configuração G-quad inativa no componente de RNA da telomerase. Outros inibidores de telomerase de pequena molécula incluem BIBR1532 (ácido 2- [(E)-3-naften-2-il but-2-enoilamino]benzóico) (veja Ward & Autexier, Mol. Pharmacol. 68: 779-786, 2005; também J. Biol. Chem. 277 (18): 15.566-72, 2002); AZT e outros análogos de nucleosídeos, por exemplo, ddG e ara-G (veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos 5.695.932 e 6.368.789), e alguns derivados de tiopiridina, benzo[b]tiofeno e pirido[b]tiofeno, descritos por Gaeta e cols. nas Patentes U.S. Nos 5.767.278, 5.770.613, 5.863.936, 5.656.638 e 5.760.062, cujas revelações são aqui incorporadas por referência. Outro exemplo é 3-clorobenzo[b]tiofeno-2- carbóxi-2’-[(2,5-diclorofenil amino)tia]hidrazina, descrita na Patente U.S. N° 5.7 60.062 e que é aqui incorporada por referência.
B. Inibidores de telomerase à base de oligonucleotídeos: Sequência e composição
[053] Os genes que codificam tanto a proteína quanto componentes de RNA da telomerase humana foram clonados e sequenciados (veja as Patentes U.S. Nos 6.261.836 e 5.583.016, respectivamente, ambas aqui incorporadas por referência). Oligonucleotídeos podem ser direcionados contra o mRNA que codifica o componente de proteína da telomerase (cuja forma humana é conhecida como transcriptase reversa telomerase humana, ou hTERT) ou o componente de RNA da holoenzima telomerase (cuja forma humana é conhecida como RNA da telomerase humana, ou hTR).
[054] A sequência de nucleotídeos do componente de RNA de telomerase humana (hTR) é mostrada na Listagem de sequências abaixo (ID. DE SEQ. N°: 1), na direção 5’^3’. A sequência é mostrada com o uso de abreviações padronizadas para ribonucleotídeos; aqueles habilitados na técnica reconhecerão que a sequência também representa a sequência da cDNA, na qual os ribonucleotídeos são substituídos por desoxirribonucleotídeos, com uridina (U) sendo substituída por timidina (T). A sequência-modelo do componente de RNA está localizada dentro da região definida por nucleotídeos 46 a 56 (5’-CUAACCCUAAC-3’) (ID. DE SEQ. N°: 2), que é complementar a uma sequência telomérica composta por cerca de uma e dois terços de unidades de repetição telomérica. A região de modelo funciona para especificar a sequência das repetições teloméricas que a telomerase adiciona às extremidades do cromossomo e é essencial para a atividade da enzima telomerase (veja, por exemplo, Chen e cols., Cell 100: 503-514, 2000; Kim e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (14): 7.982-7.987, 2001). O design de agentes anti- senso, de ribozima ou de pequeno RNA interferente (siRNA), para inibir ou causar a destruição de mRNAs é bem conhecido (veja, por exemplo, Lebedeva, I., e cols. Annual Review of Pharmacology and Toxicology, Vol. 41: 403-419, Abril de 2001; Macejak, D., e cols. Journal of Virology, Vol. 73 (9): 7.745-7.751, Setembro de 1999, e Zeng, Y. e cols., PNAS Vol. 100 (17) páginas 9.779-9.784, 19 de agosto de 2003), e esses agentes podem ser projetados para visar o mRNA de hTERT e, dessa forma, inibir a produção da proteína de hTERT em uma célula-alvo como, por exemplo, uma célula de câncer (veja, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 6.444.650 e 6.331.399).
[055] Oligonucleotídeos que visam hTR (ou seja, o componente de RNA da enzima) atuam como inibidores da atividade da enzima telomerase por bloqueio ou algum outro tipo de interferência com a interação de hTR com a proteína de hTERT, cuja interação é necessária para a função de telomerase (veja, por exemplo, Villeponteau e cols., Patente U.S. N° 6.548.298).
[056] Uma região-alvo preferida de hTR é região de modelo, que transpõe os nucleotídeos 30 a 67 do ID. DE SEQ. N°: 1 (GGGUUGCGGAGGGUGGGCCUGGGAGGGGUGGUGGCCAUUUUUUGUCUAACCCUAACUG AGAAGGGCGUAGGCGCCGUGCUUUUGCUCCCCGCGCGCUGUUUUUCUCGCUGACUUUCA GCGGGCGGAAAAGCCUCGGCCUGCCGCCUUCCACCGUUCAUUCUAGAGCAAACAAAAAA UGUCAGCUGCUGGCCCGUUCGCCUCCCGGGGACCUGCGGCGGGUCGCCUGCCCAGCCCC CGAACCCCGCCUGGAGCCGCGGUCGGCCCGGGGCUUCUCCGGAGGCACCCACUGCCACC GCGAAGAGUUGGGCUCUGUCAGCCGCGGGUCUCUCGGGGGCGAGGGCGAGGUUCACCGU UUCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGUCCCGCCGCGGCGCGAUUCCCUGAGCUGU GGGACGUGCACCCAGGACUCGGCUCACACAUGCAGUUCGCUUUCCUGUUGGUGGGGGGA ACGCCGAUCGUGCGCAUCCGUCACCCCUCGCCGGCAGUGGGGGCUUGUGAACCCCCAAA CCUGACUGACUGGGCCAGUGUGCU). Oligonucleotídeos que visam essa região são aqui denominados “inibidores de modelo de hTR” (veja por exemplo, Herbert e cols., Oncogene 21 (4): 638-42 (2002).) De preferência, um oligonucleotídeo desse tipo inclui uma sequência que é complementar ou quase complementar a alguma porção da região de 11 nucleotídeos que possui a sequência 5’ -CUAACCCUAAC-3 ’ (ID. DE SEQ. N°: 2), que transpõe os nucleotídeos 46 a 56 do ID. DE SEQ. N°: 1.
[057] Outra região-alvo preferida é a região que transpõe os nucleotídeos 137 a 179 de hTR (veja Pruzan e cols., Nucl. Acids Research, 30: 559-568, 2002). Dentro dessa região, a sequência que transpõe 141 a 153 é um alvo preferido. A Publicação PCT WO 98/28442 descreve o uso de oligonucleotídeos de pelo menos 7 nucleotídeos de comprimento para inibir telomerase, em que os oligonucleotídeos são projetados para serem complementares às porções acessíveis da sequência de hTR fora da região de modelo, incluindo os nucleotídeos 137 a 196, 290 a 319 e 350 a 380 de hTR.
[058] A região do oligonucleotídeo terapêutico que é direcionada à sequência de hTR é preferivelmente exatamente complementar à sequência de hTR correspondente. Embora erros de pareamento possam ser tolerados em certos casos, espera-se que eles diminuam a especificidade e a atividade do conjugado de oligonucleotídeo resultante. Em modalidades particulares, a sequência de base do oligonucleotídeo é, dessa forma, selecionada para incluir uma sequência de pelo menos 5 nucleotídeos exatamente complementara ao alvo de hTR, e inibição de telomerase aumentada pode ser obtida se forem empregados comprimentos crescentes da sequência complementar, por exemplo, pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 13 ou pelo menos 15 nucleotídeos exatamente complementares ao alvo de hTR. Em outras modalidades, a sequência do oligonucleotídeo inclui uma sequência de pelo menos 5 a 20, de pelo menos 8 a 20, de pelo menos 10 a 20 ou de pelo menos 10 a 15 nucleotídeos exatamente complementar à sequência de hTR-alvo.
[059] A atividade inibidora de telomerase ótima pode ser obtida quando o comprimento total do oligonucleotídeo é selecionado para ser complementar à sequência de hTR-alvo. No entanto, não é necessário que o comprimento total do oligonucleotídeo seja exatamente complementar à sequência- alvo, e a sequência de oligonucleotídeos pode incluir regiões que não são complementares à sequência-alvo. Essas regiões podem ser adicionadas, por exemplo, para conferir outras propriedades ao composto, por exemplo, sequências que facilitam a purificação. Alternativamente, um oligonucleotídeo pode incluir múltiplas repetições de uma sequência complementar a uma sequência de hTR-alvo.
[060] Caso o oligonucleotídeo deva incluir regiões que não são complementares à sequência-alvo, essas regiões são tipicamente posicionadas em um ou em ambos os terminais 5’ ou 3’. Sequências exemplares que visam o RNA de telomerase humana (hTR) incluem o seguinte.
[061] As ligações internucleosídeos no oligonucleotídeo podem incluir qualquer uma das químicas de oligonucleotídeo disponíveis, por exemplo, fosfodiéster, fosfotriéster, metilfosfonato, fosforamidato P3’^N5‘, fosforamidato N3’^P5’, tiofosforamidato N3’^P5’ e fosforotioato. Tipicamente, mas não necessariamente, todas as ligações internucleosídeos dentro do oligonucleotídeo serão do mesmo tipo, embora o componente de oligonucleotídeo possa ser sintetizado com o uso de uma mistura de ligações diferentes.
[062] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo possui pelo menos uma ligação fosforamidato N3’^P5’ (NP) ou tiofosforamidato N3’^P5’ (NPS), cuja ligação pode ser representada pela estrutura: 3’-(-NH--P(=O)(--XR)--O-)-5’, em que X é O ou S e R é selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, alquil e aril; e sais farmaceuticamente aceitáveis deste, quando XR é OH ou SH. Em outras modalidades, o oligonucleotídeo inclui todas as ligações NP ou, em algumas modalidades, todas as ligações NPS.
[063] Em uma modalidade, a sequência para um oligonucleotídeo inibidor de modelo de hTR é a sequência complementar aos nucleotídeos 42 a 54 do ID. DE SEQ. N°: 1 supra. O oligonucleotídeo que possui essa sequência (TAGGGTTAGACAA; ID. DE SEQ. N°: 3) e ligações tiofosforamidato N3’^P5’ (NPS) é aqui designado GRN163. Veja, por exemplo, Asai e cols., Cancer Research 63: 3.9313.939 (2003) e Gryaznov e cols., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 22 (5-8): 577-81 (2003).
[064] O oligonucleotídeo GRN163 administrado isoladamente demonstrou atividade inibidora in vitro em cultura de células, incluindo células de câncer de carcinoma epidermóide, do epitélio da mama, de carcinoma renal, de adenocarcinoma renal, pancreático, do cérebro, cólon, próstata, leucemia, linfoma, mieloma, epidérmico, cervical, ovariano e hepático.
[065] O oligonucleotídeo GRN163 também foi testado e demonstrou ser terapeuticamente eficaz em diversos modelos animais de tumor, incluindo tumor ovariano e de pulmão, tanto de pequena célula quanto de célula não pequena (veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 7.998.938, cuja revelação é incorporada por referência).
C. Conjugados lipídeo-oligonucleotídeo
[066] Em alguns aspectos, os inibidores da telomerase à base de oligonucleotídeo aqui revelados incluem pelo menos um grupo lipídico ligado covalentemente (veja Publicação U.S. N°. 2005/0113325, que é aqui incorporada por referência). Essa modificação fornece propriedades superiores de captação celular, de tal forma que um efeito biológico equivalente pode ser obtido usando quantidades menores do oligonucleotídeo conjugado, comparado com a forma não modificada. Quando aplicado a um ambiente terapêutico humano, isso pode se traduzir em riscos reduzidos de toxicidade, e economias de custos.
[067] O grupo lipídico L é tipicamente um hidrocarboneto ou ácido graxo alifático, incluindo derivados de hidrocarbonetos e ácidos graxos, com exemplos sendo compostos de cadeia linear saturada que possuem 14 a 20 carbonos, por exemplo, ácido mirístico (tetradecanóico), ácido palmítico (hexadecanóico) e ácido esteárico (octadecanóico), e suas formas de hidrocarboneto alifático correspondentes, tetradecano, hexadecano e octadecano. Exemplos de outros grupos lipídicos adequados que podem ser empregados são esteróis, por exemplo, colesterol, e ácidos graxos e hidrocarbonetos substituídos, particularmente formas polifluoradas desses grupos. O escopo do grupo lipídico L inclui derivados como, por exemplo, derivados amina, amida, éster e carbamato. O tipo de derivado é frequentemente determinado pelo modo de ligação ao oligonucleotídeo, como exemplificado abaixo.
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[068] Em uma estrutura exemplar, a porção lipídica é palmitoil amida (derivada de ácido palmítico), conjugada por meio de um vinculador de aminoglicerol ao grupo tiofosfato 5’ de um oligonucleotídeo ligado a NPS. O oligonucleotídeo-NPS que possui a sequência mostrada para GRN163 e conjugado dessa forma (como mostrado abaixo) é aqui designado GRN163L (Imetelstat). Em uma segunda estrutura exemplar, o lipídeo, como uma palmitoil amida, é conjugado por meio do grupo amino do terminal 3’ de um oligonucleotídeo-NPS.
D. Composições farmacêuticas
[069] Em alguns aspectos da presente invenção, quando empregados como substâncias farmacêuticas, os compostos inibidores da telomerase aqui revelados podem ser formulados com um excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável para serem formulados em uma composição farmacêutica.
[070] Quando empregados como substâncias farmacêuticas, os compostos inibidores da telomerase podem ser administrados na forma de composições farmacêuticas. Esses compostos podem ser administrados por diversas vias, incluindo as vias oral, retal, transdérmica, subcutânea, intravenosa, intramuscular e intranasal. Esses compostos são eficazes como composições tanto injetáveis quanto orais. Essas composições são preparadas de uma forma bem conhecida na técnica farmacêutica e compreendem pelo menos um composto ativo. Quando empregados como composições orais, os compostos inibidores da telomerase aqui revelados são protegidos da digestão por ácido no estômago por um protetor farmaceuticamente aceitável.
[071] Essa invenção também inclui composições farmacêuticas que contêm, como o ingrediente ativo, um composto inibidor da telomerase associado a um ou mais excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Na produção das composições dessa invenção, o ingrediente ativo é normalmente misturado com um excipiente ou veículo, diluído por um excipiente ou veículo ou englobado dentro desse excipiente ou veículo, que pode estar na forma de uma cápsula, sachê, papel ou outro recipiente. Quando o excipiente ou veículo serve como um diluente, ele pode ser um material sólido, semissólido ou líquido, que atua como um veículo, carreador ou meio para o ingrediente ativo. Dessa forma, as composições podem estar na forma de comprimidos, pílulas, pós, losangos, sachês, sinetes, elixires, suspensões, emulsões, soluções, xaropes, aerossóis (como um sólido ou em um meio líquido), pomadas contendo, por exemplo, até 10% por peso do composto ativo, cápsulas gelatina macia e dura, supositórios, soluções injetáveis estéreis e pós embalados estéreis.
