CN112076186B - 一种3,4,5-o-三咖啡酰基奎宁酸在放射治疗中作为细胞保护剂的应用 - Google Patents

一种3,4,5-o-三咖啡酰基奎宁酸在放射治疗中作为细胞保护剂的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种3,4,5‑O‑三咖啡酰基奎宁酸在放射治疗中作为细胞保护剂的应用。本发明中的3,4,5‑O‑三咖啡酰基奎宁酸对放射治疗过程中消化系统、免疫系统及造血系统的正常细胞具有保护作用，可以改善由于IR导致的普通结肠上皮细胞的增殖抑制，逆转电离辐射诱导的细胞周期G2/M阻滞；3,4,5‑O‑三咖啡酰基奎宁酸通过抑制细胞内活性氧ROS的产生、抑制依赖于ROS产生的MAPKs介导的线粒体途径，抑制了IR诱导的正常结肠上皮细胞的凋亡。

Description

一种3,4,5-O-三咖啡酰基奎宁酸在放射治疗中作为细胞保护 剂的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种3,4,5-O-三咖啡酰基奎宁酸在放射治疗中作为细胞保护剂的应用，在放射治疗过程中对消化系统、免疫系统及造血系统均具有保护作用。
背景技术
据统计，目前有70％的癌症患者在治疗过程中都要接受放疗，放射治疗一般是利用电离辐射(IR)治疗肿瘤的一种局部治疗方法。但放疗在杀死癌细胞的同时，也使患者产生恶心、食欲不振等效应，并伴有白细胞下降、免疫功能降低等并发症，导致部分患者不得不放弃放疗。
在放射治疗中，放射性物质的无控制释放或癌症的强化放疗导致的高剂量照射还会导致胃肠道综合症(GIS)，这是一种致死性疾病，影响肠道结构。症状和体征包括恶心，腹泻，呕吐，出血和肠穿孔，通过细菌感染和败血性休克导致患者死亡。目前GIS的治疗方法非常有限，通常集中在减轻GIS症状上。
电离辐射(IR)往往伴随着活性氧(ROS)的过度激活。ROS在许多细胞反应如增殖、分化、凋亡中发挥重要作用。低浓度的ROS促进了细胞存活和增殖，然而一旦ROS超过了抗氧化蛋白对ROS的清除能力，就会造成细胞严重的功能失衡甚至死亡。许多研究表明ROS通过直接参与细胞信号或者调节氧化还原状态来控制信号转导，从而调节基因表达。最开始认为只有吞噬细胞在它们发挥宿主防御功能时候才释放出ROS，但是近来认为ROS和信号转导调节密切相关。丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)，包括JNK(c-Jun氨基末端激酶，c-Jun N-terminal kinase)以及p38，它们受不同的信号通路途径调节，从而控制细胞生理的很多方面，比如细胞生长、增殖和凋亡。JNK和p38很容易被环境因素所激活，从而控制细胞的生存或死亡。近来，有研究报道无论是外源性的还是内源性的活性氧(ROS)都可以诱导蛋白激酶MAPKs的活化。
目前，氨磷汀作为第一个被FDA批准用于临床的辐射防护剂，以其为代表的硫醇类化合物都被证实具有一定的辐射防护活性。但由于这类药物的不良反应严重，临床应用仍然存在局限。而植物和天然产物来源的化合物由于其低毒性和良好的抗辐射效果正在被更加频繁的被注意到。
因此，亟需提供一种3,4,5-O-三咖啡酰基奎宁酸在放射治疗或电离辐射中作为细胞保护剂的应用，以保护细胞增殖、降低电离辐射造成的细胞损伤及凋亡，实现对正常细胞的保护。
发明内容
本发明的目的在于解决上述问题，提供一种3,4,5-O-三咖啡酰基奎宁酸(tCQA)在放射治疗或电离辐射(IR)中作为细胞保护剂的应用，对放射治疗过程中消化系统、免疫系统及造血系统的正常细胞均具有保护作用。
为了实现上述目的，本发明采取了以下技术方案。
本发明提供了一种3,4,5-O-三咖啡酰基奎宁酸(tCQA)在放射治疗或电离辐射(IR)中作为细胞保护剂的应用。
在所述应用中，所述3,4,5-O-三咖啡酰基奎宁酸(tCQA)的使用浓度为5～500μg/mL。
在所述应用中，所述所述3,4,5-O-三咖啡酰基奎宁酸的使用浓度为20～40μg/mL。
在所述应用中，所述3,4,5-O-三咖啡酰基奎宁酸的使用对放射治疗中的消化系统、免疫系统及造血系统具有保护作用。
在所述应用中，所述3,4,5-O-三咖啡酰基奎宁酸(tCQA)抑制活性氧(ROS)的过度激活。
在所述应用中，所述活性氧(ROS)包括羟自由基、超氧阴离子、过氧化氢和单线态氧中的至少一种。
在所述应用中，所述3,4,5-O-三咖啡酰基奎宁酸(tCQA)抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的激活。
