CN111440861B - 甲基化的miR-124基因在制备用于诊断抑郁症的标志物中的用途 - Google Patents

甲基化的miR-124基因在制备用于诊断抑郁症的标志物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了甲基化的miR‑124基因在制备用于诊断抑郁症的标志物中的用途，所述的甲基化的miR‑124基因为甲基化的MIR124‑1基因、MIR124‑2基因或者MIR124‑3基因中的任意一种或者两种以上的组合。本发明发现miR‑124的三个前体基因甲基化水平在抑郁症患者中显著降低，成为判别抑郁症及健康对照的诊断标志物。

Description

甲基化的miR-124基因在制备用于诊断抑郁症的标志物中的 用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种诊断标记物，具体来说是miR-124基因甲基化在制备用于诊断抑郁症的标志物中的用途。
背景技术
抑郁症（major depressive disorder，MDD）是一类严重影响患者生活质量的高患病、高复发、高致残及高自杀的精神疾病。2019中国心理健康调查（the China MentalHealth Survey, CMHS）表明现中国的心境障碍终身患病率为6.8%，重性抑郁障碍的终身患病率为3.4%，为仅此于焦虑障碍的中国第二大精神疾病，造成了严重的疾病负担。在临床实践中，抑郁症的识别率仍然较低，而漏诊和误诊率较高。这是由于目前对抑郁症的诊断主要依赖于医生的精神检查和个人经验，缺乏客观有效的生物学指标。因此，寻找具有高度敏感性和特异性的生物标志物来完善抑郁症的诊断，是临床医生和发明者迫切需要解决的问题。
大量肿瘤相关发明已经发现miRNA甲基化极有可能作为疾病诊断及转移标志物，且可能作为治疗靶点之一。Torres-Ferreira等人的发明发现尿液中miR-193b启动子甲基化水平可准确检测前列腺癌，miR-34b/c或miR-129-2启动子甲基化可定义临床侵袭性肿瘤的亚型。Rogeri 等人亦发现4种基因的高甲基化可能为宫颈癌前体病变的一种有前途的生物标志物。Loginov 等人检测12种miRNAs，发现8种miRNAs在卵巢癌组织中存在高表达，1种miRNA存在低甲基化状态，且与上皮性卵巢癌向淋巴结、腹膜和远处器官转移存在显著的相关性。 Shimizu 等人发现miRNA基因的表观沉默可能参与了膀胱癌的发展，四种miRNA的甲基化判别膀胱癌的敏感性为81%，特异性为89%， ROC曲线下面积为0.916。因此，从以上发明可推测miRNA的甲基化极有可能成为癌症等疾病的生物标志物。
在众多的miRNA中，miR-124在中枢神经系统中特异性表达，是成人大脑中最为丰富的miRNAs之一。许多研究发现miR-124在动物抑郁模型中存在表达异常，且在尸脑研究及临床研究的MDD患者中得到验证，表明miR-124极可能是一个重要的抑郁症生物标志物和治疗靶点。甲基化、羟甲基化及组蛋白修饰等表观遗传调控能影响 miRNA 表达。miRNA邻近CpG岛的高甲基化和低甲基化可分别抑制和激活miRNA表达。经查阅文献还未发现有研究检测miR-124三个前体基因在MDD患者中的甲基化水平，因此，本发明首次探索miR-124三个前体基因甲基化水平在抑郁症及健康人群中的表达差异。
miR-124三个前体基因(MIR124-1、MIR124-2、MIR124-3)启动子区(上游2kb至下游1kb)的CpG岛基因序列在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)及Ensembl(http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/Index)等数据库中均能查阅。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了甲基化的miR-124基因在制备用于诊断抑郁症的标志物中的用途。所述的这种用途要解决现有技术中抑郁症的识别率较低、漏诊和误诊率较高的技术问题。
本发明提供了甲基化的miR-124基因在制备用于诊断抑郁症的标志物中的用途。
进一步的，所述的甲基化的miR-124基因为甲基化的MIR124-1基因、MIR124-2基因或者MIR124-3基因中的任意一种或者两种以上的组合。
进一步的，所述的甲基化的miR-124基因选自MIR124-1基因的三个CpG岛中的任意一种或者两种以上的组合，其基因序列分别为：MIR124-1_1 chr8:9762839-9762653Length:187 tggggactgcggccagtctcttaaaaaaggagaacaaaaagccgaagaccttgtgtggccgccgggacaaagcaccttgggttcggcgagaagggacgcgcaggagcgctgaacccagaacacgcgtggccgctgcggaagggcgtccgcccggcgtgcggaacgctgagggtattcggattgtctt（SEQ ID NO.1）
MIR124-1_2 chr8:9760765-9760983 Length:219
ggacaggcagccggagggagctccagacccctcccctcgcgcccgcggccgctgcgcggaggtctgcggagggcgcctggctcggtcggtcgctccttccttggcgggccctcgccgacccacggtgctcagccagccccattcttggcattcaccgcgtgccttaattgtatggacatttaaatcaaggtccgctgtgaacacggagagagaggcctt（SEQ ID NO.2）
MIR124-1_4 chr8:9761467-9761664 Length:198
