CN111471778A - 一种检测帕金森病等疾病病人肠道Akk丰度变化及其基因型分布的方法 - Google Patents

一种检测帕金森病等疾病病人肠道Akk丰度变化及其基因型分布的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111471778A
CN111471778A CN202010075763.8A CN202010075763A CN111471778A CN 111471778 A CN111471778 A CN 111471778A CN 202010075763 A CN202010075763 A CN 202010075763A CN 111471778 A CN111471778 A CN 111471778A
Authority
CN
China
Prior art keywords
akk
dna
parkinson
abundance
disease
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010075763.8A
Other languages
English (en)
Inventor
彭永正
黄东泉
易江丰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Comzea Medical Science & Technology Co ltd
Original Assignee
Guangzhou Comzea Medical Science & Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Comzea Medical Science & Technology Co ltd filed Critical Guangzhou Comzea Medical Science & Technology Co ltd
Priority to CN202010075763.8A priority Critical patent/CN111471778A/zh
Publication of CN111471778A publication Critical patent/CN111471778A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种检测帕金森病(Parkinson’s disease,PD)等疾病病人肠道Akk丰度变化及其基因型分布的方法，包括采集粪便样品；提取粪便DNA；实时荧光定量PCR(RT‑qPCR)检测粪便DNA中AkkⅠ和AkkⅡ，AkkⅢ的相对丰度。优点有：利用RT‑qPCR建立了快速分析肠道内Akk三个亚型分布的方法，能够初步探讨Akk亚型丰度的变化与PD等疾病的相关性，为后续探讨Akk不同亚型的作用机制做铺垫，并可能为日后PD等疾病的预防和治疗提供新的思路。

Description

一种检测帕金森病等疾病病人肠道Akk丰度变化及其基因型 分布的方法
技术领域
本发明涉及一种肠道细菌检测技术领域，尤其涉及肠道细菌丰度、基因型分布的检测技术。
背景技术
帕金森病(PD)是一种α突触核蛋白异常沉积于脑内、外神经系统的退行性疾病。有研究表明肠道菌群失衡会导致α突触核蛋白在肠道神经系统内沉积，且沿脑－肠轴上升迁移至脑内并沉积，最后导致PD发生。故有学者推测PD的早期发病可能在肠道，是由菌群失调所致。因此，探索脑－肠道－微生物轴的相互作用关系，明确肠道菌群改变与PD发病的因果关系及作用机制，将有助于深刻理解PD的发病机制，并可以为PD的预防和治疗提供新思路。
作为疣微菌门中唯一已知的代表菌，嗜黏蛋白阿克曼氏菌(A.muciniphila/Akk)在人类微生物群中含有许多唯一且独特的基因，因此其丰度的改变可能会对整个微生物群的功能特征造成特别影响。自2004年发现以来，在许多动物和人体研究中观察到一致现象，即肠道Akk丰度在多种代谢紊乱的疾病中降低，包括肥胖症，血脂异常和2型糖尿病等。但近年来研究发现PD病人体内Akk的丰度增加。目前PD病人体内Akk丰度增加的原因尚不清楚，是否同一种菌不同菌株存在不同的作用机理也不得而知。最近，上海瑞金医院的研究发现，证实了中国PD病人出现肠道微生态失调，但未发现PD与Akk的关联。关于PD病人的肠道菌群组成的文献有限，制约了菌群数量-微生态脆性-疾病发生间因果关系的深入探讨。另一个局限性是目前使用的基于16S rRNA测序使分类学鉴定至多达到属水平，极少能够区分到菌株水平。
因此亟需建立一种可检测Akk丰度及其基因型分布的的方法，应用于与Akk密切相关的疾病。
发明内容
本发明的目的在于建立一种检测帕金森病等疾病病人肠道Akk丰度变化及其基因型分布的方法，为研究帕金森病等疾病病人肠道嗜黏蛋白阿克曼氏菌的丰度变化及其基因型分布影响提供基础。
为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：
(1)采集粪便样品；
(2)提取粪便DNA；
(3)实时荧光定量PCR检测粪便DNA中AkkⅠ和AkkⅡ，AkkⅢ，分析其相对丰度变化及基因型分布。
进一步地，所述步骤(1)中粪便标本采用一次性粪便采集管收集，待分析样品保存于-80℃冰箱。
进一步地，所述步骤(2)的操作是转移粪便样品至离心管中，立即加入Buffer SSL至样品中，充分打散样品；水浴，涡旋，离心；转移上清液至新离心管中；加入Proteinase K和Buffer AL于上清液中，颠倒混匀，水浴；加入无水乙醇至样品中，颠倒混匀；把HipureDNA Mini Column I装在2ml收集管中；转移混合液至Hipure DNA Mini Column I中，离心，倒弃流出液，加入500μl Buffer GW1或者GW2，重复3次；13000g离心2分钟甩干HipureDNAMini Column I，加入预热的Buffer AE至Hipure DNA Mini Column I的膜中央，室温放置后离心；丢弃Hipure DNA Mini Column I，把获得的DNA保存于-20℃。
