CN111458314B - 一种基于自身荧光-猝灭荧光拼接光谱鉴别陈皮产地的方法 - Google Patents

一种基于自身荧光-猝灭荧光拼接光谱鉴别陈皮产地的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于自身荧光‑猝灭荧光拼接光谱鉴别陈皮产地的方法，通过测量陈皮样品的荧光光谱及其加入CdTe量子点后的荧光猝灭光谱，将所得光谱数据进行转换和拼接获得自身荧光‑猝灭荧光拼接光谱，再根据拼接光谱整合的特征差异信息与不同陈皮产地之间的关联特征建立智能化判别模型，以实现对未知陈皮产地的有效识别。与传统以色谱法等陈皮产地鉴别方法相比，本发明具有仪器成本低、检测速度快、灵敏度高、对产地识别能力强等优点，在中药质量控制领域具有实际的应用价值。

Description

一种基于自身荧光-猝灭荧光拼接光谱鉴别陈皮产地的方法
技术领域
本发明属于中药质量控制技术领域，具体涉及一种基于自身荧光-猝灭荧光拼接光谱鉴别陈皮产地的方法。
背景技术
陈皮为芸香科植物橘Citrus Reticulata Blanco及其栽培变种的干燥成熟果皮，具有理气健脾、燥湿化痰等功效，是我国药、食、茶同源的，最常用的大宗中药材之一。陈皮药材因栽培品种和产地不同分为“广陈皮”和“陈皮”。中国药典(2015年版)指明：陈皮的来源为四个橘栽培变种，包括茶枝柑(广东)、大红袍(四川)、温州蜜柑(浙江)和福橘(福建)。其中“广陈皮”是贮藏三年以上茶枝柑C.Reticulata‘Chachi’的干燥成熟果皮，质量最优，以广东省江门市新会区所产的新会陈皮为道地药材，是中国国家地理标志产品。而“陈皮”通常指的是除广陈皮以外另外三种来源的陈皮。另外市场上还有其他产地如湖南、江西、广西等和其他品种的橘皮制成的陈皮，被称为杂皮。因广陈皮价格最高，常存在用其他产地陈皮冒充广陈皮的现象。
因此，产地鉴别成为陈皮质量评价的热点。众多学者利用多种检测技术，如气相色谱质谱联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、红外光谱法(IR)等，再结合化学计量学方法对陈皮的产地进行鉴别。这些方法虽然可以准确地将广陈皮与其他产地的陈皮进行辨别，但是均存在样品测试时间长，需要大型且昂贵的分析仪器，消耗更多的有害有机试剂等不足。因此，建立更快速、准确、经济的广陈皮质量评价方法对完善陈皮质量评价体系，保护消费者权益，促进陈皮产业健康快速发展等都具有至关重要的意义。
发明内容
本发明的主要目的在于针对陈皮药材产地不明，以次充好，且现有质量控制方法费时费力、依赖大型仪器等现状，提供一种新的基于自身荧光-猝灭荧光拼接光谱鉴别陈皮产地的方法；该方法通过测量陈皮荧光光谱及其加入CdTe量子点后的荧光猝灭光谱，将所得光谱数据进行转换和拼接获得自身荧光-猝灭荧光拼接光谱，再根据拼接光谱整合的特征差异信息与不同陈皮产地之间的关联建立智能化判别模型，以实现对未知陈皮产地的快速、简便、精准识别。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种基于自身荧光-猝灭荧光拼接光谱鉴别陈皮产地的方法，包括如下步骤：
1)将陈皮粉置于热水中浸渍，然后进行超声提取、离心分离，收集所得上清液进行微孔过滤，得陈皮水提液；
2)取部分所得陈皮水提液，加水混合均匀，得混合液I；测定所得混合液I在400～650nm处的自身荧光光谱；
取部分所得陈皮水提液，向其中加入巯基改性CdTe量子点和水，混合均匀，得混合液II；测定所得混合液II在400～650nm处的荧光猝灭光谱；
