CN111437389A

CN111437389A - 一种用于癌症放疗增敏的组合物及其应用

Info

Publication number: CN111437389A
Application number: CN202010500140.0A
Authority: CN
Inventors: 岳欣; 刘然义; 王雪涔; 刘听雨
Original assignee: Sun Yat Sen University Cancer Center
Current assignee: Sun Yat Sen University Cancer Center
Priority date: 2020-06-04
Filing date: 2020-06-04
Publication date: 2020-07-24

Abstract

本发明提供了一种用于癌症放疗增敏的组合物及其应用，包括一种或多种蛋白酶体抑制剂。本发明通过研究发现：蛋白酶体抑制剂，尤其是20S CP抑制剂能够阻断DSB，对肿瘤放疗具有显著的增效作用，对于现有临床治疗中放疗敏感性低、疗效不够显著、副作用大的问题进行了有效地解决，在临床上使用蛋白酶体抑制剂将能够非常显著地提高肿瘤患者的放射治疗敏感性，从而大大提高肿瘤患者的治疗效果。

Description

一种用于癌症放疗增敏的组合物及其应用

技术领域

本发明属于肿瘤领域，具体是涉及一种用于癌症放疗增敏的组合物及其应用。

背景技术

目前癌症治疗方法中放化疗占很大比例，放化疗显著增加了局部进展的控制率，导致临床和组织学肿瘤消退。但由于治疗受适应证、禁忌症、耐药性和高剂量副作用的限制，疗效不够理想。因此，研究新的治疗策略与放化疗联合应用以提高癌症患者治疗的敏感性已成为当前研究的热点，同时，研究其联合作用的机制也是十分必要和迫切的。比如，在结直肠癌的治疗中，放疗是结直肠癌综合治疗中重要方式之一，尤其在直肠癌中，基于常规长程放疗的新辅助治疗已成为NCCN指南推荐的标准方案。

著名的德国直肠癌研究组临床试验（CAO/ARO/AIO-04）结果显示，新辅助治疗具有显著的降低肿瘤分期、降低局部复发率、提高保肛率等多方面的作用。长期的临床研究发现，直肠癌患者对于新辅助治疗的响应程度差异较大，一部分患者在治疗周期结束时可以实现病理完全缓解（pCR），然而，有部分的患者不能从长程治疗中获益，少部分患者甚至出现恶化进展。本发明发明人近年来（2014-2019年，年均收治1800例）对新辅助治疗后的评估结果显示，不能获益的患者占比为30%左右，出现进展的占比达10%，这主要是由于放疗效应未体现或者耐受性的产生导致。因此，寻找能够具备增敏效应或者逆转放疗抵抗效应的新型药物来提升放疗效果，具有重大的现实意义。

蛋白酶体（Proteasome）是泛素-蛋白酶体系统（UPS）的核心组成部分，主要功能是识别有缺陷的蛋白质底物，然后迅速使其降解为肽段。目前，蛋白酶体抑制剂（ProteasomeInhibitors，PIs）在临床抗肿瘤中的应用越来越受到重视。然而，这些PIs在癌症治疗中的应用，特别是与放射治疗相结合的研究，还没有得到充分的挖掘，特别是在食管癌，咽喉癌，宫颈癌，肛管癌等以放疗为根治术的癌种，及结直肠癌，乳腺癌，淋巴瘤，脑转移瘤等以放疗为辅助性方式的癌种中都没有相应的研究结果。