进一步地，所述步骤(2)的详细操作是：转移100-200mg粪便样品至2ml离心管中，立即加入1.2ml Buffer SSL至样品中，最高涡旋1分钟充分打散样品；70℃水浴10分钟，涡旋15秒，室温下，≥14000g离心10分钟，转移250μl上清液至新的1.5ml离心管中，加入20μlProteinase K和250μl Buffer AL于上清液中。颠倒混匀10次；70℃水浴10分钟，加入250μl无水乙醇至样品中，颠倒混匀10次；把Hipure DNA Mini Column I装在2ml收集管中；转移混合液至Hipure DNA Mini Column I中；10000g离心30-60秒；倒弃流出液，加入500μlBuffer GW1或者GW2，重复3次；13000g离心2分钟甩干Hipure DNA Mini Column I，加入30-100μl预热至70℃的Buffer AE至Hipure DNA Mini Column I的膜中央，室温放置2分钟，13000g离心1min；丢弃Hipure DNA Mini Column I，把获得的DNA保存于-20℃。
进一步地，所述步骤(3)的操作是：
根据分光光度计确定DNA浓度和纯度；
设计引物进行实时荧光定量PCR反应检测，反应体系是Mix 10μl，上下游引物各0.8μl，DNA2μl，DEPC水6.4μl；
扩增条件是：第一阶段Denature为95℃30s，1个循环；第二阶段PCR为95℃5s，60℃30s，40个循环；第三阶段Melting为95℃5s，60℃1min，1个循环；第四阶段Cooling为40℃30S，1个循环；每份样品重复3次扩增操作。
进一步地，所述PCR扩增需要的引物：内参16srRNA正反向引物、AkkⅠ正反向引物、AkkⅡ正反向引物、AkkⅢ正反向引物，每一对引物各自进行PCR反应。
进一步地，所述内参16srRNA正反向引物序列如下：
内参16srRNA正向引物：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；
内参16srRNA反向引物TTACTCACCCGTNCGCCRCT。
进一步地，所述AkkⅠ正反向引物序列序列如下：
AkkⅠ正向引物：AGCCTGAACGCATTATCCGC；
AkkⅠ反向引物AGGGCAGTTCTTCCAGCGTA；
进一步地，所述AkkⅡ正反向引物如下：
AkkⅡ正向引物：CGTCTGGTTCGGCTCCAAGTG；
AkkⅡ反向引物：TGACCACGTACCATTGCGGAATG；
进一步地，所述AkkⅢ正反向引物序列如下：
AkkⅢ正向引物：GGCAAGCCTTCTGACCTACGC；
AkkⅢ反向引物：ATTCCGACCACGATCAACAGCAG。
本发明的优点有：利用了RT-qPCR建立快速分析肠道内Akk三个亚型分布的方法，能够初步探讨Akk亚型丰度的变化与PD等疾病的相关性，为后续探讨Akk不同亚型的作用机制做铺垫，并可能为日后PD等疾病的预防和治疗提供新的思路。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1是帕金森病病人和健康体检者肠道Akk基因型的分布图；
图2是帕金森病病人肠道AkkⅠ亚型的丰度变化图；
图3是帕金森病病人肠道AkkⅡ亚型的丰度变化图；
图4是帕金森病病人肠道AkkⅢ亚型的丰度变化图；
图5是65岁及其以上帕金森病病人肠道AkkⅠ亚型的丰度变化图；
图6是65岁及其以上帕金森病病人肠道AkkⅡ亚型的丰度变化图；
图7是65岁及其以上帕金森病病人肠道AkkⅢ亚型的丰度变化图；
图8是用3个基因型的引物作为AkkI的引物；
图9是用3个基因型的引物作为AkkII的引物；
图10是用3个基因型的引物作为AkkIII的引物
以上附图计算的是相对定量，相对与较少的AkkⅢ亚型的倍数。
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
发明人前期研究工作中已分离了37株人肠道Akk，将其分为I-III三个基因型，通过PCA和CAZy谱分析发现，AkkⅠ和AkkⅡ，AkkⅢ的基因组有较大的差异。
AkkⅡ和AkkⅢ对碳水化合物的代谢比AkkⅠ更加多样化。前期研究的动物实验初步验证了Akk菌能缓解学习认知损伤，还发现AkkⅠ亚型(GP01株)分解培养基成分产生乙酸、丙酸和异戊酸的能力强于同属AkkⅠ亚型的模式菌株(ATCC BAA835)，而低水平的短链脂肪酸(SCFA)对脑神经元能造成负面影响。
本发明通过分析AkkⅠ和AkkⅡ，AkkⅢ的基因组的特异性序列，合成特异性的引物，使用RT-qPCR法检测帕金森病人和健康体检者粪便DNA，能够快速分析帕金森病人肠道AkkⅠ和AkkⅡ，AkkⅢ丰度变化及其分布。当然，此方法学的建立，同样可应用于与Akk乃至肠道菌群密切相关的疾病。
本发明具体操作如下：
1材料与方法
1.1材料粪便提取试剂盒购自美基生物；RT-qPCR试剂盒(TB GreenTM Premix ExTaqTM II)购自日本TaKaRa公司；AkkⅠ和AkkⅡ，AkkⅢ特异性引物和内参基因引物由赛默飞世尔科技合成。
1.2方法
1.2.1研究对象收集2018年7月至2019年4月在我院就诊的初诊帕金森病病人40例，男22例，女18例，年龄39-81岁，平均(66.95±9.80)；健康体检者40例，男19例，女21例，年龄28-76岁，平均(57.55±11.7)。