[072] Na preparação de uma formulação, pode ser necessário triturar o composto ativo liofilizado para fornecer o tamanho de partícula apropriado antes da combinação com os outros ingredientes. Se o composto ativo é substancialmente insolúvel, ele normalmente é triturado até um tamanho de partícula de uma trama menor do que 200. Se o composto ativo é substancialmente hidrossolúvel, o tamanho de partícula é normalmente ajustado por trituração para fornecer uma distribuição substancialmente uniforme na formulação, por exemplo, uma trama cerca de 40.
[073] Alguns exemplos de excipientes ou veículos adequados incluem lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amidos, goma acácia, fosfato de cálcio, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de cálcio, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, celulose, água estéril, xarope e metil celulose. As formulações podem adicionalmente incluir: agentes lubrificantes como, por exemplo, talco, estearato de magnésio e óleo mineral; agentes umidificantes; agentes emulsificantes e de suspensão; agentes conservantes como, por exemplo, metil- e propilhidroxi-benzoatos; agentes adoçantes; e agentes flavorizantes. As composições da invenção podem ser formuladas de modo a fornecer liberação rápida, sustentada ou retardada do ingrediente ativo após administração ao paciente por emprego de procedimentos conhecidos na técnica.
[074] As composições podem ser formuladas em uma forma de dosagem unitária, cada dosagem contendo de cerca de 5 mg até cerca de 100 mg ou mais, por exemplo, qualquer um de cerca de 1 mg até cerca de 5 mg, 1 mg até cerca de 10 mg, cerca de 1 mg até cerca de 20 mg, cerca de 1 mg até cerca de 30 mg, cerca de 1 mg até cerca de 40 mg, cerca de 1 mg até cerca de 50 mg, cerca de 1 mg até cerca de 60 mg, cerca de 1 mg até cerca de 70 mg, cerca de 1 mg até cerca de 80 mg ou cerca de 1 mg até cerca de 90 mg, inclusive, incluindo qualquer faixa entre esses valores, do ingrediente ativo. O termo “formas de dosagem unitária” se refere às unidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para indivíduos, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de material ativo, calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com um excipiente ou veículo farmacêutico adequado.
[075] Os compostos inibidores da telomerase são eficazes ao longo de uma faixa de dosagem ampla e são geralmente administrados em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Será subentendido, no entanto, que a quantidade dos compostos inibidores da telomerase realmente administrada será determinada por um médico, à luz das circunstâncias relevantes, incluindo a condição a ser tratada, a via de administração escolhida, o real composto administrado, a idade, peso e resposta do paciente individual, a gravidade dos sintomas do paciente, e semelhantes.
[076] Para a preparação de composições sólidas como, por exemplo, comprimidos, o ingrediente ativo principal, o composto inibidor da telomerase, é misturado com um excipiente ou veículo farmacêutico para formar uma composição de pré-formulação sólida que contém uma mistura homogênea de um composto da presente invenção. Quando se diz que essas composições de pré-formulação são homogêneas, significa que o ingrediente ativo está disperso igualmente por toda a composição, de modo que a composição possa ser facilmente subdividida em formas de dosagem unitária igualmente eficazes como, por exemplo, comprimidos, pílulas e cápsulas.
[077] Os comprimidos ou pílulas da presente invenção podem ser revestidos ou de algum outro modo compostos para fornecer uma forma de dosagem que gera a vantagem de ação prolongada e para proteger os compostos inibidores da telomerase da hidrólise por ácido no estômago. Por exemplo, o comprimido ou pílula pode compreender um componente de dosagem interna e um componente de dosagem externa, o último estando na forma de um envelope sobre o primeiro. Os dois componentes podem ser separados por uma camada entérica que serve para resistir à desintegração no estômago e permitir que o componente interno passe intacto até o duodeno ou que seja liberado. Diversos materiais podem ser usados para essas camadas ou revestimentos entéricos, tais materiais incluindo vários ácidos poliméricos e misturas de ácidos poliméricos com materiais como, por exemplo, goma-laca, álcool cetílico e acetato de celulose.
[078] As formas líquidas nas quais as novas composições da presente invenção podem ser incorporadas para administração oral ou por injeção incluem soluções aquosas, xaropes adequadamente flavorizados, suspensões aquosas ou oleosas, e emulsões flavorizadas com óleos comestíveis como, por exemplo, óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo de gergelim, óleo de coco ou óleo de amendoim, bem como elixires e veículos farmacêuticos similares.
[079] As composições para inalação ou insuflação incluem soluções e suspensões em solventes aquosos ou orgânicos farmaceuticamente aceitáveis, ou misturas destes, e pós. As composições líquidas ou sólidas podem conter excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados, como descrito supra. As composições podem ser administradas pela via oral ou respiratória nasal para efeito local ou sistêmico. Composições em solventes farmaceuticamente aceitáveis podem ser nebulizadas por uso de gases inertes. Soluções nebulizadas podem ser inaladas diretamente do dispositivo de nebulização ou o dispositivo de nebulização pode ser anexado a uma tenda de máscara facial, ou respirador de pressão positiva intermitente. Composições em solução, suspensão ou pó também podem ser administradas, oralmente ou nasalmente, de dispositivos que liberam a formulação de uma forma apropriada.
IV. MÉTODOS DA INVENÇÃO
[080] Em alguns aspectos, são aqui fornecidos métodos para a seleção de um indivíduo diagnosticado ou suspeito de ter câncer que se beneficiará do tratamento com um inibidor da telomerase. Esses métodos se baseiam na determinação do comprimento relativo médio de telômeros em células de câncer presentes em uma amostra biológica do indivíduo. Se o comprimento do telômero médio em células de câncer presentes em uma amostra biológica do indivíduo é determinado como estando no 50° percentil ou menos de uma faixa de comprimentos relativos de telômero determinada a partir de um ou mais padrões conhecidos, então o indivíduo diagnosticado com ou suspeito de ter câncer se beneficiará do tratamento com um inibidor da telomerase (por exemplo, qualquer um dos inibidores da telomerase aqui fornecidos). Em outros aspectos, os compostos inibidores da telomerase aqui revelados podem ser usados para o tratamento e/ou prevenção de um distúrbio proliferativo celular (por exemplo, câncer) quando o comprimento relativo médio do telômero em células de câncer presentes em uma amostra biológica do indivíduo é determinado como estando no 50° percentil ou menos de uma faixa de comprimentos relativos de telômero determinada a partir de um ou mais padrões conhecidos.
A. Distúrbios proliferativos celulares
[081] Um “distúrbio proliferativo” é qualquer distúrbio celular no qual as células proliferam mais rapidamente do que o crescimento de tecido normal. Dessa forma, uma “célula proliferante” é uma célula que está proliferando mais rapidamente do que células normais. O distúrbio proliferativo inclui, sem limitação, neoplasias. Uma “neoplasia” é um crescimento de tecido anormal, que geralmente forma uma massa distinta que cresce por proliferação celular mais rapidamente do que o crescimento de tecido normal. Neoplasias exibem ausência parcial ou total de organização estrutural e coordenação funcional com tecido normal. Essas podem ser classificadas de forma ampla em tipos três principais. Neoplasias malignas que surgem de estruturas epiteliais são denominadas carcinomas, neoplasias malignas que se originam de tecidos conjuntivos como, por exemplo, músculo, cartilagem, gordura ou osso, são denominadas sarcomas, e tumores malignos que afetam estruturas hematopoiéticas (estruturas que pertencem à formação de células sanguíneas), incluindo componentes do sistema imune, são denominados leucemias e linfomas. Um tumor é o crescimento neoplásico da doença câncer. Como aqui usada, uma neoplasia, também denominada um “tumor”, visa englobar neoplasias hematopoiéticas, além de neoplasias sólidas. Outros distúrbios proliferativos incluem, sem limitação, neurofibromatose.
[082] Os compostos inibidores da telomerase (por exemplo, em composições) aqui fornecidos são úteis para a modulação de estados de doença associados à desregulação do comprimento do telômero. Em algumas modalidades, o distúrbio proliferativo celular está associado à expressão ou atividade aumentada de telomerase ou crescimento celular, ou ambos. Em algumas modalidades, a proliferação celular é câncer.
[083] Os métodos aqui descritos também são úteis para o tratamento de tumores sólidos (por exemplo, tumores sólidos avançados). Em algumas modalidades, é fornecido um método de tratamento de câncer de pulmão, incluindo, por exemplo, câncer de pulmão de célula não pequena (NSCLC, por exemplo, NSCLC avançado), câncer de pulmão de pequena célula (SCLC, por exemplo, SCLC avançado), e malignidade tumoral sólida avançada no pulmão. Em algumas modalidades, é fornecido um método de tratamento de qualquer um de câncer ovariano, câncer da cabeça e pescoço, malignidades gástricas como, por exemplo, câncer gástrico, câncer gastrintestinal como, por exemplo, câncer gastrintestinal superior, câncer da vesícula biliar, câncer da bexiga, glioblastoma, sarcomas como, por exemplo, osteossarcoma, sarcoma de Ewing e meningeossarcoma, melanoma (incluindo melanoma metastático e melanoma maligno), câncer cólon-retal e câncer pancreático.
[084] Em algumas modalidades, o método é útil para o tratamento de um ou mais dos seguintes: linfoma cutâneo de célula T (CTCL), leucemia, linfoma folicular, linfoma de Hodgkin e leucemia mielóide aguda.
[085] Em algumas modalidades, a doença é um câncer de qualquer um dos seguintes: carcinoma de célula basal, meduloblastoma, glioblastoma, mieloma múltiplo, leucemia mielógena crônica (CML), leucemia mielógena aguda, câncer pancreático, câncer de pulmão (câncer de pulmão de pequena célula e câncer de pulmão de célula não pequena), câncer esofagiano, câncer do estômago, câncer biliar, câncer de próstata, câncer do fígado, câncer hepatocelular, câncer gastrintestinal, câncer gástrico, câncer da vesícula biliar, câncer ovariano e câncer da bexiga. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado do grupo que consiste em adenocarcinoma ductal do pâncreas, adenocarcinoma do cólon e cistadenocarcinoma do ovário. Em algumas modalidades, o câncer é adenocarcinoma ductal do pâncreas. Em algumas modalidades, o câncer é um tumor que é pouco perfundido e/ou pouco vascularizado.
[086] Em algumas modalidades, o câncer é câncer pancreático, incluindo, por exemplo, adenocarcinoma pancreático, carcinoma pancreático adenoescamoso, carcinoma pancreático de célula escamosa e carcinoma pancreático de célula gigante. Em algumas modalidades, o câncer pancreático é câncer pancreático exócrino. Em algumas modalidades, o câncer pancreático é câncer pancreático endócrino (por exemplo, carcinoma de célula da ilhota). Em algumas modalidades, o câncer pancreático é câncer pancreático metastático avançado.
[087] Outros exemplos de cânceres que podem ser tratados pelos métodos da invenção incluem, sem limitação, carcinoma adrenocortical, metaplasia mielóide agnogênico, cânceres relacionados à AIDS (por exemplo, linfoma relacionado à AIDS), câncer anal, câncer do apêndice, astrocitoma (por exemplo, cerebelar e cerebral), carcinoma de célula basal, câncer do ducto biliar (por exemplo, extra-hepático), câncer da bexiga, câncer ósseo, (osteossarcoma e histiocitoma fibroso maligno), tumor cerebral (por exemplo, glioma, glioma do tronco cerebral, astrocitoma cerebelar ou cerebral (por exemplo, astrocitoma pilocítico, astrocitoma difuso, astrocitoma anaplásico (maligno)), glioma maligno, ependimoma, oligodendroglioma, meningioma, meningeossarcoma, craniofaringioma, hemangioblastomas, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais, glioma da via visual e hipotalâmico e glioblastoma), câncer de mama, adenomas/carcinóides brônquicos, tumor carcinóide (por exemplo, tumor carcinóide gastrintestinal), carcinoma de primário desconhecido, linfoma do sistema nervoso central, câncer cervical, câncer do cólon, câncer cólon-retal, distúrbios mieloproliferativos crônicos, câncer endometrial (por exemplo, câncer uterino), ependimoma, câncer esofagiano, família de tumores de Ewing, câncer ocular (por exemplo, melanoma intraocular e retinoblastoma), câncer da vesícula biliar, câncer gástrico (do estômago), tumor carcinóide gastrintestinal, tumor estromal gastrintestinal (GIST), tumor de célula germinativa (por exemplo, extracraniano, extragonadal, ovariano), tumor trofoblástico gestacional, câncer da cabeça e pescoço, câncer hepatocelular (do fígado) (por exemplo, carcinoma hepático e hepatoma), câncer hipofaríngeo, carcinoma de célula da ilhota (endócrino pâncreas), câncer laríngeo, câncer laríngeo, leucemia, câncer dos lábios e da cavidade oral, câncer oral, câncer do fígado, câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de pequena célula, câncer de pulmão de célula não pequena, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão), neoplasia linfóide (por exemplo, linfoma), meduloblastoma, câncer ovariano, mesotelioma, câncer escamoso metastático do pescoço, câncer da boca, síndrome de neoplasia endócrina múltipla, síndromes mielodisplásicas, doenças mielodisplásicas/mieloproliferativas, câncer da cavidade nasal e do seio paranasal, câncer nasofaríngeo, neuroblastoma, câncer neuroendócrino, câncer orofaríngeo, câncer ovariano (por exemplo, câncer epitelial ovariano, tumor de célula germinativa ovariana, tumor ovariano com baixo potencial maligno), câncer pancreático, câncer da paratireóide, câncer do pênis, câncer da cavidade peritoneal, câncer faríngeo, feocromocitoma, pineoblastoma e tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais, tumor da hipófise, blastoma pleuropulmonar, linfoma, linfoma primário do sistema nervoso central (microglioma), linfangiomiomatose pulmonar, câncer retal, câncer renal, câncer da pelve renal e do ureter (câncer de célula transicional), rabdomiossarcoma, câncer da glândula salivar, câncer de pele (por exemplo, não melanoma (por exemplo, carcinoma de célula escamosa), melanoma e carcinoma de célula de Merkel), câncer do intestino delgado, câncer de célula escamosa, câncer testicular, câncer da garganta, timoma e carcinoma tímico, câncer da tireóide, esclerose tuberosa, câncer uretral, câncer vaginal, câncer vulvar, tumor de Wilms e distúrbio linfoproliferativo pós-transplante (PTLD), proliferação vascular anormal associada às facomatoses, edema (por exemplo, aquele associado a tumores cerebrais), e síndrome de Meigs.