发明内容

针对上述存在问题和不足，本发明提供一种用于癌症放疗增敏的组合物及其应用，从而显著增强癌症放射治疗的敏感性，大大提升治疗效果，降低毒副作用。

本发明是通过如下技术方案得以实现的：

本发明第一方面提供了一种用于癌症放疗增敏的组合物，包括一种或多种蛋白酶体抑制剂。

作为优选地，所述蛋白酶体抑制剂选自20S蛋白水解酶核心颗粒抑制剂（20S CP抑制剂）。

作为优选地，所述20S CP抑制剂选自硼替佐米、艾莎佐米、卡菲佐米中的一种或多种。

作为优选地，作为优选地，所述癌症选自大肠癌、头颈肿瘤、食管癌、咽喉癌，宫颈癌、肛管癌、乳腺癌、淋巴瘤、脑转移瘤中的一种或多种。

作为优选地，所述大肠癌选自结肠癌、直肠癌中的一种或多种。

本发明第二方面提供了上述组合物在制备用于癌症放疗增敏药物、制剂或试剂盒中的应用。

作为优选地，所述组合物包括一种或多种蛋白酶体抑制剂。

作为优选地，作为优选地，所述蛋白酶体抑制剂选自20S蛋白水解酶核心颗粒抑制剂（20S CP抑制剂）。

作为优选地，所述癌症选自大肠癌、头颈肿瘤、食管癌、咽喉癌，宫颈癌、肛管癌、乳腺癌、淋巴瘤、脑转移瘤中的一种或多种。

新辅助放射治疗（neo-RT）是例如局部进展期直肠癌、肝转移性T4结肠癌等癌症的基本治疗方法之一。然而，在实际临床工作中发现有部分病人对新辅助放疗出现耐受，治疗效果远不如预期，出现过度治疗的问题。因此，临床工作迫切需要放疗敏感生物标记物指导精准临床治疗方案的制定以及能够增敏放疗的药物以改善耐受放疗病人的预后。但是遗憾的是目前能预测放射治疗反应的生物标记物很少，也很少有药物能增强患者的放射敏感性。

本发明发明人则将研究方向主要聚焦在寻找能够提高放射治疗敏感性的有效药物，希望能够改善放疗耐受病人的治疗效果，并进一步通过大量的实验研究发现，蛋白酶体是泛素-蛋白酶体系统（UPS）的核心组成部分，主要功能是识别有缺陷的蛋白质底物，然后迅速使其降解为肽段。在结构和功能上，蛋白酶体（26S）包括一个中空的圆柱形20S蛋白水解酶核心颗粒（CP），而20S CP可能在恶性肿瘤的发生发展中起着重要作用。

相应地，本发明发明人选择经FDA批准上市的蛋白酶体抑制剂，尤其是20S CP抑制剂（硼替佐米、艾莎佐米、卡菲佐米等）进行研究分析发现，PIs在细胞水平上能够扩大放射所致的损伤效应从而促进凋亡，通过大量的实验研究证实，在临床上使用蛋白酶体抑制剂将能够非常显著地提高肿瘤患者的放射治疗敏感性，从而大大提高肿瘤患者的治疗效果。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

本发明通过大量实验证实蛋白酶体抑制剂对肿瘤放疗具有显著的增效作用，同时阐明了其中的增效机制以及协同机理，对于现有临床治疗中放疗敏感性低、疗效不够显著、副作用大的问题进行了有效地解决，并为临床上使用放疗作为治疗手段进行癌症治疗提供了一种非常有效的治疗策略，具有十分重大的临床以及社会经济意义。