初诊帕金森病病人组纳入标准：
(1)根据2015年MDS版的帕金森病诊断标准确诊的18-85岁原发性帕金森病病人；
(2)近3个月内无抗生素或益生菌、益生元使用史。
排除标准：
(1)年龄小于18岁或者大于85岁；
(2)完成脑CT或者脑MRI检查有：原发性震颤；脑血管病、脑炎、精神类药物使用史、中毒、创伤等所致的继发性PD综合征；进行性核上性麻痹、多系统萎缩、路易体痴呆、皮质基底节变性等PD叠加症；
(3)近3个月内抗生素或益生菌、益生元使用史；
(4)消化道疾病如克罗恩病、胃溃疡病史、溃疡性结肠炎；
(5)患有其他严重疾病(例如心衰、肾功能衰竭、呼吸衰竭、严重的血液系统疾病以及严重的肝肾功能损害)；
(6)患有糖尿病、高脂血症、高尿酸血症等代谢紊乱疾病。
健康对照组纳入标准：
(1)18-85岁的南方医科大学珠江医院门诊及健康体检中心的病人；
(2)无神经系统退行性病变；
(3)近3个月内无抗生素或益生菌、益生元使用史；
排除标准：
(1)年龄小于18岁或者大于85岁；
(2)完成脑CT或者脑MRI检查有：原发性震颤；脑血管病、脑炎、精神类药物使用史、中毒、创伤等所致的继发性PD综合征；进行性核上性麻痹、多系统萎缩、路易体痴呆、皮质基底节变性等PD叠加症；
(3)近3个月内抗生素或益生菌、益生元使用史；
(4)消化道疾病如克罗恩病、胃溃疡病史、溃疡性结肠炎；
(5)患有其他严重疾病(例如心衰、肾功能衰竭、呼吸衰竭、严重的血液系统疾病以及严重的肝肾功能损害)；
(6)患有糖尿病、高脂血症、高尿酸血症等代谢紊乱疾病。
标本信息见表1：
表1入选标本信息表
Figure BDA0002378453230000071
Tab.1Selected Specimen Information Form
Figure BDA0002378453230000072
所有研究对象均签订之情同意书。经我院伦理委员会审批同意。
1.2.2样本采集研究对象的粪便标本收集于一次性粪便采集管，待分析的标本保存于-80℃冰箱。
1.2.3粪便DNA的提取转移100-200mg粪便样品至2ml离心管中，立即加入1.2mlBuffer SSL至样品中，最高涡旋1分钟充分打散样品。70℃水浴10分钟。涡旋15秒。室温下，≥14000g离心10分钟。转移250μl上清液至新的1.5ml离心管中。加入20μl Proteinase K和250μl Buffer AL于上清液中。颠倒混匀10次。70℃水浴10分钟。加入250μl无水乙醇至样品中，颠倒混匀10次。把Hipure DNA Mini Column I(Hipure DNA Mini色谱柱I)装在2ml收集管中。转移混合液至Hipure DNA Mini Column I中。10000g离心30-60秒。倒弃流出液，加入500μl Buffer GW1或者GW2，重复3次。13000g离心2分钟甩干Hipure DNA Mini Column I。加入30-100μl预热至70℃的Buffer AE至Hipure DNA Mini Column I的膜中央，室温放置2分钟。13000g离心1min。丢弃Hipure DNA Mini Column I，把DNA保存于-20℃。
1.2.4获得AkkⅠ和AkkⅡ，AkkⅢ特异性序列
AkkⅠ序列分别为：
>BAA-835.39(I型)
Figure BDA0002378453230000081
Figure BDA0002378453230000091
Akk II序列分别为：>GP07.11(II型)
Figure BDA0002378453230000092
AkkⅢ序列为：
>GP22.3(III型)
Figure BDA0002378453230000093
Figure BDA0002378453230000101
1.2.5实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测粪便DNA中AkkⅠ和AkkⅡ，AkkⅢ的相对丰度。
通过NanoDrop ND2000C分光光度计(Thermofisher公司)确定DNA的浓度和纯度。
随后用荧光定量PCR仪Roche480检测粪便DNA中AkkⅠ和AkkⅡ，AkkⅢ的相对丰度。其中，选取
内参16srRNA正向引物：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；
内参16srRNA反向引物：TTACTCACCCGTNCGCCRCT；
且，根据AkkⅠ和AkkⅡ，AkkⅢ序列，设计了如下引物：
AkkⅠ正向引物：AGCCTGAACGCATTATCCGC；
AkkⅠ反向引物：AGGGCAGTTCTTCCAGCGTA；
AkkⅡ正向引物：CGTCTGGTTCGGCTCCAAGTG；
AkkⅡ反向引物：TGACCACGTACCATTGCGGAATG；
AkkⅢ正向引物：GGCAAGCCTTCTGACCTACGC；
AkkⅢ反向引物：ATTCCGACCACGATCAACAGCAG。
每一对引物各自进行PCR反应，PCR反应的体系为：Mix 10μl，上下游引物各0.8μl，DNA2μl，DEPC水6.4μl。PCR扩增的条件为：第一阶段Denature为95℃30s，1个循环。第二阶段PCR为95℃5s，60℃30s，40个循环。第三阶段Melting为95℃5s，60℃1min，1个循环。第四阶段Cooling为40℃30S，1个循环。每组样品重复3次。基因的相对丰度表达量采用2-△△Ct法计算。
1.3统计学方法采用SPSS23.0统计软件进行统计分析，计量数据以(x±s)表示；两组间比较分析使用独立样本t检验；多组间均数比较采用单因素方差分析；得出Akk三个亚型的丰度数据，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1AkkⅠ和AkkⅡ，AkkⅢ特异性序列
