CN111450573A - 一种石墨烯混合填料及制备方法和石墨烯混合填料层析柱及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种石墨烯混合填料及层析柱，所述混合填料中，包括石墨烯材料和层析介质填料，所述石墨烯材料和所述层析介质填料的重量比为1‑50:100，所述石墨烯材料的粒度为500‑5000目，所述层析介质填料的粒度为200‑500目。利用石墨烯的特殊性质(π‑π电子共轭效应)达到具有对π共轭电子结构的化合物的柱吸附，同时，在下层柱具有分离常规杂质的效果，可以进一步分离纯化，吸附杂质，避免了多次操作，可以有效减低目标产物的层析成本和操作时间。

Description

一种石墨烯混合填料及制备方法和石墨烯混合填料层析柱及 应用

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种石墨烯混合填料及其制备方法和石墨烯混合填料层析柱及其应用。

背景技术

目前在药物生产和分析纯化的领域中，特别是一些来源于发酵产品的药物，在生产、发酵过程中也产生了多个结构相似、物理化学性质都相似的副产物；主产物和副产物仅仅差别在于是否存在烯烃或炔烃的结构；例如Lipstatin、Tacrolimus、Astaxanthin、DHA、EPA、Rapamycin、Solanesol、Coenzyme Q10、植物甾醇、维生素E等，以上药物或及其发酵副产物的分离，通常都使用硝酸银或者大孔吸附树脂对主产物进行分离层析，但在层析过程中，硝酸银中银离子具有氧化活性容易导致目标产物降解、银盐的流失损耗大及银盐价格高导致层析成本过高，而大孔吸附树脂纯化比较繁琐效率不高，需要多步分离纯化，废水相对较多，耗材昂贵其需消耗大量溶剂且操作步骤繁琐。

例如大环内酯类药物他克莫司的分离。他克莫司粗品主要来源于发酵产品，发酵过程同时也产生了多个他克莫司类似物，包括二氢他克莫司、8epi-Tacrolimus和子囊霉素。目前主要使用硝酸银的银离子或者大孔吸附树脂的苯环结构对这四个主要物质进行分离层析，很多份专利进行了报道和研究，但这两种方法纯化效率不高，需要多步分离纯化，耗材昂贵其需消耗大量溶剂且操作步骤繁琐、价格相对昂贵。同时，他克莫司还有一种微量杂质8epi-Tacrolimus，该杂质结构和他克莫司有同样结构，只是在侧链的不饱和烯烃上是手性翻转的，用常规层析法也难以分离，一直是他克莫司纯化的难点所在。

例如减肥药奥利司他发酵提取纯化来的原料利普斯他，在发酵液纯化中，除了有同系物副产品外，也有一些油类杂质容易附在层析柱上，在层析过程中不好与主产品分开，较难获得高纯度的原料利普斯他，需进一步分离纯化技术方面进行突破降低成本。

石墨烯(Graphene)是一种由碳原子以sp²杂化方式形成的蜂窝状平面薄膜，是一种只有一个原子层厚度的准二维材料，所以又叫做单原子层石墨。石墨烯片层的横向尺寸对控制石墨烯基材料的微观结构和性质起重要作用。缩小石墨烯片层的尺寸分布可以改善宏观石墨烯材料的特性；而无论是大或小的片层都具有其各自的优势，大片层的石墨烯可用于制造基于石墨烯的三维网络，2D分层体系结构，和光电子器件的导电薄膜。在这些情况下，石墨烯片层越大，和其他片层的联结点越少，接触电阻越小。而小片层的石墨烯，以其更突出的电化学活性的生物相容性，更适合用于感测及生物方面的应用。而且，石墨烯材料的电导率与热导率和石墨烯的片层尺寸有极大的关系。例如，一般情况下，大片层石墨烯的电导率比小片层高。石墨烯微片(Graphene Nanoplatelets)是指碳层数多于10层、厚度在5-100纳米范围内的超薄的石墨烯层状堆积体，在有的文献中，也称为Graphene Nanosheets。石墨烯微片保持了石墨原有的平面型碳六元环共轭晶体结构，具有优异的机械强度、导电、导热性能，以及良好的润滑、耐高温和抗腐蚀特性。相对于普通石墨，石墨烯微片的厚度处在纳米尺度范围内，但其径向宽度可以达到数个到数十个微米，具有超大的形状比(直径/厚度比)，具有较大的比表面积和较强的机械性能。同时由于在石墨烯片层表面有大量的共轭π电子，能产生较强的静电吸附，而且石墨烯是一个平面二维结构，上下两面都可以接触到目标物，经过介质空间位阻后可以有效提高其分离效率。然而由于石墨烯也具有较强的表面能，自身易发生团聚现象，给目标物的分离和洗脱带来不便，需要合理的洗脱剂组成层析柱切向流结合介质材料空间束缚，因此合理的介质比例和空间分散才能提升层析分离效果。

