CN107624164A - 采用光学陷阱的光片层成像显微镜 - Google Patents
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Abstract
一种包括捕获光学器件和光片层成像光学器件的光学系统，捕获光学器件用于使用反向传播光束形成光学陷阱，光片层成像光学器件用于对位于光学陷阱中的颗粒，例如，细胞，进行光片层成像，其中反向传播光束的波长和用于光片层成像的光的波长是非干涉的。
Description
技术领域
本发明涉及样品(例如生物样品)的光学操作和成像。具体而言，本发明涉及光学陷阱中的光片层成像。
背景技术
光片层荧光显微镜或选择性平面照明显微镜使用薄片层光照射样品，而荧光图像是垂直于照射平面拍摄的。这种几何形状使光片层荧光显微镜比其他类型的显微镜具有多重优势：首先，样品的未照射部分保持未暴露于光下，不能被检测到。这增强了轴向分辨率和图像对比度，并且也降低了样品暴露的光漂白和光毒性。其次，光片层荧光显微镜的轴向分辨率主要取决于光片层的厚度，而不依赖于检测光学器件。因此，低倍率物镜可用于大视场，同时仍能获得良好的轴向分辨率。第三，由于整个平面同时被照明和成像，成像速度比扫描共聚焦显微镜更快。这些优点使光片层荧光显微镜适用于构建大样品的3D图像，甚至可以长期监测活体样品。这种模式可以通过使用更先进的光束形状来扩展，例如贝塞尔光束或艾里光束。
用于在光片层荧光显微镜中记录3D堆叠样品的现有方法包括：使样品沿着检测轴线机械地移动，或沿着检测轴线以彼此固定的距离移动光片层和检测物镜。在这两种方法中，通常使用凝胶来保持样品，同时沿着检测轴线机械地扫描样品。所得到的凝胶和水之间的界面由于两种介质之间的折射率不匹配而引起光学像差，从而降低了图像质量。此外，使用这种限制模式的长期监测可能会限制生物样品的发育。此外，对于移动的样品，如海洋游泳微生物，样本必须被麻醉或用足够的力量进行物理限制，以克服跳动的纤毛以阻止样品的运动。特别是如果需要长时间的话，麻醉剂和/或体力的使用可能会损害生物体的发育和正常功能。
发明内容
根据本发明，提供了一种包括捕获光学器件和光片层成像光学器件的光学系统，捕获光学器件用于使用反向传播的光束形成光学陷阱，光片层成像光学器件用于使定位在光学陷阱中的颗粒(例如细胞)光片层成像。优选地，光学陷阱能够保持或定位样品，例如细胞，使得样品不失真，即，样品以其自然未失真状态保持在陷阱内。
使用反向传播的光束陷阱(有时称为双光束光镊)提供了微生物的无接触和无污染的处理，使它们能够被捕获，并且用于一些在空间中平移和/或转动的应用(通过适度的光束位移)。
因为光学俘获以用于光片层荧光显微镜的独立的激光波长工作，所以光学俘获不影响成像质量。另外，没有会降低图像质量的媒体接口。
反向传播光束可以使用来自单个源的光形成。例如，可以使用来自由镜子反射的单个源的光形成反向传播光束。
反向传播光束可以由两个不同的源提供。
反向传播光束可以诸如允许陷阱内的颗粒的运动，例如转动运动。
反向传播光束可以具有不同的强度，从而引起陷阱内的颗粒的运动，例如转动运动。
反向传播光束可以具有不同的偏振，从而引起陷阱内的颗粒的运动，例如转动运动。
反向传播光束可以偏移或未对准，从而引起陷阱内的颗粒的运动，例如转动运动。
反向传播光束可以被布置成在微流体装置中形成光学陷阱。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于对样品进行成像的方法，其包括在反向传播光束光学陷阱中俘获样品；以及使用光片层成像光学器件来对位于光学陷阱中的样品(例如细胞)进行光片层成像。优选地，光学陷阱能够保持或定位样品，例如细胞，使得样品不失真，即，样品以其自然未失真状态保持在陷阱内。
使用反向传播的光束陷阱(有时称为双光束光镊)提供了微生物的无接触和无污染的处理，使它们能够被捕获，并且用于一些在空间中平移和/或转动的应用(通过适度的光束位移)。
因为光学俘获以用于光片层荧光显微镜的独立的激光波长工作，所以光学俘获不影响成像质量。另外，没有会降低图像质量的媒体接口。
反向传播光束可以使用来自单个源的光形成。例如，可以使用来自由镜子反射的单个源的光形成反向传播光束。
反向传播光束可以由两个不同的源提供。
反向传播光束可以诸如允许陷阱内的颗粒的运动，例如转动运动。
反向传播光束可以具有不同的强度，从而引起陷阱内的颗粒的运动，例如转动运动。