获得AkkⅠ和AkkⅡ，AkkⅢ特异性序列。
2.2帕金森病人和健康体检者肠道Akk基因型的分布
利用RT-qPCR分析了帕金森病病人和健康体检者各自的肠道Akk基因型的分布。如图1所示，两组研究对象均为AkkⅠ的丰度最高，AkkⅢ的丰度最低。不同的是，在健康体检者肠道AkkⅠ高于AkkⅡ，但是没有显著性的差异，而帕金森病病人肠道AkkⅠ丰度显著性高于AkkⅡ。
2.3帕金森病病人肠道Akk亚型的丰度变化
分别对比了AkkⅠ和AkkⅡ，AkkⅢ在帕金森病病人和健康体检病人肠道的丰度变化。从图2-3可看出，对比健康体检病人，帕金森病病人肠道AkkⅠ和AkkⅡ丰度下降。从图4发现有特别意义的现象是AkkⅢ在帕金森病病人肠道中略有上升。从总体上来看没有显著性的差异。
2.4 65岁及其以上帕金森病病人肠道Akk亚型的丰度变化
考虑到帕金森病是一种老年神经系统退行性疾病。本发明分析了65岁及其以上帕金森病病人肠道Akk的丰度变化。从图5、7中看到，AkkⅠ和AkkⅢ的丰度变化与整体帕金森病病人差异不大。但在图6中，可以看到65岁及其以上帕金森病病人肠道AkkⅡ显著性的降低。考虑到AkkⅡ和AkkⅢ对碳水化合物的代谢比AkkⅠ更加多样化，是否会神经系统造成影响需要后续的实验来验证。
3讨论
自2004年发现Akk以来，在许多动物和人体研究中观察到一致现象，即肠道Akk丰度在多种代谢紊乱的疾病中降低，包括肥胖症，血脂异常和2型糖尿病[3]。但近年来研究发现PD病人体内Akk的丰度增加。Akk对机体的作用机制仍然在探索中[8-10]，也许和Akk存在各种亚型，而不用的亚型对机体代谢起到不同的作用有关。最新的研究发现，同一种的细菌不同菌株对体内免疫细胞的作用不一定是相同或相似的，而是存在一些刚好“相左”的作用。即虽然它们结构相似，却并不完全起到协同作用，而存在相互制衡。
传统的16SrRNA测序至多在属的水平上的研究，无法分析其亚型甚至具体菌株的丰度变化。发明人前期研究工作中分离了37株人肠道Akk，将其分为Ⅰ-Ⅲ三个基因型。当比较它们的功能谱时，每个亚型系群携带一些独特的蛋白质。通过PCA分析发现，AkkⅠ和AkkⅡ与AkkⅢ的基因组之间有较大的差异，而AkkⅡ和AkkⅢ相对更接近，这与它们的进化关系相关。此外，AkkⅠ的CAZy谱也显示与AkkⅡ和AkkⅢ存在显着差异。AkkⅡ和AkkⅢ基因组携带的CAZy基因组的数目大于AkkⅠ基因组，特别是糖基转移酶家族4(GT4)。通过PCA和CAZy谱分析发现，AkkⅠ和AkkⅡ，AkkⅢ的基因组有较大的差异，AkkⅡ和AkkⅢ对碳水化合物的代谢比AkkⅠ更加多样化。通过检测三个亚型的Akk的特异性序列，合成特异性的引物，利用RT-qPCR的方法，快速分析肠道内三个亚型的Akk的相对丰度，为后续更好地探究Akk与PD的关系做铺垫。
前期研究中发现AkkⅠ中编号为GP01的Akk可减轻高脂饮食引起的代谢紊乱，并抑制小鼠神经退行性病变过程。同样作为神经退行性病变的PD患者，发明人观察到了他们肠道内AkkⅠ的丰度是有下降的趋势，尽管并没有观察到显著性的差异。PD患者肠道AkkⅢ的丰度有上升的趋势也值得探讨，具体AkkⅢ对机体的代谢影响需要后续的实验来佐证。在本发明中还观察到65岁及其以上的帕金森病病人肠道内AkkⅡ出现显著性的下降。老龄化与AkkⅡ的下降是否共同促进了帕金森的发生发展需要我们后续的实验进一步阐明AkkⅡ对机体的代谢影响。
总的来说，本发明利用了RT-qPCR建立了快速分析肠道内Akk三个亚型分布的方法，初步探讨Akk亚型丰度的变化与PD的相关性，为后续探讨Akk不同亚型的作用机制做铺垫，并可能为日后PD等的预防和治疗提供新的思路。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
序列表
<110> 广州康泽医疗科技有限公司
彭永正
<120> 一种检测帕金森病等疾病病人肠道Akk 丰度变化及其基因型分布的方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 411
<212> DNA
<213> 嗜黏蛋白阿克曼氏菌(A.muciniphila/Akk)
<400> 1
atgattgttt ttacggaaga gaagaaattt tccagggaag atgttcaaga attgttcctg 60
tccgttggct ggatttccgg acaatatccg gggcgtctgt tcaaggctct catgaattcg 120
tccactgttg ttacggcttg ggacggtgac cgcctggcag ggctggtgcg ggtgctggac 180
gacagcgaga tggttgccta catgcattat gttctggtgc atcccgctta tcagggcagg 240
gggattgctg gaaaaatggt ggaaatggtt aaggaaaaat acagggacta cctgtatctt 300
gaaatcatgc cggaggagag cagaaacgcc gctttttatg agaagcacgg cttccgggtt 360
atggaagacg gcgtagccat gcagctgtgc aacttttcaa acaggagctg a 411
<210> 2
<211> 486
<212> DNA
<213> 嗜黏蛋白阿克曼氏菌(A.muciniphila/Akk)
<400> 2
atgaaaggga gaaacgccgg taaattggtc tgtttaagga atcatcctga attcctttcc 60
