CN111458334B - 一种昆虫浅色触角内淋巴管可视化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种昆虫浅色触角内淋巴管可视化的方法，属于实验样品处理技术领域。本发明通过触角整体分离、组织固定、酒精脱水、姿态固定与显影、常规显微镜拍照几个步骤，即可快速实现触角内淋巴管的可视化。该发明解决了完整触角内淋巴管可视化的难题，第一次在不使用示踪剂、不切片的条件下，使用常规显微镜技术直接观察到了完整触角内微小淋巴管的分布与路径走向。这将对昆虫触角循环系统生理学和解剖学研究带来深远的影响；该方法成本低廉、方法可靠、操作简便易行、快速获取数据、重复性好。

Description

一种昆虫浅色触角内淋巴管可视化的方法

技术领域

本发明涉及一种昆虫触角的样品处理方法，尤其涉及一种昆虫浅色触角内淋巴管可视化的方法，属于实验样品处理技术领域范畴。

背景技术

触角对于昆虫的生存和繁衍至关重要。昆虫主要是通过触角感受气味、风、温湿度等外界环境变化的。借助于触角，昆虫才能够进行寻找食物或配偶，躲避天敌，种内通讯及寻找合适的产卵地等一系列的生命活动。根据形态差异，昆虫的触角可以分为刚毛状、具芒状、丝状、棍棒状等类型。触角分为柄节、梗节和鞭节三节，其表面覆盖着一层几丁质化的外骨骼，有着保护内部柔软结构和减少水分蒸发等功能，不同种类昆虫的触角呈现不同颜色，如蜜蜂科的黑色触角，实蝇科的浅色触角，果蝇科的浅色触角。

触角是一个多模态感觉器官。在触角表面上分布着嗅觉、风觉、声觉、温度觉、湿度觉等不同模态的感受器，比如双翅目昆虫的触角上主要分布着毛形感器、锥形感器、棒形感器、腔锥形感器、触角芒、感觉窝等感器，更进一步的功能研究显示，昆虫毛形感器、锥形感器和棒槌形感器，表面分布“密孔”，其功能是探测气味。气味分子经孔道进入，与神经细胞膜上气味受体结合后转化为电生理信号，沿神经纤维传导到脑。腔锥形感器可能是感受化学或是温湿度；触角芒可以感受温度；触角芒和鞭节可能通过其位移将机械信号传导至梗节内部，由梗节内部的江氏器神经细胞感受风、重力和声音等；鞭节上感觉窝很可能是感受湿度。可见，昆虫为了生存和繁衍，是通过触角感知变化环境。然而，这些触角功能的发挥依赖于触角内的淋巴循环系统。触角内的淋巴循环系统负责将营养物，激素，代谢废物和其他分子运进来和排出去，确保触角体腔内各类细胞的活性和功能保持正常。因此研究触角的淋巴管至关重要。

开展昆虫成虫触角循环器官解剖学研究，例如双翅目果蝇科黑腹果蝇、双翅目蚊子、鞘翅目甲虫等，现有技术中一般直接使用切片法，并结合使用昂贵的电子显微镜进行拍照后观察触角横切片和纵切片上淋巴管。该方法获得的触角淋巴管的信息是碎片化、准确度较低，不能精确获得触角内淋巴管真实的数量、空间分布和完整结构等直观信息。近些年来，人们试图模仿神经示踪的策略，开始摸索使用荧光等多种标记方法对淋巴循环系统进行标记与可视化研究，即采用淋巴管示踪剂的标记、组织显色、组织固定、透明、整体固定或切片压片、特殊显微镜拍照等步骤，希望将触角内淋巴管可视化。但是，昆虫成虫的触角被一层几丁质化的外骨骼包裹，不仅严重影响显色效率和过程，而且即使淋巴管被标记出来，不透光的角质层也导致无法进行荧光等光学观察。并且，荧光易受到甲醛固定等步骤的干扰，易淬灭；此外，需要使用特殊的显微镜(例如荧光显微镜或其他更高级别的显微镜)。国际上至今昆虫触角淋巴循环系统可视化技术未能获得成功，尚不能在昆虫成虫完整触角内进行淋巴管通路原位解析，包括淋巴管的数量、空间分布等精细信息。因此，解析完整触角内部淋巴管结构图像信息是国际科学界一直在努力追求的目标。