[088] Em algumas modalidades, o câncer é um tumor sólido (por exemplo, tumor sólido avançado). Tumores sólidos incluem, sem limitação, sarcomas e carcinomas como, por exemplo, fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogênico, osteossarcoma, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, sarcoma de Kaposi, sarcoma de tecido mole, sarcoma-sinovioma uterino, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, meningeossarcoma, carcinoma do cólon, câncer pancreático, câncer de mama, câncer ovariano, câncer de próstata, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula basal, adenocarcinoma, carcinoma de glândula sudorípara, carcinoma de glândula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de célula renal (incluindo, por exemplo, adenocarcinoma, carcinoma de célula renal de célula clara, carcinoma papilar de célula renal, carcinoma de célula renal cromófobo, carcinoma de célula renal de ducto coletor, carcinoma de célula renal granular, carcinoma de célula renal granular misto, angiomiolipomas renais ou carcinoma de célula renal fusiforme), hepatoma, carcinoma do ducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilm, câncer cervical, tumor testicular, carcinoma do pulmão, carcinoma do pulmão de pequena célula, carcinoma de bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma do acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma e retinoblastoma.
[089] Em algumas modalidades, a neoplasia linfóide (por exemplo, linfoma) é uma neoplasia de célula B. Exemplos de neoplasias de célula B incluem, sem limitação, neoplasias de célula B precursora (por exemplo, leucemia/linfoma linfoblástico de B precursora) e neoplasias de célula B periféricas (por exemplo, leucemia linfocítica crônica de célula B/leucemia prolinfocítica/linfoma linfocítico pequeno (linfocítica (SL) pequena NHL), linfoma linfoplasmocitóide/imunocitoma, linfoma de célula do manto, linfoma do centro do folículo, linfoma folicular (por exemplo, graus citológicos: I (célula pequena), II (misto, célula pequena e grande), III (célula grande) e/ou subtipo: difuso e predominantemente do tipo célula pequena), grau baixo/linfoma folicular não-Hodgkin (NHL), grau intermediário/NHL folicular, linfoma de célula B da zona marginal (por exemplo, extranodal (por exemplo, do tipo MALT +/- células B monocitóides) e/ou Nodal (por exemplo, +/- células B monocitóides)), linfoma da zona marginal esplênica (por exemplo, +/- linfócitos vilosos), leucemia de célula pilosa, plasmocitoma/mieloma de célula plasmática (por exemplo, mieloma e mieloma múltiplo), linfoma de célula B grande difuso (por exemplo, linfoma de célula B mediastinal primário (tímico)), NHL difuso de grau intermediário, linfoma de Burkitt, linfoma de célula B de grade elevado, do tipo Burkitt, NHL imunoblástico de grau elevado, NHL linfoblástico de grau elevado, grau elevado NHL de pequena célula não clivada, doença NHL volumosa, linfoma relacionado à AIDS e macroglobulinemia de Waldenstrom).
[090] Em algumas modalidades, a neoplasia linfóide (por exemplo, linfoma) é uma neoplasia de célula T e/ou de suposta célula NK. Exemplos de neoplasias de célula T e/ou suposta célula NK incluem, sem limitação, neoplasia de célula T precursora (linfoma/leucemia linfoblástica de T precursora) e neoplasias periféricas de célula T e célula NK (por exemplo, leucemia linfocítica/leucemia prolinfocítica crônica de célula T e leucemia granular de linfócito grande (LGL) (por exemplo, tipo célula T e/ou tipo célula NK), linfoma cutâneo de célula T (por exemplo, micose fungóide/síndrome de Sezary), linfomas primários de célula T não especificados (por exemplo, categorias citológicas (por exemplo, célula de tamanho médio, mistos de célula médias e grandes), célula grande, célula linfoepitelióide, linfoma de célula T do subtipo hepatoesplênico yδ, e linfoma de célula T subcutâneo paniculítico), linfoma de célula T angioimunoblástico (AILD), linfoma angiocêntrico, linfoma intestinal de célula T (por exemplo, +/- enteropatia associada), linfoma/leucemia de célula T do adulto (ATL), linfoma anaplásico de célula grande (ALCL) (por exemplo, tipos célula CD30+, T e null), linfoma anaplásico de célula grande e linfoma de Hodgkin).
[091] Em algumas modalidades, a neoplasia linfóide (por exemplo, linfoma) é doença de Hodgkin. Por exemplo, a doença de Hodgkin pode ser de predominância de linfócitos, de esclerose nodular, de celularidade mista, de depleção de linfócitos e/ou rica em linfócitos.
[092] Em algumas modalidades, o câncer é leucemia. Em algumas modalidades, a leucemia é leucemia crônica. Exemplos de leucemia crônica incluem, sem limitação, leucemia mielocítica crônica I (granulocítica), leucemia mielógena crônica e linfocítica crônica (CLL). Em algumas modalidades, a leucemia é leucemia aguda. Exemplos de leucemia aguda incluem, sem limitação, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mielóide aguda, leucemia linfocítica aguda e leucemia mielocítica aguda (por exemplo, mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica e eritroleucemia).
[093] Em algumas modalidades, o câncer é tumor líquido ou plasmocitoma. Plasmocitoma inclui, sem limitação, mieloma. Mieloma inclui, sem limitação, um plasmocitoma extramedular, um mieloma solitário e mieloma múltiplo. Em algumas modalidades, o plasmocitoma é mieloma múltiplo.
[094] Em algumas modalidades, o câncer é mieloma múltiplo. Exemplos de mieloma múltiplo incluem, sem limitação, mieloma múltiplo de IgG, mieloma múltiplo de IgA, mieloma múltiplo de IgD, mieloma múltiplo de IgE e mieloma múltiplo não secretório. Em algumas modalidades, o mieloma múltiplo é mieloma múltiplo de IgG. Em algumas modalidades, o mieloma múltiplo é mieloma múltiplo de IgA. Em algumas modalidades, o mieloma múltiplo é um mieloma múltiplo latente ou indolente. Em algumas modalidades, o mieloma múltiplo é mieloma múltiplo progressivo. Em algumas modalidades, o mieloma múltiplo pode ser resistente a um fármaco, por exemplo, sem limitação, bortezomib, dexametasona (Dex-), doxorrubicina (Dox-), e melfalan (LR). B. Métodos para a seleção de indivíduos que se beneficiarão do tratamento com inibidor da telomerase
[095] São aqui fornecidos métodos para a seleção de um indivíduo diagnosticado ou suspeito de ter câncer que se beneficiará do tratamento com um inibidor da telomerase. O comprimento do telômero é determinado por análise do comprimento de nucleotídeos teloméricos em células de câncer presentes em uma amostra biológica do indivíduo. O termo “benefício” significa que há uma diferença positiva ou benéfica na gravidade ou ocorrência de pelo menos uma pontuação clínica ou biológica (por exemplo, sem limitação, sobrevida livre de progressão), valor ou medição usada para avaliar esses indivíduos naqueles que foram tratados com os compostos inibidores da telomerase da presente invenção, quando comparados com aqueles que não foram.
1. Obtenção de amostras biológicas
[096] Amostras biológicas de indivíduos diagnosticados ou suspeitos de ter um distúrbio proliferativo celular (por exemplo, câncer) podem ser obtidas de várias formas. Por exemplo, uma amostra biológica pode ser obtida de um tumor sólido, que pode ser um tumor acessível por via subcutânea ou de qualquer outro tipo de tumor sólido canceroso acessível à biópsia ou remoção cirúrgica. A amostra biológica pode ser obtida por qualquer método conhecido na técnica incluindo, sem limitação, biópsia por agulha ou por agulha grossa (core) ou aspiração por agulha fina. Adicionalmente, a amostra biológica pode ser fixada, embebida em parafina, fresca ou congelada antes do comprimento do telômero ser determinado. Em algumas modalidades, a amostra biológica é fixada em formalina e depois embebida em parafina. Em algumas modalidades, o indivíduo possui ou é suspeito de ter um câncer de origem sanguínea (ou seja, um câncer hematológico, por exemplo, sem limitação, leucemia, linfoma etc.). Nesse caso, uma amostra biológica pode ser obtida do sangue do indivíduo.
2. Medição do comprimento do telômero em amostras biológicas
[097] Numerosos métodos estão disponíveis na técnica para a determinação de comprimento do telômero de células em amostras biológicas de acordo com os métodos aqui revelados.
[098] Em um aspecto, o comprimento do telômero pode ser determinado por medição do comprimento médio de um fragmento de restrição terminal (TRF). O TRF é definido como o comprimento - em geral o comprimento médio - de fragmentos que resultam da digestão completa de DNA genômico com uma enzima de restrição que não cliva o ácido nucléico dentro da sequência telomérica. Tipicamente, o DNA é digerido com enzimas de restrição que clivam frequentemente dentro de DNA genômico, mas não clivam dentro das sequências de telômero. Tipicamente, as enzimas de restrição possuem uma sequência de reconhecimento de quatro bases (por exemplo, AluI, HinfI, RsaI e Sau3A1) e são usadas isoladamente ou em combinação. O fragmento de restrição terminal resultante contém tanto repetições teloméricas quanto DNA subtelomérico. Como aqui usado, DNA subtelomérico são sequências de DNA adjacentes às repetições em tandem de sequências teloméricas e contêm sequências de repetição de telômero intercaladas com sequências variáveis do tipo teloméricas. O DNA digerido é separado por eletroforese e “blotted” (transferida) sobre um suporte, por exemplo, uma membrana. Os fragmentos que contêm sequências de telômero são detectados por hibridização de uma sonda, ou seja, sequências de repetição marcadas, à membrana. Mediante visualização dos fragmentos que contêm telômero, os comprimentos médios de fragmentos de restrição terminais podem ser calculados (Harley, C.B. e cols., Nature. 345 (6274): 458-60 (1990), aqui incorporado por referência). A estimativa do TRF por Southern blotting gera uma distribuição do comprimento do telômero nas células ou tecido e, dessa forma, o comprimento médio do telômero de todas as células.
[099] Para os vários métodos aqui descritos, diversas condições de hibridização podem ser usadas, incluindo condições de rigor elevado, moderado e baixo (veja, por exemplo, Sambrook, J. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); Ausubel, F.M. e cols., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons (atualizações até 2002); aqui incorporados por referência). Condições de rigor são sequência-dependentes e serão diferentes em circunstâncias diferentes, incluindo o comprimento da sonda ou iniciador, número de erros de pareamento, teor de G/C e força iônica. Uma guia para a hibridização de ácidos nucléicos é fornecida em Tijssen, P. “Overview of Principles of Hybridization e the Strategy of Nucleic Acid Assays”, em “Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization with Nucleic Acid Probes”, Vol. 24, Elsevier Publishers, Amsterdam (1993). Geralmente, condições rigorosas são selecionadas para serem cerca de 5 a 10°C menores do que o ponto de fusão térmica (ou seja, Tm) para um híbrido específico em uma temperatura definida sob uma condição de solução definida na qual 50% da sonda ou do iniciador são hibridizados para o ácido nucléico-alvo no equilíbrio. Como o grau de rigor é geralmente determinado pela diferença na temperatura de hibridização e o Tm, um grau de rigor particular pode ser mantido apesar das alterações na condição de solução de hibridização, desde que a diferença na temperatura do Tm seja mantida. As condições de hibridização também podem variar com o tipo de arcabouço de ácido nucléico, por exemplo, arcabouço de ácido ribonucleico ou ácido nucleico peptídico.
[100] Em outro aspecto, os comprimentos de telômero podem ser medidos por citometria de fluxo (Hultdin, M. e cols., Nucleic Acids Res. 26: 3.651-3.656 (1998); Rufer, N. e cols., Nat. Biotechnol. 16: 743-747 (1998); aqui incorporados por referência). Métodos de citometria de fluxo de são variações de técnicas de FISH. Se o material de partida é tecido, é feita uma suspensão de células, geralmente por separação mecânica e/ou tratamento com proteases. As células são fixadas com um fixador e hibridizadas com uma sonda específica para a sequência de telômero, preferivelmente uma sonda de PNA, marcada com um marcador fluorescente. Após hibridização, as células são lavadas e depois analisadas por FACS. O sinal de fluorescência é medido para células em G0/G1 após subtração apropriada para a fluorescência basal. Essa técnica é adequada para estimativa rápida do comprimento do telômero para grandes números de amostras. Similar ao TRF, o comprimento do telômero é o comprimento médio de telômeros dentro da célula.
[101] Em outros aspectos, o comprimento médio de telômeros de células dentro de uma amostra biológica é determinado por meio de PCR quantitativa (qPCR) ou hibridização fluorescente de telômero in situ (telo-FISH). a. qPCR em amostras fixadas com formalina e embebidas em parafina (FFPE)
[102] Em alguns aspectos, o comprimento do telômero é determinado usando qPCR de DNA extraído de amostras biológicas fixadas com formalina e embebidas em parafina (FFPE).
[103] Em qPCR, o corante de ligação de DNA se liga a todo o DNA de fita dupla causando a fluorescência do corante. Um aumento no produto de DNA durante a reação de PCR leva a um aumento na intensidade de fluorescência e é medida em cada ciclo da reação de PCR. Isso permite que a concentração de DNA seja quantificada. A concentração relativa do DNA presente durante a fase exponencial da reação é determinada por tabulação do nível de fluorescência contra o número do ciclo de PCR em uma escala semilogarítmica. Um limiar para detecção de fluorescência acima do nível basal é determinado. O ciclo no qual a fluorescência da amostra cruza o limiar é denominado o limiar do ciclo (Ct). Como a quantidade de DNA teoricamente dobra a cada ciclo durante a fase exponencial, as quantidades relativas de DNA podem ser calculadas. O nível de base consiste nos ciclos iniciais de PCR, no qual há pouca alteração no sinal de fluorescência.
[104] O limiar é um nível ΔRn que é automaticamente determinado pelo software “Sequence Detection Systems” ou manualmente estabelecido e que é usado para determinação do Ct em ensaios em tempo real. O nível é estabelecido como estando acima do nível basal e suficientemente baixo para estar dentro da região de crescimento exponencial da curva de amplificação. O limiar é a linha cuja intersecção com o gráfico de amplificação define o Ct. O Ct é o número do ciclo fracionado no qual a fluorescência passou o limiar. O ciclo limiar da amostra é determinado por subtração do ciclo limiar de uma amostra de referência do ciclo limiar da reação em cadeia de polimerase telomérica (ΔCtamostra — Cttelômero- Ctreferência). A reação em cadeia de polimerase também é realizada com iniciadores dirigidos a um gene com número de cópia único como uma referência para determinar o ciclo limiar para o gene com número de cópia único. A diferença média do número do ciclo do gene de cópia única para a reação em cadeia de polimerase telomérica determinará os comprimentos de telômero (ΔCt = Cttelômero- Ctgene de cópia única).
