CN111494365A - Silvestrol在制备用于治疗幽门螺杆菌感染所致上消化道疾病的药物中的应用 - Google Patents

Silvestrol在制备用于治疗幽门螺杆菌感染所致上消化道疾病的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了Silvestrol在制备用于治疗幽门螺杆菌感染所致上消化道疾病的药物中的应用，并用中性粒细胞与幽门螺杆菌建立体外共培养模式，模拟体内胃粘膜幽门螺杆菌感染部位中性粒细胞的凋亡信号通路，通过对比各体外培养实验组中的中性粒细胞的凋亡情况以及凋亡蛋白的表达情况，确定了幽门螺杆菌感染后通过延长中性粒细胞的凋亡周期引起幽门螺杆菌定植处中性粒细胞的持续浸润，验证了Silvestrol对中性粒细胞的凋亡具有精确的靶向作用和有效的激活率，能促进幽门螺杆菌感染部位浸润的中性粒细胞的凋亡进程，适当的清除感染灶中的中性粒细胞，以替代临床现用的抗菌药物治疗方法，降低幽门螺杆菌耐药性的产生。

Description

Silvestrol在制备用于治疗幽门螺杆菌感染所致上消化道疾 病的药物中的应用
技术领域
本发明涉及Silvestrol在制备用于治疗幽门螺杆菌感染所致上消化道疾病的药物中的应用。
背景技术
幽门螺杆菌是慢性活动性胃炎的致病菌，与消化道溃疡，尤其十二指肠溃疡有密切关系。人体胃黏膜感染幽门螺杆菌之后，胃上皮细胞会发生信号转导和细胞骨架重组，释放IL-8等细胞因子和某些化学因子，促使中性粒细胞从血管内移行到胃上皮处进入感染灶并激活中性粒细胞释放反应性代谢物和蛋白溶解酶，通过其一系列的杀菌功能杀伤致病体以维持机体健康。感染幽门螺杆菌后，如果不进行及时的根除治疗，中性粒细胞的杀菌过程将持续发挥作用，宿主体内积累过多的活性氧、颗粒酶等杀菌物质，造成宿主胃粘膜屏障的损伤，引起上消化道的持续炎症反应，加重胃炎、胃溃疡的严重程度。在临床相关性研究中发现，幽门螺杆菌阳性胃炎患者的胃粘膜组织切片中，中性粒细胞浸润程度比阴性胃炎患者明显，但是尚不清楚有关的机制。
临床上现主要采用抗生素和化学合成药物杀灭幽门螺杆菌，但伴随着人类滥用抗生素，例如采用抗生素三联疗法(如抗生素+甲硝唑+铋剂)，致使逐渐出现了幽门螺杆菌耐药株，使得此疗法的应用逐渐受到限制。因此，亟需寻找新的预防与治疗幽门螺杆菌感染的方案。
需要说明的是，上述内容属于发明人的技术认知范畴，并不必然构成现有技术。
发明内容
本发明提供了Silvestrol在用于治疗幽门螺杆菌感染所致上消化道疾病的药物中的应用，在中性粒细胞与幽门螺杆菌共培养体系中Silvestrol起到促进中性粒细胞凋亡的作用，使中性粒细胞的生存时间趋于正常，缓解幽门螺杆菌感染者胃粘膜上中性粒细胞的浸润情况，为幽门螺杆菌感染所致上消化道疾病的治疗提供新的治疗药物。
本发明通过采取以下技术方案实现上述目的：
一方面，本发明提供了Silvestrol在制备用于治疗幽门螺杆菌感染所致上消化道疾病的药物中的应用，Silvestrol的结构式为：
Figure BDA0002473327280000021
进一步的，所述应用为Silvestrol通过调控中性粒细胞的凋亡信号通路促进中性粒细胞凋亡的应用。
进一步的，所述应用为Silvestrol通过激活中性粒细胞凋亡信号通路中凋亡蛋白的活性，以促进中性粒细胞凋亡的应用。
进一步的，所述应用为Silvestrol通过激活中性粒细胞凋亡信号通路中Caspase-3凋亡蛋白的活性促进中性粒细胞凋亡的应用。
进一步的，所述药物以Silvestrol为活性成分，添加一种或多种药学上可接受的载体或辅料制成药学上可接受的剂型。
进一步的，所述上消化道疾病包括胃炎、胃溃疡或十二指肠溃疡。
另一方面，本发明还提供了Silvestrol作为制备用于治疗幽门螺杆菌感染所致上消化道疾病的药物的检测方法，包括如下步骤：
S1、设定中性粒细胞单独培养组、中性粒细胞+幽门螺杆菌共培养组和中性粒细胞+幽门螺杆菌+Silvestrol共培养组共三个体外培养实验组，细胞培养后检测各实验组中的中性粒细胞的凋亡率。
进一步的，所述检测方法还包括如下步骤：
S2、设定中性粒细胞单独培养组、中性粒细胞+幽门螺杆菌共培养组和中性粒细胞+幽门螺杆菌+Silvestrol共培养组共三个体外培养实验组，细胞培养后检测各实验组中的中性粒细胞内相关蛋白的表达水平。