acagcttccg tctggttcgg ctccaagtgg gacgttcccg tagaggccta tgaggaaagc 120
atgaaggaat gcatggaacg gaaaacgggc attccgcaat ggtacgtggt catgaacgga 180
cagggggcaa tcattgcggg tgccggagtg attgaaaacg atttccatga ccggaaggat 240
ttagccccca acttatgcgc gctatttgtg gaaaaaaggc atcgcggcag gggcgtggcc 300
gcgtccatcc tggactttgt gcggaaggat ttggctgcgc tcggatatcc ccgtctctat 360
ctggtgacgg acctggcggg gttttatgaa aaatgcgggt gggaactgct gacaatggcg 420
acgggcggtc atcatgcccg ggaacgcctg tatacggctc ccgccatgga aaccggaccc 480
gtttga 486
<210> 3
<211> 1053
<212> DNA
<213> 嗜黏蛋白阿克曼氏菌(A.muciniphila/Akk)
<400> 3
atgaaacccc ctgcctttat cccgggcatc tcacttatcc gaatcctcct gtgcctgatg 60
atctgccttt tccactggac atggtggtct cccgcgggag gaggcgtggg tgtggactgg 120
ttcattatcc tgtccggttt tttaatgatg tttacgctga agaaggaaaa attcagcgcc 180
tcctccttct atatctccaa atttggccgc ctgtggccgt tattgttcac agccttcctc 240
ttatcggcgc tcctgtccta caaaagccat tttaacttca ataacctggt cagcgtcctc 300
atcgcctcat tcggcggcaa tcaattcgtg taccaataca cgggtgacaa ttaccctcta 360
tggtacatga agattgaaat cctcatggta ctttttttcc ctctggtggc atacgggcgc 420
aaatatcttc tcctgatgct ggcgctgagt tttgcagccg cgctggcctg cattttcttt 480
ctggaaccgg ataagcagct ttacgcctat tttccctatc gcctatggca gttccttgca 540
ggttgttatg cagcacggct ttataaaaag cacgcacgtt tcttttcgtg gagtcctgcc 600
atatttgctt gcggaatagg ttaccttctc tatcaaacat tcatcgggac attcttgatt 660
ggagaagaaa atatatccat gggttttctg ctgccggaca cgctgatagc catcctgacc 720
atttccagtg cgtgttccct ggaaaaattc aacgcgccgc ggttcgtgaa aatcccgccc 780
ggcgtcattc atctggttaa tcgggcaagc cttctgacct acgccatttt tctgatgcac 840
atccccgttc tgaacttcat gcagtatatt tggacgcaat accacgacgg aacatattcc 900
accctcttct ggttcttctc atgcctgctg ttgatcgtgg tcggaatcat cctgcattac 960
ggcattgaac agccatgcag caaatggctc tcttcaagac tgaaacggtc attctacctc 1020
ttccggaact ataaagatat tccccggtat tga 1053
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 5
ttactcaccc gtncgccrct 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<400> 6
agcctgaacg cattatccgc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 7
agggcagttc ttccagcgta 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 8
cgtctggttc ggctccaagt g 21
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 9
tgaccacgta ccattgcgga atg 23
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 10
ggcaagcctt ctgacctacg c 21
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 11
attccgacca cgatcaacag cag 23

Claims (10)

1.一种检测帕金森病等疾病病人肠道Akk丰度变化及其基因型分布的方法，其特征在于：
包括如下步骤：
(1)采集粪便样品；
(2)提取粪便DNA；
(3)实时荧光定量PCR检测粪便DNA中AkkⅠ和AkkⅡ，AkkⅢ，分析其相对丰度变化及基因型分布。