gcccaggaaactgaaggggactaggaggaggaagaagagagcgaaggacaaggagagcagcggggactcggcagcggcagccggggcagggcgcgcggccgccgcctctttacctccatcgctgagtgggggcgcagccgggccgggcgtgccgcaggggcgagttgccgcggtccggggctgggacctggggattca（SEQ ID NO.3）
进一步的，所述的甲基化的miR-124基因选自MIR124-2基因的三个CpG岛中的任意一种或者两种以上的组合，其基因序列分别为：MIR124-2_1 chr8:65289879-65290057Length:179
ggatcagcaagcgagggggaaagaccggaccgctccgacccaccccctccctacccccacctcccaccttaaagcaccttataccacggaaggctctcagcctcttctttcctctgcgaacgcgctgagcagcgattgaaaacgttttggtcctctgcaggtttgaacagggctagcag（SEQ ID NO.4）
MIR124-2_2 chr8:65290522-65290334 Length:189
ggatacaaggtgacaagaggacaggaccccagtcggccggtcgcgacctccgtccccaggcttcagggggacgcggaggggaccctgagcccacggagcgcggggcccgcagcccggggggagggggtggcgcgatgactgtaagcgcaggtctgggctgcggaagtccagaggagggtgcatgcgctg（SEQ ID NO.5）
MIR124-2_3 chr8:65290874-65290642 Length:233
agtggccacagtctggggctggaagcgcctgggccgggcggagggagggcaagcaggagagagaaaagggtgagggaagttgacctctacgggcggagccctctgcgcagcgggcaggaggcagcgggcgcgacggctcttttcacggcgtcccctacggcgtggtcgacccgagggaaaggcccgctcccgctccagagtccgaggaaaggagagagagctgagagctggtc（SEQ ID NO.6）
进一步的，所述的甲基化的miR-124基因选自MIR124-3基因的三个CpG岛中的任意一种或者两种以上的组合，其基因序列分别为：MIR124-3_1 chr20:61808446-61808655Length:210
gtgcgttctgcaggcgccagacaggagacgcgaacccgcggtcagggcccgagtgcgggtgcgtgtctgcgggtgccgctgggctgcgtgccggcgaggcgtgcgcgtggcgaggcgtgcgcgtggcggggtgtggctagaggtgtcaatgtgcagctggaggggctgcgcgcgtgggtgcaggagggccatgtgaggggctggagtgtg（SEQ IDNO.7）
MIR124-3_2 chr20:61809036-61808831 Length:206
cgctgcaggcgcccagctcctgctagcccggcccggccccgatgcaactgtccccgcgcccgccgccgccgccgccgtcgccgttgcctccgcgcgtatccgcgctccgctccggcaccggccgattatcactggggcgcgcggtgacgtcacccggacaccggccccgccgctgcctccccgaggtgtccttgagaactgcgggg（SEQ ID NO.8）
MIR124-3_4 chr20:61809699-61809972 Length:274
gactgggacagcacagtcggctgagcgcagcgcccccgccctgcccgccacgcggcgaagacgcctgagcgttcgcgcccctcgggcgaggaccccacgcaagcccgagccggtcccgaccctggccccgacgctcgccgcccgccccagccctgagggcccctctgcgtgttcacagcggaccttgatttaatgtctatacaattaaggcacgcggtgaatgccaagagaggcgcctccgccgctcctttctcatggaaatggcccgcgagcc（SEQ ID NO.9）
本发明通过寻找具有高度敏感性和特异性的客观有效的生物标志物来完善抑郁症的诊断，以解决在临床实践中因主要依赖于医生的精神检查和个人经验而导致抑郁症的识别率较低，而漏诊和误诊率较高的问题。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明发现miR-124的三个前体基因甲基化水平在抑郁症患者中显著降低，成为判别抑郁症及健康对照的诊断标志物。
附图说明
图1显示 miR-124三个前体基因启动子区域附近的11个CpG岛甲基化水平。注：与健康对照组相比，11个CpG岛在MDD患者中均存在低甲基化，其中有9个CpG岛(MIR124-1_3和MIR124-3_3除外)存在显著的统计学差异。
图2显示交叉验证与λ值的选择。注：在一个标准误差内最优的λ值为0.15 (log(λ)= -1.90)。
图3显示 7个CpG位点的甲基化水平。注：与健康对照组相比，7个CpG生物标志物的甲基化水平在MDD患者中显著降低，且具有显著的统计学差异。
图4显示 MDD患者与对照组的平均甲基化评分。注：患者的平均甲基化评分低于对照组，且两组具有显著的统计学差异。
图5显示受试者工作曲线与曲线下面积。注：甲基化评分判别MDD和对照组的AUC值达到0.905。
具体实施方式
1． 发明对象
抑郁症患者
纳入33例来自上海交通大学医学院附属精神卫生中心的MDD患者。由有经验的精神科医生根据精神障碍诊断与统计手册（第四版）(Diagnostic and Statistical Manualof Mental Disorders, DSM-IV)的标准做出诊断。