反向传播光束可以具有不同的偏振，从而引起陷阱内的颗粒的运动，例如转动运动。
反向传播光束可以偏移或未对准，从而引起陷阱内的颗粒的运动，例如转动运动。
反向传播光束可以被布置成在微流体装置中形成光学陷阱。
附图说明
将参照附图描述本发明的各个方面，其中：
图1是具有一体的光学陷阱系统的光片层成像系统的示意图；
图2是反向传播光束光学陷阱中的颗粒的示意图；
图3显示了使用图1的系统捕获和成像的一对BY-2细胞的例子，和
图4(a)显示了光学捕获的拉氏链球菌幼虫的明场图像；和
图4(b-d)显示了利用来自幼虫的自体荧光信号获得的光学捕获的拉氏链球菌(lamarcki)幼虫的光片层图像的实例。
具体实施方式
本发明使用反向传播光束来形成光学陷阱和光片层成像光学器件，用于对光学陷阱中的颗粒进行光片层成像。用于形成反向传播激光束陷阱的技术在本领域中是公知的。这种类型的光学陷阱使用两个轻微聚焦的反向传播激光束来限制光束焦点之间的较大的目标物体。沿着光束传播方向的光学散射力可以被平衡以用于在该方向上的限制，其中梯度力允许在另外两个横向方向上的抑制。这两个焦点可以用空间光调制器或通过简单地组合具有不同发散度的两个光束来形成。前一种方法受益于稳健而简单的装置，但受到空间光调制器的高成本的限制。两个光纤，每一个都具有低至0.1的数值孔径，可以用来提供足够的俘获力。这种反向传播的激光束构造也可以通过沿着单个光束的传播轴线产生两个焦点并用反射镜反射该光束以产生反向传播构造来实现。通过这种布置，具有从50μm到200μm的大小范围的微生物已被成功捕获。
使用光学捕获提供了一种无接触的方式，以将样品保持在其本地介质或环境中，并移动或转动样品而不引入光学像差。这样做的另一个好处是它需要较低的功率密度，从而减少潜在的光损伤。
图1示出了用于对样品进行光学俘获和光片层成像的系统。这具有两个主要部分：用于捕获和保持要被成像的颗粒的光学装置，以及用于在处于光学陷阱中时对颗粒进行光片层成像的光学装置。光片层成像光学装置基于开放式存取项目openSPIM。图1的右侧显示了成像部分，左侧显示了用于将近红外俘获激光束输送到样品室中的光学器件。用于俘获的光的波长和用于成像的光的波长必须被选择为使得两者之间不存在干涉。此外，陷阱应该使得样品不会被光学力扭曲，而是保持在其自然的，不失真的状态中。
更具体地，图1的系统具有例如488nm波长的激光器L1，用于为荧光片层成像提供照明。激光束被具有25mm和100mm的焦距FL的4X扩束器BE1准直和扩展。可调狭缝AS改变光束的宽度，这允许控制照明的数值孔径，从而控制光片层的厚度。光束通过圆柱形透镜CL聚焦到转向反射镜SM1上，然后使用中继透镜组合RL1传递到形成光片层的照明物镜01的后孔。使用物镜02、镜筒透镜TL和照相机CAM，垂直于照明平面拍摄图像。
通过分色镜SM1将第二光路集成到成像系统中实现了宏观俘获。具有例如工作波长＝1060nm-1100nm的近红外激光器L2被引入光纤F。光束的偏振状态由半波片HW控制。这使得能够控制两个俘获光束之间的激光功率分布。光束被偏振分束器PBS1分成两束。这些光束然后由另一个偏振分束器PBS2组合。中继透镜组合RL2将光束传递到分色镜，然后传递到照明物镜01。
在两个偏振分束器之间的光路中的一个中，激光束被扩展为BE2，使得其可以填充照明物镜的后孔。在另一光路中，光束发散度被透镜LE改变，使得光束在进入照明物镜的后孔中时发散。两个光束通过相同的物镜01，并且聚焦在相同轴线上的间隔约0.8mm的两个点上。在样品室中使用银反射镜来溯源反射光束以实现反向传播的陷阱构造。这如图2所示。焦点之间的距离可以通过沿着照明轴线平移反射镜来调整。在这个例子中，样品被保存在FEP管(乙烯丙烯)中。这具有与水的折射率相似的折射率，因此很大程度上避免了光学像差。该管和银反射镜由放置在手动平移台M上的定制保持器保持。
图1的系统可以用来将陷阱内的样品保持稳定/静止以用于成像。可选地，形成反向传播激光束陷阱的光束的特性可以改变，以使得样品在陷阱内移动。这可能是少量的平移或转动运动。这种移动可以由例如改变俘获光束的偏振引起。可选地或附加地，光束的对准可以改变，例如略微偏移，以便引起在陷阱内的移动。例如，这样做的优点是具有陷阱的样品可以被光学地移动，例如转动，从而可以在不同的位置捕获多个光片层图像。
