CN111440767A - 一种线粒体保护剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种线粒体保护剂及其应用，涉及细胞保护技术领域。本发明提供了线粒体保护剂、在制备药剂中的应用以及相应的药剂。本发明将米糠萃取物用于保护视网膜细胞线粒体功能，当米糠萃取物用量不高于150μg/ml时无细胞毒性，且可显著提高细胞线粒体产ATP功能和电子传递链。

Description

一种线粒体保护剂及其应用
技术领域
本发明属于细胞保护技术领域，具体涉及一种线粒体保护剂及其应用。
背景技术
线粒体(Mitochondria)是细胞内进行氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要场所。由于三磷酸腺苷为细胞活动的能量来源，所以线粒体又有细胞能量工厂之称。除了为细胞提供能量外，线粒体还参与细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长周期的能力。但是在紫外光刺激下对线粒体存在一定的破坏作用，尤其是对视网膜细胞线粒体的破坏作用更甚，降低ATP的生成和电子传递链的作用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种线粒体保护剂及其应用，可提升米糠的利用价值，同时为保护视网膜提供一种新的。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种线粒体保护剂，所述保护剂的活性成分包括米糠萃取物，所述米糠萃取物的萃取剂为水。
优选的，所述米糠萃取物的制备方法，包括：将米糠与ddH2O按照1g：10mL的质量体积比混合煮沸3h，冷却至18~25℃离心，将上清液置于-80℃中冷冻12h以上后，冷冻干燥，得米糠萃取物。
优选的，所述离心的离心力为8000g，离心的时间为30min。
优选的，所述冷冻干燥的时间为28h。
本发明还提供了所述线粒体保护剂在制备保护细胞线粒体ATP生成药剂中的应用。
本发明还提供了所述线粒体保护剂在制备保护细胞线粒体电子传递链药剂中的应用。
本发明还提供了所述线粒体保护剂在制备紫外光刺激下视网膜细胞粒线体ATP生成的药剂中的应用。
本发明还提供了所述线粒体保护剂在制备紫外光刺激下视网膜细胞粒线体电子传递链药剂中的应用。
本发明还提供了一种保护细胞线粒体ATP生成和/或电子传递链的药剂。
本发明还提供了一种保护紫外光刺激下视网膜细胞线粒体ATP生成和/或电子传递链的药剂。
本发明提供一种线粒体保护剂及其应用，将米糠萃取物用于保护视网膜细胞线粒体功能，当米糠萃取物用量不高于150μg/ml时无细胞毒性，且可显著提高细胞线粒体产ATP功能和电子传递链。本发明所述米糠萃取物由米糠中萃取得到，无品种、产地、种植方式之限制。
附图说明
图1为米糠萃取物无毒性浓度；
图2为米糠萃取物海马OCR测定，其中包括米糠萃取物100ug/ml有效增加在紫外光1小时刺激下视网膜细胞粒线体ATP生成(ATP production)和米糠萃取物150ug/ml有效增加在紫外光1小时刺激下视网膜细胞电子传递链能力(Spare Respiratory Capacity)；其中# p<0.05,## p<0.1 与control 比较，* p<0.05 与UVA 比较；
图3为米糠萃取物生物能量健康指数(BHI)，其中# p<0.05 与control 比较；* p<0.05, **p<0.1 与UVA 比较。
具体实施方式
本发明提供了一种线粒体保护剂，所述保护剂的活性成分包括米糠萃取物，所述米糠萃取物的萃取剂为水。
本发明所述米糠萃取物的制备方法，优选包括：将米糠与ddH2O按照1g：10mL的质量体积比混合煮沸3h，冷却至18~25℃离心，将上清液置于-80℃中冷冻12h以上后，冷冻干燥，得米糠萃取物。本发明所述离心的离心力优选为8000g，离心的时间优选为30min。本发明所述冷冻干燥的时间优选为28h。本发明对所述米糠的来源并没有特殊限定，优选利用本领域的常规米糠即可。本发明在所述混合前优选还包括对所述米糠进行干燥和粉碎。
本发明还提供了所述线粒体保护剂在制备保护细胞线粒体ATP生成药剂中的应用。
本发明还提供了所述线粒体保护剂在制备保护细胞线粒体电子传递链药剂中的应用。
本发明还提供了所述线粒体保护剂在制备紫外光刺激下视网膜细胞粒线体ATP生成的药剂中的应用。
本发明还提供了所述线粒体保护剂在制备紫外光刺激下视网膜细胞粒线体电子传递链药剂中的应用。
本发明还提供了一种保护细胞线粒体ATP生成和/或电子传递链的药剂。
本发明还提供了一种保护紫外光刺激下视网膜细胞线粒体ATP生成和/或电子传递链的药剂。
本发明所述药剂中优选还包括药学或食品上可接受的辅料，本发明对所述辅料的种类和配比并没有特殊限定，根据本领域的常规剂型进行配比即可。
下面结合实施例对本发明提供的线粒体保护剂及其应用进行详细的说明。
实施例1
萃取步骤:
1. 米糠烘干、磨粉；
2. 20g米糠加200ml ddH2O，煮沸3小时候冷却，8000g离心30min取上清液，上清液冷冻(-80℃)12小时以上，上冷冻干燥机(冷冻干燥28小时)；