将所得荧光光谱和荧光猝灭光谱数据转换为CDF格式并导入MATLAB(MathWorks，USA)进行提取和拼接，获得自身荧光-猝灭荧光拼接光谱数据，具体过程如下：将所有批次样品的荧光光谱中荧光强度数据合并为矩阵A(矩阵行数为步骤2)中扫描所得自身荧光光谱中的荧光强度变量数(扫描波长范围/扫描步长)+1)，同法合并得到猝灭荧光光谱荧光强度的数据矩阵B(矩阵行数为步骤2)中扫描所得荧光猝灭光谱中的荧光强度变量数)，将B矩阵接到A矩阵的最后行后面即可获得自身荧光-猝灭荧光光谱拼接数据矩阵C；然后以荧光强度为变量，并对荧光强度进行顺序编号，则变量数等于矩阵C行数，再以荧光强度对应的编号为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制出自身荧光-猝灭荧光拼接光谱数据；
3)提供广陈皮、川陈皮和其他陈皮这三类已知产地的陈皮样品，将已知产地的陈皮对照药材作为建模的样品；分别按照步骤1)和2)所述方法得到对照药材的自身荧光-猝灭荧光拼接光谱；然后将所得自身荧光-猝灭荧光拼接光谱数据导入MATLAB平台中，并结合对应已知产地信息利用最小二乘判别法对所得数据进行处理分析，建立基于拼接光谱的智能化识别模型库；
4)按照步骤1)和2)所述方法获得未知产地陈皮样品的自身荧光-猝灭荧光拼接光谱，再将其输入步骤3)所得智能化识别模型库中进行识别，根据被分配给哪一类属来实现对未知产地陈皮样品的产地识别。
上述方案中，步骤3)中基于拼接光谱的智能化识别模型库是利用偏最小二乘判别分析(PLSDA)法建立的；利用该模型库对输入的自身荧光-猝灭荧光拼接光谱数据进行分析，将陈皮样品分配给具有最高预测响应值和最小错误率的产地类属。
优选的，所述自身荧光光谱和荧光猝灭光谱在360nm的激发波长条件下进行测定。
上述方案中，步骤3)所得拼接光谱识别的模型库中，广陈皮对照药材的样品数量为10批以上、川陈皮及其他产地陈皮对照药材的样品数量各为5批以上。
上述方案中，所述巯基改性CdTe量子点的制备方法包括如下步骤：
i)将镉源和巯基乙酸充分溶解于水中，加入碱液调节所得溶液的pH值至碱性，然后通入保护气氛并冰浴搅拌；
ii)向步骤1)所得溶液中加入碲源，搅拌均匀，然后加入硼氢化钠，搅拌均匀得澄清溶液；再在油浴条件下回流反应，得所述巯基改性CdTe。
上述方案中，所得巯基改性CdTe量子点为发射波长为550～560nm，发翠绿色荧光的橙黄色量子点。
上述方案中，所述镉源为二氯化镉；碲源为亚碲酸钠。
上述方案中，所述碱液为氢氧化钠溶液。
上述方案中，所述镉源、碲源、巯基乙酸的摩尔比为1:(5-10):(2-3)。
上述方案中，所述镉源与硼氢化钠的摩尔比为1:(8-16)。
上述方案中，所述油浴为90-100℃，回流反应时间为1-2h。
上述方案中，所述碱性条件对应的pH值为9.5-11.0。
上述方案中，所述混合液I中所含陈皮成分的量以步骤1)中所述陈皮粉生药计为0.5-1.0mg生药/mL。
上述方案中，所述混合液II中所含陈皮成分的量以步骤1)中所述陈皮粉生药计为0.5-1.0mg生药/mL，CdTe量子点含量为1.0-1.5×10-7mol/L。
上述方案中，步骤1)中所述热水温度为95-100℃；浸渍时间为15-25min。
上述方案中，步骤1)中所述陈皮粉相对热水的固液比为1:100-200g：mL。
上述方案中，所述超声提取温度为45-55℃，时间为25-35min。
上述方案中，所述微孔过滤采用0.22mm微孔滤膜。
上述方案中，所述其他陈皮为除广州和四川之外生产的陈皮，包括湖南、浙江或江西等。
上述方案中，步骤3)和4)中所有光谱分析只采用原始光谱数据，不作任何其他光谱预处理。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)本发明所述自身荧光-猝灭荧光拼接光谱是将陈皮荧光光谱与加CdTe量子点后所得荧光猝灭光谱的转换数据进行拼接获得的；这种拼接光谱可将两种单一光谱中的差异信息进行累积叠加，有利于显著提升所得智能化模型的识别率。
2)本发明首次提出利用自身荧光-猝灭荧光拼接光谱鉴别陈皮产地，既能利用不同产地之间陈皮荧光光谱的差异信息，又能利用荧光探针CdTe量子点与不同产地陈皮作用后的荧光猝灭光谱差异信息；所得自身荧光-猝灭荧光拼接光谱包含了更全面的不同产地之间差异信息；与采用单一荧光光谱的鉴别手段相比，可表现出更高的灵敏度和更强的特异性，可为陈皮产地的高效鉴定提供一条全新思路。
3)本发明所得巯基改性CdTe量子点与陈皮提取液发生作用时，有两个荧光发射峰会根据不同产地陈皮的化学成分的差异而产生不同的变化：该CdTe量子点不仅可以一定程度猝灭陈皮提取液的自身荧光(λem＝450nm)，而且量子点自身的荧光(λem＝550nm)也会被陈皮提取液明显猝灭；其原因一方面可能是由于不同产地陈皮的荧光成分含量有差异，所以被量子点猝灭的程度也有差异；另一方面，不同产地陈皮所含的黄酮类、多甲氧基黄酮类、氨基酸类等成分也有较大差异，而这些成分可显著猝灭Cdte量子点的荧光响应，由此而产生更多的特征性差异信息，有助于陈皮产地识别模型的构建，可提高方法的灵敏度和特异性。
4)与传统以色谱法鉴别陈皮产地的方法相比，本发明具有仪器成本低、检测速度快、灵敏度高、对产地识别能力强等优点，且涉及的检测试剂制备简单、反应条件温和，在中药质量控制领域具有实际的应用价值。
附图说明
图1为本发明基于自身荧光-猝灭荧光拼接光谱鉴别陈皮产地方法的流程示意图。
图2为实施例1所得巯基改性CdTe量子点的荧光光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。
图3为实施例1所得三类产地陈皮样品陈皮的自身荧光光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。
图4为实施例1所得三类产地陈皮样品陈皮加入CdTe量子点后的荧光猝灭光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。
图5为实施例1所述三类产地陈皮样品的自身荧光-猝灭荧光拼接光谱的拼接流程示意图，横坐标为变量编号，纵坐标为荧光强度。
图6为实施例1所述三类产地陈皮样品自身荧光-猝灭荧光拼接光谱在智能化判别模型中的识别结果图，(a)已知模型库；(b)未知样品集。
图7为对比例1所述三类产地陈皮样品的自身荧光-纳米金猝灭荧光拼接光谱的拼接流程示意图，横坐标为变量编号，纵坐标为荧光强度。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例中，采用LS55发光光谱仪(Perkin Elmer公司)进行光谱测定。
实施例1
一种基于自身荧光-猝灭荧光拼接光谱鉴别陈皮产地的方法，包括如下步骤：
1)CdTe量子点的合成：
将0.0457g二氯化镉和18μL巯基乙酸加入50mL超纯水中，在常温常压下搅拌使其充分溶解；然后加入1.0mol/L的氢氧化钠溶液调节所得溶液的pH值至10.3，然后通入氮气并在冰浴条件下搅拌20分钟；加入0.0089g亚碲酸钠，搅拌15分钟后，再加入0.08g硼氢化钠，继续搅拌10min；将所得澄清溶液转移至油浴锅中，100℃油浴回流1.5h，得到发射波长为550nm左右、发翠绿色荧光的橙黄色CdTe量子点荧光探针(其荧光光谱如图2所示)；
2)陈皮水提液的制备：
将干燥的陈皮剪碎，磨粉，过50目筛备用；将0.1g陈皮粉加入20mL100℃的去离子水中浸渍20min，然后在50℃下超声提取30min，4000r/min离心10min，上清液过0.22μm微孔滤膜，得到陈皮水提液，4℃冷藏备用；
3)陈皮自身荧光-猝灭荧光拼接光谱的获取：
在1.5mL比色皿中加入100μL步骤2)所得陈皮水提液和900μL去离子水，设置激发波长为360nm，在400～650nm处进行荧光光谱测定，得到陈皮荧光光谱，共收集了400个三类已知产地陈皮样品的荧光光谱信息，结果显示所述陈皮样品均在450nm处具有较强的荧光响应(见图3)；
在1.5mL比色皿中加入100μL步骤1)中制备的巯基乙酸包裹的CdTe量子点溶液(浓度为1.31*10-6mol/L)、100μL步骤2)所得陈皮水提液和800μL去离子水，设置激发波长为360nm，在400～650nm范围内(步长为0.2nm)测定荧光光谱，得到陈皮加CdTe量子点后的荧光猝灭光谱，见图4；结果显示当陈皮样品加入CdTe量子点后，陈皮在450nm处的荧光和CdTe量子点在550nm处的荧光均发生一定程度的猝灭，由此形成了加CdTe量子点后的陈皮荧光猝灭光谱，并且不同产地不同批次陈皮对CdTe量子点荧光猝灭的效果也存在差异；具体表现为广陈皮可显著猝灭CdTe量子点在550nm处的荧光，而川陈皮和其他产地陈皮的猝灭效果较小，但也存在差异；这可能是由于陈皮中所含二氢黄酮类和多甲氧基黄酮类成分可以通过光之电子转移效应有效猝灭CdTe量子点的荧光，而不同产地的陈皮中所含的这些黄酮类成分有较大的差异，从而使其荧光猝灭光谱表现出与产地相关的差异；
将所得陈皮自身荧光光谱与加CdTe量子点后所得陈皮荧光猝灭光谱的数据转换为CDF格式并导入MATLAB(MathWorks，USA)进行提取和拼接，获得自身荧光-猝灭荧光拼接光谱数据，具体过程如下：将所有批次样品的荧光光谱中荧光强度数据合并为矩阵A(1251行)，同法得到猝灭荧光光谱荧光强度的数据矩阵B(1251行)，将B矩阵接到A矩阵的行后面即可获得自身荧光-猝灭荧光光谱拼接数据矩阵C(2502行)；然后以荧光强度为变量，并对荧光强度进行顺序编号，则变量数等于矩阵行数，再以荧光强度对应的编号为横坐标，荧光强度为纵坐标，可分别绘制出自身荧光光谱特征图，猝灭荧光光谱特征图和拼接荧光光谱特征图(拼接流程示意图见图5)；其中所得拼接光谱将陈皮荧光的差异和加CdTe量子点后产生的猝灭效果差异累加在一起，共同表征不同产地陈皮之间的差异性，从而有助于提高方法的灵敏度和准确度；
4)陈皮产地智能化判别模型的构建与验证：
按照步骤3)和4)所述方法对400个三类已知产地陈皮样品的光谱随机划分为306个训练样本构建已知模型库，剩余94个作为未知预测样本，其中各产地陈皮样品光谱标记信息见表1，且所已知产地陈皮样品的荧光光谱、加CdTe后的荧光猝灭光谱、拼接所得自身荧光-猝灭拼接光谱的原始数据均导入MATLAB平台中，利用偏最小二乘判别分析法进行模型库的构建；并将陈皮样品按产地进行分类：第一类为广陈皮(CRC)，第二类为川陈皮(CRD)，第三类为其他产地陈皮(Other CRB)；每一类特征矩阵的每一行的自身荧光光谱、荧光猝灭光谱、拼接光谱分别代表一个样本的分类向量，通过3个一对二的智能分类器模型中进行识别，其中广陈皮分类向量为1，川陈皮分类向量为2，其他产地陈皮分类向量为3；
结果显示：不同产地不同批次的陈皮荧光光谱存在一定的差异，但是当进行智能化产地判别分析时，其预测集识别准确率不高，仅为87.23％，说明自身荧光法难以对不同产地陈皮进行准确分类；当采用智能化产地判别模型对荧光猝灭光谱数据进行分析时，其训练集和预测集的识别率分别为100％和94.68％，该结果比陈皮自身荧光光谱法显著提高，但是仍然不能达到100％的识别率；在此基础上，本发明提出的将陈皮荧光光谱与加CdTe量子点后的荧光猝灭光谱进行拼接，得到自身荧光-猝灭荧光拼接光谱后再进行智能化判别，在建立的模型库与预测样本的识别率均可以达到100％(见图6)；三种方法识别率对比的详细数据如表2所示；
表1 三类产地陈皮样品荧光光谱标记信息
Figure BDA0002449024430000071
表2 自身荧光法、加CdTe量子点荧光猝灭法和自身荧光-猝灭荧光拼接光谱法的智能判别模型对陈皮产地的判别结果
Figure BDA0002449024430000072
综上所述，在将陈皮荧光光谱及其加CdTe量子点的荧光猝灭光谱进行拼接之后，再结合智能化判别分析可准确、有效地识别陈皮的产地，并且所有识别3类不同产地陈皮的灵敏度和特异性都可以达到1；
5)判别未知陈皮样品所属的产地类别
将6批产地待验证的陈皮样品(广陈皮2批，川陈皮2批，浙江和江西陈皮各1批为其他产地陈皮)按上述步骤2)和3)获得其自身荧光-猝灭荧光拼接光谱，将数据导入预测集，在已建立的智能化判别模型中进行识别，当识别结果在0～1之间时，即将陈皮样品分为对应分类向量，以实现对未知样品的产地识别，如分类向量为1，则为广陈皮，分类向量为2，则为川陈皮，分类向量3则为其他产地陈皮。实验结果显示对6批陈皮样品的产地均识别为其标示的产地类别。
对比例1
一种基于自身荧光-猝灭荧光拼接光谱鉴别陈皮产地的方法，包括如下步骤：
1)纳米金的合成：
精密称量0.025g柠檬酸三钠溶解于2.5ml水中配置浓度为1wt％的柠檬酸三钠溶液，将氯金酸配置成浓度为1wt％的氯金酸水溶液，将2ml所得柠檬酸三钠溶液与1ml氯金酸水溶液滴加到100ml的水中，然后封口进行微波处理(700W，220V，50Hz)5min，取出得到酒红色的纳米金(AuNPs)溶液；
2)按实施例1步骤2)所述步骤制备陈皮水提液；
3)陈皮自身荧光-猝灭荧光拼接光谱的获取：
按实施例1步骤3)所述步骤获得陈皮水提液的荧光光谱数据；
在1.5mL比色皿中加入100μL上述步骤1)中制备的纳米金溶液、100μL步骤2)所得陈皮水提液和800μL去离子水，设置激发波长为360nm，在400～650nm范围内测定荧光光谱，得到陈皮加AuNPs后的荧光猝灭光谱；结果显示当陈皮样品加入AuNPs后，陈皮在450nm处的荧光发生不同程度的猝灭；
将所得陈皮荧光光谱与加AuNPs后所得陈皮荧光猝灭光谱数据按实施例1中相同方法进行拼接，获得陈皮自身荧光-纳米金猝灭荧光拼接光谱(拼接流程示意图见图7)；
4)陈皮产地智能化判别模型的构建与验证
将陈皮荧光-纳米金猝灭光谱数据按实施例相同方法进行智能化产地判别分析时，其预测集识别准确率更低，仅为66.58％，该结果说明采用其他纳米颗粒产生猝灭荧光而获得的拼接光谱并不一定能成功地建立识别模型。
上述实施例仅是为了清楚地说明所做的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或者变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于自身荧光-猝灭荧光拼接光谱鉴别陈皮产地的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）将陈皮粉置于热水中浸渍，然后进行超声提取、离心分离，收集所得上清液进行微孔过滤，得陈皮水提液；
2）取部分所得陈皮水提液，加水混合均匀，得混合液I；测定所得混合液I在400~650nm范围内的自身荧光光谱；取部分所得陈皮水提液，向其中加入巯基改性CdTe量子点和水，混合均匀，得混合液II；测定所得混合液II在400~650nm范围内的猝灭荧光光谱；将所得自身荧光光谱和猝灭荧光光谱数据转换为CDF格式并导入MATLAB平台中进行提取和拼接，获得自身荧光-猝灭荧光拼接光谱数据；
3）陈皮产地智能分析模型的构建：提供广陈皮、川陈皮和其他陈皮这三类已知产地的陈皮样品，并将其作为建模的样品；分别按照步骤1）和2）所述方法得到已知产地的陈皮样品的自身荧光-猝灭荧光拼接光谱；然后将所得自身荧光-猝灭荧光拼接光谱数据导入MATLAB平台中，并结合对应已知产地信息利用偏最小二乘判别法对所得数据进行处理分析，建立基于拼接光谱的智能化识别模型库；
4）按照步骤1）和2）所述方法获得未知产地陈皮样品的自身荧光-猝灭荧光拼接光谱，再将其输入步骤3）所得智能化识别模型库中进行识别，根据被分配给哪一产地类属来实现对未知产地陈皮样品的产地鉴别；
步骤2）中所述拼接方法包括如下步骤：将自身荧光光谱中荧光强度数据合并为矩阵A，将猝灭荧光光谱中的荧光强度数据合并成矩阵B，其中矩阵A和B的行数分别为扫描所得自身荧光光谱或猝灭荧光光谱中的荧光强度数据的数量，将矩阵B接到矩阵A的最后一行后面，即获得自身荧光-猝灭荧光光谱拼接数据矩阵C；然后以荧光强度为变量，并根据矩阵C信息对荧光强度进行顺序编号，再以荧光强度对应的编号为横坐标，对应的荧光强度数据为纵坐标，绘制出自身荧光-猝灭荧光拼接光谱图。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中基于拼接光谱的智能化识别模型库利用偏最小二乘判别分析建立；利用该模型库对输入的自身荧光-猝灭荧光拼接光谱数据进行分析，将陈皮样品的归属产地分为广陈皮、川陈皮或其他陈皮对应的这三个类属之一。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述巯基改性CdTe量子点的制备方法包括如下步骤：
i）将镉源和巯基乙酸充分溶解于水中，加入碱液调节所得溶液的pH值至碱性，然后通入保护气氛并冰浴搅拌；
ii）向步骤i）所得溶液中加入碲源，搅拌均匀，然后加入硼氢化钠，搅拌均 匀得澄清溶液；再在油浴条件下回流反应，得所述巯基改性CdTe量子点。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述镉源、碲源、巯基乙酸的摩尔比为1:(0.15-0.3):(0.8-1.2)；所述镉源与硼氢化钠的摩尔比为1:(8-16)。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述油浴为90-100℃，回流反应时间为1-2h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合液I中所含陈皮成分的量以陈皮粉生药计为0.5-1.0 mg生药/mL。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合液II中所含陈皮成分的量以陈皮粉 生药计为 0.5-1.0mg生药/mL， CdTe量子点的含量为1.0-1.5×10-7mol/L。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中所述陈皮粉相对热水的固液比为1 g:100-200mL。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超声提取温度为45-55℃，时间为25-35min。
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