[105] Ácidos nucléicos teloméricos podem ser extraídos de amostras biológicas fixadas com formalina e embebidas em parafina usando um método de extração brando. Por exemplo, a amostra pode ser tratada com o uso de detergentes, sonificação, eletroporação, desnaturantes, etc., para romper as células. Os ácidos nucléicos-alvo podem ser purificados, como necessário. Foi verificado que métodos de extração brandos que não usam uma coluna para isolar os ácidos nucléicos são benéficos, pois esses métodos retêm os fragmentos menores de ácido nucléico na preparação do ácido nucléico final (fragmentos de DNA pequenos encontrados em amostras FFPE e podem ser perdidos durante extração da coluna). Em algumas modalidades, os métodos de extração retêm uma maioria dos fragmentos do ácido nucléico telomérico-alvo que possuem pelo menos 50 bp, pelo menos 60 bp, pelo menos 70 bp, pelo menos 80 bp. Em uma modalidade, o método de extração retém fragmentos de ácido nucléico que têm menos do que 60 bp, que têm menos do que 70 bp, que têm menos do que 80 bp, que têm menos do que 90 bp, que têm menos do que 100 bp, que têm menos do que 110 bp. Em uma modalidade, o método de extração de DNA brando não usa uma coluna para isolar os fragmentos de DNA. Em uma modalidade, o método de extração de ácido nucléico é o kit de extração de DNA “BioChain FFPE Tissue”.
[106] Em uma modalidade, a amostra FFPE pode ser desparafinada antes da extração do DNA. Em outra modalidade, o DNA pode ser extraído da amostra FFPE sem desparafinação prévia da amostra FFPE. Nessa modalidade, a parafina não é removida da amostra FFPE. Em uma modalidade, o ácido nucléico extraído é aquecido até pelo menos 88°C, 89°C, 90°C, 91°C, 92°C, 93°C, 94°C, 95°C, 96°C, 97°C por pelo menos 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 40 minutos, 50 minutos, 60 minutos, 70 minutos, 80 minutos.
[107] Após extração de DNA, o DNA é marcado com um corante fluorescente (por exemplo, Verde SYBR I, Invitrogen, Carlsbad, CA). Em algumas modalidades, o DNA é marcado com qualquer um de cerca de 0,04X, 0,06X, 0,08X, 0,1X, 0,15X, 0,2X, 0,25X, 0,3X, 0,35X, 0,4X, 0,45X, 0,5X, 0,55X, 0,60X, 0,65X, 0,70X, 0,75X, 0,8X, 0,9X, 1,0X ou 1,1X, inclusive, incluindo quaisquer valores entre esses números, de corante Verde SYBR I. Após marcação de DNA, é realizada uma reação em cadeia de polimerase usando um ácido nucléico de cópia única-alvo da amostra biológica fixada com formalina e embebida em parafina (que compreende primeira e segunda fitas substancialmente complementares), um primeiro iniciador de gene de cópia única (em que o primeiro iniciador de gene de cópia única é capaz de (i) hibridização para a primeira fita do ácido nucléico do gene de cópia única-alvo e (ii) ser estendido por DNA polimerase para formar um iniciador estendido de gene de cópia única), e em segundo iniciador de gene de cópia única (em que o segundo iniciador de gene de cópia única é capaz de (i) hibridização para o primeiro iniciador estendido de gene de cópia única e/ou do DNA-alvo e (ii) ser estendido por DNA polimerase), e permitindo que a reação em cadeia de polimerase proceda em ciclos de desnaturação e extensão e identificação do ciclo de replicação no qual o sinal de PCR limiar é passado.
[108] Sequências de telômero são amplificadas por reação em cadeia de polimerase em três estágios. O Estágio 1 é realizado sob condições suficientes para ativar a DNA polimerase. O Estágio 2 é realizado sob condições suficientes para gerar produtos de PCR que atuarão como modelos para os ciclos de amplificação subsequentes. Em uma modalidade, o número de ciclos de estágio 2 é de 2 a 8 ciclos, ou de 3 a 6 ciclos ou de 3 a 5 ciclos. Em uma modalidade, a temperatura para dissociação varia de 90°C a 98°C, ou de 92°C a 97°C ou de 94°C a 96°C por um período de 10 segundos a 20 segundos. Em uma modalidade, a temperatura para associação varia de 45°C a 60°C, de 49°C a 58°C, de 50°C a 55°C por um período de 5 segundos a 20 segundos. O Estágio 3 é realizado sob condições suficientes para amplificar os modelos. Em uma modalidade, o número de ciclos do Estágio 3 é de 20 a 40 ciclos, ou de 25 a 35 ciclos. Em uma modalidade, a temperatura para dissociação varia de 90°C a 98°C, ou de 92°C a 97°C ou de 94°C a 96°C por um período de 10 segundos a 20 segundos. Em uma modalidade, a temperatura para associação varia de 45°C a 70°C, de 49°C a 68°C, de 50°C a 60°C por um período de 5 segundos a 20 segundos.
[109] Em uma modalidade, a qPCR de amplificação do gene de cópia única é realizada em uma placa diferente e sob condições diferentes, comparada com a qPCR de amplificação de telômero que é realizada em uma segunda placa. Em outra modalidade, a qPCR de amplificação do gene de cópia única é realizada em um primeiro poço e a qPCR de amplificação de telômero é realizada em um segundo poço na mesma placa e sob as mesmas condições. A análise de telômero por qPCR pode ser realizada em 1, 2 ou mais amostras de tecido do mesmo tumor do paciente.
[110] Em uma modalidade, o tamanho do amplicon do gene de cópia única na reação de PCR é similar ao tamanho do amplicon para a reação de PCR do telômero. Em uma modalidade, o amplicon de gene único gerado pela extensão do primeiro e segundo iniciadores tem de cerca de 50 a 100 nucleotídeos, de 60 a 90 nucleotídeos, de 70 a 80 nucleotídeos.
[111] O comprimento do telômero é determinado por subtração do ciclo limiar da PCR quantitativa da cópia única do gene do ciclo limiar da reação em cadeia de polimerase telomérica quantitativa (ΔCtamostra = Cttelômero- Ctgene de cópia única). A diferença média do número do ciclo do gene de cópia única para a reação em cadeia de polimerase telomérica determinará os comprimentos de telômero (ΔCt = Cttelômero-Ctgene de cópia única). O comprimento do telômero é determinado para um indivíduo e correlacionado com o comprimento do telômero observado em uma população de indivíduos ou com um indivíduo de referência. Em uma modalidade, a população de indivíduos tem idade compatível com a idade do indivíduo que está sendo testado. Para humanos, a população com idade compatível está dentro de cerca de 10 anos da idade do indivíduo, ou dentro de 5 anos ou dentro de 1 ano. Em outra modalidade, a população de indivíduos é combinada de acordo com o tipo de células de câncer (por exemplo, sem limitação, câncer de pulmão, câncer de próstata, leucemia etc.).
[112] O comprimento do telômero é expresso como o produto de telômero normalizado por produto do gene de cópia única. Em outras palavras, o comprimento relativo do telômero de uma amostra é o fator pelo qual a amostra experimental difere de uma amostra de DNA de referência em sua proporção de número de cópia de repetição de telômero para o número de cópia de gene único. A quantidade de repetições de telômero em cada amostra experimental é medida como o nível de diluição de uma amostra de DNA de referência escolhida arbitrariamente que tornaria as amostras experimentais e de referência equivalentes com relação ao número de ciclos de PCR necessários para gerar certa quantidade de produto de telômero de PCR durante a fase exponencial da amplificação por PCR. Similarmente, a quantidade relativa do gene de cópia única em cada amostra experimental é expressa como o nível de diluição da amostra de DNA de referência necessário para combiná-la com a amostra experimental com relação ao número de ciclos de PCR necessários para gerar certa quantidade de produto de PCR do gene de cópia única durante a fase exponencial da PCR.
[113] Em uma modalidade, para cada amostra experimental, a proporção dos fatores de diluição é a proporção relativa de telômero para gene de cópia única (T/S). Dessa forma, T/S = 1 quando o DNA desconhecido é idêntico ao DNA de referência em sua proporção de número de cópia de repetição de telômero para número de cópia única. A amostra de DNA de referência (com a qual todas as amostras experimentais em certo estudo são comparadas) pode ser de um único indivíduo ou pode ser um pool de amostras de múltiplos indivíduos ou pode ser de uma ou mais linhagens de células que possuem telômeros de comprimentos conhecidos. A proporção T/S de um indivíduo em relação à proporção T/S do indivíduo de referência ou do pool de amostras ou das linhagens de células corresponde ao comprimento relativo do telômero do DNA do indivíduo. Em uma modalidade, a linhagem de célula é selecionada do grupo que consiste em células M14Mel, células A549, células SK- Mel-5 e células Ovcar-5.
[114] Em outra modalidade, para cada amostra experimental, a proporção dos fatores de diluição é o log2 da proporção relativa do gene de cópia única para telômero (log2 S/T). A amostra de DNA de referência (com a qual todas as amostras experimentais em certo estudo são comparadas) pode ser de um único indivíduo ou pode ser um pool de amostras de múltiplos indivíduos ou pode ser de uma ou mais linhagens de células que possuem telômeros de comprimentos conhecidos. O log2 da proporção S/T de um indivíduo em relação ao log2 da proporção S/T do indivíduo de referência ou do pool de amostras ou das linhagens de células corresponde ao comprimento relativo do telômero do DNA do indivíduo. Em uma modalidade, a linhagem de célula é selecionada do grupo que consiste em células M14Mel, células A549, células SK-Mel-5 e células Ovcar-5.
[115] A correlação do comprimento do telômero medido do indivíduo e a população são examinadas por vários métodos estatísticos, por exemplo, análise de sobrevida, incluindo modelos de regressão de risco proporcional de Cox, estimativa da distribuição de sobrevida de Kaplan-Meier, teste de Peto Wilcoxon, análise de probabilidade máxima, análise de regressão múltipla e outros.
[116] Os métodos de qPCR aqui descritos também podem ser usados para medir uma reação do indivíduo ao tratamento com um inibidor da telomerase (por exemplo, qualquer um dos inibidores da telomerase aqui revelados). A taxa na qual o comprimento relativo do telômero encurta em tumores sólidos ao longo do tempo de tratamento é medida para determinar a reação do indivíduo ao inibidor da telomerase.
[117] Além disso, diversos agentes podem ser adicionados à reação de PCR para facilitar a hibridização, amplificação e detecção ótimas. Esses incluem sais, tampões, proteínas neutras, detergentes etc. Outros agentes podem ser adicionados para aumentar a eficiência da reação como, por exemplo, inibidores de protease, inibidores de nuclease, agentes antimicrobianos etc.
[118] Mais informações relacionadas à avalição do comprimento do telômero por meio de qPCR podem ser encontradas nas Publicações de Pedidos de Patente U.S. Nos 2006/0210980, 2010/0151477 e 2011/0207128, bem como nas Publicações de Pedidos de Patente International Nos WO 2010/075413 e WO 2012/0135125, cujas revelações são aqui incorporadas por referência. b. Hibridização fluorescente de telômero in situ (telo-FISH)
[119] Em alguns aspectos, o comprimento do telômero é determinado com o uso de telo-FISH. Nesse método, células são fixadas e hibridizadas com uma sonda conjugada a um marcador fluorescente, por exemplo, Cy-3, fluoresceína, rodamina, etc. Sondas para esse método são oligonucleotídeos projetados para hibridizar especificamente para sequências de telômero. Geralmente, as sondas têm 8 ou mais nucleotídeos de comprimento, por exemplo, 12 a 20 ou mais nucleotídeos de comprimento. Em um aspecto, as sondas são oligonucleotídeos que compreendem nucleotídeos de ocorrência natural. Em um aspecto, a sonda é um ácido nucléico peptídico, que possui um Tm maior do que sequências naturais análogas e, dessa forma, permite o uso de condições de hibridização mais rigorosas. As células podem ser tratadas com um agente, por exemplo, colcemid, para induzir interrupção do ciclo celular na metáfase, fornecendo cromossomos em metáfase para hibridização e análise. Em algumas modalidades, DNA celular também pode ser corado com o corante fluorescente 4’,6-diamidino-2- fenilindol (DAPI).
[120] Imagens digitais de cromossomos em metáfase intatos são adquiridas e a intensidade de fluorescência das sondas hibridizadas para telômeros quantificada. Isso permite a medição do comprimento do telômero de cromossomos individuais, além do comprimento do telômero médio em uma célula, e evita problemas associados à presença de DNA subtelomérico (Zjilmans, J.M. e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 7.423-7.428 (1997); Blasco, M.A. e cols., Cell 91: 25-34 (1997); incorporados por referência). A intensidade do sinal fluorescente se correlaciona com o comprimento do telômero, com um sinal fluorescente mais brilhante indicando um telômero mais longo.
[121] Em alguns aspectos, um software (por exemplo, o “IN Cell Developer Toolbox 1.9, GE Corp.) é utilizado para quantificar o comprimento do telômero médio de células obtidas de amostras biológicas e submetidas à telo-FISH. Em uma modalidade, o software é usado para desenhar uma ou mais linhas em torno (i) dos núcleos das células, que são determinadas com base na localização da coloração com DAPI, e (ii) em torno dos telômeros. Após cada núcleo e telômero ter sido circundado, o software pode calcular a intensidade de cada telômero individual nas células e, dessa forma, determinar o comprimento do telômero médio para as células derivadas da amostra biológica. Em algumas modalidades, o comprimento do telômero é calculado usando a equação: 1,376 x log2 (intensidade)-6,215 x / (área) Equação 1 em que “intensidade” é definida como a intensidade do telômero e “área” é definida como a área do telômero definida pela linha desenhada em torno dele.
[122] Em outra modalidade, para cada amostra experimental, o valor calculado usando a Equação 1 é normalizado contra o valor calculado de um único indivíduo ou de um pool de amostras de múltiplos indivíduos ou de uma ou mais linhagens de células que possuem telômeros de comprimentos conhecidos. O valor calculado usando a Equação 1 em relação ao valor calculado usando a Equação 1 do indivíduo de referência ou do pool de amostras ou das linhagens de células corresponde ao comprimento relativo do telômero do DNA do indivíduo. Em uma modalidade, a linhagem de célula é selecionada do grupo que consiste em células M14Mel, células A549, células SK-Mel-5 e células Ovcar-5.