2.根据权利要求1所述的一种检测帕金森病等疾病病人肠道Akk丰度变化及其基因型分布的方法，其特征在于：
所述步骤(1)中粪便标本采用一次性粪便采集管收集，待分析样品保存于-80℃冰箱。
3.根据权利要求1所述的一种检测帕金森病等疾病病人肠道Akk丰度变化及其基因型分布的方法，其特征在于：
所述步骤(2)的操作是转移粪便样品至离心管中，立即加入Buffer SSL至样品中，充分打散样品；水浴，涡旋，离心；转移上清液至新离心管中；加入Proteinase K和Buffer AL于上清液中，颠倒混匀，水浴；加入无水乙醇至样品中，颠倒混匀；把Hipure DNA Mini ColumnI装在2ml收集管中；转移混合液至Hipure DNA Mini Column I中，离心，倒弃流出液，加入500μl Buffer GW1或者GW2，重复3次；13000g离心2分钟甩干Hipure DNA Mini Column I，加入预热的Buffer AE至Hipure DNA Mini Column I的膜中央，室温放置后离心；丢弃Hipure DNA Mini Column I，把获得的DNA保存于-20℃。
4.根据权利要求1或3所述的一种检测帕金森病等疾病病人肠道Akk丰度变化及其基因型分布的方法，其特征在于：
所述步骤(2)的详细操作是：转移100-200mg粪便样品至2ml离心管中，立即加入1.2mlBuffer SSL至样品中，最高涡旋1分钟充分打散样品；70℃水浴10分钟，涡旋15秒，室温下，≥14000g离心10分钟，转移250μl上清液至新的1.5ml离心管中，加入20μl Proteinase K和250μl Buffer AL于上清液中。颠倒混匀10次；70℃水浴10分钟，加入250μl无水乙醇至样品中，颠倒混匀10次；把Hipure DNA Mini Column I装在2ml收集管中；转移混合液至HipureDNA Mini Column I中；10000g离心30-60秒；倒弃流出液，加入500μl Buffer GW1或者GW2，重复3次；13000g离心2分钟甩干Hipure DNA Mini Column I，加入30-100μl预热至70℃的Buffer AE至Hipure DNA Mini Column I的膜中央，室温放置2分钟，13000g离心1min；丢弃Hipure DNAMini Column I，把获得的DNA保存于-20℃。
5.根据权利要求1所述的一种检测帕金森病等疾病病人肠道Akk丰度变化及其基因型分布的方法，其特征在于：
所述步骤(3)的操作是：
根据分光光度计确定DNA浓度和纯度；
设计引物进行实时荧光定量PCR反应检测，反应体系是Mix 10μl，上下游引物各0.8μl，DNA2μl，DEPC水6.4μl；
扩增条件是：第一阶段Denature为95℃30s，1个循环；第二阶段PCR为95℃ 5s，60℃30s，40个循环；第三阶段Melting为95℃ 5s，60℃ 1min，1个循环；第四阶段Cooling为40℃30S，1个循环；每份样品重复3次扩增操作。
6.根据权利要求5所述的一种检测帕金森病等疾病病人肠道Akk丰度变化及其基因型分布的方法，其特征在于：
所述PCR扩增需要的引物：内参16srRNA正反向引物、AkkⅠ正反向引物、AkkⅡ正反向引物、AkkⅢ正反向引物，每一对引物各自进行PCR反应。
7.根据权利要求6所述的一种检测帕金森病等疾病病人肠道Akk丰度变化及其基因型分布的方法，，其特征在于：
所述内参16srRNA正反向引物序列如下：
内参16srRNA正向引物：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；
内参16srRNA反向引物TTACTCACCCGTNCGCCRCT。
8.根据权利要求6所述的一种检测帕金森病等疾病病人肠道Akk丰度变化及其基因型分布的方法，其特征在于：
所述AkkⅠ正反向引物序列序列如下：
AkkⅠ正向引物：AGCCTGAACGCATTATCCGC；
AkkⅠ反向引物AGGGCAGTTCTTCCAGCGTA。
9.根据权利要求6所述的一种检测帕金森病等疾病病人肠道Akk丰度变化及其基因型分布的方法，其特征在于：
所述AkkⅡ正反向引物如下：
AkkⅡ正向引物：CGTCTGGTTCGGCTCCAAGTG；
AkkⅡ反向引物：TGACCACGTACCATTGCGGAATG。
10.根据权利要求6所述的一种检测帕金森病等疾病病人肠道Akk丰度变化及其基因型分布的方法，其特征在于：
所述AkkⅢ正反向引物序列如下：
AkkⅢ正向引物：GGCAAGCCTTCTGACCTACGC；
AkkⅢ反向引物：ATTCCGACCACGATCAACAGCAG。
CN202010075763.8A 2020-01-22 2020-01-22 一种检测帕金森病等疾病病人肠道Akk丰度变化及其基因型分布的方法 Pending CN111471778A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010075763.8A CN111471778A (zh) 2020-01-22 2020-01-22 一种检测帕金森病等疾病病人肠道Akk丰度变化及其基因型分布的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010075763.8A CN111471778A (zh) 2020-01-22 2020-01-22 一种检测帕金森病等疾病病人肠道Akk丰度变化及其基因型分布的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111471778A true CN111471778A (zh) 2020-07-31