发明内容

针对以上技术问题，本发明拟提供一种昆虫浅色触角内淋巴管可视化的方法。

其技术方案如下：

一种昆虫浅色触角内淋巴管可视化的方法，包括以下步骤：

步骤1)活体触角的分离：先将50ml Ringer液倒入100ml烧杯中，在Ringer液中持续充入气体N；在一个凹孔型载玻片上滴上几滴Ringer液，随后在体式显微镜下，在载玻片上的Ringer液中用眼科剪在昆虫触角根部小心剪下触角，然后使用Ringer液清洗3遍离体触角；

步骤2)组织固定：用尖头镊子轻轻地将触角转移到一个干净的PCR管中，滴上2-4滴浓度5％的甲醛溶液，固定10分钟后除去该甲醛溶液；然后再滴上2-4滴浓度10％的甲醛溶液，再固定10分钟；最后用干燥的滤纸条吸除多余的甲醛溶液；

步骤3)组织脱水：用尖头镊子轻轻地将组织固定后的昆虫触角转移到另一个干净的PCR管中，依次用70％、80％、90％、100％浓度的酒精进行四次脱水，每次脱水时间为5分钟；

步骤4)姿态固定与显影：小心快速地使用细镊将步骤3)处理过的昆虫触角以水平姿态固定在载玻片上的小井装置中，并进行姿态微细调整和固定，然后滴入液体M；同时在体式显微镜下保持时刻观察，1-2分钟内，触角内淋巴管在显微镜视野下逐渐显色；

步骤5)整体拍照：立即置于不同倍率的常规光学显微镜下，观察并采集完成完整触角内淋巴管的图像信息。

进一步为，本发明步骤1)中，所述的烧杯埋于冰中，以保持Ringer液冰冷。

进一步为，本发明步骤1)中，所述的气体N为体积95％氧气和5％二氧化碳构成的混合气体。

进一步为，本发明步骤2)中，所述的浓度5％的甲醛溶液和浓度10％的甲醛溶液均替换为浓度4％的多聚甲醛溶液。

进一步为，本发明步骤4)中所述的液体M为水杨酸甲酯或甲苯或二甲苯或氯仿或香柏油或histo-clear II其中的任意一种。

进一步为，本发明步骤4)中所述的液体M的折射率控制在1.5±0.1之间。水杨酸甲酯替换为甲苯、二甲苯、氯仿、香柏油。

进一步为，本发明所述的步骤4)水杨酸甲酯的浓度为100％。

进一步为，本发明所述的步骤5)拍照时间控制在3-5分钟内完成。

本发明所述的操作与观察须精细，1-2分钟内目视显微镜内影像变化，要在自加入水杨酸甲脂起5分钟内完成固定和拍照，否则，淋巴管内酒精将被置换，从而导致淋巴管显影消失。

工作原理：

本发明中，显微解剖过程中分离出完整触角，确保触角淋巴系统的完整。分别用5％和10％的甲醛溶液对触角进行组织固定。再用70％、80％、90％和100％的梯度酒精进行脱水。水杨酸甲酯是一种无色透明的液体，具有较高的折射率(1.5369，20℃)，通常被用作软、薄组织的透明剂，能够一定程度上透明昆虫浅色触角浅色的角质层和内部组织。触角浸没在水杨酸甲酯后，由于触角腔尺寸远远大于淋巴管尺寸，导致水杨酸甲酯首先浸入触角腔内除淋巴管以外的组织，使这些组织透明，而淋巴管内(酒精，折射率1.2，20℃)暂时没有被水杨酸甲酯置换，进而导致触角内呈现两种介质，即触角腔内淋巴管的光疏介质和其他透明组织的光密介质，光线进入触角后在淋巴管壁处发生全反射，不能穿透淋巴管，而淋巴管以外的组织和触角浅色的角质层外骨骼具有良好的透光性，因此在透射光下观察时淋巴管呈黑色。本发明中时刻观察水杨酸甲酯的置换过程中淋巴管影像的变化，并随时终止置换非常重要，决定了视野下淋巴管可视化的时间长短与精细度。时间过长将导致淋巴管内酒精被置换，从而导致淋巴管影像消失。本发明中显微解剖时应用剪刀切移，应避免直接扯下触角等拉扯操作，避免组织移位，因此通过以上环节最终实现浅色昆虫触角内的淋巴管原位可视化。