在所述应用中，所述丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)包括JNK和p38。
在所述应用中，所述3,4,5-O-三咖啡酰基奎宁酸(tCQA)逆转细胞周期G2/M阻滞。
在所述应用中，所述3,4,5-O-三咖啡酰基奎宁酸(tCQA)逆转细胞周期蛋白的降解。
在所述应用中，所述细胞周期蛋白为cyclin B。例如cyclin B1。
在所述应用中，所述3,4,5-O-三咖啡酰基奎宁酸(tCQA)逆转周期蛋白依赖性激酶的活化抑制。
在所述应用中，所述周期蛋白依赖性激酶为CDK1。
本发明中，所述3,4,5-O-三咖啡酰基奎宁酸(tCQA)为从植物中提取得到的活性单体。例如本发明实施例中的tCQA是从一种药用植物满江红中提取出的活性单体。
本发明实施例中，人结肠上皮细胞系NCM460购自中国科学院典型培养物保藏中心细胞库(中国上海)。所有细胞均在37℃，5％CO2和95％空气的潮湿气氛中，在补充有10％FBS(胎牛血清)的RPMI 1640(Gibco，CA，USA)培养基中培养。
本发明实施例中采用的tCQA化合物在实验之前，用RPMI1640培养基将tCQA稀释至所需浓度。
本发明实施例中采用的137Csγ-射线来自上海复旦大学放射研究中心Gammacell-40型低剂量率研究辐射仪。例如，本发明实施例中，在室温条件下采用Gammacell-40型低剂量率研究辐射仪对样品以0.70Gy/分进行照射。
本发明实施例中采用MTT assay(MTT比色试验)检测细胞活力与细胞密度的关系。
本发明实施例中采用的克隆形成测定、线粒体膜电位(MMP)的测量、流式细胞仪分析凋亡、细胞周期分析、细胞内ROS水平的测量、氧化损伤评估、BALB/c小鼠全身辐射损伤模型等实验方法均可以采用本领域常规技术手段实现。
本发明实施例中，使用Graphpad Prism 5.0进行统计分析，并将实验数据统一表示为平均值±标准差(SD)。使用Student t检验评估每个测试组与对照组之间的差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
本发明实施例中，所述3,4,5-O-三咖啡酰基奎宁酸(tCQA)的使用浓度为500μg/mL时，属于安全浓度，对放疗中的消化系统、免疫系统及造血系统的正常细胞均具有保护作用。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的3,4,5-O-三咖啡酰基奎宁酸(tCQA)在放射治疗或电离辐射(IR)中作为细胞保护剂的应用，可以改善由于IR导致的普通结肠上皮细胞的增殖抑制，逆转电离辐射诱导的细胞周期G2/M阻滞；3,4,5-O-三咖啡酰基奎宁酸通过抑制细胞内活性氧ROS的产生、抑制依赖于ROS产生的MAPKs介导的线粒体途径，抑制了IR诱导的正常结肠上皮细胞的凋亡。
本发明中tCQA可以逆转由于IR导致的G2/M期停滞、细胞周期蛋白的降解以及周期蛋白依赖性激酶的活化抑制，促进细胞生长，改善IR导致的结肠上皮细胞的增殖抑制。
本发明中tCQA抑制细胞内活性氧ROS的产生，抑制依赖于ROS产生的MAPKs介导的线粒体途径，tCQA抑制IR诱导的MAPKs的激活，进而抑制正常结肠上皮细胞的凋亡。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中不同电离辐射条件下的细胞存活率数据图。
图2为本发明实施例2中tCQA和IR对细胞活力的影响数据图。
图3为本发明实施例3中的菌落图及其对应的菌落数柱状图。
图4A为本发明实施例4中的细胞在细胞周期的分布数据图。
图4B为实施例4中的细胞在G2/M期的细胞分布情况及细胞内细胞周期调节蛋白的表达情况示意图。
图5A为本发明实施例5中的细胞凋亡数据图。
图5B为本发明实施例5中的细胞早期凋亡和晚期凋亡分布数据图。
图6A为本发明实施例6中的细胞凋亡检测结果示意图。
图6B为本发明实施例6中的JC-1染色后细胞内绿色荧光柱状数据图。
图6C为本发明实施例6中的JC-1染色后细胞荧光示意图。
图6D为本发明实施例6中细胞内的Bcl-2蛋白、Bax蛋白、胱天蛋白酶和β-肌动蛋白的活性示意图。
图7为本发明实施例7中的细胞内ROS含量示意图。
图8A为本发明实施例8中细胞内SOD活性水平柱状图。
图8B为本发明实施例8中细胞内CAT活性水平柱状图。
图8C为本发明实施例8中细胞内MDA活性水平柱状图。
图9A为本发明实施例9中细胞内的胱天蛋白酶、β-肌动蛋白的活性示意图。
图9B为本发明实施例9中的细胞数量图。