[123] A correlação do comprimento do telômero medido do indivíduo e da população é examinada por vários métodos estatísticos, por exemplo, análise de sobrevida, incluindo modelos de regressão de risco proporcional de Cox, estimativa da distribuição de sobrevida de Kaplan-Meier, teste de Peto Wilcoxon, análise de probabilidade máxima, análise de regressão múltipla e outros. 3. Seleção de um indivíduo diagnosticado ou suspeito de ter câncer que se beneficiará do tratamento com um inibidor da telomerase
[124] Em alguns aspectos, são aqui fornecidos métodos para a seleção de um indivíduo diagnosticado ou suspeito de ter câncer que se beneficiará do tratamento com um inibidor da telomerase, o método compreendendo: determinação do comprimento relativo do telômero por análise do comprimento relativo de ácidos nucléicos teloméricos em células de câncer presentes em uma amostra biológica do indivíduo; e seleção de um indivíduo que se beneficiará do tratamento com um inibidor da telomerase quando o comprimento relativo médio do telômero nas células de câncer presentes em uma amostra biológica do indivíduo é determinado como estando no 50° percentil ou menos de uma faixa de comprimentos relativos de telômero determinada a partir de um ou mais padrões conhecidos. Em algumas modalidades, o inibidor da telomerase compreende um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, o inibidor da telomerase é Imetelstat. Em outra modalidade, o câncer é câncer de pulmão de pequena célula, câncer de mama, câncer de próstata ou um câncer hematológico. Ainda em outras modalidades, o indivíduo é um humano.
[125] Qualquer método pode ser usado para determinar o comprimento relativo do telômero no indivíduo, incluindo qualquer um dos métodos aqui descritos. Em uma modalidade, o comprimento relativo de ácidos nucléicos teloméricos é determinado usando qPCR de DNA extraído de amostras biológicas fixadas com formalina e embebidas em parafina (FFPE). Quando esse método é usado, a frase “comprimento relativo do telômero” é definida como (i) a proporção relativa de telômero para gene de cópia única (T/S) ou (ii) o log2 da proporção relativa do gene de cópia única para telômero (log2 S/T). Em algumas modalidades, os referidos (um ou mais) padrões conhecidos são linhagens de células caracterizadas. O termo “linhagens de células caracterizadas” significa que o comprimento relativo de ácidos nucléicos teloméricos das células nas linhagens de células é conhecido e relativamente constante. Exemplos não limitantes de linhagens de células caracterizadas incluem células M14Mel, células A549, células SK-Mel-5 e células Ovcar-5. Em outra modalidade, as linhagens de células caracterizadas são selecionadas de linhagens de células representativas da amostra biológica do indivíduo. Exemplos não limitantes dessas linhagens de células podem incluir linhagens de células de câncer de pulmão de célula não pequena, linhagens de células hepatocelulares ou linhagens de células ovarianas. Ainda em outras modalidades, os referidos (um ou mais dos) padrões conhecidos consistem em uma faixa de comprimentos de telômero estabelecida a partir de diversos tumores de ocorrência natural de diversos indivíduos. Em uma modalidade, as células de câncer de diversos tumores de ocorrência natural podem ser do mesmo tipo que as células de câncer presentes na amostra biológica do indivíduo. Em algumas modalidades, o comprimento do telômero nas células de câncer presentes na amostra biológica é determinado como estando em qualquer um do 45° percentil, 40° percentil, 35° percentil, 30° percentil, 25° percentil, 20° percentil, 15° percentil, 10° percentil, 5° percentil ou menos do que a faixa de comprimentos de telômero, inclusive, incluindo quaisquer percentis entre esses números.
[126] Ainda em outras modalidades, o comprimento relativo de ácidos nucléicos teloméricos é determinado usando qPCR de DNA extraído de amostras biológicas fixadas com formalina e embebidas em parafina (FFPE) e a frase “comprimento relativo do telômero” é definida como o log2 da proporção relativa do gene de cópia única para telômero (log2 S/T). Em algumas modalidades, o log2 da proporção S/T é menor do que qualquer um de cerca de 0, -0,1, -0,2, -0,3, -0,4, -0,5, -0,6, -0,7, -0,8, -0,9, -1,0, -1,1, -1,2, -1,3, -1,4, -1,5, -1,6, - 1,7, -1,8, -1,9, -2,0, ou mais.
[127] Em outra modalidade, o comprimento relativo de ácidos nucléicos teloméricos é determinado com o uso de telo-FISH. Quando esse método é usado, a frase “comprimento relativo do telômero” é definida como o valor determinado usando a Equação 1 nos métodos descritos acima. Em algumas modalidades, os referidos (um ou mais) padrões conhecidos são linhagens de células caracterizadas. O termo “linhagens de células caracterizadas” significa que os ácidos nucléicos teloméricos relativos das células nas linhagens de células são conhecidos e relativamente constantes. Exemplos não limitantes de linhagens de células caracterizadas incluem células M14Mel, células A549, células SK-Mel-5 e células Ovcar-5. Em outra modalidade, as linhagens de células caracterizadas são selecionadas de linhagens de células representativas da amostra biológica do indivíduo. Exemplos não limitantes dessas linhagens de células podem incluir linhagens de células de câncer de pulmão de célula não pequena, linhagens de células hepatocelulares ou linhagens de células ovarianas. Ainda em outras modalidades, os referidos (um ou mais dos) padrões conhecidos consistem em uma faixa de comprimentos de telômero estabelecida a partir de diversos tumores de ocorrência natural de diversos indivíduos. Em uma modalidade, as células de câncer de diversos tumores de ocorrência natural podem ser do mesmo tipo que as células de câncer presentes na amostra biológica do indivíduo. Em algumas modalidades, o comprimento do telômero nas células de câncer presentes na amostra biológica é determinado como estando em qualquer um do 45° percentil, 40° percentil, 35° percentil, 30° percentil, 25° percentil, 20° percentil, 15° percentil, 10° percentil, 5° percentil ou menos do que a faixa de comprimentos de telômero, inclusive, incluindo quaisquer percentis entre esses números. Em outras modalidades, o comprimento relativo do telômero, como determinado usando a Equação 1 nos métodos descritos acima, é menor do que qualquer um de cerca de 0, -0,1, -0,2, -0,3, -0,4, -0,5, -0,6, -0,7, -0,8, -0,9, -1,0, -1,5, -2,0, -2,5, -3,0, -3,5, -4,0, -4,5, -5,0, -5,5, -6,0, -6,5, -7,0, -7,5, - 8,0, -8,5, -9,0, -9,5, -10,0 ou mais, inclusive, incluindo qualquer número entre esses valores.
C. Métodos de tratamento de distúrbios proliferativos celulares com o uso de inibidores da telomerase
[128] Em alguns aspectos, a presente invenção é dirigida aos métodos para inibição dos sintomas ou condições (deficiências, incapacidades) associadas a um distúrbio proliferativo celular (por exemplo, câncer), como descrito em detalhe acima. Dessa forma, não é necessário que todos os efeitos da condição sejam inteiramente evitados ou revertidos, embora os efeitos dos métodos atualmente revelados provavelmente se estendam a um benefício terapêutico significante para o paciente. Dessa forma, um benefício terapêutico não é necessariamente uma prevenção ou cura completa para uma condição particular resultante de um distúrbio proliferativo celular (por exemplo, câncer), mas, ao invés disso, pode englobar um resultado que inclui redução ou prevenção dos sintomas que resultam de um distúrbio proliferativo celular, redução ou prevenção da ocorrência desses sintomas (quantitativamente ou qualitativamente), redução da gravidade desses sintomas ou seus efeitos fisiológicos, e/ou melhora da recuperação do indivíduo após apresentar sintomas de um distúrbio proliferativo celular.
[129] Especificamente, uma composição da presente invenção (por exemplo, qualquer um dos compostos inibidores da telomerase aqui revelados), quando administrada a um indivíduo, pode tratar ou evitar um ou mais dos sintomas ou condições associadas a um distúrbio proliferativo celular (por exemplo, câncer) e/ou reduzir ou aliviar sintomas ou condições associadas a esse distúrbio. Dessa forma, a proteção de um indivíduo dos efeitos ou sintomas resultantes de um distúrbio proliferativo celular (por exemplo, câncer) inclui tanto a prevenção quanto a redução da ocorrência e/ou gravidade dos efeitos do distúrbio e o tratamento de um paciente no qual os efeitos do distúrbio já estão ocorrendo ou estão começando a ocorrer. Um efeito benéfico pode facilmente ser avaliado por aqueles habilitados na técnica e/ou por um médico treinado que está tratando o paciente. De preferência, há uma diferença positiva ou benéfica na gravidade ou ocorrência de pelo menos uma pontuação clínica ou biológica, valor ou medição usada para avaliar esses pacientes naqueles que foram tratados com os métodos da presente invenção, quando comparados com aqueles que não foram.
[130] Os métodos podem ser praticados em uma situação de adjuvante. “Situação de adjuvante” se refere a uma situação clínica na qual um indivíduo teve uma história de uma doença proliferativa, particularmente câncer, e geralmente (mas não necessariamente) foi responsivo à terapia, que inclui, sem limitação, cirurgia (por exemplo, ressecção cirúrgica), radioterapia e quimioterapia. No entanto, por causa de sua história da doença proliferativa (por exemplo, câncer), esses indivíduos são considerados em risco para o desenvolvimento da doença. Tratamento ou administração na “situação de adjuvante” se refere a um modo de tratamento subsequente. O grau de risco (ou seja, quando um indivíduo na situação de adjuvante é considerado como “alto risco” ou “baixo risco”) depende de vários fatores, mais normalmente a extensão da doença quando primeiro tratada.
[131] Os métodos aqui fornecidos também podem ser praticados em uma “situação de neoadjuvante”, ou seja, o método pode ser realizado antes da terapia primária/definitiva. Em algumas modalidades, o indivíduo foi previamente tratado. Em algumas modalidades, o indivíduo não foi previamente tratado. Em algumas modalidades, o tratamento é uma terapia de primeira linha.
[132] Consequentemente, em alguns aspectos, são aqui fornecidos métodos para o tratamento de um indivíduo diagnosticado ou suspeito de ter câncer, o método compreendendo: determinação do comprimento relativo do telômero por análise do comprimento relativo de ácidos nucléicos teloméricos em células de câncer presentes em uma amostra biológica do indivíduo; seleção de um indivíduo que se beneficiará do tratamento com um inibidor da telomerase quando o comprimento relativo médio do telômero nas células de câncer presentes em uma amostra biológica do indivíduo é determinado como estando no 50° percentil ou menos de uma faixa de comprimentos relativos de telômero determinada a partir de um ou mais padrões conhecidos; e administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do inibidor da telomerase ao indivíduo. Em algumas modalidades, o inibidor da telomerase compreende um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, o inibidor da telomerase é Imetelstat. Em outra modalidade, o câncer é câncer de pulmão de pequena célula, câncer de mama, câncer de próstata ou um câncer hematológico. Ainda em outras modalidades, o indivíduo é um humano.
[133] Em outros aspectos, são aqui fornecidos métodos para o tratamento de um indivíduo diagnosticado ou suspeito de ter câncer, o método compreendendo: administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor da telomerase ao indivíduo quando o comprimento relativo médio do telômero em células de câncer presentes em uma amostra biológica do indivíduo foi determinado como estando no 50° percentil ou menos de uma faixa de comprimentos relativos de telômero determinada a partir de um ou mais padrões conhecidos. Em algumas modalidades, o inibidor da telomerase é Imetelstat. Em outra modalidade, o câncer é câncer de pulmão de pequena célula, câncer de mama, câncer de próstata ou um câncer hematológico. Ainda em outras modalidades, o indivíduo é um humano.
[134] Qualquer método pode ser usado para determinar o comprimento relativo do telômero no indivíduo, incluindo qualquer um dos métodos aqui descritos. Em uma modalidade, o comprimento relativo de ácidos nucléicos teloméricos é determinado usando qPCR de DNA extraído de amostras biológicas fixadas com formalina e embebidas em parafina (FFPE). Quando esse método é usado, a frase “comprimento relativo do telômero” é definida como (i) a proporção relativa de telômero para gene de cópia única (T/S) ou (ii) log2 da proporção relativa do gene de cópia única para telômero (log2 S/T). Em algumas modalidades, os referidos (um ou mais) padrões conhecidos são linhagens de células caracterizadas. O termo “linhagens de células caracterizadas” significa que o comprimento relativo de ácidos nucléicos teloméricos das células nas linhagens de células são conhecidos e relativamente constantes. Exemplos não limitantes de linhagens de células caracterizadas incluem células M14Mel, células A549, células SK-Mel-5 e células Ovcar-5. Em outra modalidade, as linhagens de células caracterizadas são selecionadas de linhagens de células representativas da amostra biológica do indivíduo. Exemplos não limitantes dessas linhagens de células podem incluir linhagens de células de câncer de pulmão de célula não pequena, linhagens de células hepatocelulares ou linhagens de células ovarianas. Ainda em outras modalidades, os referidos (um ou mais dos) padrões conhecidos consistem em uma faixa de comprimentos de telômero estabelecida a partir de diversos tumores de ocorrência natural de diversos indivíduos. Em uma modalidade, as células de câncer de diversos tumores de ocorrência natural podem ser do mesmo tipo que as células de câncer presentes na amostra biológica do indivíduo. Em algumas modalidades, o comprimento do telômero nas células de câncer presentes na amostra biológica é determinado como estando em qualquer um do 45° percentil, 40° percentil, 35° percentil, 30° percentil, 25° percentil, 20° percentil, 15° percentil, 10° percentil, 5° percentil ou menos do que a faixa de comprimentos de telômero, inclusive, incluindo quaisquer percentis entre esses números.
[135] Em outra modalidade, o comprimento relativo de ácidos nucléicos teloméricos é determinado com o uso de telo-FISH. Quando esse método é usado, a frase “comprimento relativo do telômero” é definida como o valor determinado usando a Equação 1 nos métodos descritos acima. Em algumas modalidades, os referidos (um ou mais) padrões conhecidos são linhagens de células caracterizadas. Exemplos não limitantes de linhagens de células caracterizadas incluem células M14Mel, células A549, células SK-Mel-5 e células Ovcar-5. Em outra modalidade, as linhagens de células caracterizadas são selecionadas de linhagens de células representativas da amostra biológica do indivíduo. Exemplos não limitantes dessas linhagens de células podem incluir linhagens de células de câncer de pulmão de célula não pequena, linhagens de células hepatocelulares ou linhagens de células ovarianas. Ainda em outras modalidades, os referidos (um ou mais dos) padrões conhecidos consistem em uma faixa de comprimentos de telômero estabelecida a partir de diversos tumores de ocorrência natural de diversos indivíduos. Em uma modalidade, as células de câncer de diversos tumores de ocorrência natural podem ser do mesmo tipo que as células de câncer presentes na amostra biológica do indivíduo. Em algumas modalidades, o comprimento do telômero nas células de câncer presentes na amostra biológica é determinado como estando em qualquer um do 45° percentil, 40° percentil, 35° percentil, 30° percentil, 25° percentil, 20° percentil, 15° percentil, 10° percentil, 5° percentil ou menos do que a faixa de comprimentos de telômero, inclusive, incluindo quaisquer percentis entre esses números.