Family

ID=71748019

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010075763.8A Pending CN111471778A (zh) 2020-01-22 2020-01-22 一种检测帕金森病等疾病病人肠道Akk丰度变化及其基因型分布的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111471778A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111996267A (zh) * 2020-08-11 2020-11-27 康美华大基因技术有限公司 一种快速检测akk菌的荧光定量pcr引物组、试剂盒及其应用
CN114015761A (zh) * 2021-09-24 2022-02-08 上海交通大学医学院附属瑞金医院 粪便tyrDC基因丰度作为预测左旋多巴疗效生物标志物的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109658980A (zh) * 2018-03-20 2019-04-19 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种粪便基因标志物的筛选及应用
US20190314425A1 (en) * 2016-07-11 2019-10-17 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Akkermansia muciniphila strain having a prophylactic or therapeutic effect on a degenerative brain disease or metabolic disease and use thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190314425A1 (en) * 2016-07-11 2019-10-17 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Akkermansia muciniphila strain having a prophylactic or therapeutic effect on a degenerative brain disease or metabolic disease and use thereof
CN109658980A (zh) * 2018-03-20 2019-04-19 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种粪便基因标志物的筛选及应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AURÉLIA CAPUTO ET AL.: "Whole-genome assembly of Akkermansia muciniphila sequenced directly from human stool", 《BIOLOGY DIRECT 》, pages 5 *
FANG LI ET AL.: "Alteration of the fecal microbiota in North-Eastern Han Chinese population with sporadic Parkinson\'s disease", 《NEUROSCI LETT》, pages 134297 *
LULU DENG ET AL.: "Diverse Effects of Different Akkermansia muciniphila Genotypes on Brown Adipose Tissue Inflammation and Whitening in a High-fat-diet Murine Model", 《RESEARCHSQUARE》, pages 5 *
XIANFENG GUO ET AL.: "Genome sequencing of 39 Akkermansia muciniphila isolates reveals its population structure, genomic and functional diverisity, and global distribution in mammalian gut microbiotas", 《BMC GENOMICS》, vol. 18, no. 1, pages 2 *
ZHUANG GUO ET AL.: "Intestinal Microbiota Distinguish Gout Patients from Healthy Human", 《SCIENTIFIC REPORTS》, vol. 6, pages 8 *
道客巴巴: "粪便基因组DNA快速提取试剂盒", Retrieved from the Internet <URL:https://www.doc88.com/p-6139636263403.html> *
黄东泉 等: "帕金森病患者肠道嗜黏蛋白阿克曼菌各亚型丰度的变化及其临床价值", 《实用医学杂志》, pages 1673 - 1678 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111996267A (zh) * 2020-08-11 2020-11-27 康美华大基因技术有限公司 一种快速检测akk菌的荧光定量pcr引物组、试剂盒及其应用