入组标准：
1）年龄18-65岁;
2）汉族;
3）汉密尔顿抑郁量表(HAMD-17)>17；
4）首发未用药或复发但停用抗精神病药物8周以上。
排除标准：
1）患有除MDD外其他DSM-IV轴- I型精神疾病的患者；
2）孕妇或哺乳期妇女。
对照组
招募33例性别及年龄相匹配的健康对照。
入组标准：
1)年龄18-65岁
2)BECK抑郁自评问卷（13项）≤4分；
排除标准：
1)符合任意DSM-IV疾病诊断；
2)患有躯体性疾病如自身免疫性疾病，糖脂代谢性疾病等；
3)吸烟或饮酒；
4)孕妇或哺乳期妇女。
本发明经上海市精神卫生中心的机构伦理审查委员会批准。所有参与者均签署了知情同意书。
2.CpG位点的选择
检测miR-124三个前体基因(MIR124-1、MIR124-2、MIR124-3)启动子区上的CpG岛。检测范围为三个前体基因转录起始位点(TSS)上游2 k处至下游1 k处，纳入标准如下:
1)CpG比值(观测值/期望值) > 0.60;
2)GC含量> 50%;
3)长度> 200 bp。
最后，共检测miR-124前体基因启动子区的11个CpG岛，包括222个CpG位点。详细信息见表1。）
表1. miR-124三个前体基因上CpG 岛的具体信息
Table 1. The specific information of CpG islands on three precursorgenes of miR-124.
Target Chr Gene TSS Start End Length Target_ Strand Distance2TSS
MIR124-1_1 8 MIR124-1 9760982 9762839 9762653 187 - -1857
MIR124-1_2 8 MIR124-1 9760982 9760765 9760983 219 + 217
MIR124-1_3 8 MIR124-1 9760982 9761472 9761245 228 - -490
MIR124-1_4 8 MIR124-1 9760982 9761467 9761664 198 + -485
MIR124-2_1 8 MIR124-2 65291705 65289879 65290057 179 + -1826
MIR124-2_2 8 MIR124-2 65291705 65290522 65290334 189 - -1183
MIR124-2_3 8 MIR124-2 65291705 65290874 65290642 233 - -831
MIR124-3_1 20 MIR124-3 61809851 61808446 61808655 210 + -1405
MIR124-3_2 20 MIR124-3 61809851 61809036 61808831 206 - -815
MIR124-3_3 20 MIR124-3 61809851 61809667 61809931 265 + -184
MIR124-3_4 20 MIR124-3 61809851 61809699 61809972 274 + -152
具体的基因序列如下：
MIR124-1基因的四个CpG岛
MIR124-1_1 chr8:9762839-9762653 Length:187 tggggactgcggccagtctcttaaaaaaggagaacaaaaagccgaagaccttgtgtggccgccgggacaaagcaccttgggttcggcgagaagggacgcgcaggagcgctgaacccagaacacgcgtggccgctgcggaagggcgtccgcccggcgtgcggaacgctgagggtattcggattgtctt（SEQ ID NO.1）
MIR124-1_2 chr8:9760765-9760983 Length:219
ggacaggcagccggagggagctccagacccctcccctcgcgcccgcggccgctgcgcggaggtctgcggagggcgcctggctcggtcggtcgctccttccttggcgggccctcgccgacccacggtgctcagccagccccattcttggcattcaccgcgtgccttaattgtatggacatttaaatcaaggtccgctgtgaacacggagagagaggcctt（SEQ ID NO.2）
MIR124-1_3 chr8:9761472-9761245 Length:228
ctgggcgaagcagagggcgacatgggtgggtgggttgctgcgctggggcgaggtggggtcgatgttgttttttcattgtctggagctgcaggggaggcgaggcgcggggaaaggggcgaggggagccggggtaattaacacgggggaggcacccctccgtctcccacttccacccacacccccatccctccaccccctccgctttgcaggaaaaagcctggatgcgaa（SEQ ID NO.10）
MIR124-1_4 chr8:9761467-9761664 Length:198
gcccaggaaactgaaggggactaggaggaggaagaagagagcgaaggacaaggagagcagcggggactcggcagcggcagccggggcagggcgcgcggccgccgcctctttacctccatcgctgagtgggggcgcagccgggccgggcgtgccgcaggggcgagttgccgcggtccggggctgggacctggggattca（SEQ ID NO.3）
MIR124-2基因的三个CpG岛
MIR124-2_1 chr8:65289879-65290057 Length:179