图9C为本发明实施例9中的细胞内ROS含量柱状图。
图10为本发明实施例10中的细胞的蛋白质印迹法检测结果示意图。
图11为本发明实施例11中的细胞蛋白质印迹的检测结果示意图。
图12A为本发明实施例12中小鼠的存活率数据图。
图12B为本发明实施例12中小鼠的体重数据图。
图13A为本发明实施例13中小鼠的十二指肠和结肠的绒毛结构图。
图13B为本发明实施例13中小鼠的结肠、胸腺和脾脏的生长状态图及数据图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在本文中术语“包括”是指“包括但不限于”。本发明的各种实施例可以以一个范围的型式存在；应当理解，以一范围型式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所数范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。本文中所揭露的大小和数值不应意图被理解为严格限于所述精确数值。相反的，除非另外指明，各种大小旨在表示所引用的数值以及功能上与所述数值相同的范围。例如所揭露的大小为「10微米」是指「约10微米」。
本发明实施例提供一种3,4,5-O-三咖啡酰基奎宁酸(tCQA)在放射治疗或电离辐射(IR)中作为细胞保护剂的应用。
所述3,4,5-O-三咖啡酰基奎宁酸的使用对放射治疗中的消化系统、免疫系统及造血系统具有保护作用。
在一些实施例中，所述3,4,5-O-三咖啡酰基奎宁酸(tCQA)的使用浓度为5～500μg/mL。例如，所述3,4,5-O-三咖啡酰基奎宁酸(tCQA)的使用浓度可以为5、10、20、40、80、100、200、300、400、500μg/mL。将本发明中所述3,4,5-O-三咖啡酰基奎宁酸(tCQA)的使用浓度应用于放疗中，均可以一定程度地抑制电离辐射对正常细胞的损害，实现在放射治疗中保护正常细胞的目的。
在一些实施例中，所述3,4,5-O-三咖啡酰基奎宁酸(tCQA)抑制活性氧(ROS)的过度激活。
在一些实施例中，所述活性氧(ROS)包括羟自由基、超氧阴离子、过氧化氢和单线态氧中的至少一种。
在一些实施例中，所述3,4,5-O-三咖啡酰基奎宁酸(tCQA)抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的激活。
在一些实施例中，所述丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)包括JNK和p38。
在一些实施例中，所述3,4,5-O-三咖啡酰基奎宁酸(tCQA)逆转细胞周期G2/M阻滞。
在一些实施例中，所述3,4,5-O-三咖啡酰基奎宁酸(tCQA)逆转细胞周期蛋白的降解。
在一些实施例中，所述细胞周期蛋白为cyclin B。例如cyclin B1。
在一些实施例中，所述3,4,5-O-三咖啡酰基奎宁酸(tCQA)逆转周期蛋白依赖性激酶的活化抑制。
在一些实施例中，所述周期蛋白依赖性激酶为CDK1。
在一些实施例中，所述3,4,5-O-三咖啡酰基奎宁酸(tCQA)为从植物中提取得到的活性单体；例如，从药用植物满江红中提取出的活性单体tCQA。
实施例1：
本实施例中，对正常结肠上皮细胞NCM460分别按照不同辐射剂量(0、4、6、8Gy)进行照射，并检测NCM460细胞在不同辐射剂量下的细胞存活率。
方法：为构建辐射损伤模型，本实施例中的正常结肠上皮细胞在室温条件下接受Gammacell-40型低剂量率研究辐射仪以0.70Gy/分进行照射，照射剂量分别为4Gy、6Gy、8Gy，依次记为照射组1、2、3；并将正常结肠上皮细胞未辐射进行正常培养的作为对照组(NC组)；照射后120h，对照射组和对照组的细胞活力进行检测，以了解细胞存活率，并进行对比观察。每个实验重复三次。用MTT法测定细胞活力，用三次实验的平均值±SD表示。检测细胞存活率的实验数据如图1所示。
实验数据通过Student t检验可视化，分析照射组和对照组之间差异的显著性：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图1为本实施例中不同电离辐射条件下的细胞存活率数据图。
实验结果：根据图1可知：放射性治疗(电离辐射)可降低正常结肠上皮细胞NCM460的细胞存活率，可见电离辐射(IR)会影响正常结肠上皮细胞的细胞毒性和增殖，降低细胞存活率。
实施例2：
本实施例中，在对正常结肠上皮细胞NCM460辐射前加入tCQA，采用MTT法检测细胞活力，观察细胞增殖情况。