D. Administração de inibidores da telomerase
[136] Em algumas modalidades, o inibidor da telomerase (por exemplo, qualquer um dos compostos inibidores da telomerase aqui revelados) é administrado na forma de uma injeção. A injeção pode compreender o composto em combinação com um excipiente ou veículo injetável aquoso. Exemplos não limitantes de excipientes ou veículos injetáveis aquosos adequados são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica, e eles, e os métodos de formulação das formulações, podem ser encontrados em referências- padrão como, por exemplo, Alfonso A.R.: “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 17a Edição, Mack Publishing Company, Easton Pa., 1985. Excipientes ou veículos injetáveis aquosos adequados incluem água, solução salina aquosa, solução de dextrose aquosa, e semelhantes, opcionalmente contendo intensificadores de dissolução como, por exemplo, manitol 10% ou outros açúcares, glicina 10%, ou outros aminoácidos. A composição pode ser injetada por via subcutânea, por via intraperitoneal ou por via intravenosa.
[137] Em algumas modalidades, é usada a administração intravenosa, e ela pode ser infusão intravenosa contínua ao longo de um período de poucos minutos até uma hora ou mais, por exemplo, em torno de quinze minutos. A quantidade administrada pode variar amplamente, dependendo do tipo do inibidor da telomerase, tamanho da dosagem unitária, tipo de excipientes ou veículos, e de outros fatores bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. O inibidor da telomerase pode compreender, por exemplo, de cerca de 0,001% até cerca de 10% (p/p), de cerca de 0,01% até cerca de 1%, de cerca de 0,1% até cerca de 0,8%, ou qualquer faixa entre eles, com o restante compreendendo o(s) excipiente(s) ou veículo(s).
[138] Para administração oral, o inibidor da telomerase pode assumir a forma de, por exemplo, comprimidos ou cápsulas preparadas por meios convencionais com excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis como, por exemplo, agentes aglutinantes; enchimentos; lubrificantes; desintegrantes; ou agentes umidificantes. Preparações líquidas para administração oral podem assumir a forma de, por exemplo, soluções, xaropes ou suspensões, ou podem ser apresentadas como um produto seco para reconstituição com água ou outro veículo adequado antes do uso. Essas preparações líquidas podem ser preparadas por meios convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis como, por exemplo, agentes de suspensão (por exemplo, xarope de sorbitol, derivados de celulose ou gorduras hidrogenadas comestíveis); agentes emulsificantes (por exemplo, lecitina ou acácia); veículos não aquosos (por exemplo, óleo de amêndoas, ésteres oleosos, álcool etílico ou óleos vegetais fracionados); e conservantes (por exemplo, metil ou propil-p-hidroxibenzoatos ou ácido sórbico). As preparações também podem conter sais de tampão, flavorizantes e corantes, como apropriado.
[139] Em algumas modalidades, o inibidor da telomerase pode ser administrado por inalação por meio de um spray de aerossol ou um nebulizador que pode incluir um propelente adequado como, por exemplo, diclorodifluormetano, triclorofluormetano, diclorotetrafluoretano, dióxido de carbono, ou uma combinação destes. Em um exemplo não limitante, uma unidade de dosagem para um aerossol pressurizado pode ser liberada por meio de uma válvula dosimétrica. Em outra modalidade, cápsulas e cartuchos de gelatina, por exemplo, podem ser usados em um inalador e podem ser formulados para conter uma mistura em pó do composto com uma base de pó adequada como, por exemplo, amido ou lactose.
[140] Em algumas modalidades, a quantidade de inibidor da telomerase na composição (por exemplo, uma composição farmacêutica) é incluída em qualquer uma das seguintes faixas: cerca de 0,5 até cerca de 5 mg, cerca de 5 até cerca de 10 mg, cerca de 10 até cerca de 15 mg, cerca de 15 até cerca de 20 mg, cerca de 20 até cerca de 25 mg, cerca de 20 até cerca de 50 mg, cerca de 25 até cerca de 50 mg, cerca de 50 até cerca de 75 mg, cerca de 50 até cerca de 100 mg, cerca de 75 até cerca de 100 mg, cerca de 100 até cerca de 125 mg, cerca de 125 até cerca de 150 mg, cerca de 150 até cerca de 175 mg, cerca de 175 até cerca de 200 mg, cerca de 200 até cerca de 225 mg, cerca de 225 até cerca de 250 mg, cerca de 250 até cerca de 300 mg, cerca de 300 até cerca de 350 mg, cerca de 350 até cerca de 400 mg, cerca de 400 até cerca de 450 mg ou cerca de 450 até cerca de 500 mg. Em algumas modalidades, a quantidade de um inibidor da telomerase na quantidade eficaz da composição farmacêutica (por exemplo, uma forma de dosagem unitária) está na faixa de cerca de 5 mg até cerca de 500 mg, por exemplo, cerca de 30 mg até cerca de 300 mg ou cerca de 50 mg até cerca de 200 mg. Em algumas modalidades, a concentração do inibidor da telomerase na composição farmacêutica está diluída (cerca de 0,1 mg/ml) ou concentrada (cerca de 100 mg/ml), incluindo, por exemplo, qualquer um de cerca de 0,1 até cerca de 50 mg/ml, cerca de 0,1 até cerca de 20 mg/ml, cerca de 1 até cerca de 10 mg/ml, cerca de 2 mg/ml até cerca de 8 mg/ml, cerca de 4 até cerca de 6 mg/ml, cerca de 5 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração do inibidor da telomerase é pelo menos cerca de qualquer um de 0,5 mg/ml, 1,3 mg/ml, 1,5 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml ou 50 mg/ml.
[141] Quantidades eficazes exemplares de um inibidor da telomerase na composição farmacêutica incluem, sem limitação, pelo menos cerca de qualquer um de 25 mg/m2, 30 mg/m2, 50 mg/m2, 60 mg/m2, 75 mg/m2, 80 mg/m2, 90 mg/m2, 100 mg/m2, 120 mg/m2, 125 mg/m2, 150 mg/m2, 160 mg/m2, 175 mg/m2, 180 mg/m2, 200 mg/m2, 210 mg/m2, 220 mg/m2, 250 mg/m2, 260 mg/m2, 300 mg/m2, 350 mg/m2, 400 mg/m2, 500 mg/m2, 540 mg/m2, 750 mg/m2, 1.000 mg/m2 ou 1.080 mg/m2. Em várias modalidades, a composição farmacêutica inclui menos do que cerca de qualquer um de 350 mg/m2, 300 mg/m2, 250 mg/m2, 200 mg/m2, 150 mg/m2, 120 mg/m2, 100 mg/m2, 90 mg/m2, 50 mg/m2, ou 30 mg/m2 de um inibidor da telomerase. Em algumas modalidades, a quantidade do inibidor da telomerase por administração é menor do que cerca de qualquer um de 25 mg/m2, 22 mg/m2, 20 mg/m2, 18 mg/m2, 15 mg/m2, 14 mg/m2, 13 mg/m2, 12 mg/m2, 11 mg/m2, 10 mg/m2, 9 mg/m2, 8 mg/m2, 7 mg/m2, 6 mg/m2, 5 mg/m2, 4 mg/m2, 3 mg/m2, 2 mg/m2 ou 1 mg/m2. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz de um inibidor da telomerase na composição farmacêutica é incluída em qualquer uma das seguintes faixas: cerca de 1 até cerca de 5 mg/m2, cerca de 5 até cerca de 10 mg/m2, cerca de 10 até cerca de 25 mg/m2, cerca de 25 até cerca de 50 mg/m2, cerca de 50 até cerca de 75 mg/m2, cerca de 75 até cerca de 100 mg/m2, cerca de 100 até cerca de 125 mg/m2, cerca de 125 até cerca de 150 mg/m2, cerca de 150 até cerca de 175 mg/m2, cerca de 175 até cerca de 200 mg/m2, cerca de 200 até cerca de 225 mg/m2, cerca de 225 até cerca de 250 mg/m2, cerca de 250 até cerca de 300 mg/m2, cerca de 300 até cerca de 350 mg/m2 ou cerca de 350 até cerca de 400 mg/m2. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz de um inibidor da telomerase na composição farmacêutica é cerca de 5 até cerca de 300 mg/m2, por exemplo, cerca de 20 até cerca de 300 mg/m2, cerca de 50 até cerca de 250 mg/m2, cerca de 100 até cerca de 150 mg/m2, cerca de 120 mg/m2, cerca de 130 mg/m2 ou cerca de 140 mg/m2 ou cerca de 260 mg/m2.
[142] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos acima, a quantidade eficaz de um inibidor da telomerase na composição farmacêutica inclui pelo menos cerca de qualquer um de 1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3,5 mg/kg, 5 mg/kg, 6,5 mg/kg, 7,5 mg/kg, 9,4 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg ou 20 mg/kg. Em várias modalidades, a quantidade eficaz de um inibidor da telomerase na composição farmacêutica inclui menos do que cerca de qualquer um de 350 mg kg, 300 mg/kg, 250 mg/kg, 200 mg/kg, 150 mg/kg, 100 mg/kg, 50 mg/kg, 30 mg/kg, 25 mg/kg, 20 mg/kg, 10 mg/kg, 9,4 mg/kg, 7,5 mg/kg, 6,5 mg/kg, 5 mg/kg, 3,5 mg/kg, 2,5 mg/kg ou 1 mg/kg de um inibidor da telomerase.
[143] Frequências de dosagem exemplares para as composições farmacêuticas (por exemplo, uma composição farmacêutica contendo qualquer um dos inibidores da telomerase aqui revelados) incluem, sem limitação, diariamente; em dias alternados; duas vezes por semana; três vezes por semana; semanalmente sem intervalo; semanalmente, três a cada quatro semanas; uma vez a cada três semanas; uma vez a cada duas semanas; semanalmente, duas a cada três semanas. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada por volta de uma vez a cada 2 semanas, uma vez a cada 3 semanas, uma vez a cada 4 semanas, uma vez a cada 6 semanas ou uma vez a cada 8 semanas. Em algumas modalidades, a composição é administrada pelo menos cerca de qualquer um de 1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x ou 7x (ou seja, diariamente) por semana, ou três vezes ao dia, duas vezes ao dia. Em algumas modalidades, os intervalos entre cada administração são menores do que cerca de qualquer um de 6 meses, 3 meses, 1 mês, 20 dias, 15 dias, 12 dias, 10 dias, 9 dias, 8 dias, 7 dias, 6 dias, 5 dias, 4 dias, 3 dias, 2 dias ou 1 dia. Em algumas modalidades, os intervalos entre cada administração são maiores do que cerca de qualquer um de 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 8 meses ou 12 meses. Em algumas modalidades, não há intervalo na posologia de dosagem. Em algumas modalidades, o intervalo entre cada administração é de, no máximo, cerca de uma semana.
[144] A administração da composição farmacêutica pode ser estendida ao longo de um período de tempo estendido, por exemplo, de cerca de um mês até cerca de sete anos. Em algumas modalidades, a composição é administrada ao longo de um período de pelo menos cerca de qualquer um de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 24, 30, 36, 48, 60, 72 ou 84 meses.
EXEMPLOS Exemplo 1: Preparação e conjugação de lipídeo a oligonucleotídeos fosforamidatos N3’^P5‘ (NP) ou tiofosforamidatos N3’^P5’ (NPS)
[145] Esse exemplo mostra como sintetizar oligonucleotídeos fosforamidatos N3’^P5’ (NP) ou N3’^P5’ tiofosforamidatos (NPS) conjugado a lipídeo.
Materiais e métodos Compostos de partida
[146] Esses compostos podem ser preparados como descrito, por exemplo, em McCurdy e cols., Tetrahedron Letters 38: 207-210 (1997) ou Pongracz & Gryaznov, Tetrahedron Letters 49: 7.661-7.664 (1999). Os monômeros de 3’-amino nucleosídeo de partida podem ser preparados como descrito em Nelson e cols., J. Org. Chem. 62: 7.278-7.287 (1997) ou pelos métodos descritos em Gryaznov e cols., Publicação de Pedido U.S. N° 2006/0009636.
Adesão do lipídeo
[147] Diversas abordagens sintéticas podem ser usadas para conjugar uma porção lipídica L ao oligonucleotídeo, dependendo da natureza da ligação selecionada; veja, por exemplo, Mishra e cols., Biochim. et Biophys. Acta 1.264: 229-237 (1995), Shea e cols., Nucleic Acids Res. 18: 3.777-3.783 (1995) ou Rump e cols., Bioconj. Chem. 9: 341-349 (1995). Tipicamente, a conjugação é obtida por meio do uso de um grupo funcional adequado em um terminal do oligonucleotídeo. Por exemplo, o grupo 3’-amino presente no terminal 3’ dos oligonucleotídeos NP e NPS pode ser reagido com ácidos carboxílicos, cloretos ácidos, anidridos e ésteres ativos, usando catalisadores de acoplamento adequados, para formar uma ligação amida. Grupos tiol também são adequados como grupos funcionais (veja Kupihar e cols., Bioorg. Med. Chem. 9: 1.241-1.247 (2001)). Vários modificadores amino- e tiol-funcionalizados de comprimentos de cadeia diferentes estão disponíveis comercialmente para a síntese de oligonucleotídeo.
[148] Abordagens específicas para adesão de grupos lipídicos a um terminal de um oligonucleotídeo NP ou NPS incluem aquelas descritas na Publicação de Pedido U.S. N° 2005/0113325, que é aqui incorporada em sua totalidade por referência. Além das ligações amida observadas acima, por exemplo, lipídeos também podem ser anexados à cadeia de oligonucleotídeo usando um derivado de fosforamidita do lipídeo, para produzir uma ligação fosforamidato ou tiofosforamidato que conecta o lipídeo e o oligonucleotídeo. O 3’-amino livre do oligonucleotídeo totalmente protegido ligado ao suporte também pode ser reagido com um aldeído de lipídeo adequado, seguido por redução com cianoboro-hidreto de sódio, que produz uma ligação amina.