ggatcagcaagcgagggggaaagaccggaccgctccgacccaccccctccctacccccacctcccaccttaaagcaccttataccacggaaggctctcagcctcttctttcctctgcgaacgcgctgagcagcgattgaaaacgttttggtcctctgcaggtttgaacagggctagcag（SEQ ID NO.4）
MIR124-2_2 chr8:65290522-65290334 Length:189
ggatacaaggtgacaagaggacaggaccccagtcggccggtcgcgacctccgtccccaggcttcagggggacgcggaggggaccctgagcccacggagcgcggggcccgcagcccggggggagggggtggcgcgatgactgtaagcgcaggtctgggctgcggaagtccagaggagggtgcatgcgctg（SEQ ID NO.5）
MIR124-2_3 chr8:65290874-65290642 Length:233
agtggccacagtctggggctggaagcgcctgggccgggcggagggagggcaagcaggagagagaaaagggtgagggaagttgacctctacgggcggagccctctgcgcagcgggcaggaggcagcgggcgcgacggctcttttcacggcgtcccctacggcgtggtcgacccgagggaaaggcccgctcccgctccagagtccgaggaaaggagagagagctgagagctggtc（SEQ ID NO.6）
MIR124-3基因的四个CpG岛
MIR124-3_1 chr20:61808446-61808655 Length:210
gtgcgttctgcaggcgccagacaggagacgcgaacccgcggtcagggcccgagtgcgggtgcgtgtctgcgggtgccgctgggctgcgtgccggcgaggcgtgcgcgtggcgaggcgtgcgcgtggcggggtgtggctagaggtgtcaatgtgcagctggaggggctgcgcgcgtgggtgcaggagggccatgtgaggggctggagtgtg（SEQ IDNO.7）
MIR124-3_2 chr20:61809036-61808831 Length:206
cgctgcaggcgcccagctcctgctagcccggcccggccccgatgcaactgtccccgcgcccgccgccgccgccgccgtcgccgttgcctccgcgcgtatccgcgctccgctccggcaccggccgattatcactggggcgcgcggtgacgtcacccggacaccggccccgccgctgcctccccgaggtgtccttgagaactgcgggg（SEQ ID NO.8）
MIR124-3_3 chr20:61809667-61809931 Length:265
ggagaagtgtgggctcctccgagtcgggggcggactgggacagcacagtcggctgagcgcagcgcccccgccctgcccgccacgcggcgaagacgcctgagcgttcgcgcccctcgggcgaggaccccacgcaagcccgagccggtcccgaccctggccccgacgctcgccgcccgccccagccctgagggcccctctgcgtgttcacagcggaccttgatttaatgtctatacaattaaggcacgcggtgaatgccaagagagg（SEQ ID NO.11）
MIR124-3_4 chr20:61809699-61809972 Length:274
gactgggacagcacagtcggctgagcgcagcgcccccgccctgcccgccacgcggcgaagacgcctgagcgttcgcgcccctcgggcgaggaccccacgcaagcccgagccggtcccgaccctggccccgacgctcgccgcccgccccagccctgagggcccctctgcgtgttcacagcggaccttgatttaatgtctatacaattaaggcacgcggtgaatgccaagagaggcgcctccgccgctcctttctcatggaaatggcccgcgagcc（SEQ ID NO.9）
3.MethylTarget 检测甲基化水平
取受试者5ml外周血，离心分装，-80℃冰箱冻存。采用上海莱枫生物科技有限公司1ml 血液基因组DNA提取试剂盒。采用MethylTarget 检测甲基化水平，该技术依托多重PCR技术，结合二代测序平台，实现对多个特定CpG岛同时捕获测序，并基于高深度测序数据，准确计算每个CpG位点的甲基化水平，在之前的研究中已被广泛使用[1,2]。使用EZ DNAMethylation-Gold™ Kit (Zymo Research, CA, USA)对 400ng基因组DNA进行重亚硫酸盐转换。亚硫酸氢钠优先将未甲基化的胞嘧啶残基脱氨基为尿嘧啶，而甲基胞嘧啶则保持不变。采用HotStart Taq聚合酶试剂盒(Takara)进行PCR扩增，构建文库，然后在IlluminaHiSeq测序仪上进行测序。用于PCR的引物序列的详细信息见表2。每个CpG位点的甲基化水平以甲基化胞嘧啶占总胞嘧啶的百分比来计算。启动子区域和第一个外显子的甲基化状态被定义为区域内所有CpG位点的平均甲基化水平。
表2. MethylTarget™的引物信息
TARGET PrimerF PrimerR
MIR124-1_1 tggggattgyggttagttttt（SEQ ID NO.12） aaaacaatccraataccctcaac（SEQ ID NO.13）
MIR124-1_2 ggataggtagtyggagggagttttag（SEQ ID NO.14） aaaacctctctctccrtattcacaa（SEQ ID NO.15）