各实验组中的中性粒细胞釆用人抗凝外周血中性粒细胞，幽门螺杆菌采用标准菌株NCTC11637。进一步的，菌种复苏时取幽门螺杆菌标准菌株NCTC11637溶解后接种于含新鲜绵羊血的Karmali培养基中，置于CO2培养箱中，37℃下培养3-5天，挑取菌落制成幽门螺杆菌悬液待接种。
进一步的，中性粒细胞+幽门螺杆菌共培养组的接种方法为：在细胞培养板的培养孔内加入含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基，将中性粒细胞接种于培养孔，培养1-2h后接入挑取的幽门螺杆菌悬液，中性粒细胞与幽门螺杆菌的接种浓度比为1:10；
进一步的，中性粒细胞+幽门螺杆菌+Silvestrol共培养组的接种方法为：在细胞培养板的培养孔内加入含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基，将中性粒细胞接种于培养孔，培养1h后接入挑取的幽门螺杆菌悬液，继续培养1h后加入Silvestrol，中性粒细胞与幽门螺杆菌的接种浓度比为1:10；
各实验组在温度37℃、C02体积分数为5％、饱和湿度的细胞培养箱中培养。
具体的，使用6孔细胞培养板时，中性粒细胞的接种浓度为1.0×10E6个/ml，幽门螺杆菌的接种浓度为1.0×10E7CFU/ml，Silvestrol的加入量为1μL，6孔板的培养体系为2ml/孔。
进一步的，步骤S1中采用AnnexinV-PI双染法检测各实验组中的中性粒细胞的凋亡率，具体方法为：
S1.1、收集培养12h、24h后的各实验组的细胞，分别用预冷的PBS洗涤2次，离心去上清液得到细胞沉淀，向细胞沉淀中添加1×Binding Buffer使细胞重悬，得到细胞悬液；
S1.2、向细胞悬液中分别加入PI、Annexin V，混匀后避光孵育15min；孵育完成后加入1×Binding Buffer使细胞重悬，然后用流式细胞术定量检测各实验组中的中性粒细胞的凋亡率。
进一步的，步骤S2中采用Western Blot方法检测各实验组中的中性粒细胞内凋亡蛋白的表达情况，具体方法为：收集培养12h、24h后的各实验组的细胞，分别加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度；蛋白经SDS-PAGE电泳、转膜、显色后，采用凝胶成像系统拍照成像，照片用Image J软件进行蛋白表达分析和灰度扫描。
进一步的，所述检测方法还包括如下步骤：
S3、数据处理：
釆用Microsoft Excel、GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析，各实验组组间两两比较符合正态分布釆用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义，p<0.01为差异有明显统计学意义。
本发明釆用中性粒细胞与幽门螺杆菌建立体外共培养模式，模拟体内胃粘膜幽门螺杆菌感染部位中性粒细胞的凋亡信号通路，通过对比各实验组中的中性粒细胞的凋亡情况以及凋亡蛋白的表达情况，确定了幽门螺杆菌感染后通过延长中性粒细胞的凋亡周期引起幽门螺杆菌定植处中性粒细胞的持续浸润，并验证了Silvestrol对中性粒细胞的凋亡具有精确的靶向作用和有效的激活率，能促进幽门螺杆菌感染部位浸润的中性粒细胞的凋亡进程，适当的清除感染灶中的中性粒细胞，以替代临床现用的抗菌药物治疗方法，降低幽门螺杆菌耐药性的产生，为幽门螺杆菌感染所致胃、十二指肠疾病的预防与治疗提供新的理论依据和实践指导。
其中，釆用双染检测各实验组中的中性粒细胞的凋亡率，采用Western Blot方法检测各实验组中的中性粒细胞凋亡信号通路中凋亡蛋白的表达情况。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1是本发明实施例中ctrl组和ctrl+H.p组中的中性粒细胞的凋亡率情况图；
图2是本发明实施例中ctrl+H.p组和ctrl+H.p+Silvestrol组中的中性粒细胞的凋亡率情况图；
图3是本发明实施例中ctrl组和ctrl+H.p组中的中性粒细胞凋亡信号通路相关蛋白信号的表达水平图；