本发明与现有技术相比，本发明的方法较现有技术的有益效果：

1)本发明突破了现有切片技术的局限，首次实现了完整触角内淋巴管原位可视化，国际上首次获得了完整触角内淋巴管数量、空间分布和行进路线等精细信息，这一问题的解决将对昆虫触角循环系统解剖学和功能研究带来深远的影响。

2)本发明开创了新的科学思路，在不使用示踪剂、不进行切片处理，仅使用普通的生物级显微镜的条件下，在成虫触角上首次实现了完整触角内淋巴管的可视化。这项技术的突破有可能带来新的技术变革方向。

3)本发明大大缩短了实验时间，能够快速获取淋巴管数据。

4)本发明成本低廉、方法可靠、操作简便易行，重复性好。

附图说明

图1为本发明的技术路线图；

图2为本发明获得的番石榴实蝇触角内淋巴管可视化图，箭头表示淋巴管。

具体实施方式

实施例1

一种番石榴实蝇触角内淋巴管可视化的方法

番石榴实蝇的触角呈具芒状，分为柄节、梗节和鞭节，全长约860μm，最宽约170μm，最窄约100μm，各节形状和尺寸不同，整体上是一个尺寸较小，呈不规则的几何形状，且集合了嗅觉、听觉、温湿度感觉和重力感觉等多种功能的感觉器官。

1)活体触角的分离：先将50ml Ringer液倒入100ml烧杯中，并将烧杯埋于冰中，冰冷的Ringer液中持续充入95％氧气和5％二氧化碳的混合气体；在一个凹孔型载玻片上滴上几滴冰冷Ringer液，随后在体式显微镜下，并在载玻片上的Ringer液中用眼科剪在触角根部小心剪下触角，然后，使用Ringer液清洗3遍离体触角；

2)组织固定：用尖头镊子轻轻地将其转移到一个干净的PCR管中，依次滴上2-4滴5％和10％的甲醛溶液，各固定10分钟，最后用干燥的滤纸条吸除多余的甲醛溶液；

3)组织脱水：用尖头镊子轻轻地将固定后的昆虫触角转移到另一个干净的PCR管中，依次用70％、80％、90％、100％的酒精进行脱水，各脱水5分钟；

4)姿态固定与显影：小心快速地使用细镊将上述处理的昆虫触角以水平姿态固着载玻片上的小井沙粒装置中，并进行姿态的微调，然后滴入水杨酸甲酯；同时在体式显微镜(×40)下保持时刻观察，1-2分钟内，淋巴管在显微镜视野下逐渐呈现(黑色)；

5)显微镜拍照：立即置于不同倍率的普通光学显微镜下，5分钟之内采集完触角内循环系统淋巴管的图像信息。

所述的步骤2)中5％和10％甲醛溶液可替换为4％多聚甲醛。

所述的步骤4)中水杨酸甲酯的浓度为100％，其可替换为甲苯、氯仿、香柏油。

所述的姿态固定用的小井装置详细信息见专利号为CN201910625649.5的“一种活体昆虫形状不规则触角定向固定装置及其制作方法”。

本发明所述的操作与观察须精细，1-2分钟内目视显微镜内影像变化，要在自加入水杨酸甲脂起5分钟内完成固定和拍照，否则，淋巴管内酒精将被置换，从而导致淋巴管显色消失。