MIR124-1_3 ttgggygaagtagagggygata（SEQ ID NO.16） ttcrcatccaaactttttcctaca（SEQ ID NO.17）
MIR124-1_4 gtttaggaaattgaaggggattagg（SEQ ID NO.18） taaatccccaaatcccaacc（SEQ ID NO.19）
MIR124-2_1 ggattagtaagygagggggaaaga（SEQ ID NO.20） ctactaaccctattcaaacctacaaaa（SEQ ID NO.21）
MIR124-2_2 ggatataaggtgataagaggataggatttt（SEQ ID NO.22） caacrcatacaccctcctctaaac（SEQ ID NO.23）
MIR124-2_3 agtggttatagtttggggttgga（SEQ ID NO.24） aaccaactctcaactctctctcct（SEQ ID NO.25）
MIR124-3_1 gtgygttttgtaggygttagataggag（SEQ ID NO.26） cacactccaacccctcaca（SEQ ID NO.27）
MIR124-3_2 ygttgtaggygtttagtttttgttagtt（SEQ ID NO.28） ccccrcaattctcaaaaaca（SEQ ID NO.29）
MIR124-3_3 ggagaagtgtgggttttttygagt（SEQ ID NO.30） cctctcttaacattcaccrcrtacc（SEQ ID NO.31）
MIR124-3_4 gattgggatagtatagtyggttgagyg（SEQ ID NO.32） aactcrcraaccatttccataaaa（SEQ ID NO.33）
注：y、r为简并碱基，y: c/t，r: g/a.
[1]Sun X, Tian Y, Zheng Q, Zheng R, Lin A, Chen T, Zhu Y, Lai M.Anovel discriminating colorectal cancer model for differentiating normal andtumor tissues.Epigenomics,2018,10(11):1463-1475.
[2]Qi R, Luo Y, Zhang L, Weng Y, Surento W, Xu Q, Jahanshad N, Li L,Cao Z, Lu GM, Thompson PM. Decreased functional connectivity of hippocampalsubregions and methylation of the NR3C1 gene in Han Chinese adults who losttheir only child. Psychol Med, 2020 Jan 27:1-10.
4.统计方法
Shapiro-Wilk检验评估连续性变量的正态分布。采用独立样本t检验或Mann-Whitney U检验来比较病例组及对照组的CpG岛及CpG位点的甲基化水平。独立样本t检验比较两组均满足正态分布的连续性变量，若有一组或两组数据均不满足正态分布，则采用Mann-Whitney U检验来比较。采用SPSS 20.0软件(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)进行统计分析。采用R软件中的ggplot2包进行绘图。
Lasso回归分析是一种常用的高维数据降维方法，其特点是在拟合广义线性模型的同时进行变量筛选和复杂度调整。变量筛选是指不将所有的变量都拟合到模型中，而是有选择的将变量放入模型中以获得更好的性能参数。复杂度调整的程度由参数λ控制，λ越大对较多变量的模型惩罚力度就越大，从而获得一个变量较少的模型。因此，通过LASSO回归分析可以挑选出与疾病最相关的候选CpG位点，而忽略对模型贡献不大的CpG位点。在本发明中，最佳 λ 值为交叉验证误差在一个标准误差内的λ值。最后，将挑选出的CpG位点的非零系数计算甲基化评分。甲基化评分定义为各CpG位点甲基化水平乘以方程中相应位点非零系数的总和。采用R语言中的glmnet包进行LASSO回归分析。受试者工作特征(Receiveroperating characteristic， ROC)曲线和曲线下面积(The area under the curve， AUC)评价模型的鉴别及诊断性能。双侧P < 0.05被定义为有统计学差异。
5.主要结果
5.1受试者人口学和临床特征
受试者的人口统计学和临床特征见表3。MDD患者与健康对照组在性别和年龄方面均无统计学差异。MDD患者本次病程为（11.28 ± 13.98）月，总病程为（29.33 ± 4.48）月，基线HAMD-17 评分为（22.64 ± 2.66）分，基线HAMA评分为（16.33±4.81）分，基线CGI评分为（4.55±0.75）分。
表3. 受试者的人口统计学和临床特征
Table 3. Demographic and clinical characteristics of the subjects
抑郁症 (n=33) 对照 (n = 33) χ2 or t or z p-value
性别 (男/女) 18/15 14/19 0.971 0.325a
年龄 (年) 33.76 ± 12.48 34.91 ± 11.85 -0.019 0.985b
BMI 23.22 ± 3.34
c 本次病程 (月) 11.28 ± 13.98
c 总病程 (月) 29.33 ± 4.48
c 基线HAMD-17 评分 22.64 ± 2.66
c 基线 HAMA评分 16.33±4.81
c 基线 CGI评分 4.55±0.75
注：BMI:体质指数a卡方检验; b Mann-Whitney test. c均数± 标准差 (SD).