图4是本发明实施例中ctrl组、ctrl+H.p组和ctrl+H.p+Silvestrol组中的中性粒细胞凋亡信号通路相关蛋白信号的表达水平图。
具体实施方式
在以下内容中将结合附图对本发明进行进一步的详细描述。但是需要指出的是，以下的具体实施方式仅仅以示例性的方式给出本发明的具体操作实例，但是本发明的保护范围不仅限于此。本发明的保护范围仅仅由权利要求书所限定。本领域技术人员能够显而易见地想到，可以在本发明权利要求书限定的保护范围之内对本发明所述的实施方式进行各种其它的改良和替换，并且仍然能够实现相同的技术效果，达到本发明的最终技术目的。
1材料与方法
1.1、本发明所用试剂为普通市售产品，可由市场购得。其中，细胞培养使用的RPMI1640培养基为HyClone公司产品；Karmali Selective Medium购自OXOID公司，胎牛血清为浙江天杭生物科技股份有限公司产品；AnnexinV-PI细胞凋亡检测试剂盒购自BDBioscience公司，GAPDH、Akt、Bax、Caspase-3、Caspase-8、Bcl-xL的一抗、HRP标记羊抗兔和抗鼠二抗均购自Cell Signal Technology公司，Silvestrol购自MCE公司，幽门螺杆菌采用标准菌株NCTC11637。
1.2、人外周血中性粒细胞采集自健康志愿者(本发明使用了两个不同批次的中性粒细胞，对应的实验结果会存在差异)，细胞取生长良好，细胞存活率(台盼蓝拒染法)＞95％的细胞进行实验。
1.3、方法
设定三个实验组：
中性粒细胞单独培养组，记为ctrl组；
中性粒细胞与幽门螺杆菌共培养组，记为ctrl+H.p组；
中性粒细胞+幽门螺杆菌+Silvestrol共培养组，记为ctrl+H.p+Silvestrol组；
其中，共培养组中的中性粒细胞与幽门螺杆菌的接种浓度比为1:10；
1.3.1、Annexin V-PI双染法检测ctrl组和ctrl+H.p组中的中性粒细胞的凋亡率，具体步骤如下：
取幽门螺杆菌标准菌株NCTC11637，溶解后接种于加入含新鲜绵羊血的Karmali培养基中，置于CO2培养箱中37℃下培养3-5天，挑取菌落制成幽门螺杆菌悬液待接种；
在6孔板的培养孔内加入含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基，将第一批次的中性粒细胞接种于培养孔，培养1-2h后接入挑取的幽门螺杆菌悬液；中性粒细胞的接种浓度为1.0×10E6个/ml，幽门螺杆菌的接种浓度为1.0×10E7CFU/ml；6孔板的培养体系为2ml/孔，各实验组在温度37℃、C02体积分数为5％、饱和湿度的细胞培养箱中培养。
12h、24h后将每个培养孔内的液体分别吸出收集，用预冷的PBS洗涤2次，离心去上清液得细胞沉淀；向得到的每管细胞沉淀中添加100μL的1×Binding Buffer进行细胞的重悬，再分别加入2μL PI、Annexin V，混匀后避光孵育15min；孵育完成后每管加入400μL 1×Binding Buffer重悬，过滤至流式细胞仪上样管，上流式细胞仪检测。
1.3.2、Annexin V-PI双染法检测ctrl+H.p组和ctrl+H.p+Silvestrol组中的中性粒细胞的凋亡率，具体步骤如下：
取幽门螺杆菌标准菌株NCTC11637，溶解后接种于加入含新鲜绵羊血的Karmali培养基中，置于CO2培养箱中37℃下培养3-5天，挑取菌落制成幽门螺杆菌悬液待接种；
在6孔板的培养孔内加入含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基，将第二批次的中性粒细胞接种于培养孔，培养1h后接入挑取的幽门螺杆菌悬液，继续培养1h后加入1μLSilvestrol，中性粒细胞的接种浓度为1.0×10E6个/ml，幽门螺杆菌的接种浓度为1.0×10E7CFU/ml；培养体系为2ml/孔，各实验组在温度37℃、C02体积分数为5％、饱和湿度的细胞培养箱中培养。
24h后将每个培养孔内的液体分别吸出收集，用预冷的PBS洗涤2次，离心去上清液得细胞沉淀；向得到的每管细胞沉淀中添加100μL的1×Binding Buffer进行细胞的重悬，再每管分别加入2μL PI、Annexin V，混匀后避光孵育15min；孵育完成后每管加入400μL 1×Binding Buffer重悬，过滤至流式细胞仪上样管，上流式细胞仪检测。