[149] Para adesão de um lipídeo ao terminal 5’, como também descrito na Publicação de Pedido U.S. N° 2005/0113325, o oligonucleotídeo pode ser sintetizado usando um suporte sólido contendo lipídeo modificado. A reação de 3’-amino-1,2-propanodiol com um cloreto de acila graxo (RC(O)Cl), seguido por dimetoxitritilação do álcool primário e succinilação do álcool secundário, fornece um intermediário que é então acoplado, por meio do grupo succinil carboxil livre, ao suporte sólido. Um exemplo de um suporte modificado é mostrado abaixo, em que S- representa um suporte CPG amina de cadeia alquil longa, e R representa um lipídeo.
Figure img0003
[150] Esse procedimento é seguido por síntese do oligonucleotídeo na direção 5’ para 3’, como descrito, por exemplo, em Pongracz & Gryaznov (1999), partindo com desproteção e fosfitilação do grupo -ODMT. Isso é eficaz para produzir, por exemplo, a estrutura seguinte, após clivagem do suporte sólido:
Figure img0004
[151] A estrutura acima, quando -R é -(CH2)14CH3 (palmitoil), é aqui designado GRN163L (Imetelstat).
Ensaio FlashPlate™
[152] Esse ensaio foi realizado basicamente como descrito em Asai e cols., Cancer Research 63: 3.931-3.939 (2003). Resumidamente, o ensaio detecta e/ou mede atividade de telomerase por medição da adição de repetições teloméricas TTAGGG a um iniciador de substrato de telomerase biotinilado. Os produtos biotinilados são capturados em placas de microtitulação revestidas com estreptavidina, e uma sonda de oligonucleotídeo complementar a 3,5 repetições de telômero, marcada com 33P, é usada para a medição de produtos de telomerase. A sonda não ligada é removida por lavagem, e a quantidade de sonda que anela aos produtos de telomerase capturados é determinada por contagem de cintilação.
Exemplo 2: qPCR em amostras fixadas com formalina e embebidas em parafina do Estudo de Fase II de NSC de Imetelstat (CP14B-012)
[153] Esse exemplo demonstra o desempenho da reação em cadeia de polimerase quantitativa para a determinação do comprimento relativo do telômero de amostras de tecido do Estudo de Fase II de FFPE NSC (CP14B-012).
Materiais e métodos Design do experimento clínico
[154] A finalidade do Estudo de Fase II de NSC (CP14B- 012) foi avaliar a eficácia e segurança de Imetelstat (GRN163L) como terapia de manutenção para pacientes com câncer de pulmão de célula não pequena em estágio avançado que não progrediu após 4 ciclos de terapia à base de platina. Participantes foram randomizados em uma proporção de 2:1 para Imetelstat mais padrão de atendimento versus padrão de atendimento isoladamente. Participantes que receberam bevacizumab com sua quimioterapia de indução continuaram a receber bevacizumab nesse estudo.
[155] As medidas do resultado final primário foram sobrevida livre de progressão, definida como o tempo desde a randomização até progressão da doença documentada ou morte, o que ocorrer mais cedo, como determinado pela avaliação do investigador de acordo com RECIST (“Response Evaluation Criteria in Solid Tumors”). As medidas do resultado final secundário foram resposta objetiva, tempo até mortalidade por todas as causas, e segurança e tolerabilidade (avaliadas pela incidência, natureza e gravidade de eventos adversos, anormalidades laboratoriais e sinais vitais).
[156] Os pacientes foram divididos em dois braços. No braço experimental, pacientes receberam Imetelstat mais o padrão de atendimento (Bevacizumab ou observação). Especificamente, 9,4 mg/kg de Imetelstat (GRN163L) foram dados aos pacientes ao longo de uma infusão IV de 2 horas no Dia 1 e Dia 8 de cada ciclo de 21 dias até progressão da doença. Se administrado, Bevacizumab foi dado no Dia 1 de cada ciclo de 21 dias, com dosagem e duração de acordo com a bula de Bevacizumab aprovada pelo FDA (“Food and Drug Administration” - agência governamental americana que regula e fiscaliza a fabricação de comestíveis, drogas e cosméticos).
[157] No braço de controle, pacientes receberam Bevacizumab ou observação. Se administrado, Bevacizumab foi dado no Dia 1 de cada ciclo de 21 dias, com dosagem e duração de acordo com a bula de Bevacizumab aprovada pelo FDA.
[158] Foram obtidas amostras de 61 dos 116 pacientes incluídos no Estudo de Fase II de NSC (CP14B-012), e desses, 57 resultaram em resultados do ensaio avaliáveis usados para a análise de sobrevida livre de progressão (PFS).
Fixação com formalina e embebição em parafina
[159] Amostras fixadas com formalina e embebidas em parafina foram preparadas usando o Kit HistoGel (N° de Catálogo R904012: Richard Allen Scientific, uma subsidiária de ThermoFisher, Kalamazoo, MI). As células foram cultivadas até 80 a 90% de confluência. Os péletes de células (106/pélete) primeiro foram gentilmente misturados em 200 a 500μl de HistoGel derretido a 50 ± 5°C, e depois resfriados em gelo para solidificar. Após solidificação, as amostras foram rapidamente centrifugadas para remover o líquido residual. Dez ml de formalina 4% foram adicionados aos péletes gelificados e os péletes de células foram fixados por 48 horas em temperatura ambiente. Os péletes de células fixados foram então embebidos usando técnica padronizada de histologia no Laboratório Histo-Tec em Hayward, CA e depois congelados a -80°C.
Extração de DNA
[160] DNA genômico das amostras do Estudo de Fase II de NSCLC foi isolado de amostras processadas por FFPE usando o Kit de Extração de DNA FFPE feito por BioChain (BioChain Institute, N° de Catálogo K5019100, Hayward, CA), de acordo com as instruções do fabricante. O tecido foi misturado em 170μl do tampão do kit e 30μl de proteinase K. A mistura foi incubada a 56°C por uma hora, e depois a temperatura foi aumentada até 90°C por 60 minutos e depois 98°C por 2 minutos, e colocada no gelo por 2 minutos. A mistura foi centrifugada a 14.000 rpm por 10 minutos a 4°C e o sobrenadante obtido. A concentração de DNA foi determinada pelo Kit “Quant-iT Pico Green dsDNA Assay” (Invitrogen, N° de Catálogo P7589, Carlsbad, CA). A concentração de DNA no sobrenadante foi ajustada para 0,1 ng/μl com H2O. PCR quantitativa (qPCR)
[161] Todas as reações de PCR quantitativa foram realizadas usando o sistema de detecção de sequência ABI Prism 7900 HT (Applied Biosystems, Carlsbad CA). Duas PCRs foram realizadas para cada amostra, uma para determinar o valor limiar de ciclos (Ct) para amplificação de telômero (T) e a outra para determinar o valor Ct para a amplificação de um gene de cópia única (fosfoproteína ribossômica ácida P, 36B4).
[162] As sequências iniciadoras para amplificação de telômero foram Telg 5’-ACA CTA AGG TTT GGG TTT GGG TTT GGG TTT GGG TTA GTG T (ID. DE SEQ. N°: 4) e Tele 5’-TGT TAG GTA TCC CTA TCC CTA TCC CTA TCC CTA TCC CTA ACA (ID. DE SEQ. N°: 5) (Cawthon, 2009); e aquelas para 36B4u: 5’-CAG CAA GTG GGA AGG TGT AAT CC (ID. DE SEQ. N°: 6) e 36B4d: 5’-CCC ATT CTA TCA TCA TCA ACG GGT ACA A (ID. DE SEQ. N°: 7) (Cawthon, 2002).
[163] Cada reação de PCR para amplificação de telômero foi realizada usando 1 ng/10μl de amostra (0,1 ng/μl) e uma mistura de PCR de 40 μl contendo 1,25 U de DNA Taq polimerase Hotstart (BioChain), 150 nM de corante fluorescente 6-ROX, 0,04 x corante de ácido nucléico Verde SYBR I (Invitrogen, Carlsbad CA), 50 mM de KCl, 2 mM de MgCl2, 0,2 mM de cada um dos trifosfatos de desoxinucleosídeo (Applied Biosystems, Carlsbad, CA), 5mM de ditiotreitol, dimetil sulfóxido 1%, e 15 mM de Tris-HCl pH 8,0 e par de iniciadores Telg e Tele (ambos a 900 nM). A concentração de iniciador maior é preferida para o DNA telomérico quando se utiliza DNA de FFPE, pois concentrações elevadas de iniciadores permitem múltiplos sítios de anelamento.
[164] As sequências de telômero foram amplificadas em três estágios. Estágio 1: 95°C por 10 minutos para ativar a DNA Taq polimerase Hotstart (BioChain); estágio 2: 5 ciclos de 15 s a 95°C, 10 s a 50°C para gerar produtos de PCR que atuarão como modelos para os ciclos de amplificação subsequentes. A temperatura de anelamento no estágio 2 podia variar de 49°C a 58°C. Estágio 3: 25 ciclos de 15 s a 95°C, 15 s a 60°C com aquisição de sinal a 60°C. O tempo de execução total foi de 70 minutos.
[165] A amplificação do gene de cópia única 36B4 foi realizada usando “Power SYBR Green PCR Master Mix” (Applied Biosystems) da seguinte forma: dez minutos a 95°C para ativar a DNA polimerase no Master Mix (Applied Biosystems), seguido por 40 ciclos de 15 s a 95°C, 1 minuto a 58°C com aquisição de sinal a 58°C. A amplificação de 36B4 foi realizada usando 1ng/10 μl de amostras (0,1 ng/μl), 40 μl de “Power SYBR Green Master Mix” (Applied Biosystems, Carlsbad CA) e par de iniciadores 36B4d (300nM) e 36B4u (300 nM).
[166] O número de ciclos para PCR da sequência de telômero no estágio 2 foi modificado para 5 ciclos a fim de ter valor ΔCt adequado (ΔCtamostra = Cttelômero - Ctreferência) quando se utiliza 1ng de DNA em cada reação de PCR. 1ng - 10ng de DNA por reação tiveram >94% de eficiência de PCR nos estudos de reprodutibilidade. O número do ciclo para a PCR do gene de cópia única precisa ser nove ciclos maior do que para a PCR do telômero a fim de produzir produto de PCR suficiente do gene de cópia única.
[167] As diferenças médias do número do ciclo de gene de cópia única para telômero (Ct36B4 - Cttelômero, ou ΔCt) entre as amostras variaram de 9,208 a 14,500.
[168] A reticulação e fragmentação de DNA no DNA genômico de amostras FFPE impõem um desafio único, especialmente para amplificação de sequências teloméricas repetitivas longas, enquanto a amplificação de um fragmento de 76 bp de um gene de cópia única para fosfoproteína ribossômica ácida P (designada 36B4 nesse documento) na mesma amostra frequentemente não é afetada. Para solucionar esse problema, várias condições de PCR foram alteradas, ou seja, a escolha dos iniciadores de PCR, as condições de tampão da reação de PCR e as condições de ciclagem térmica, para obter o objetivo de encurtar o tamanho do amplicon de telômero e aumentar a eficiência da amplificação por PCR.
Resultados
[169] Os comprimentos de telômero médios em linhagens de células tumorais humanas determinados por Southern blot se correlacionam com os resultados obtidos por qPCR (padrões de ensaio) (Figuras 3A e 3B).
[170] A análise de sobrevida livre de progressão de subgrupos de comprimento do telômero obtidos por qPCR indicou que pacientes com telômeros curtos que foram tratados com Imetelstat eram significantemente mais responsivos comparados com controles do que pacientes com telômeros médios-longos (Figuras 1A e IB).
[171] 19 das 57 amostras (33%) tinham telômeros curtos (Figura 1A). Para esses, a análise da sobrevida livre de progressão indicou o seguinte: eventos do controle/N foram 7/8, e eventos de Imetelstat/N foram 8/11 (Figura 1A); a mediana do controle (CI de 95%) foi de 1,48 (1,18, 2,76), e a mediana de Imetelstat (CI de 95%) foi de 4,05 (1,25, NA) (Figura 1A); o log rank do valor P foi de 0,042, e a razão de risco (CI de 95%) foi de 0,32 (0,1, 1,02) (Figura 1A).
[172] 38 das 57 amostras (67%) tinham telômeros médios- longos (Figura 1B). Para esses, a análise da sobrevida livre de progressão indicou o seguinte: eventos do controle/N foram 8/12, e eventos de Imetelstat/N foram 21/26 (Figura 1B); a mediana do controle (CI de 95%) foi de 2,7 (1,09, 3,59), e a mediana de Imetelstat (CI de 95%) foi de 2,8 (1,51, 4,18) (Figura 1B); o log rank do valor P foi de 0,623, e a razão de risco (CI de 95%) foi de 0,83 (0,36, 1,89) (Figura 1B).
[173] O efeito do tratamento aumenta de forma não linear com redução do comprimento do telômero do tumor (Figura 5).
Exemplo 3: Telo-FISH em amostras fixadas com formalina e embebidas em parafina do Estudo de Fase II de NSC (CP14B)
[174] Foram obtidas amostras de 61 dos 116 pacientes incluídos no Estudo de Fase II de NSC (CP14B-012) descrito acima. Dessas 61 amostras de pacientes, 59 resultaram em resultados avaliáveis do ensaio Telo-FISH usados para análise de PFS. Cada ensaio produziu dados para entre 7 e 14.545 focos de seis regiões (“campos”) em uma lâmina. A área e a intensidade fluorescente foram registradas para cada um dos focos.
Materiais e métodos
[175] Lâminas de tecido FFPE não corado (cortes de tecido com 5μm de espessura) foram preparadas por métodos histológicos de rotina. As lâminas de tecido foram pré- aquecidas a 65°C por 6 minutos para derreter a parafina, e depois carregadas em uma prateleira de lâminas. A prateleira de lâminas carregada foi imersa em 100 ml de xileno em um tanque de coloração por 3 minutos duas vezes (3 minutos x 2) para remover parafina.
[176] As lâminas foram então hidratadas em incrementos de 3 minutos por meio de uma série de etanol graduada: EtOH 100%,(3 minutos x 2), EtOH 95% (3 minutos x 2) e EtOH 70% (3 minutos x 2). Após essa imersão em etanol, as lâminas foram imersas em água deionizada por 3 minutos e em água deionizada com detergente Tween-20 1% por mais 3 minutos.
[177] As lâminas foram mergulhadas brevemente em água para retirar por lavagem o Tween-20, e depois blotted e imersas em um tanque de tampão de citrato de 100 ml 1X contendo solução de desmascaramento de alvo Vector (diluição de 100x em H2O). O tanque inteiro foi colocado em uma caldeira pré-aquecida (ebulição) e fervido por 35 minutos, e depois removido da caldeira e resfriado por pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente. A seguir as lâminas foram imersas em água deionizada por 3 minutos, e depois etanol 70% duas vezes, etanol 95% duas vezes, e secas ao ar.