发明内容

为此，需要提供一种石墨烯混合层析介质填料，用于一些含有π共轭电子结构的化合物药物的分离纯化，同时提高纯化效率、简化纯化的过程。

为实现上述目的，发明人提供了一种石墨烯混合填料，所述混合填料中，包括石墨烯材料和层析介质填料，所述石墨烯材料和所述层析介质填料的重量比为1-50:100，所述石墨烯材料的粒度为500-5000目，所述层析介质填料的粒度为200-500目。以上的参数设置，使得石墨烯可以堆砌形成空隙，避免了团聚现象，考虑压缩层析介质也具有刚性，石墨烯可以和刚性的层析介质形成一个牢笼框架使自身发生固定，才不容易导致层析介质填料塌陷造成理论塔板数变小，在洗脱过程中，也不容易发生含有石墨烯固定相填料在使用过程中的下沉，增加了所填装层析柱的使用时间和提高整体层析柱柱效和分离特性。

进一步地，所述层析介质填料包括硅胶、键合硅胶、氧化铝、硅藻土、纤维素粉。

进一步地，所述键合硅胶包括十八烷基键合硅胶、辛烷基键合硅胶、苯基键合硅胶和氰基键合硅胶。

发明人还提供了一种石墨烯混合填料的制备方法，包括以下步骤：

石墨烯悬浮液加入粒度为200-500目的层析介质填料，混合均匀后在90-100℃下烘干2-5小时制得石墨烯混合填料；所述石墨烯混合填料中的石墨烯和所述层析介质填料的重量比为1-50:100；所述层析介质填料包括键合硅胶、氧化铝、硅藻土或纤维素粉；所述石墨烯悬浮液为粒度为500-5000目的石墨烯材料加水或浓度为45-55wt％乙醇水溶液后搅拌均匀制成。

发明人还提供了一种石墨烯混合填料的制备方法，包括以下步骤：

将粒度为500-5000目的石墨烯材料与粒度为200-500目层析介质填料混合均匀，得到石墨烯混合填料，所述石墨烯悬浮液中的石墨烯和所述层析介质填料的重量比为1-50:100；所述层析介质填料为键合硅胶。

发明人再提供了一种石墨烯混合湿料的制备方法，包括以下步骤：

将粒度为500-5000目的石墨烯材料、粒度为200-500目的层析介质填料、水或浓度为45-55wt％乙醇水溶液混合搅拌均匀后制得石墨烯混合湿料，所述石墨烯悬浮液中的石墨烯和所述层析介质填料的重量比为1-50:100；所述层析介质填料为键合硅胶。

发明人提供了一种石墨烯混合填料层析柱，所述层析柱分为上部和下部，所述层析柱的上部填充上面任一所述的石墨烯混合填料，所述层析柱的下部填充层析柱上部使用的层析介质填料,所述层析柱下部的填料高度为层析柱总填料高的5-10％。该下部填充层的设计能够减少在使用过程中石墨烯的流失，起到回收的作用，同时可以进一步的分离纯化，吸附杂质，避免二次操作。