5.2 MDD患者miR-124三个前体基因的甲基化水平较低
对miR-124三个前体基因启动子区域附近的11个CpG岛 (MIR124-1_1、MIR124-1_2、MIR124-1_3、MIR124-2_1、MIR124-2_2、MIR124-2_3、MIR124-3_1、MIR124-3_2、MIR124-3_4、MIR124-3_4，详见表1)进行扩增和测序。结果表明，与健康对照组相比，11个CpG岛(MIR124-1_3和MIR124-3_3除外) 在MDD患者中均存在低甲基化，其中有9个CpG岛存在显著的统计学差异。见图1。
此外，对于单个CG位点的甲基化水平，我们发现miR-124前体基因的222个CG位点中有137个在MDD患者和对照组之间存在显著差异。
5.3降维与模型构建
执行LASSO回归模型降维后，在一个标准误差内最优的λ值为0.15 (log(λ) = -1.90)(图2)。在137差异CpG位点中有7个位点(CpG 1 - 7)为与抑郁症最相关的候选CpG位点 (表2)。每个受试者的甲基化分值由以下方程计算而来:
甲基化分值= (15.49×CpG 1) + (8.47×CpG 2) + (17.81×CpG 3) + (28.82×CpG 4) + (3.52×CpG 5) + (0.70×CpG 6) + (3.55×CpG 7).
与健康对照组相比，这7个CpG生物标志物的甲基化水平在MDD患者中显著降低(表4，图3) (p-value < 0.001)。MDD患者的平均甲基化评分也低于对照组(3.11±0.39 vs3.91±0.55，z=-5.66， p=0.000)(图4)。甲基化评分判别MDD和对照组的AUC值达到0.905(图5)。
表4 在MDD患者和对照组中筛选出的7个CpG位点的甲基化水平
ID Target Position Nonzero coefficient Normal MDD patients t or Z p-value
CpG 1 MIR124-1_1 123 15.49 0.050±0.009 0.042±0.005 -3.89a 5E-05
CpG 2 MIR124-1_2 40 8.47 0.024±0.008 0.017±0.004 -4.97b 8.5E-06
CpG 3 MIR124-1_2 46 17.81 0.021±0.006 0.015±0.004 -4.22a 1.2E-05
CpG 4 MIR124-1_4 94 28.82 0.050±0.009 0.040±0.006 -4.48a 3.7E-06
CpG 5 MIR124-2_2 42 3.52 0.069±0.013 0.057±0.007 -4.75a 2E-05
CpG 6 MIR124-2_3 158 0.70 0.146±0.031 0.105±0.032 -5.23 b 2E-06
CpG 7 MIR124-3_1 92 3.55 0.210±0.029 0.179±0.025 -3.93a 4.2E-05
注：aMann-Whitney test; b独立样本t检验
6、发明的效果
本发明对miR-124三个前体基因启动子区域附近的11个CpG岛进行扩增和测序后发现，与健康对照组相比，9个CpG岛的甲基化水平在MDD患者中显著降低。运用LASSO回归模型降维，从 137差异CpG位点中筛选出7个与抑郁症最相关的候选CpG位点，而这些位点的甲基化水平均在抑郁症中显著降低。通过甲基化分值构建抑郁症及健康对照的判别模型，ROC曲线均表明miR-124启动子区甲基化水平能较好的区分疾病与健康状态（AUC值达到0.905）。因此，我们认为miR-124甲基化水平可以成为区别抑郁症及健康对照的外周诊断标志物。
序列表
<110> 上海交通大学医学院附属精神卫生中心
<120> 甲基化的miR-124基因在制备用于诊断抑郁症的标志物中的用途
<160> 33
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 187
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
tggggactgc ggccagtctc ttaaaaaagg agaacaaaaa gccgaagacc ttgtgtggcc 60
gccgggacaa agcaccttgg gttcggcgag aagggacgcg caggagcgct gaacccagaa 120
cacgcgtggc cgctgcggaa gggcgtccgc ccggcgtgcg gaacgctgag ggtattcgga 180
ttgtctt 187
<210> 2
<211> 219
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
ggacaggcag ccggagggag ctccagaccc ctcccctcgc gcccgcggcc gctgcgcgga 60
ggtctgcgga gggcgcctgg ctcggtcggt cgctccttcc ttggcgggcc ctcgccgacc 120
cacggtgctc agccagcccc attcttggca ttcaccgcgt gccttaattg tatggacatt 180
taaatcaagg tccgctgtga acacggagag agaggcctt 219
<210> 3
<211> 198
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
gcccaggaaa ctgaagggga ctaggaggag gaagaagaga gcgaaggaca aggagagcag 60
cggggactcg gcagcggcag ccggggcagg gcgcgcggcc gccgcctctt tacctccatc 120
gctgagtggg ggcgcagccg ggccgggcgt gccgcagggg cgagttgccg cggtccgggg 180
ctgggacctg gggattca 198
<210> 4
<211> 179
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
ggatcagcaa gcgaggggga aagaccggac cgctccgacc caccccctcc ctacccccac 60
ctcccacctt aaagcacctt ataccacgga aggctctcag cctcttcttt cctctgcgaa 120
cgcgctgagc agcgattgaa aacgttttgg tcctctgcag gtttgaacag ggctagcag 179
<210> 5
<211> 189
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
ggatacaagg tgacaagagg acaggacccc agtcggccgg tcgcgacctc cgtccccagg 60
cttcaggggg acgcggaggg gaccctgagc ccacggagcg cggggcccgc agcccggggg 120
gagggggtgg cgcgatgact gtaagcgcag gtctgggctg cggaagtcca gaggagggtg 180
catgcgctg 189