1.3.3、Western Blot方法检测ctrl组和ctrl+H.p组中的中性粒细胞凋亡信号通路和凋亡蛋白、抗凋亡蛋白的表达，具体检测凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-8、Bax，抗凋亡蛋白Bcl-xL和中性粒细胞“存活信号”Akt的表达情况。
培养12h、24h后，收集ctrl组和ctrl+H.p组的细胞，RIPA裂解液提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度，蛋白经SDS-PAGE电泳、转膜、显色后，采用凝胶成像系统拍照，照片用ImageJ进行蛋白表达分析和灰度扫描。
2结果
釆用Microsoft Excel、GraphPad Prism 5.0软件对检测结果进行统计学分析，组间两两比较符合正态分布釆用LSD-t检验:以p<0.05为差异有统计学意义，p<0.01，为差异有明显统计学意义。
细胞被分成3组：活细胞、凋亡细胞和死亡细胞，活细胞在细胞膜上有微弱的Annexin V染色，凋亡细胞在膜上有一个显著亮度Annexin V染色，死亡细胞在膜上有Annexin染色和核上的PI染色。
其中，PI+Annexin V+表示Annexin V染色阳性、PI染色阳性，为死亡细胞的比率；
PI-Annexin V-表示Annexin V染色阴性、PI染色阴性，为成活细胞的比率；
PI-Annexin V+表示Annexin V染色阳性、PI染色阴性，为早期凋亡细胞的比率。
2.1、ctrl组和ctrl+H.p组中的中性粒细胞的凋亡情况，结果显示如图1。
图1显示，培养12h、24h后，ctrl组的中性粒细胞的染色双阴率明显低于ctrl+H.p组(p<0.05)，而Annexin V染色阳性、PI染色阴性的细胞比率明显高于ctrl+H.p组中的中性粒细胞(p<0.05)。
对比ctrl组和ctrl+H.p组的中性粒细胞凋亡情况可知，随着培养时间的延长，ctrl+H.p组中的中性粒细胞凋亡进程被抑制，中性粒细胞生存周期延长，说明病灶部位中性粒细胞的凋亡周期变长，而新的中性粒细胞又不断从血管进入感染灶，导致感染灶中性粒细胞聚集，细胞浸润增多，进而加剧患者胃粘膜炎症反应，导致上消化道疾病的加剧。
2.2、ctrl+H.p组和ctrl+H.p+Silvestrol组中的中性粒细胞的凋亡率，结果显示如图2。
图2显示，培养24h后，ctrl+H.p组的双阴率(Annexin V染色和PI染色阴性)明显高于ctrl+H.p+Silvestrol组中的双阴性中性粒细胞，而Annexin V染色阳性、PI染色阴性的细胞比率明显低于ctrl+H.p+Silvestrol组。
2.3、ctrl组和ctrl+H.p组中的中性粒细胞凋亡信号通路和凋亡蛋白、抗凋亡蛋白的表达水平，结果显示如图3。
从图3中可以看出，与ctrl组正常中性粒细胞相比，ctrl+H.p组中的中性粒细胞内Bax的表达降低，活化的Caspase-3和Caspase-8表达也降低；而中性粒细胞“存活信号”蛋白Akt表达水平增高，最终使细胞凋亡进程发生障碍，延长了中性粒细胞的生存周期，造成胃黏膜感染部位的持续性炎症浸润。
ctrl组、ctrl+H.p组和ctrl+H.p+Silvestrol组中活化的Caspase-3表达水平，结果显示如图4。
从图4中可以看出，采用Silvestrol后，激活了Caspase-3的表达，活化caspace-3表达增多，中性粒细胞凋亡明显增加，使中性粒细胞存活率降低，与添加幽门螺杆菌共培养的结果相反，印证了Silvestrol在其中的关键作用，验证了Silvestrol可以针对Caspase作为靶点设计药物靶点，促进细胞的凋亡进程，以治疗胃部幽门螺杆菌感染，以解决临床抗菌药物治疗易产生抗药性的缺点。
上述具体实施方式不能作为对本发明保护范围的限制，对于本技术领域的技术人员来说，对本发明实施方式所做出的任何替代改进或变换均落在本发明的保护范围内。