进一步地，所述层析柱的直径与高度比例为1:5-25。

发明人提供了以上层析柱的应用，所述石墨烯混合填料层析柱用于π共轭电子结构的化合物药物的分离纯化。

进一步地，所述π共轭电子结构的化合物药物含有烯烃或炔烃类结构。别于现有技术，上述技术方案用是利用石墨烯的特殊性质(π-π电子共轭效应)达到具有对π共轭电子结构的化合物的柱吸附，同时，在下层柱具有分离常规杂质的效果，可以进一步分离纯化，吸附杂质，避免了二次操作，可以有效减低目标产物的层析成本和操作时间。

附图说明

图1为具体实施方式技术所述纯化前他克莫司粗品的HPLC图；

图2为实施例1氧化铝正向洗脱法纯化所得的他克莫司HPLC图；

图3为实施例2硅胶正向洗脱法纯化所得的他克莫司HPLC图；

图4为实施例3十八烷基键合硅胶反向洗脱法纯化所得的他可莫司HPLC图；

图5为背景技术所述的硝酸银法纯化所得的他克莫司HPLC图；

图6为背景技术所述的大孔树脂吸附法纯化所得的他克莫司HPLC图。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。

实施例1：石墨烯混合氧化铝层析柱的制备

将25重量份粒度为3000-5000目石墨烯粉末加水搅拌均匀制成石墨烯悬浮液；

将石墨烯悬浮液加入100重量份粒度为200-500目的氧化铝，混合均匀后在90℃下烘干2-5小时制得石墨烯混合介质填料；

在层析柱的下部填充粒度为200-500目氧化铝，层析柱的下部高度占层析柱高的8％，在层析柱的上部填充石墨烯混合介质填料，所述层析柱的直径与高度比为1:15。

实施例2：石墨烯混合硅胶层析柱的制备

将10重量份粒度为1000-3000目石墨烯加浓度为50wt％乙醇水溶液搅拌均匀制成石墨烯悬浮液；

将石墨烯悬浮液加入100重量份粒度为200-500目层析硅胶，混合均匀后在100℃下烘干2-5小时制得石墨烯混合介质填料；石墨烯可以和刚性的硅胶介质形成一个牢笼框架使自身发生固定。

在层析柱的下部填充粒度为200-500目层析硅胶，层析柱的下部高度占层析柱高的5％，在层析柱的上部填充石墨烯混合介质填料，所述层析柱的直径与高度比为1:25。

实施例3石墨烯混合十八烷基键合硅胶层析柱的制备：

将30重量份粒度为3000-5000目石墨烯粉末加入100重量份粒度为200-500目十八烷基键合硅胶混合均匀得到石墨烯混合介质填料；

在层析柱的下部填充十八烷基键合硅胶，层析柱的下部高度占层析柱高的8％，在层析柱的上部填充石墨烯混合介质填料，所述层析柱的直径与高度比为1:15。

实施例4：石墨烯混合硅藻土层析柱的制备

石墨烯混合硅藻土湿料的制备:粒度为3000-5000目的石墨烯材料加浓度为45wt％乙醇水溶液制备石墨烯悬浮液；石墨烯悬浮液加入粒度为200-500目硅藻土；所述石墨烯悬浮液中的石墨烯和硅藻土的重量比为10:100；混合均匀后在100℃下烘干2-5小时制得石墨烯混合介质填料；

层析柱的下部填充硅藻土,所述层析柱的上部填充石墨烯混合硅藻土填料，所述层析柱下部高度为层析柱总高的10％，层析柱的直径与高度比例为1:25。

实施例5：石墨烯混合纤维素粉层析柱的制备

石墨烯混合纤维素粉填料的制备：粒度为500-1000目的石墨烯材料加水制备石墨烯悬浮液；石墨烯悬浮液加入粒度为200-500目纤维素粉，混合均匀后在80℃下烘干5小时制得石墨烯混合纤维素粉填料；所述石墨烯混合纤维素粉填料中的石墨烯和纤维素粉的重量比为1:100；

层析柱的下部填充纤维素粉,所述层析柱的上部填充石墨烯混合纤维素粉填料，所述层析柱下部高度为层析柱总高的5％，层析柱的直径与高度比例为1:5。

实施例6石墨烯混合苯基键合硅胶层析柱的制备：

石墨烯混合填料的制备：粒度为1000-2000目的石墨烯材料加入粒度为300-500目苯基键合硅胶，混合均匀后制得石墨烯混合填料；所述混合填料中的石墨烯和苯基键合硅胶的重量比为10:100；