3.20g米糠萃取出 3.6g萃取物。
实验使用的细胞为视网膜细胞(ARPE-19)。实验样品准备方式为于孔盘的每一个孔中植入20000个视网膜细胞后培养24个小时，使用的培养液为DMEM / F12（Dulbecco'sModified Eagle's Medium / Nutrient Mixture F-12），并加入重量百分浓度10％的胎牛血清，浓度为每毫升100单位的盘尼西林以及浓度为每毫升100微克的链霉素。每一个孔中培养液的体积为1毫升。
细胞毒性测试则是将预定浓度的米糠萃取物水溶液加入视网膜细胞所在的孔中并浸泡24小时。接着，移除视网膜细胞所在的孔中的水溶液，加入10% alarm blue medium作用3~4小时，以分光光度计侦测OD530/595 nm计数存活细胞百分比，结果如图1所示，在米糠萃取物的浓度低于150μg/mL时，无细胞毒性。
实验中，模拟视网膜细胞因紫外光照射而受损所使用的紫外光为波长365nm的紫外光。
于实验过程中，首先将预定浓度的米糠萃取物水溶液加入视网膜细胞所在的孔中并浸泡24小时。接着，移除视网膜细胞所在的孔中的水溶液，并以波长365奈米的紫外光照射视网膜细胞一小时后移除紫外光。最后，以海马生物能量测定仪量测孔中视网膜细胞的氧气消耗量。
海马生物能量测定仪的测量原理与流程如下：首先，侦测孔中细胞的基础耗氧量。接着，加入三磷酸线苷合成酶抑制剂以抑制粒线体产生三磷酸线苷，此时减少的耗氧量即为粒线体进行氧化磷酸化反应以合成三磷酸线苷的耗氧量，亦即是粒线体的基础耗氧量(Basal Respiration)。三磷酸线苷合成酶抑制剂例如为寡霉素(Oligomycin)。接着，加入适当浓度的抗耦合剂，在不破坏粒线体内膜的电子传递链的情况下，让粒线体以极限状况空转以评估粒线体的最大耗氧能力(Maximal Respiration)。抗耦合剂例如为Carbonylcyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone(FCCP)。最后，加入电子传递链抑制剂已完全关闭粒线体的耗氧，藉此确认量测的背景值，亦即是非粒线体耗氧量(Non-mitochondrial Respiration)。电子传递链抑制剂例如为鱼藤酮(Rotenone)与抗霉素A(Antimycin A)之组合。
结果如表1和图2所示：
表1 米糠提取物对线粒体的作用参数
Figure DEST_PATH_IMAGE002
粒线体的基础耗氧量等于细胞的基础耗氧量减去非粒线体耗氧量。粒线体的基础耗氧量减去合成三磷酸线苷消耗的氧气量等于克服氢离子泄漏(Proton Leakage)的耗氧量。粒线体的最大耗氧能力减去粒线体的基础耗氧量等于粒线体的预存耗氧能力(SpareRespiratory Capacity)。粒线体的三磷酸线苷媒合效率(Coupling Efficiency)等于合成三磷酸线苷耗氧量除以粒线体的基础耗氧量。将上述数值带入下述公式，可以计算初生物能量健康指标 (Bioenergetic Healthy Index，BHI) BHI=[合成三磷酸线苷的耗氧量×预存耗氧能力]/[克服氢离子泄漏的耗氧量×非粒线体耗氧量]。
结果如表2和图3所示：
表2 米糠萃取物生物能量健康指数
平均 SD
Control 0.872896 0.343305
UVA 0.377943 0.076192
100ug/ml米糠萃取物 0.571309 0.069952
150ug/ml米糠萃取物 0.74895 0.12125
综上可知，米糠萃取物可有效增加在紫外光刺激下视网膜细胞(ARPE-19)粒线体ATP生成及电子传递链能力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种线粒体保护剂，其特征在于，所述保护剂的活性成分包括米糠萃取物，所述米糠萃取物的萃取剂为水。
2.根据权利要求1所述线粒体保护剂，其特征在于，所述米糠萃取物的制备方法，包括：将米糠与ddH2O按照1g：10mL的质量体积比混合煮沸3h，冷却至18~25℃离心，将上清液置于-80℃中冷冻12h以上后，冷冻干燥，得米糠萃取物。
3.根据权利要求2所述线粒体保护剂，其特征在于，所述离心的离心力为8000g，离心的时间为30min。
4.根据权利要求2所述线粒体保护剂，其特征在于，所述冷冻干燥的时间为28h。
5.权利要求1~4任一项所述线粒体保护剂在制备保护细胞线粒体ATP生成药剂中的应用。
6.权利要求1~4任一项所述线粒体保护剂在制备保护细胞线粒体电子传递链药剂中的应用。
7.权利要求1~4任一项所述线粒体保护剂在制备紫外光刺激下视网膜细胞粒线体ATP生成的药剂中的应用。
8.权利要求1~4任一项所述线粒体保护剂在制备紫外光刺激下视网膜细胞粒线体电子传递链药剂中的应用。
9.一种保护细胞线粒体ATP生成和/或电子传递链的药剂。
10.一种保护紫外光刺激下视网膜细胞线粒体ATP生成和/或电子传递链的药剂。
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