<210> 6
<211> 233
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
agtggccaca gtctggggct ggaagcgcct gggccgggcg gagggagggc aagcaggaga 60
gagaaaaggg tgagggaagt tgacctctac gggcggagcc ctctgcgcag cgggcaggag 120
gcagcgggcg cgacggctct tttcacggcg tcccctacgg cgtggtcgac ccgagggaaa 180
ggcccgctcc cgctccagag tccgaggaaa ggagagagag ctgagagctg gtc 233
<210> 7
<211> 210
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
gtgcgttctg caggcgccag acaggagacg cgaacccgcg gtcagggccc gagtgcgggt 60
gcgtgtctgc gggtgccgct gggctgcgtg ccggcgaggc gtgcgcgtgg cgaggcgtgc 120
gcgtggcggg gtgtggctag aggtgtcaat gtgcagctgg aggggctgcg cgcgtgggtg 180
caggagggcc atgtgagggg ctggagtgtg 210
<210> 8
<211> 206
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
cgctgcaggc gcccagctcc tgctagcccg gcccggcccc gatgcaactg tccccgcgcc 60
cgccgccgcc gccgccgtcg ccgttgcctc cgcgcgtatc cgcgctccgc tccggcaccg 120
gccgattatc actggggcgc gcggtgacgt cacccggaca ccggccccgc cgctgcctcc 180
ccgaggtgtc cttgagaact gcgggg 206
<210> 9
<211> 274
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
gactgggaca gcacagtcgg ctgagcgcag cgcccccgcc ctgcccgcca cgcggcgaag 60
acgcctgagc gttcgcgccc ctcgggcgag gaccccacgc aagcccgagc cggtcccgac 120
cctggccccg acgctcgccg cccgccccag ccctgagggc ccctctgcgt gttcacagcg 180
gaccttgatt taatgtctat acaattaagg cacgcggtga atgccaagag aggcgcctcc 240
gccgctcctt tctcatggaa atggcccgcg agcc 274
<210> 10
<211> 228
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
ctgggcgaag cagagggcga catgggtggg tgggttgctg cgctggggcg aggtggggtc 60
gatgttgttt tttcattgtc tggagctgca ggggaggcga ggcgcgggga aaggggcgag 120
gggagccggg gtaattaaca cgggggaggc acccctccgt ctcccacttc cacccacacc 180
cccatccctc caccccctcc gctttgcagg aaaaagcctg gatgcgaa 228
<210> 11
<211> 265
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
ggagaagtgt gggctcctcc gagtcggggg cggactggga cagcacagtc ggctgagcgc 60
agcgcccccg ccctgcccgc cacgcggcga agacgcctga gcgttcgcgc ccctcgggcg 120
aggaccccac gcaagcccga gccggtcccg accctggccc cgacgctcgc cgcccgcccc 180
agccctgagg gcccctctgc gtgttcacag cggaccttga tttaatgtct atacaattaa 240
ggcacgcggt gaatgccaag agagg 265
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tggggattgy ggttagtttt t 21
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aaaacaatcc raataccctc aac 23
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggataggtag tyggagggag ttttag 26
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aaaacctctc tctccrtatt cacaa 25
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttgggygaag tagagggyga ta 22
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ttcrcatcca aactttttcc taca 24
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gtttaggaaa ttgaagggga ttagg 25
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
taaatcccca aatcccaacc 20
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggattagtaa gygaggggga aaga 24
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ctactaaccc tattcaaacc tacaaaa 27
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggatataagg tgataagagg ataggatttt 30
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
caacrcatac accctcctct aaac 24
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
agtggttata gtttggggtt gga 23
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