生物样品，如烟草亮黄2(BY-2)细胞和野生型拉氏链球菌幼虫，被捕获并在图1的系统中成像。BY-2细胞系从詹姆斯·哈顿研究所(The James Hutton Institute(JHI))得到，经过基因修饰以稳定表达GFP(绿色荧光蛋白)。图3显示了一对被捕获的BY-2细胞的例子。被捕获的烟草细胞沿着检测轴线平移以形成3D光片层荧光显微镜图像。通过使用致动器(CMA-12CCCL，Newport)自动扫描转向反射镜来执行细胞的平移。以8fps的速度和0.5μm的增量采集四百帧以完成完整的3D堆叠。拉氏链球菌成虫从圣安德鲁斯(East Andrews)的东沙岩(East Sands rocks)采集，并在环境海水温度下保存在苏格兰海洋研究所的Gatty海洋实验室的循环海水水族系统中。通过用强力镊子折断管的后部以从其钙质居住管去除成虫，然后用施加到前端的钝探针，将成虫从其余管的后端推出，从而获得幼虫。将单独的虫子放入多孔盘中的0.1μm的小容量(500μL至750μL)的过滤的海水中，并允许产生其配子。将来自多个雌性的卵子收获到过滤海水的培养皿中，分别收集精液，将来自至少两个雄性的精液混合并在显微镜下检查其运动性。向卵子的培养皿中加入一滴或两滴精液，并在室温下(小于22℃)使受精进行15分钟。然后将卵子倒入40微米的细胞过滤器中，并通过多次改变的新鲜过滤的海水以去除多余的精液。然后在成像之前使幼虫在过滤的海水中在大约17℃下发育18小时。
活的旋鳃虫(以前的马旋鳃虫)拉氏链球菌幼虫被捕获并且当它们在陷阱里游泳/移动时拍摄了组合式自动荧光图象。拉氏链球菌幼虫是强壮的游泳者，以通常符合螺丝锥图案的轨迹移动。在发育的这个早期阶段观察到典型的游泳速度在1毫米/秒以上，这明显快于被捕获的微生物的速度，被捕获的微生物以100微米/秒到150微米/秒左右的速度移动。因此，幼虫被限制在陷阱区域中，但它保持其转动运动，同时试图突破陷阱的限制。如图4所示，当光片层和检测物镜固定时，幼虫的这种转动运动使得它的截面图像被记录下来。具体地，图4(a)示出了明场图像，图(b-d)示出了用来自幼虫的自动荧光信号获得的光片图像的三个例子。由于这种幼虫还处于发育的早期阶段，所以具有相对难以识别的形态。然而，一些结构可以被识别，例如纤毛和内陷肠道。
光片层显微镜是利用最小的光损伤和光漂白来形成较大标本的三维图像的有效方法。通过将光片层显微镜与光学捕获系统形成一体，本发明提供了显著地扩大光片层成像的应用范围和条件的可能性，光学捕获系统使用光学力使用反向传播的激光束几何形状捕捉和保持样品。应用可以包括避免琼脂糖，因此在一些情况下可以将药物或其他化合物添加到样品中。
技术人员将会认识到，在不脱离本发明的范围的情况下，所公开的布置的变化是可能的。例如，反向传播激光束陷阱可以形成在微流体装置中。这提供了高通量成像的可能性。悬浮在流动中的单个样本(例如细胞)可以移入捕获区域中，保持在陷阱中并使用光片层成像器成像。一旦获得图像，样品可以从陷阱中释放，并且流体流动用于将样品移出捕获区域，使得另一个样品/细胞可以被移入陷阱中并成像。因此，上述具体实施例的描述仅仅是作为例子，而不是用于限制性目的。本领域技术人员将清楚的是，可以在不对所描述的操作进行重大改变的情况下进行较小的修改。
Claims (8)
1.一种包括捕获光学器件和光片层成像光学器件的光学系统，捕获光学器件用于使用反向传播光束形成光学陷阱，光片层成像光学器件用于对位于光学陷阱中的颗粒，例如，细胞，进行光片层成像，其中反向传播光束的波长和用于光片层成像的光的波长是非干涉的。
2.根据权利要求1所述的光学系统，其中，
所述反向传播光束利用从反射镜反射的来自单个源的光形成。
3.根据权利要求1所述的光学系统，其中，
所述反向传播光束由两个不同的源提供。
4.根据前述权利要求中的任一项所述的光学系统，其中，
所述反向传播光束诸如允许颗粒在所述陷阱内的运动，例如转动运动。
5.根据前述权利要求中的任一项所述的光学系统，其中，
所述反向传播光束具有不同的强度，从而引起陷阱内的颗粒的运动，例如转动运动。
6.根据前述权利要求中的任一项所述的光学系统，其中，
所述反向传播光束具有不同的偏振，从而引起所述陷阱内的颗粒的运动，例如转动运动。
7.根据前述权利要求中的任一项所述的光学系统，其中，
所述反向传播光束偏移或未对准，从而引起所述陷阱内的颗粒的运动，例如转动运动。
8.根据前述权利要求中的任一项所述的光学系统，其中，
所述反向传播光束被布置成在微流体装置中形成所述光学陷阱。
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