[178] Uma sonda de hibridização foi preparada usando os seguintes reagentes e volumes:
Figure img0005
Dez μg/ml de sonda de telômero de PNA TelC-Cy3 (PNA Bio Inc.)
[179] Estoque de CCCTAACCCTAACCCTAA (ID. DE SEQ. N°: 8) foi diluído em tampão de hibridização com um fator de diluição adequado (por exemplo, 5x). 30 a 50μl da sonda de PNA diluída foram adicionados sobre a amostra, e depois uma lamínula foi aplicada sem introdução de bolhas de ar. As lâminas foram colocadas na superfície de uma incubadora de lâminas por 6 minutos a 84°C para desnaturar o DNA do telômero.
[180] As lâminas foram movidas para um recipiente fechado escuro e hibridizadas por 2 horas em temperatura ambiente. O recipiente foi umedecido por adição de água ou de um lenço de papel úmido para evitar dessecação.
[181] O tampão de lavagem para a sonda de telômero de PNA foi preparado usando os seguintes reagentes e volumes:
Figure img0006
[182] Após remoção das lamínulas, as lâminas foram lavadas com tampão de lavagem de PNA por 15 minutos duas vezes (15 minutos x 2) com agitação suave em temperatura ambiente. A seguir, as lâminas foram drenadas e o contador de núcleos corado com 1 μg/ml de solução DAPI por 5 minutos (diluição 1:5.000 em água de uma solução de estoque de DAPI de 5 mg/ml; por exemplo, 20 μl de estoque de DAPI de 5 mg/ml em 100 ml de H2O).
[183] A seguir, as lâminas foram lavadas em água destilada por 3 minutos quatro vezes (3 minutos x 4), e depois drenadas e secas ao ar. As lamínulas foram montadas nas lâminas usando solução de meio de montagem anti-fade, evitando bolhas de ar. As lâminas montadas foram mantidas de um dia para o outro em um local escuro para proteger as lâminas da luz antes da testagem sob o microscópio. As lâminas coradas foram avaliadas sob um IN Cell Analyzer 2000 (GE Corp.) para coletar a intensidade do sinal fluorescente e a área do sinal fluorescente de DAPI (núcleos) e Cy3 (telômero).
[184] O software “IN Cell Developer Toolbox 1.9” (GE Corp.) foi utilizado para quantificar o comprimento do telômero médio de células obtidas de amostras biológicas e submetidas a telo-FISH. Esse software foi usado para desenhar linhas em torno dos núcleos das células com base na localização da coloração com DAPI, e em torno dos telômeros das células com base na localização da fluorescência telômero-específica. Após cada núcleo e telômero ter sido circundado, o software calculou a intensidade e a área de cada telômero individual nas células e determinou o comprimento do telômero médio para as células derivadas da amostra biológica de acordo com a Equação 1: 1,376 x log2(intensidade)-6,215 x ^(área) [Equação 1]
Resultados iniciais
[185] Os comprimentos de telômeros em linhagens de células tumorais humanas determinados por Southern blot se correlacionam com os resultados obtidos por Telo-FISH (padrões de ensaio) (Figuras 4A e 4B).
[186] A análise de sobrevida livre de progressão de subgrupos de comprimento do telômero obtidos por Telo-FISH IN Cell-Quartile Split indicou uma área grande e intensidade baixa (ou seja, uma proporção intensidade para área baixa) estão associadas a uma melhor eficácia de Imetelstat (Figura 2).
[187] A análise de sobrevida livre de doença indicou o seguinte: Eventos/N foram 9/15; a mediana do controle (CI de 95%) foi de 1,18 (1,09, NA) e a mediana de Imetelstat (CI de 95%) foi de 4,7 (1,41, NA) (Figura 2); o log rank do valor P foi de 0,044, e a razão de risco (CI de 95%) foi de 0,26 (0,06, 1,1) (Figura 2).
[188] A previsão por Telo-FISH multivariado de sobrevida livre de progressão em pacientes tratados com Imetelstat resultou nos seguintes dados:
Figure img0007
[189] Divisão de quartil de risco de PFS por modelo multivariado (proporção intensidade/área pequena):
Figure img0008
[190] O efeito do tratamento aumenta de forma não linear com redução do comprimento do telômero do tumor (Figura 6).
Resultados posteriores
[191] Análise posterior da população de pacientes foi realizado em um ponto do tempo posterior. Esses dados posteriores são revelados nas Figuras 7 a 10.
[192] A Figura 7 mostra a análise da sobrevida livre de progressão para todos os pacientes (N=114 pacientes totais, com 92 eventos de sobrevida livre de progressão e um acompanhamento mediano de 2,6 meses), enquanto as Figuras 8A e 8B mostram a análise da sobrevida livre de progressão para pacientes com telômeros curtos e telômeros médios- longos, respectivamente. Para pacientes com telômeros curtos, o ensaio Telo-FISH prospectivo foi preditivo de sobrevida livre de progressão (Figura 8A).
[193] A análise da sobrevida global para todos os pacientes (114 pacientes totais, com 66 eventos de sobrevida global e um acompanhamento mediano de 10,5 meses) é mostrada na Figura 9, que demonstra uma tendência em direção ao benefício de sobrevida global para pacientes que recebem Imetelstat, quando comparados com o controle. A análise da sobrevida global para pacientes com telômeros curtos é mostrada na Figura 10A, enquanto a análise da sobrevida global para pacientes com telômeros médios-longos é mostrada na Figura 10B.
Exemplo 4: qPCR em amostras fixadas com formalina e embebidas em parafina do Estudo de Fase II de NSC de Imetelstat (CP14B-012)
[194] Esse exemplo demonstra o desempenho de uma segunda reação em cadeia de polimerase quantitativa para a determinação do comprimento relativo do telômero de amostras de tecido do Estudo de Fase II de FFPE NSC (CP14B- 012).
[195] Esse Exemplo seguiu todos os procedimentos do
Exemplo 2 com as seguintes alterações ao protocolo de qPCR. PCR quantitativa (qPCR)
[196] Todas as reações de PCR quantitativa foram realizadas usando o Sistema de Detecção de Sequência ABI Prism 7900 HT (Applied Biosystems, Carlsbad CA). Uma PCR foi realizada.
[197] As sequências iniciadoras para amplificação de telômero foram Telg 5’-ACA CTA AGG TTT GGG TTT GGG TTT GGG TTT GGG TTA GTG T (ID. DE SEQ. N°: 4) e Tele 5’-TGT TAG GTA TCC CTA TCC CTA TCC CTA TCC CTA TCC CTA ACA (ID. DE SEQ. N°: 5) (Cawthon, 2009); e aquelas para 36B4u: 5’-CAG CAA GTG GGA AGG TGT AAT CC (ID. DE SEQ. N°: 6 e 36B4d: 5’-CCC ATT CTA TCA TCA TCA ACG GGT ACA A (ID. DE SEQ. N°: 7) (Cawthon, 2002).
[198] Padrões de DNA também foram usados como um controle de ensaio/placa. A sequência para o padrão de DNA para o modelo de comprimento do telômero de fita dupla foi 5’-TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG-3’ (ID. DE SEQ. N°: 9) e a sequência para o modelo de gene de cópia única de fita dupla foi: 5’-CTT TTC AGC AAG TGG GAA GGT GTA ATC CGT CTC CAC AGA CAA GGC CAG GAC TCG TTT GTA CCC GTT GAT GAT AGA ATG GGG TAC—3’ (ID. DE SEQ. N°: 10) (ambas de Integrated DNA Technologies).
[199] Cada reação de PCR para amplificação de telômero no DNA da amostra FFPE ou para o padrão de telômero de oligonucleotídeo foi realizada usando 1 ng/10 μl de amostra (0,1 ng/μl) e a 40 μl de mistura de PCR contendo 1,25 U de DNA Taq polimerase Hotstart (BioChain), 150 nM de corante fluorescente 6-ROX, 0,4 x corante de ácido nucléico Verde SYBR I (Invitrogen, Carlsbad CA), 50 mM de KCl, 2 mM de MgCl2, 0,2 mM de cada um dos trifosfatos de desoxinucleosídeo (Applied Biosystems, Carlsbad, CA), 5 mM de ditiotreitol, dimetil sulfóxido 1% e 15 mM de Tris-HCl pH 8,0 e par de iniciadores Telg e Tele (ambos a 900 nM). A concentração de iniciador maior é preferida para o DNA telomérico quando se utiliza DNA de FFPE, pois concentrações elevadas de iniciadores permitem múltiplos sítios de anelamento.
[200] A amplificação do padrão de gene de cópia única 36B4 e do gene de cópia única na amostra FFPE foi realizada usando “Power SYBR Green PCR Master Mix” (Applied Biosystems). A amplificação de 36B4 foi realizada usando 1 ng/10 μl de amostras (0,1 ng/μl), 40 μl de “Power SYBR Green Master Mix” (Applied Biosystems, Carlsbad CA) e par de iniciadores 36B4d (300 nM) e 36B4u (300 nM).
[201] O DNA das amostras FFPE para amplificação da sequência de telômero e do DNA de amostras FFPE para amplificação do gene de cópia única foram colocados em poços separados na placa. Os padrões de DNA para amplificação de sequência de telômero e para amplificação de gene de cópia única 36B4 foram colocados em poços separados na mesma placa e todos foram amplificados em três estágios. Estágio 1: 95°C por 10 minutos para ativar a DNA Taq polimerase; estágio 2: 3 ciclos de 15 s a 95°C, 10 s a 50°C para gerar produtos de PCR que atuarão como modelos para os ciclos de amplificação subsequentes. Estágio 3: 35 ciclos de 15 s a 95°C, 15 s a 60°C com aquisição de sinal a 60°C. O tempo de execução total foi de 90 minutos.
[202] O número de ciclos no estágio 2 foi de 3 ciclos a fim de ter valor ΔCt adequado (ΔCtamostra = Cttelômero - Ctreferência) quando se utiliza 10 ng de amostra DNA de FFPE em cada reação de PCR. 1 ng a 10 ng de DNA da amostra FFPE por reação tiveram >94% de eficiência de PCR nos estudos de reprodutibilidade.
Resultados
[203] A análise de sobrevida livre de progressão de subgrupos de comprimento do telômero obtidos por qPCR retrospectiva indicou que pacientes com telômeros curtos que foram tratados com Imetelstat eram significantemente mais responsivos comparados com controles do que pacientes com telômeros médios-longos (Figuras 11A e 11B).
[204] 18 das 52 amostras (35%) tiveram telômeros curtos (Figura 11A). Para esses, a análise da sobrevida livre de progressão indicou o seguinte: eventos/N foram 13/18 (Figura 11 A); a mediana do controle (CI de 95%) foi de 2,57 (1,18, NA), e a mediana de Imetelstat (CI de 95%) foi de 1,91 (1,22, NA) (Figura 11A); o log rank do valor P foi de 0,325, e a razão de riscos (CI de 95%) foi de 0,55 (0,17, 1,84) (Figura 11 A).
[205] 34 das 52 amostras (65%) tiveram telômeros médios-longos (Figura 11B). Para esses, a análise da sobrevida livre de progressão indicou o seguinte: eventos/N foram 26/34 (Figura 11B); a mediana do controle (CI de 95%) foi de 2,66 (0,92, NA), e a mediana de Imetelstat (CI de 95%) foi de 3,03 (1,58, 4,47) (Figura 11B); o log rank do valor P foi de 0,309, e a razão de riscos (CI de 95%) foi de 0,65 (0,27, 1,56) (Figura 11B).
[206] Os exemplos, que visam ser simplesmente exemplares da invenção e não devem, portanto, ser considerados como limitantes da invenção de forma alguma, também descrevem e detalham aspectos e modalidades da invenção discutidos acima. Os exemplos e a descrição detalhada, apresentados anteriormente, são oferecidos apenas como ilustração, e não como forma de limitação. Todas as publicações, pedidos de patentes e patentes citados nesse relatório descritivo são aqui incorporados por referência como se cada publicação, pedido de patente ou patente individual fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado por referência. Em particular, todas as publicações aqui citadas são expressamente aqui incorporadas por referência com a finalidade de descrever e revelar composições e metodologias que podem ser usadas em conexão com a invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em algum detalhe apenas como ilustração e exemplo para fins de clareza de compreensão, será facilmente evidente para aqueles habilitados na técnica à luz dos ensinamentos dessa invenção que certas alterações e modificações podem ser feitas a ela sem se afastar do espírito ou escopo das reivindicações em anexo.

Claims (7)

1. Método in vitro de seleção de um indivíduo diagnosticado ou suspeito de ter câncer para o tratamento com um inibidor da telomerase, o método caracterizado por compreender: a. determinação do comprimento relativo do telômero por análise do comprimento relativo de ácidos nucléicos teloméricos em células de câncer presentes em uma amostra biológica do indivíduo, em que o comprimento relativo dos telômeros é determinado por: PCR quantitativa (qPCR); hibridização in situ fluorescente de telômero (telo-FISH) ou Southern blot; e b. selecionar o indivíduo para o tratamento com um inibidor da telomerase quando o comprimento relativo médio do telômero nas células de câncer presentes em uma amostra biológica do indivíduo é determinado como estando no 50° percentil ou menos de uma faixa de comprimentos relativos de telômero, determinada a partir de padrões conhecidos, em que o câncer é câncer de pulmão de células não pequenas, e em que o inibidor da telomerase é Imetelstat, em que: os padrões conhecidos são um intervalo de comprimento de telômero estabelecido a partir de uma pluralidade de tumores de ocorrência natural de uma pluralidade de indivíduos em que as células cancerosas da pluralidade de tumores de ocorrência natural são do mesmo tipo que as células cancerosas presentes na amostra biológica do indivíduo com diagnóstico de câncer; ou os padrões conhecidos são linhagens de células caracterizadas representativas do tipo de células de câncer presentes na amostra biológica.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o inibidor da telomerase é administrado com um excipiente farmaceuticamente aceitável.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o inibidor de telomerase é administrado ao indivíduo com um ou mais agentes terapêuticos anticâncer adicionais.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a linhagem de células caracterizadas são células A549.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que as linhagens de células caracterizadas são linhagens de células de câncer de pulmão de célula não pequena.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o comprimento relativo médio do telômero nas células de câncer presentes na amostra biológica é determinado como estando no 40° percentil, 35° percentil, 30° percentil, 25° percentil, 20° percentil, 15° percentil, 10° percentil ou 5° percentil ou menos da faixa de comprimento de telômero relativo determinado a partir dos padrões conhecidos.
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