aaccaactct caactctctc tcct 24
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gtgygttttg taggygttag ataggag 27
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cacactccaa cccctcaca 19
<210> 28
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ygttgtaggy gtttagtttt tgttagtt 28
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ccccrcaatt ctcaaaaaca 20
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ggagaagtgt gggtttttty gagt 24
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
cctctcttaa cattcaccrc rtacc 25
<210> 32
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gattgggata gtatagtygg ttgagyg 27
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
aactcrcraa ccatttccat aaaa 24

Claims (1)

1.检测miR-124基因CpG位点甲基化的试剂在制备用于诊断抑郁症产品中的用途，所述的miR-124基因CpG位点为7个CpG位点的组合，CpG 1为miR-124前体基因MIR-124-1_1 CpG岛基因序列SEQ ID NO.1的第123位点，CpG 2为miR-124前体基因MIR-124-1_2 CpG岛基因序列SEQ ID NO.2的第40位点，CpG 3为miR-124前体基因MIR-124-1_2 CpG岛基因序列SEQID NO.2的第46位点，CpG 4为miR-124前体基因MIR-124-1_4 CpG岛基因序列SEQ ID NO.3的第94位点，CpG 5为miR-124前体基因MIR-124-2_2 CpG岛基因序列SEQ ID NO.5的第42位点，CpG 6为miR-124前体基因MIR-124-2_3 CpG岛基因序列SEQ ID NO.6的第158位点，CpG7为miR-124前体基因MIR-124-3_1 CpG岛基因序列SEQ ID NO.7的第92位点；通过计算甲基化分值来诊断抑郁症，甲基化分值= (15.49×CpG 1甲基化水平) + (8.47×CpG 2甲基化水平) + (17.81×CpG 3甲基化水平) + (28.82×CpG 4甲基化水平) + (3.52×CpG 5甲基化水平) + (0.70×CpG 6甲基化水平) + (3.55×CpG 7甲基化水平)，抑郁症患者的甲基化分值显著低于健康对照。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111899869A (zh) * 2020-08-03 2020-11-06 东南大学 一种抑郁症患者识别系统及其识别方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1884528A (zh) * 2006-06-29 2006-12-27 上海交通大学 与利培酮临床疗效相关的核酸序列
CN106715695A (zh) * 2014-02-05 2017-05-24 耶达研究及发展有限公司 用于治疗和诊断5‑羟色胺‑、肾上腺素‑、去甲肾上腺素‑、谷氨酸‑和促肾上腺皮质素释放激素‑相关医学病况的微rna和包含所述微rna的组合物
CA3005493A1 (en) * 2015-11-20 2017-05-26 Braindtech S.R.L. Microglia microvesicles contained microrna-based methods for the diagnosis, prognosis and treatment monitoring of neurological, neurodegenerative and inflammation-based diseases
CN107034295A (zh) * 2017-06-05 2017-08-11 天津医科大学肿瘤医院 用于癌症早期诊断和危险度评价的dna甲基化指标及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1884528A (zh) * 2006-06-29 2006-12-27 上海交通大学 与利培酮临床疗效相关的核酸序列
CN106715695A (zh) * 2014-02-05 2017-05-24 耶达研究及发展有限公司 用于治疗和诊断5‑羟色胺‑、肾上腺素‑、去甲肾上腺素‑、谷氨酸‑和促肾上腺皮质素释放激素‑相关医学病况的微rna和包含所述微rna的组合物
CA3005493A1 (en) * 2015-11-20 2017-05-26 Braindtech S.R.L. Microglia microvesicles contained microrna-based methods for the diagnosis, prognosis and treatment monitoring of neurological, neurodegenerative and inflammation-based diseases
CN107034295A (zh) * 2017-06-05 2017-08-11 天津医科大学肿瘤医院 用于癌症早期诊断和危险度评价的dna甲基化指标及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Identification of MicroRNA-124-3p as a Putative Epigenetic Signature of Major Depressive Disorder";Bhaskar Roy et al.;《Neuropsychopharmacology》;20161005;第42卷;第864–875页 *
"miR-124 及其靶基因在抑郁症及抗抑郁疗效中的作用";曾端;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20220115(第01期);第E071-27页 *
"Promoter Hypomethylation of miR-124 Gene Is Associated With Major Depressive Disorder";Duan Zeng et al.;《Frontiers in Molecular Neuroscience》;20211221;第14卷;第1-9页 *
"首发抑郁症患者外周血 microRNA-124的变化及临床意义";袁梅菊等;《精神医学杂志》;20181231;第31卷(第1期);第27-29页 *

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