附图说明

图1为肿瘤细胞放疗后细胞克隆形成受到BTZ、IXZ、CFZ等药物影响的生存统计图。

图2为肿瘤细胞放疗与BTZ、IXZ、CFZ等药物联合产生协同效应的统计图。

图3为彗星实验结果示意图。

图4为放疗所致DNA彗尾长度的统计结果。

图5为BTZ对细胞凋亡的影响结果。

图6为裸鼠荷瘤（HCT116）治疗效果图。

图7为裸鼠荷瘤（HCT116）生长体积变化曲线。

图8为裸鼠荷瘤（HCT116）重量结果。

图9为荷瘤（HCT116）裸鼠生存结果。

图10为裸鼠荷瘤（FaDu）治疗效果图。

图11为裸鼠荷瘤（FaDu）生长体积变化曲线。

图12为裸鼠荷瘤（FaDu）重量结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在无特别说明的情况下，本发明上下文中所列出的包括HCT116、HT29、SW837和FaDu等细胞系从American Type Culture Collection（ATCC、Manassas、VA、USA）购入并根据ATCC指南进行培养。其中HCT116和HT29细胞在McCoy’s 5A培养基（KGM4892N，KeyGENBioTECH，中国南京）中培养，SW837细胞在Leibovitz’s L-15培养基（KGM41300N，KeyGENBioTECH）中培养，FaDu细胞在RPMI-1640培养基中培养，添加10%胎牛血清（FBS，P30-2302，Pan BioTECH，Aidenbach，Bavaria，Germany）和1%青霉素-链霉素（P4333, sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）。细胞在37℃ 5%CO₂中培养。所有细胞系均通过中国典型培养物保藏中心（武汉）的短串联重复分析鉴定，并使用PCR检测试剂盒（上海BiothriveSci）验证是否存在支原体污染，同时在液氮中冷冻保存并用于后续实验。

生物学重复中选择具有代表性的结果呈现在上下文附图中，数据按照图示中规定的以mean ± SD 和 mean ± SEM展示。所有体外实验至少重复三次，动物实验重复两次。数据采用GraphPad Prism 5.0或SPSS 20.0软件进行分析。采用t检验或方差分析比较两组或两组以上的平均值差异。生存率用Kaplan-Meier法和对数秩检验进行分析。p＜0.05被认为是一个显著的差异。

实施例1 肿瘤协同抑制实验

选择HT-29、HCT116、SW837与FaDu四种细胞，选择硼替佐米（BTZ）、艾莎佐米（IXZ）及卡菲佐米（CFZ）作为蛋白酶体抑制剂（PIs）进行实验。放疗对细胞增殖的影响主要通过细胞的克隆形成能力来反映，具体实验方法具体如下：

将HCT116、HT29、SW837及FaDu细胞按1000个细胞/孔的密度接种到6孔板中。24小时后，用指定剂量的X射线或药物处理细胞，然后培养10-14天，然后用甲醇固定，0.5%结晶紫染色。对含有50个以上细胞的集落进行计数。

结果显示：低浓度的BTZ、IXZ、CFZ均能显著削弱了放疗后HT29、HCT116、SW837和FaDu细胞的克隆形成能力（如图1所示），并且随着放射剂量加大，各加药组与对照组的差距越来越大，增敏的效果明显，而单独使用药物对肿瘤细胞的克隆形成能力没有任何影响。

进一步进行CCK-8实验，具体实验方法具体如下：四种细胞（2500个/孔）在96个孔板中培养24小时，然后用X射线或药物处理后培养72小时。细胞活力用CCK-8试剂盒（HY-K0301，MCE，Monmouth Junction，NJ，USA）通过OD450 nm测定。用Chou-Talalay法评价X线与药物联合应用的疗效。其中CI计算公式如下：

CI=D _Rx/D _R+D _Dx/D _D+（D _Rx·D _Dx）/（D _R·D _D）。

D _Rx：联合组达到某细胞抑制率时放射所用剂量；D _Dx：联合组达到某细胞抑制率时所用药物的浓度；D _R：单放射组达到某细胞抑制率时放射所用的剂量；D _D：单药组达到某细胞抑制率时所用药物的浓度。

当CI＜1说明两种方式联合表现出协同作用。

如图2所示，使用CI值（Fa-CI图）量化BTZ、IXZ、CFZ三种药物与放疗X射线辐射联合治疗的效果，发现在四种细胞中，四种组合方式均能表现出协同效应。

由此可见，蛋白酶体抑制剂BTZ、IXZ、CFZ在体外均能显著促进放疗后肿瘤细胞的死亡。

实施例2 DNA双链断裂（DSBs）损伤与细胞凋亡实验

放疗最直接的效应是导致DNA双链断裂，基于以上明显的协同效应，进一步通过彗星实验来判断DNA损伤的程度。本实验中选择HT-29、HCT116以及SW837三种细胞系，选择硼替佐米（BTZ）作为蛋白酶体抑制剂（PIs）。具体实验方法如下：