本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。

Claims (10)

1.Silvestrol在制备用于治疗幽门螺杆菌感染所致上消化道疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为Silvestrol通过调控中性粒细胞的凋亡信号通路促进中性粒细胞凋亡的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用为Silvestrol通过激活中性粒细胞凋亡信号通路中凋亡蛋白的活性以促进中性粒细胞凋亡的应用。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用为Silvestrol通过激活中性粒细胞凋亡信号通路中Caspase-3凋亡蛋白的活性促进中性粒细胞凋亡的应用。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物以Silvestrol为活性成分，制成药学上可接受的剂型。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述上消化道疾病包括胃炎、胃溃疡或十二指肠溃疡。
7.Silvestrol作为制备用于治疗幽门螺杆菌感染所致上消化道疾病的药物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、设定中性粒细胞单独培养组、中性粒细胞+幽门螺杆菌共培养组和中性粒细胞+幽门螺杆菌+Silvestrol共培养组共三个体外培养实验组，细胞培养后检测各实验组中的中性粒细胞的凋亡率。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，还包括如下步骤：
S2、设定中性粒细胞单独培养组、中性粒细胞+幽门螺杆菌共培养组和中性粒细胞+幽门螺杆菌+Silvestrol共培养组共三个体外培养实验组，细胞培养后检测各实验组中的中性粒细胞凋亡信号通路中相关蛋白信号表达水平。
9.根据权利要求7或8所述的检测方法，其特征在于，各实验组中的中性粒细胞釆用人抗凝外周血中性粒细胞，幽门螺杆菌采用标准菌株NCTC11637，菌种复苏时取幽门螺杆菌标准菌株NCTC11637溶解后接种于含新鲜绵羊血的Karmali培养基中，置于CO2培养箱中，37℃下培养3-5天，挑取菌落制成幽门螺杆菌悬液待接种。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，中性粒细胞+幽门螺杆菌共培养组的接种方法为：在细胞培养板的培养孔内加入含10％胎牛血清的RPMI1640培养基，将中性粒细胞接种于培养孔，培养1-2h后接入挑取的幽门螺杆菌悬液，中性粒细胞与幽门螺杆菌的接种浓度比为1:10；
中性粒细胞+幽门螺杆菌+Silvestrol共培养组的接种方法为：在细胞培养板的培养孔内加入含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基，将中性粒细胞接种于培养孔，培养1h后接入挑取的幽门螺杆菌悬液，继续培养1h后加入Silvestrol，中性粒细胞与幽门螺杆菌的接种浓度比为1:10；
随后，各实验组在温度37℃、C02体积分数为5％、饱和湿度的细胞培养箱中培养。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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REGINA CENCIC: "《Antitumor Activity and Mechanism of Action of the Cyclopenta[b]benzofuran, Silvestrol》", 《PLOS ONE》 *
STEINHARDT: "《Regulation of translation initiation upon B-cell receptor activation》", 《UMB DIGITAL ARCHIVE》 *

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