CN114015761A (zh) * 2021-09-24 2022-02-08 上海交通大学医学院附属瑞金医院 粪便tyrDC基因丰度作为预测左旋多巴疗效生物标志物的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wu et al. An Akkermansia muciniphila subtype alleviates high-fat diet-induced metabolic disorders and inhibits the neurodegenerative process in mice
Zhai et al. Strain-specific anti-inflammatory properties of two Akkermansia muciniphila strains on chronic colitis in mice
Wang et al. Mannan-oligosaccharide modulates the obesity and gut microbiota in high-fat diet-fed mice
Ohigashi et al. Changes of the intestinal microbiota, short chain fatty acids, and fecal pH in patients with colorectal cancer
Cruz-Mora et al. Effects of a symbiotic on gut microbiota in Mexican patients with end-stage renal disease
WO2015147432A1 (ko) 장내 세균의 군집과 기능의 변화를 이용한 대사성 및 염증성 질환의 조기진단
RU2521364C2 (ru) Применение lactobacillus plantarum для повышения бактериального разнообразия
KR102141246B1 (ko) qPCR 분석을 통한 대장암 진단방법
WO2016167365A1 (ja) 精神疾患バイオマーカー
CN111471778A (zh) 一种检测帕金森病等疾病病人肠道Akk丰度变化及其基因型分布的方法
Yang et al. Duodenal and rectal mucosal microbiota related to small intestinal bacterial overgrowth in diarrhea‐predominant irritable bowel syndrome
Ni et al. Characteristics of gut microbiota and its response to a Chinese Herbal Formula in elder patients with metabolic syndrome
WO2019149247A1 (zh) 用于2型糖尿病的生物标志物及其用途
Moubayed et al. Screening and identification of gut anaerobes (Bacteroidetes) from human diabetic stool samples with and without retinopathy in comparison to control subjects
CN110541026A (zh) 一种检测溃疡性结肠炎的生物标志物及应用
CN112029844B (zh) 肠道微生物在诊断肌张力障碍症中的应用
Yokoyama et al. Exploratory research on the relationship between human gut microbiota and portal hypertension
Zhang et al. Study on the Intervention Effect of Qi Gong Wan Prescription on Patients with Phlegm‐Dampness Syndrome of Polycystic Ovary Syndrome Based on Intestinal Flora
WO2016049827A1 (en) Use of bacteroides in prevention and treatment for coronary artery disease
CN111246870B (zh) 用于治疗生态失调的葡萄皮
JP2021510309A (ja) モルガネラ属細菌由来ナノ小胞およびその用途
Lu et al. Oral-gut microbiome analysis in patients with metabolic-associated fatty liver disease having different tongue image feature
JP2022187990A (ja) 新規抗肥満・抗糖尿病プロバイオティクス
MOHAMED et al. Relation of Lactobacilli acidophilus to obesity in egyptian population
Xu et al. Alteration of the faecal microbiota composition in patients with constipation: evidence of American Gut Project

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination