CN111454879A - 大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞模型的构建方法 - Google Patents

大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞模型的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞模型的构建方法。所述细胞模型为感染了大肠杆菌ATCC 25922的单层致密奶牛乳腺上皮细胞，且感染时单层致密奶牛乳腺上皮细胞的跨膜电阻值达到400Ω·cm2。本发明提供的大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞模型，可作为检测大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞的黏附率及其对奶牛乳腺上皮细胞紧密连接蛋白表达的影响进行应用，也可在大肠杆菌诱发乳房炎对乳腺组织及乳腺上皮细胞的损伤机制和抗生素替代品的筛选等相关领域广泛应用。

Description

大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞模型的构建方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞模型的构建方法及其应用。
背景技术
乳房炎是一种由细菌感染导致的乳腺炎症，是奶牛养殖业中常见且危害极大的疾病之一，是全球奶牛养殖业的顽疾，具有发生范围广、发病率高、难治愈、易复发等特点，不仅给动物造成巨大的痛苦，也给世界各地奶牛场带来了巨大的经济损失。
大肠杆菌是诱发奶牛临床性乳房炎的主要环境性致病菌，其中大肠杆菌ATCC25922是一种从乳房炎奶牛中分离得到的大肠杆菌菌株，可引发急性或超急性乳房炎。
目前对于奶牛急性乳房炎的治疗主要依赖于抗生素的使用，而抗生素的长期大量使用已经导致许多致病菌出现了耐药性，且抗生素的长期大量使用还会污染环境，危害人和动物健康。目前对于大肠杆菌诱发乳房炎对乳腺组织及单层致密乳腺上皮细胞的损伤机制尚未完全明确，且对于许多抗生素替代品保护大肠杆菌诱发单层致密奶牛乳腺上皮细胞损伤的机制也尚未完全明确，亟需建立大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞模型提供研究基础。而单层细胞跨膜电阻值(Trans Epithelial Electric Resistance，TEER)值是反映单层细胞完整性的一个简单而权威的评价方法，通常认为TEER值在达到200Ω·cm2时即表明完整细胞单层和细胞间紧密连接的形成，TEER值越大即认为细胞单层越致密完整。
发明内容
本发明的目的是提供大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞模型的构建方法及其应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞模型，所述细胞模型为感染了大肠杆菌ATCC 25922的单层致密奶牛乳腺上皮细胞，且感染时单层致密奶牛乳腺上皮细胞的跨膜电阻值达到400Ω·cm2。
第二方面，本发明提供大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞模型的构建方法，包括以下步骤：
1)将奶牛乳腺上皮细胞接种于六孔板中，每24h更换培养基，直至形成单层致密奶牛乳腺上皮细胞，当单层致密奶牛乳腺上皮细胞的跨膜电阻值达到400Ω·cm2时，进行大肠杆菌(ATCC 25922)感染；
2)用无血清细胞培养基配制浓度为103～105CFU/mL(优选5×104CFU/mL)的大肠杆菌ATCC 25922菌悬液；
3)将步骤2)的菌悬液按2mL/孔的量加入步骤1)的六孔板中，于37℃、5％CO2培养箱中孵育4～6h(优选5h)，孵育后，用PBS清洗细胞3遍，即得大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞模型。
优选地，步骤1)中将奶牛乳腺上皮细胞接种于含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养基的六孔板中。
第三方面，本发明提供所述大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞模型或根据上述方法构建的细胞模型在大肠杆菌诱发乳房炎对乳腺组织及乳腺上皮细胞的损伤机制研究以及药物筛选中的应用。
所述乳房炎包括但不限于奶牛乳房炎。
第四方面，本发明提供所述大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞模型或根据上述方法构建的细胞模型在大肠杆菌引起的奶牛乳腺上皮细胞炎性反应及细胞损伤的分子机制中的应用。
第五方面，本发明提供所述大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞模型或根据上述方法构建的细胞模型在检测大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞黏附率中的应用。
第六方面，本发明提供所述大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞模型或根据上述方法构建的细胞模型在检测大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin表达量中的应用。
第七方面，本发明提供所述大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞模型或根据上述方法构建的细胞模型在检测抗生素替代物保护大肠杆菌感染导致的单层致密奶牛乳腺上皮细胞损伤中的应用。
优选地，所述抗生素替代物包括但不限于干酪乳酸杆菌Zhang。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明提供一种大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞模型的方法，建立于单层致密奶牛乳腺上皮细胞之上，为研究大肠杆菌诱发乳房炎对乳腺组织及乳腺上皮细胞的损伤机制和抗生素替代品保护大肠杆菌诱发单层致密奶牛乳腺上皮细胞损伤的机制等相关领域广泛应用提供体外细胞模型。
(二)应用大肠杆菌ATCC 25922感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞模型，研究大肠杆菌ATCC 25922对单层致密奶牛乳腺上皮细胞的黏附效果及其对紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin表达的影响，为研究大肠杆菌ATCC 25922与单层致密奶牛乳腺上皮细胞的互作提供研究基础。
附图说明
图1为本发明的技术路线图。
图2为本发明实施例1中大肠杆菌对单层致密奶牛乳腺上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1表达的影响结果。
图3为本发明实施例1中大肠杆菌对单层致密奶牛乳腺上皮细胞紧密连接蛋白Claudin-1表达的影响结果。
图4为本发明实施例1中大肠杆菌对单层致密奶牛乳腺上皮细胞紧密连接蛋白Occludin表达的影响结果。
图5为本发明实施例2中保护单层致密奶牛乳腺上皮细胞损伤的抗生素替代物干酪乳酸杆菌Zhang的筛选。
其中，图2、图3-图5中**表示与大肠杆菌处理组相比差异显著。
具体实施方式
本发明利用从乳房炎奶牛中分离得到的大肠杆菌(ATCC 25922)感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞，构建了一种大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞模型，可在大肠杆菌诱发乳房炎对乳腺组织及乳腺上皮细胞的损伤机制和抗生素替代品保护大肠杆菌诱发单层致密奶牛乳腺上皮细胞损伤的机制等相关领域广泛应用。
本发明提供一种大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞模型的建立方法，包括以下步骤：
(1)大肠杆菌ATCC 25922的活化及培养。
(2)单层致密奶牛乳腺上皮细胞的培养。
(3)大肠杆菌ATCC 25922感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞。
所述步骤(1)的具体操作为：
a.取保存于-80℃冰箱的大肠杆菌菌株ATCC 25922 100μL于5mL TSB培养基中，置于37℃恒温水浴振荡器中120rpm培养12h得到活化的大肠杆菌ATCC 25922。
b.将a中活化好的大肠杆菌ATCC 25922于TSA平板上划线，置于37℃恒温培养箱中倒置培养12h，在无菌操作台挑取单菌落于5mL TSB培养基，在置于37℃恒温水浴振荡器中120rpm培养12h得到大肠杆菌ATCC 25922菌液。
所述步骤(2)的具体操作为：
a.当奶牛乳腺上皮细胞(Bovine mammary epithelial cells，BMECS)铺满细胞培养皿80％左右时，加入0.05％胰蛋白酶(含0.02％EDTA)1mL进行消化，于倒置显微镜下观察，待70％细胞变圆皱缩，从培养皿底部脱落时加入3mL培养基终止消化。
b.收集细胞，1000rpm离心90s，弃去上清液后加入1mL培养基制成细胞悬液，与0.4％台盼蓝染液按1：1的比例均匀混合，用移液枪吸取混合溶液20μL，沿计数板边缘缓缓滴入，使之充满计数板，用细胞计数器(TC10automated cell counter，Bio-Rad)进行计数。
c.根据细胞计数结果，将奶牛乳腺上皮细胞以1×105个/孔接种于六孔板中，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中进行培养。
d.将c中的细胞培养于含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养基中培养至细胞铺满六孔板，每24h更换一次培养基，直至形成单层致密奶牛乳腺上皮细胞，当单层致密奶牛乳腺上皮细胞的跨膜电阻值达到400Ω·cm2时，进行大肠杆菌感染。
所述步骤(3)的具体操作为：
a.将步骤(2)中的细胞用无菌PBS溶液清洗3次后更换为无血清DMEM/F12培养基。
b.用a中的无血清细胞培养基制备大肠杆菌ATCC 25922细菌悬液，所述大肠杆菌ATCC 25922的菌液浓度为5×104CFU/mL。
c.步骤(2)中的六孔板取3孔加入无血清DMEM/F12培养基作为空白对照组，其余3孔加入b中菌液(2mL/孔)，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育5h。
d.孵育后，用无菌PBS溶液清洗细胞3次，去除未黏附的大肠杆菌，完成大肠杆菌ATCC 25922感染奶牛单层致密乳腺上皮细胞模型的建立。
本发明还提供一种大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞模型的应用，所述大肠杆菌ATCC 25922感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞模型。作为检测大肠杆菌ATCC 25922感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞黏附率的应用。
所述应用步骤如下：
a.将奶牛乳腺上皮细胞以1×105个/孔接种于六孔板中，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中，每24h更换一次培养基，直至形成单层致密奶牛乳腺上皮细胞，当单层致密奶牛乳腺上皮细胞的跨膜电阻值达到400Ω·cm2时，进行接种。
b.将a中的细胞用无菌PBS溶液清洗3次后更换为无血清DMEM/F12培养基。
c.用无血清细胞培养基制备大肠杆菌ATCC 25922细菌悬液，所述大肠杆菌ATCC25922的菌液浓度为5×104CFU/mL。
d.将a中的六孔板取3孔加入无血清DMEM/F12培养基作为空白对照组，其余3孔加入b中菌液2mL，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育5h。
e.孵育后，用无菌PBS溶液清洗细胞3次，去除未黏附的大肠杆菌ATCC 25922。
f.将经步骤e处理后的六孔板中加入1mL 0.25％Triton X-100裂解细胞15min，释放出黏附在奶牛乳腺上皮细胞表面的活细菌，8000rpm离心5min沉淀细菌，加入无菌PBS溶液得到细菌菌液。
f.将e中菌液按照10倍倍比稀释，将菌液用PBS溶液等比稀释102、104、106倍，取稀释液10μL均匀滴于TSA琼脂培养基，每个稀释倍数设置4个重复，于37℃培养箱中倒置培养24h后进行菌落计数。
本发明还提供一种大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞模型的应用，所述大肠杆菌ATCC 25922感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞模型。作为检测大肠杆菌ATCC 25922对单层致密奶牛乳腺上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin表达量的影响应用。
所述应用步骤如下：
在上述步骤d之后用蛋白提取试剂盒提取细胞蛋白，采用Western Blot方法检测其中紧密连接蛋白的表达，蛋白样品的上样量为40μg。
本发明还提供一种大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞模型的应用，所述大肠杆菌ATCC 25922感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞模型。作为检测抗生素替代物(干酪乳酸杆菌Zhang)保护大肠杆菌ATCC 25922对单层致密奶牛乳腺上皮细胞损伤的保护作用。
所述应用步骤如下：
在上述步骤d之后，取细胞培养上清液，检测其中乳酸脱氢酶(LDH)的释放量。
本发明的技术路线图见图1。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1大肠杆菌感染奶牛单层致密乳腺上皮细胞模型的构建及应用
1.材料
1.1菌株与细胞
大肠杆菌菌株编号为ATCC 25922，由北京中源合聚生物科技有限公司提供；奶牛乳腺上皮细胞(Bovine mammary epithelial cells，BMECS)，由扬州大学动物科学与技术学院动物营养与饲料工程技术研究中心提供。
1.2主要试剂
菌株培养所用TSB、TSA培养基购自北京索莱宝科技有限公司；细胞培养用培养基、胎牛血清等均购自英潍捷基(上海)贸易有限公司；细胞培养六孔板购自Corning公司；其余分析纯试剂均由本实验室提供。
1.3主要仪器
CO2恒温培养箱(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；恒温水浴振荡器(金坛市普林仪器制造有限公司)；常用恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；细胞计数器(TC10automated cell counter，Bio-Rad)等。
2.方法
2.1大肠杆菌的活化与培养计数
胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基用于菌株活化与传代，胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基用于菌落计数。
(1)菌株传代：挑取单菌落于TSB培养基，37℃，120rpm下振荡培养24h，在121℃下高压15min备用。
(2)菌落计数：TSA培养基在121℃下高压15min，待溶液冷却至45℃左右时倒至平板培养皿备用。按照10倍倍比稀释的方式，将菌液用PBS溶液等比稀释102、104、106倍，取稀释液10μL均匀滴于TSA琼脂培养基，每个稀释倍数设置四个重复，于37℃培养箱中倒置培养24h后进行菌落计数。
2.2大肠杆菌ATCC 25922对单层致密奶牛乳腺上皮细胞的黏附试验
将奶牛乳腺上皮细胞以1×105个/孔接种于六孔板中，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中培养至细胞铺满六孔板，培养至细胞铺满六孔板后，每24h更换一次培养基，直至形成单层致密奶牛乳腺上皮细胞，当单层致密奶牛乳腺上皮细胞的跨膜电阻值达到400Ω·cm2时，进行大肠杆菌ATCC 25922的感染。将细胞用无菌PBS溶液清洗3次后更换为无血清DMEM/F12培养基；用无血清细胞培养基制备大肠杆菌ATCC 25922细菌悬液(浓度为5×104CFU/mL)；六孔板取3孔加入无血清DMEM/F12培养基作为空白对照组，其余3孔加入b中菌液2mL，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育5h；孵育后，用无菌PBS溶液清洗细胞3次，去除未黏附的大肠杆菌ATCC 25922；处理后的六孔板中加入1mL 0.25％Triton X-100裂解细胞15min，释放出黏附在奶牛乳腺上皮细胞表面的活细菌，8000rpm离心5min沉淀细菌，加入无菌PBS溶液得到细菌菌液；上述菌液按照10倍倍比稀释，将菌液用PBS溶液等比稀释102、104、106倍，取稀释液10μL均匀滴于TSA琼脂培养基，每个稀释倍数设置4个重复，于37℃培养箱中倒置培养24h后进行菌落计数。
2.3大肠杆菌ATCC 25922对单层致密奶牛乳腺上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin的影响
在上述大肠杆菌ATCC 25922处理细胞之后用蛋白提取试剂盒提取细胞蛋白，采用Western Blot方法检测其中紧密连接蛋白的表达，具体方法如下：
1)采用12％的聚丙烯酰胺凝胶，蛋白样品的上样量为40μg，采用湿转转膜将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜(美国Bio-Rad电泳仪)；
2)用牛血清蛋白(BSA)4℃封闭过夜；
3)加入一抗(抗体来源：北京博奥森生物技术有限公司)孵育3h；
4)使用TBST洗涤缓冲液洗膜5次，每次6min；
5)加入二抗(抗体来源：金氏生物科技(上海)有限公司)孵育1h；
6)使用TBST洗涤缓冲液洗膜5次，每次6min；
7)使用照胶仪(Bio-Rad，美国)及ImageJ灰度分析蛋白表达量。
3.结果
大肠杆菌ATCC 25922对奶牛单层致密乳腺上皮细胞的黏附试验结果如下：将105CFU大肠杆菌加入奶牛乳腺上皮细胞进行孵育，5h后对黏附于细胞的活菌进行平板计数得到其菌落数为108CFU。
大肠杆菌ATCC 25922对单层致密奶牛乳腺上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin表达影响的结果如图2～图4所示。可以看出，与对照组相比，大肠杆菌处理组奶牛乳腺上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin的表达量显著下调。
实施例2保护单层致密奶牛乳腺上皮细胞损伤的抗生素替代物的筛选
1.材料
1.1菌株与细胞
大肠杆菌菌株编号为ATCC 25922，由北京中源合聚生物科技有限公司提供；奶牛乳腺上皮细胞(Bovine mammary epithelial cells，BMECS)，由扬州大学动物科学与技术学院动物营养与饲料工程技术研究中心提供；干酪乳酸杆菌Zhang(Lactobacillus caseiZhang)，由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室提供。
1.2主要试剂
菌株培养所用TSB、TSA培养基购自北京索莱宝科技有限公司；细胞培养用培养基、胎牛血清等均购自英潍捷基(上海)贸易有限公司；细胞培养六孔板购自Corning公司；其余分析纯试剂均由本实验室提供。
1.3主要仪器
CO2恒温培养箱(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；恒温水浴振荡器(金坛市普林仪器制造有限公司)；常用恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；细胞计数器(TC10automated cell counter，Bio-Rad)等。
2.方法
2.1大肠杆菌的活化与培养计数
胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基用于菌株活化与传代，胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基用于菌落计数。
(1)菌株传代：挑取单菌落于TSB培养基，37℃，120rpm下振荡培养24h，在121℃下高压15min备用。
(2)菌落计数：TSA培养基在121℃下高压15min，待溶液冷却至45℃左右时倒至平板培养皿备用。按照10倍倍比稀释的方式，将菌液用PBS溶液等比稀释102、104、106倍，取稀释液10μL均匀滴于TSA琼脂培养基，每个稀释倍数设置四个重复，于37℃培养箱中倒置培养24h后进行菌落计数。
2.2干酪乳酸杆菌Zhang对单层致密奶牛乳腺上皮细胞损伤的保护作用探究
将奶牛乳腺上皮细胞以1×105个/孔接种于六孔板中，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中培养至细胞铺满六孔板，培养至细胞铺满六孔板后，每24h更换一次培养基，直至形成单层致密奶牛乳腺上皮细胞，当单层致密奶牛乳腺上皮细胞的跨膜电阻值达到400Ω·cm2时，进行大肠杆菌ATCC 25922的感染。将细胞用无菌PBS溶液清洗3次后更换为无血清DMEM/F12培养基；用无血清细胞培养基制备大肠杆菌ATCC 25922细菌悬液(浓度为5×104CFU/mL)；六孔板取9孔分别加入无血清DMEM/F12培养基(空白对照)、5×104CFU/mL大肠杆菌悬液、干酪乳酸杆菌Zhang(500CFU/mL)预处理3h+5×104CFU/mL大肠杆菌悬液。加入大肠杆菌悬液后置于37℃、5％CO2培养箱中孵育5h；处理后取细胞培养上清液，采用LDH(乳酸脱氢酶)试剂盒(北京索莱宝科技有限公司提供)检测LDH的释放量。
3.结果
大肠杆菌ATCC 25922处理单层致密奶牛乳腺上皮细胞后，与对照组相比其LDH释放量显著增加，而干酪乳酸杆菌Zhang预处理能够显著缓减由大肠杆菌ATCC 25922诱发的LDH的显著增加(图5)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞模型，其特征在于，所述细胞模型为感染了大肠杆菌ATCC 25922的单层致密奶牛乳腺上皮细胞，且感染时单层致密奶牛乳腺上皮细胞的跨膜电阻值达到400Ω·cm2。
2.大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将奶牛乳腺上皮细胞接种于六孔板中，每24h更换培养基，直至形成单层致密奶牛乳腺上皮细胞，当单层致密奶牛乳腺上皮细胞的跨膜电阻值达到400Ω·cm2时，进行大肠杆菌感染；
2)用无血清细胞培养基配制浓度为103～105CFU/mL的大肠杆菌ATCC 25922菌悬液；
3)将步骤2)的菌悬液按2mL/孔的量加入步骤1)的六孔板中，于37℃、5％CO2培养箱中孵育4～6h，孵育后，用PBS清洗细胞3遍，即得大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞模型。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中将奶牛乳腺上皮细胞接种于含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养基的六孔板中。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中大肠杆菌ATCC 25922菌悬液的浓度为5×104CFU/mL。
5.权利要求1所述细胞模型或根据权利要求2-4任一项所述方法构建的细胞模型在大肠杆菌诱发乳房炎对乳腺组织及乳腺上皮细胞的损伤机制研究以及药物筛选中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述乳房炎为奶牛乳房炎。
7.权利要求1所述细胞模型或根据权利要求2-4任一项所述方法构建的细胞模型在大肠杆菌引起的奶牛乳腺上皮细胞炎性反应及细胞损伤的分子机制中的应用。
8.权利要求1所述细胞模型或根据权利要求2-4任一项所述方法构建的细胞模型在检测大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞黏附率中的应用。
9.权利要求1所述细胞模型或根据权利要求2-4任一项所述方法构建的细胞模型在检测大肠杆菌感染单层致密奶牛乳腺上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin表达量中的应用。
10.权利要求1所述细胞模型或根据权利要求2-4任一项所述方法构建的细胞模型在检测抗生素替代物保护大肠杆菌感染导致的单层致密奶牛乳腺上皮细胞损伤中的应用；其中，所述抗生素替代物包括干酪乳酸杆菌Zhang。
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