本发明利用水杨酸甲酯或甲苯等透明剂进入触角内不同空间组织的时间差，造成触角内非均质介质，使得光线在触角内传播时发生全反射，因此将淋巴管显影出来。本发明中，显微解剖过程中分离触角切口平整，这是触角淋巴管可视化的关键步骤之一，确保触角淋巴系统的完整。分别用5％和10％的甲醛溶液对触角进行组织固定。再用70％、80％、90％和100％的梯度酒精进行脱水；水杨酸甲酯是一种无色透明的液体，具有较高的折射率，既是触角内腔中的组织透明剂，还被我们发现它还能够一定程度透明触角浅色的角质层外骨骼。触角浸没在水杨酸甲酯后，由于触角腔尺寸远远大于淋巴管尺寸，导致水杨酸甲酯首先浸入触角腔内除淋巴管以外的组织，使这些组织开始透明，而淋巴管内暂时没有浸入水杨酸甲酯，进而导致触角内呈现两种介质，即淋巴管的光疏介质和其以外透明组织的光密介质，光线进入触角后在淋巴管壁处发生全反射，不能穿透淋巴管，而淋巴管以外的组织和触角浅色的角质层外骨骼具有良好的透光性，因此在透射光下观察时淋巴管呈黑色。从而实现了浅色昆虫触角内的淋巴管原位可视化。

以上所述的仅是本发明的部分具体实施例(由于本发明的技术方案涉及数值范围，故实施例不能穷举，本发明所记载的保护范围以本发明的数值范围和其他技术要点范围为准)，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (5)

1.一种昆虫浅色触角内淋巴管可视化的方法，包括以下步骤：

步骤1)活体触角的分离：先将50ml Ringer液倒入100ml烧杯中，在Ringer液中持续充入气体；在一个凹孔型载玻片上滴上几滴Ringer液，随后在体式显微镜下，在载玻片上的Ringer液中用眼科剪在昆虫触角根部剪下触角，然后使用Ringer液清洗3遍离体触角；

步骤2)组织固定：用尖头镊子轻轻地将触角转移到一个干净的PCR管中，滴上2-4滴浓度5％的甲醛溶液，固定10分钟后除去该甲醛溶液；然后再滴上2-4滴浓度10％的甲醛溶液，再固定10分钟；最后用干燥的滤纸条吸除多余的甲醛溶液；

步骤3)组织脱水：用尖头镊子将组织固定后的昆虫触角转移到另一个干净的PCR管中，依次用70％、80％、90％、100％浓度的酒精进行四次脱水，每次脱水时间为5分钟；

步骤4)姿态固定与显影：使用细镊将步骤3)处理过的昆虫触角以水平姿态固定在载玻片上的小井装置中，并进行姿态微细调整和固定，然后滴入液体M；同时在体式显微镜下保持时刻观察，1-2分钟内，触角内淋巴管在显微镜视野下逐渐显色；

步骤5)整体拍照：立即置于不同倍率的常规光学显微镜下，观察并采集完成完整触角内淋巴管的图像信息；

步骤4)中所述的液体M的折射率控制在1.5±0.1之间，所述的液体M为水杨酸甲酯、甲苯、二甲苯、氯仿、香柏油中的任意一种；

该方法能够在不使用示踪剂、不进行切片处理，仅使用普通的生物级显微镜的条件下，在成虫触角上实现完整触角内淋巴管的原位可视化。

2.根据权利要求1所述的昆虫浅色触角内淋巴管可视化的方法，其特征在于：步骤1)中，所述的烧杯埋于冰中，以保持Ringer液冰冷。

3.根据权利要求1所述的昆虫浅色触角内淋巴管可视化的方法，其特征在于：步骤1)中，所述的气体为体积95％氧气和5％二氧化碳构成的混合气体。

4.根据权利要求1所述的昆虫浅色触角内淋巴管可视化的方法，其特征在于：将步骤2)中浓度5％的甲醛溶液和浓度10％的甲醛溶液均替换为浓度4％的多聚甲醛溶液。

5.根据权利要求1所述的昆虫浅色触角内淋巴管可视化的方法，其特征在于：所述的步骤5)拍照时间控制在3-5分钟内完成。

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