层析柱的下部填充苯基键合硅胶,所述层析柱的上部填充石墨烯混合苯基键合硅胶填料，所述层析柱下部高度为层析柱总高的5％，层析柱的直径与高度比例为1:25。

实施例7石墨烯混合辛烷基键合硅胶层析柱的制备：

石墨烯混合填料的制备：粒度为3000-5000目的石墨烯材料加入粒度为300-500目辛烷基键合硅胶，混合均匀后制得石墨烯混合填料；所述混合填料中的石墨烯和辛烷基键合硅胶的重量比为40:100；

层析柱的下部填充辛烷基键合硅胶,所述层析柱的上部填充石墨烯混合辛烷基键合硅胶填料，所述层析柱下部高度为层析柱总高的10％，层析柱的直径与高度比例为1:5。

他克莫司粗品的纯化试验：所用的他克莫司粗品为他克莫司发酵菌丝乙醇浸泡提取浓缩萃取后经过简单粗结晶的样品，其HPLC图如图1所示。其中RTFK506＝18.5min,RTAC＝16.5min,RT2HFK506＝20.5min,RT8epiTacrolimus＝21.5min。色谱柱条件：Kromsil CN4.6*250mm，5μm，流动相35％乙腈：0.1％磷酸水，流速1.5ml/min，柱温40℃；RT＝13.5min和RT＝15min是异构体峰，在溶液里他克莫司互变异构出来的成分。

用实施例1制备的层析柱进行，他克莫司粗品的纯化试验

待分离液的制备：将1质量份的他克莫司粗品溶解于6质量份的乙酸乙酯得到含他克莫司的溶液，再加入20％乙酸乙酯体积的己烷溶剂，搅拌稀释后制成待分离液；

上样：将待分离液上样实施例1制备的层析柱，形成含有他克莫司的层析柱；所述待分离液的添加量为30g/L柱体积；

洗脱：用洗脱溶剂对层析柱进行梯度洗脱，所述洗脱溶剂由己烷和乙酸乙酯按照4:1和3:1的质量比配制，其中4:1的配比的洗脱溶剂洗脱5个柱体积后，改为3:1的配比进行洗脱；洗脱流速为每小时3个柱体积，洗脱液用HPLC进行跟踪监测，收集他克莫司含量98％以上的洗脱液。

实施例1制备的层析柱进行他克莫司纯化后的HPLC图见图2。

用实施例2制备的层析柱进行，他克莫司粗品的纯化试验

待分离液的制备：将1质量份的他克莫司粗品溶解于4质量份的乙酸乙酯得到含他克莫司的溶液，再加入15％乙酸乙酯体积的石油醚溶剂，搅拌稀释后制成待分离液；

上样：将待分离液上样实施例2制备的层析柱，形成含有他克莫司的层析柱；所述待分离液的添加量为10g/L柱体积；

洗脱：用洗脱溶剂对层析柱进行梯度洗脱，所述洗脱溶剂由石油醚和乙酸乙酯按照4:1和3:1的质量比配制，其中4:1的配比的洗脱溶剂洗脱4个柱体积后，改为3:1的配比进行洗脱；洗脱流速为每小时4个柱体积，洗脱液用HPLC进行跟踪监测，收集他克莫司含量98％以上的洗脱液。

实施例2制备的层析柱进行他克莫司纯化后的HPLC图见图3。

用实施例3制备的层析柱进行，他克莫司粗品的纯化试验

待分离液的制备：将1质量份的他克莫司粗品溶解于5质量份的乙醇得到含他克莫司的溶液，加入20％乙醇体积的水进行搅拌稀释，制成待分离液；

上样：将待分离液上样实施例3的层析柱，形成含有他克莫司的层析柱；所述待分离液的添加量为30g/L层析柱体积；

洗脱：用洗脱溶剂对层析柱进行梯度洗脱，所述洗脱溶剂由水和乙醇按照1：1和2：3的质量比配制，其中1：1的配比的洗脱溶剂洗脱8个柱体积后，改为2：3的配比进行洗脱；洗脱流速为每小时3个柱体积，洗脱液用HPLC进行跟踪监测，收集他克莫司含量98％以上的洗脱液。