方法：将样品溶解于无血清培养基中，在辐射前4小时，分别加入到含有0μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL和40μg/mL的tCQA最终剂量的培养基中，然后分别接受4Gy、6Gy、8Gy的辐射，后细胞培养120h，MTT法观察细胞增殖情况。本试验以0μg/mL、无辐射的细胞正常培养作为空白对照组。每个实验重复三次。采用MTT法检测细胞活力，结果如图2所示。
用Student t检验对这些实验的数据进行可视化分析，以分析IR组治疗组与0μg/mL组之间差异的显著性：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图2为本实施例中tCQA和IR对细胞活力的影响数据图。
结果：根据图2可知，给药5～40μg/mL的tCQA均可以改善由于IR导致的正常结肠上皮细胞的增殖抑制，并且随着tCQA浓度的增加，细胞增殖变多。
tCQA能逆转IR诱导的正常结肠上皮细胞增殖抑制。
实施例3：
本实施例通过对正常结肠上皮细胞进行克隆形成测定细胞的增值能力，用以探讨tCQA对IR诱导的正常结肠上皮细胞增殖抑制的影响。
方法：以每孔200个正常结肠上皮细胞的密度均匀地分散在24孔板上，分别置于0μg/mL、20μg/mL和40μg/mL的tCQA最终剂量的培养基中，4小时后进行辐射，辐射剂量为8Gy，分别记为实验组(0μg/mL+8Gy)、治疗组1(20μg/mL+8Gy)和治疗组2(40μg/mL+8Gy)；然后细胞培养7天。本试验以0μg/mL、无辐射的细胞正常培养为空白对照组。每个实验重复三次。培养结束后用PBS洗涤，可见菌落在4％多聚甲醛中固定30分钟，室温下用结晶紫染色20分钟。实验结果见图3所示。
图3为本实施例中的菌落图及其对应的菌落数柱状图。
结果：根据克隆形成实验，确认tCQA对IR导致的增殖抑制的逆转作用，tCQA能逆转IR诱导的正常结肠上皮细胞增殖抑制。并且随着tCQA浓度的增加，受过损伤的NCM460细胞中形成的菌落均明显增多。
用Student t检验对这些实验的数据进行可视化分析，分析治疗组1、治疗组2与实验组(0μg/mL IR组)之间的差异(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)的显著性；以及实验组(0μg/mL IR组)与空白对照组的差异(p<0.05，#p<0.01，##p<0.001)的显著性。
实施例4：
本实施例采用流式细胞术和western blot(蛋白质印迹法/免疫印迹试验)检测tCQA的对正常结肠上皮细胞的增殖保护作用，通过获得各细胞周期内的细胞数及细胞周期调节蛋白的表达，来观察tCQA是否参与IR导致的细胞周期G2/M阻滞。
目前已知电离辐射(IR)会导致细胞周期在G2/M期的停滞，细胞抑制往往与细胞周期的阻滞有关。
G2/M期一般受CDK1-cyclin B复合物的调控，CDK1活化是G2期进入M期的必要条件。磷酸化CDK1上的Tyr-15、Thr-14使CDK1高度磷酸化，可抑制CDK1活性，从而引起G2/M期停滞，而Thr-161的磷酸化可以使CDK1激活。Cyclin B可以与CDK1形成复合物，复合物活化后，细胞从G2期进入M期。G2/M期的阻滞常伴有cyclin B的下降。
实验方法：将每孔密度为1×106个细胞的细胞接种在6孔板上，并在辐射前4小时分别加入到含有0μg/mL、20μg/mL和40μg/mL的tCQA最终剂量的培养基中培养，进行辐射，辐射剂量为8Gy，然后细胞培养48h，分别记为实验组(8Gy+0μg/mL)、治疗组1(8Gy+20μg/mL)和治疗组2(8Gy+40μg/mL)；同时，采用0μg/mL无电离辐射(IR)的细胞培养组作为对照组(NC组)。每个实验重复三次。
采用流式细胞术和western blot，对本实施例得到的培养液进行DNA含量分析以及蛋白提取。实验数据和结果见图4A和图4B所示。
图4A为本实施例中的细胞在细胞周期的分布数据图。
图4B为本实施例中的细胞在G2/M期的细胞分布情况及细胞内细胞周期调节蛋白的表达情况示意图。
实验结果：本实施例使用流式细胞仪评估了细胞的细胞周期分布，然后通过western blotting分析了细胞周期调节蛋白的表达，可知tCQA的对正常结肠上皮细胞的增殖有保护作用。其中，根据图4A可知，tCQA可逆转IR诱导的细胞周期G2/M阻滞；根据图4B可知，tCQA可以逆转由于IR导致的G2/M期停滞、cyclin B1(细胞周期蛋白)的降解以及CDK1(周期蛋白依赖性激酶)的活化抑制。
用Student t检验对这些实验的数据进行可视化分析，分析治疗组与0μg/mL IR组(即实验组：8Gy+0μg/mL)之间的差异(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)以及0μg/mL IR组与对照组(NC组)的差异(p<0.05，#p<0.01，##p<0.001)的显著性。
实施例5：
本实施例采用双染细胞凋亡检测方法和流式细胞术检测tCQA对IR导致的普通结肠上皮细胞(NCM460)凋亡的影响。
目前已知细胞凋亡是IR诱导的导致细胞死亡的重要原因之一。
方法：采用annexinv-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡：将细胞镀在6孔板上，然后在含有5％二氧化碳的增湿空气中保持在37℃下，并在辐射前4小时，分别加入到含有0μg/mL、20μg/mL和40μg/mL的tCQA最终剂量的培养基中培养，进行辐射，辐射剂量为8Gy，然后细胞培养96h，分别记为实验组(8Gy+0μg/mL)、治疗组1(8Gy+20μg/mL)和治疗组2(8Gy+40μg/mL)；同时，采用0μg/mL无电离辐射(IR)的细胞培养组作为对照组(NC组)。每个实验重复三次。
为了验证tCQA对IR导致的普通结肠上皮细胞凋亡的影响，采用流式细胞术对细胞进行了Annexin V-FITC/PI双染。试验结果见图5A和图5B所示。
图5A为本发明实施例5中的细胞凋亡数据图。
图5B为本发明实施例5中的细胞早期凋亡和晚期凋亡分布数据图。
用Student t检验对这些实验的数据进行可视化分析，分析治疗组与实验组(8Gy+0μg/mL)之间的差异(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)以及实验组(8Gy+0μg/mL)与对照组的差异(p<0.05，#p<0.01，##p<0.001)的显著性。
结果：根据图5A和图5B可知，8Gy电离辐射下导致的细胞凋亡可以被tCQA缓解，由此可知，tCQA抑制IR诱导的正常结肠上皮细胞的凋亡。
实施例6：
本实施例通过线粒体膜电位测量和Western blot确定tCQA抑制IR诱导的细胞凋亡相关的途径。为了确定tCQA抑制IR诱导的细胞凋亡相关的途径，本发明中，采用annexinv-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡；于IR后48h检测了JC-1染色后线粒体膜电位的变化，并提取蛋白检测cl.caspase-3和cl.caspase-9的活性。
在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，可以产生绿色荧光。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。
用JC-1检测试剂盒检测细胞凋亡。凋亡可以通过外源性途径，通过细胞表面死亡受体的激活或通过内在途径通过线粒体相关信号因子释放诱导。线粒体膜电位的下降是细胞早期凋亡的一个标志性事件，通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易的检测到线粒体膜电位的下降，因此可以用JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的检测指标。
方法：将细胞镀在6孔板上，然后在含有5％二氧化碳的增湿空气中保持温度在37℃，并在辐射前4小时将细胞分别加入到含有0μg/mL、20μg/mL和40μg/mL的tCQA最终剂量的培养基中培养，后进行辐射，辐射剂量为8Gy，然后细胞培养48h，分别记为实验组(8Gy+0μg/mL)、治疗组1(8Gy+20μg/mL)和治疗组2(8Gy+40μg/mL)；同时，采用0μg/mL、无电离辐射(IR)的细胞培养组作为对照组(NC组)。每个实验重复三次。实验数据详见图6所示。
用Student t检验对这些实验的数据进行可视化分析，分析治疗组与实验组(8Gy+0μg/mL)之间的差异(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)以及实验组(8Gy+0μg/mL)与对照组的差异(p<0.05，#p<0.01，##p<0.001)的显著性。
图6A为本实施例中的细胞凋亡检测结果示意图。
图6B为本实施例中的JC-1染色后细胞内绿色荧光柱状数据图。IR组与对照组进行对比观察。
图6C为本实施例中的JC-1染色后细胞荧光示意图。其中，实验组(8Gy+0μg/mL)显示出较强的JC-1绿色荧光，显示细胞正在发生早期凋亡，而治疗组1(8Gy+20μg/mL)和治疗组2(8Gy+40μg/mL)的绿色荧光呈逐渐减少趋势。
图6D为本实施例中细胞内的Bcl-2蛋白、Bax蛋白、胱天蛋白酶和β-肌动蛋白的活性示意图。
结果：根据图6可知，tCQA抑制IR诱导的正常结肠上皮细胞凋亡。其中，如图6C所示，由于IR导致的JC-1红光到绿光的转变被tCQA显著抑制。如图6D所示，其中，IR导致的胱天蛋白酶(caspase-9和caspase-3)的激活也明显被tCQA抑制；IR导致的Bax蛋白的增加和Bcl-2的减少，也随着tCQA浓度的增加而得到抑制。这些都意味着在IR诱导的细胞死亡中固有的凋亡途径的激活被tCQA抑制，tCQA可以有效抑制IR诱导的细胞凋亡。
实施例7：
本实施例采用DCFH-DA探针检测IR导致的胞内ROS含量增加能否被tCQA抑制，以探究tCQA的抗细胞凋亡作用是否影响到细胞内ROS调节的功能。
已知活性氧(ROS)在激活细胞死亡途径中起着关键作用。
方法：本实施例中的细胞培养同实施例6相同，分为实验组(8Gy+0μg/mL)、治疗组1(8Gy+20μg/mL)和治疗组2(8Gy+40μg/mL)，以及，采用0μg/mL、无电离辐射(IR)的细胞培养组作为对照组(NC组)。
然后，采用DAFH-DA探针测量暴露于呋喃二酮后两个细胞中ROS的变化。用DCFH-DA探针在×100倍率下观察细胞荧光图像；用过氧化物敏感荧光探针DCFH-DA(2′，7-二氯荧光素二乙酸酯)定量评估细胞内ROS水平，该探针在过氧化物存在下被氧化为高荧光DCF(2′，7-二氯荧光素)；细胞培养6小时。每个实验重复三次。实验结果见图7所示。
图7为本实施例中的细胞内ROS含量示意图。
结果：根据图7显示：IR可以激活胞内活性氧，而tCQA可以明显降低细胞内活性氧的产生。可见，本发明中的tCQA的使用可以显著改善由于IR导致的ROS聚集，tCQA能够抑制细胞内ROS的产生，进而逆转IR诱导的细胞凋亡。
实施例8：
本实施例对正常结肠上皮细胞NCM460进行脂质氧化的水平的检测，以观察tCQA能否缓解由于IR导致的细胞的氧化损伤。
已知超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，SOD催化超氧化物阴离子发生岐化作用，生成H2O2和O2。SOD不仅是超氧化物阴离子清除酶，也是H2O2主要生成酶，在生物抗氧化系统中具有重要作用。CAT是最主要的H2O2清除酶，在活性氧清除系统中具有重要作用。氧自由基作用于脂质的不饱和脂肪酸，生成过氧化脂质，后者逐渐分解为一系列复杂的化合物，其中包括脂质过氧化物丙二醛(MDA)。
方法：本实施例中的细胞培养同实施例6相同，分为实验组(8Gy+0μg/mL)、治疗组1(8Gy+20μg/mL)和治疗组2(8Gy+40μg/mL)，以及，采用0μg/mL、无电离辐射(IR)的细胞培养组作为对照组(NC组)。
然后，通过检测细胞内的MDA的水平即可检测脂质氧化的水平。用Solarbio(中国北京)提供的微量MDA试剂盒、SOD试剂盒和CAT试剂盒测定脂质过氧化产物MDA和SOD、CAT水平。每个实验重复三次。实验数据详见图8所示。
图8A为本实施例中细胞内SOD活性水平柱状图。
图8B为本实施例中细胞内CAT活性水平柱状图。
图8C为本实施例中细胞内MDA活性水平柱状图。
用Student t检验对这些实验的数据进行可视化分析，分析治疗组与0μg/mL IR组之间的差异(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)以及0μg/mL IR组与对照组的差异(p<0.05，#p<0.01，##p<0.001)的显著性。
结论：根据图8A、图8B和图8C可知，细胞内MDA在辐射(IR)后增加了五倍，而SOD和CAT的活性均被下调；然而，用tCQA处理的细胞内逆转了IR导致的MDA升高的水平，同时SOD和CAT的活性也被上调了。
由此可知，本发明的tCQA在电离辐射(IR)中作为细胞保护剂使用，可以显著降低细胞的氧化损伤，抑制IR导致的细胞内ROS的产生，逆转由于IR处理而导致的细胞凋亡。
实施例9：
本实施例对正常结肠上皮细胞NCM460进行，激活ROS后导致的NCM460细胞损伤是否能够被tCQA缓解，进一步探究tCQA通过抑制细胞内的ROS积累从而消除了IR诱导的细胞凋亡。
方法：在与实施例8相同条件下，用tCQA药物处理细胞4h后，在8Gy电离辐射12h，然后使用500μM H2O2刺激细胞产生ROS；用过氧化物敏感荧光探针DCFH-DA(2′，7-二氯荧光素二乙酸酯)定量评估细胞内ROS水平，该探针在过氧化物存在下被氧化为高荧光DCF(2′，7-二氯荧光素)；细胞在IR后培养6h，500μM H2O2作用30min；免疫印迹后培养48小时。以空白实验作为对照组(NC组)。每个实验重复三次。实验数据详见图9所示。
用Student t检验可视化这些实验的数据，分析IR组治疗组与0μg/mL组之间差异的显著性(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
图9A为本实施例中细胞内的胱天蛋白酶、β-肌动蛋白的活性示意图。
图9B为本实施例中的细胞数量图。从图中可以看出，tCQA缓解了由于IR和H2O2导致的细胞内ROS的积累。
图9C为本实施例中的细胞内ROS含量柱状图。
结论：根据图9A、图9B和图9C可以发现，tCQA均可以缓解由于IR和H2O2导致的细胞内ROS的聚集以及线粒体途径中剪切的caspase-3，caspase-9表达的升高。虽然ROS通过激活线粒体的凋亡途径参与了IR导致的细胞凋亡，但这种凋亡能够被tCQA缓解，因此，本发明的tCQA应用于放射性治疗中，可以防止细胞内ROS的产生，逆转IR处理细胞的凋亡。
实施例10：
本实施例对正常结肠上皮细胞NCM460进行tCQA对IR激活的MAPKs信号通路的影响的探究。
丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)，例如JNK、p38。JNK和p38受不同的信号通路途径调节，从而控制细胞生理状况，比如控制细胞的生长、增殖和凋亡。
本实施例通过蛋白质印迹法检测NCM460细胞中氧化应激与MAPKs途径之间可能的相互联系。
方法：将细胞镀在6孔板上，然后在含有5％二氧化碳的增湿空气中保持在37℃下，并在辐射前4小时，加入到含有0μg/mL、20μg/mL和40μg/mL的tCQA最终剂量的培养基中；IR后培养48h。每个实验重复三次。实验数据及结果详见图10所示。
图10为本实施例中的细胞的蛋白质印迹法检测结果示意图。
结果：根据图10的结果显示，可知IR可以诱导MAPKs的激活，8Gy辐射NCM460细胞24h后，JNK和P38被显著激活；然而，添加tCQA的组，则显示出没有那么强烈的丝裂原活化蛋白激酶的激活，并随着tCQA浓度的增大，MAPKs激活程度减弱。由此可知，本发明的tCQA可以通过抑制MAPKs介导的依赖ROS产生的线粒体途径抑制细胞凋亡。
实施例11：
本实施例通过对正常结肠上皮细胞(NCM460)进行机制研究，研究tCQA抑制MAPK途径与抑制IR诱导的胱天蛋白酶依赖性细胞凋亡之间的关系。
方法：将细胞镀在6孔板上，然后在含有5％二氧化碳的增湿空气中维持温度为37℃，并在辐射前4小时，分别加入到以0μg/mL、40μg/mL的tCQA最终剂量和/或4μg/mL JNK激动剂茴香霉素(Anisomycin)剂量的培养基中；然后将细胞分别在0Gy、8Gy条件下辐射，辐射后，培养48小时；后对NCM460细胞进行处理，在500μM过氧化氢培养30min，提取蛋白，通过蛋白质印迹进行分析。每个实验重复三次。试验数据详见图11所示。
图11为本发明实施例11中的细胞蛋白质印迹的检测结果示意图。
结果：如图11所示，JNK激动剂茴香霉素(Anisomycin)可以显著增加了cl.caspase-9和-3的表达，但同时cl.caspase-9和-3的表达可以被tCQA所抑制。
通过对图11的分析可知，IR诱导的ROS激活了MAPKs信号通路，通过调节胱天蛋白酶(caspase)依赖性途径参与了线粒体介导的细胞凋亡，然而，tCQA可以有效抑制IR诱导的胱天蛋白酶的表达，逆转IR诱导的胱天蛋白酶依赖性细胞凋亡；tCQA通过抑制MAPKs介导的依赖ROS产生的线粒体途径抑制细胞凋亡。
实施例12：
本实施例研究tCQA对IR损伤后小鼠的体重和生存期的影响。
方法：将4周龄雄性BALB/c小鼠(上海JSJ实验动物有限公司，中国上海)放在标准的动物实验室中，并为其提供无菌水和食物。将小鼠随机分为六组：vehicle(空白对照)，IR+vehicle，IR+1mg/mL tCQA，IR+5mg/mL tCQA，IR+20mg/mL tCQA，IR+20mg/mL Amifostine(阿米福汀，注射用氨磷汀)，并按相应剂量连续腹腔注射给药一周后IR组小鼠在室温条件下接受6Gy 137Csγ-射线全身照射，照射后依旧连续给药一周。
4周龄的雄性BALB/c小鼠(上海JSJ实验动物有限公司，中国上海)被保存在一个标准的动物实验室，提供消毒水和食物。每只小鼠在照射前、后7天分别注射溶媒、1、5、20mg/kg tCQA和20mg/kg阿米福汀(注射用氨磷汀)。实验数据详见图12A和图12B所示。实验数据通过Student t检验可视化，以分析治疗组和IR组之间差异的显著性(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
图12A为本实施例中小鼠的存活率数据图。
图12B为本实施例中小鼠的体重数据图。
结果：根据图12A和图12B可知，在接受照射10天左右小鼠开始死亡，并且体重达到最低。经观察，中、高剂量tCQA给药组以及阳性药氨磷汀给药组小鼠体重均明显高于仅给予溶剂组(IR+vehicle)小鼠；同时，tCQA给药组的小鼠最后的生存率也显著高于辐射后仅给溶剂组小鼠，其中高剂量组(IR+20mg/mL tCQA)、阳性药组(IR+20mg/mL Amifostine)中的小鼠均无死亡。由此可知，持续使用tCQA治疗可持久保护消化系统并延长生存期。
实施例13：
本实施例研究tCQA如何对IR损伤后小鼠的消化系统、免疫系统和造血系统具有保护作用。
小鼠的消化系统是对辐射敏感的部位之一，根据观察，辐射会导致小肠长绒毛结构的完全消失，并且导致隐窝减少；对结肠的损伤主要表现在炎性细胞浸润，破坏原本的绒毛结构。
方法：将4周龄的雄性BALB/c小鼠(上海JSJ实验动物有限公司，中国上海)保存在一个标准的动物实验室，提供消毒水和食物。每只小鼠在照射前、后7天分别注射溶媒、1、5、20mg/kg tCQA和20mg/kg阿米福汀(注射用氨磷汀)；在照射后的20天取六组小鼠完整结直肠、胸腺和脾脏并测量、称重，并对小鼠的十二指肠和结肠的绒毛结构进行观察。实验数据详见图13A和图13B所示。实验数据通过Student t检验可视化，以分析治疗组和IR组之间差异的显著性(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
图13A为本实施例中小鼠的十二指肠和结肠的绒毛结构图。
图13B为本实施例中小鼠的结肠、胸腺和脾脏的生长状态图及数据图。
结果：根据图13可以看出，中、高剂量治疗组和阳性对照组，均能改善辐射对消化系统的损害(图13A)。除了消化系统，造血和免疫系统也是对辐射敏感的系统，在照射后20天取了六组小鼠完整结直肠、胸腺和脾脏并测量、称重，发现高剂量治疗组和阳性对照组，均能基本恢复原状(图13B)。可见，持续使用tCQA治疗，可持久保护小鼠的消化系统并延长生存期。
综上所述，本发明中，tCQA可以改善由于IR导致的普通结肠上皮细胞的增殖抑制；tCQA抑制了IR导致的普通结肠上皮细胞的细胞凋亡；可以显著改善IR导致的小鼠的体内损伤；tCQA对IR损伤后小鼠的消化系统、免疫系统和造血系统具有保护作用。tCQA抑制细胞内活性氧ROS的产生，tCQA抑制MAPK途径，tCQA抑制IR诱导的胱天蛋白酶依赖性细胞凋亡，进而抑制IR导致的细胞凋亡。tCQA逆转IR损伤后小鼠的体重和生存期，改善IR导致的小鼠的体内损伤。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1. 一种3, 4, 5-O-三咖啡酰基奎宁酸在制备降低放射治疗造成的结肠细胞损伤的细胞保护剂中的应用，其特征在于，所述3, 4, 5-O-三咖啡酰基奎宁酸的浓度是介于5~500 μg/mL之间。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述3, 4, 5-O-三咖啡酰基奎宁酸的浓度是介于20~40 μg/mL之间。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述3, 4, 5-O-三咖啡酰基奎宁酸抑制丝裂原活化蛋白激酶的激活。
4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述3, 4, 5-O-三咖啡酰基奎宁酸逆转细胞周期G2/M阻滞。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述3, 4, 5-O-三咖啡酰基奎宁酸逆转细胞周期蛋白的降解。
6. 根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述3, 4, 5-O-三咖啡酰基奎宁酸逆转周期蛋白依赖性激酶的活化抑制。
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