实施例3制备的层析柱进行克莫司纯化后的HPLC图见图4。

对比实施例1：

背景技术所述的硝酸银法纯化他克莫司粗品，其HPLC图如图5所示。由图中可见，洗脱液中含有较多RT＝21.5min，8epi-tacrolimus杂质。

对比实施例2

背景技术所述的大孔吸附树脂纯化他克莫司粗品，根据对比文献技术进行纯化，其HPLC图如图6所述，交叉部分样品图含有较多产品的成分损耗。由图中可见，该方法对他克莫司的纯化收率效果较差。

在层析柱中，由于上层的层析介质中混杂了石墨烯，石墨烯中具有的共轭π电子，可以吸附他克莫司侧链上的存在不饱和π键的烯烃结构，而他克莫司的两个主要类似物杂质：二氢他克莫司和子囊霉素，在并没有烯烃或其他不饱和π键结构，可被层析柱分离。同时还能通过本发明的纯化方法在层析柱上分离色素以及他克莫司另外一个微量同系杂质8-epi tacrolimus，该杂质的结构和他克莫司一样，有同样的侧链，但是在那侧链上是手性翻转的，解决了行业内的技术难题。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims (10)

1.一种石墨烯混合填料，其特征在于，所述混合填料中，包括石墨烯材料和层析介质填料，所述石墨烯材料和所述层析介质填料的重量比为1-50:100，所述石墨烯材料的粒度为500-5000目，所述层析介质填料的粒度为200-500目。

2.根据权利要求1所述的石墨烯混合填料，其特征在于，所述层析介质填料包括硅胶、键合硅胶、氧化铝、硅藻土和纤维素粉。

3.根据权权利要求1所述的石墨烯混合填料，其特征在于，所述键合硅胶包括十八烷基键合硅胶、辛烷基键合硅胶、苯基键合硅胶和氰基键合硅胶。

4.一种石墨烯混合填料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

石墨烯悬浮液加入粒度为200-500目的层析介质填料，混合均匀后在90-100℃下烘干2-5小时制得石墨烯混合填料；所述石墨烯混合填料中的石墨烯和所述层析介质填料的重量比为1-50:100；所述层析介质填料包括键合硅胶、氧化铝、硅藻土或纤维素粉；所述石墨烯悬浮液为粒度为500-5000目的石墨烯材料加水或浓度为45-55wt％乙醇水溶液后搅拌均匀制成。

5.一种石墨烯混合填料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将粒度为500-5000目的石墨烯材料与粒度为200-500目层析介质填料混合均匀，得到石墨烯混合填料，所述石墨烯悬浮液中的石墨烯和所述层析介质填料的重量比为1-50:100；所述层析介质填料为键合硅胶。

6.一种石墨烯混合湿料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将粒度为500-5000目的石墨烯材料和粒度为200-500目的层析介质填料、水或浓度为45-55wt％乙醇水溶液混合搅拌均匀后制得石墨烯混合湿料，所述石墨烯材料和所述层析介质填料的重量比为1-50:100，所述层析介质填料为键合硅胶。

7.一种石墨烯混合填料层析柱，其特征在于，所述层析柱分为上部和下部，所述层析柱的上部填充权利要求1-3任一所述的石墨烯混合填料，所述层析柱的下部填充层析柱上部使用的层析介质填料,所述层析柱下部的填料高度为层析柱总填料高的5-10％。

8.根据权利要求7所述的一种石墨烯混合填料层析柱，其特征在于，所述层析柱的直径与高度比例为1:5-25。

9.一种如权利要求7或8所述的石墨烯混合填料层析柱的应用，其特征在于，所述石墨烯混合填料层析柱用于π共轭电子结构的化合物药物的分离纯化。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述π共轭电子结构的化合物药物含有烯烃或炔烃类结构。

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