将细胞先用PIs分别处理12小时，然后用X射线（6Gy）照射，培养6小时，随后用彗星试验试剂盒（4250-050-K，Trevigen，Gaithersburg，MD，USA）收集细胞并以3×10⁵细胞/mL的浓度重悬于PBS中，用于DNA损伤分析。然后根据制造商的说明进行彗星实验。PI染色后，用荧光显微镜拍摄彗星图像。使用彗星分析IV软件（Perceptive Instruments, Bury St.Edmunds, UK）对各组的平均彗星尾矩（尾中DNA的百分比×尾长）进行评分。

结果显示：低浓度的BTZ（20nM）在未经照射的3株细胞中单独使用没有形成彗尾，说明这BTZ在低浓度单独使用时不会诱发DNA损伤（如图3-图4所示）。而在X射线（6Gy）照射后,与对照组（DMSO）相比，低浓度的BTZ（20nM）在照射后6h彗尾长度显著延长，说明低浓度BTZ可以显著提高放射诱导DNA双链断裂的水平。由彗星实验的结果可知，低浓度的BTZ与X射线辐照联合可以增强IR所诱导的DNA双链断裂。

随后，进一步采用Annexin V/PI凋亡双染实验检测放射所致的细胞凋亡情况，实验方法具体如下：

用X射线和（或）药物处理细胞，培养48h，用Annexin V/PI凋亡试剂盒（BestBio，中国上海）收集细胞并染色。然后用流式细胞仪（CytoFLEX、Beckman-Coulter）对样本进行分析。

结果如图5所示。可以看出，在未照射的条件下，与对照组（DMSO）相比，单独使用低剂量的BTZ（20nM）对细胞凋亡影响不大；但是在X射线照射（6Gy）后，低浓度BTZ（20nM）组细胞的凋亡率显著高于对照组。

由以上这些数据可知，使用蛋白酶体抑制剂BTZ抑制蛋白酶体的功能在一定程度上增强了X射线照射诱导的DNA双链断裂，进一步促进了放射诱导的细胞凋亡。

实施例3 体内肿瘤抑制实验

将HCT116细胞移植瘤块（约5mm³）皮下种植到裸鼠右侧，建立异种移植模型，随机分为4组：BTZ-放疗X射线联合治疗组、生理盐水(NS)-放疗X射线联合组、BTZ组、生理盐水(NS)组。BTZ-X射线联合治疗组、生理盐水(NS)-放疗X射线联合组从种瘤后的第7天开始，每隔一天依次用BTZ（0.1mg/kg/天×7天）和X射线放射治疗，BTZ组、生理盐水(NS)组与前二组的用药方式相同，但不进行放射治疗，每周测量肿瘤体积一次，治疗周期为14天，治疗3周后处死小鼠剥离瘤块（瘤块如图6所示）。

结果显示，在放射处理后，BTZ-放疗X射线联合治疗组肿瘤体积较生理盐水(NS)-放疗X射线联合组显著减少，在治疗后一周即出现差异，随后BTZ与放疗联合组和NS-放疗X射线联合组体积差异逐渐增大（如图7所示）。通过称量瘤块的重量，结果与观察到的瘤块体积基本一致，BTZ-放疗X射线联合治疗组的瘤块重量远低于NS-放疗X射线联合组（如图8所示），治疗后，BTZ-放疗X射线联合治疗组（89.28%）的抑瘤率明显高于NS-放疗X射线联合治疗组（61.83%）。

进一步地，对治疗后对小鼠生存情况进行了评估，结果显示，与NS-放疗X射线联合治疗相比，BTZ-放疗X射线联合治疗组小鼠的存活率增加，存活时间显著延长（如图9所示）。

更进一步地，将FaDu细胞移植瘤块（约5mm³）皮下种植到裸鼠右侧，建立异种移植模型，随机分为4组：BTZ-放疗X射线联合治疗组、生理盐水(NS)-放疗X射线联合组、BTZ组、生理盐水(NS)组。BTZ-放疗X射线联合治疗组、生理盐水(NS)-放疗X射线联合组从种瘤后的第7天开始，每隔一天依次用BTZ（0.25mg/kg/天×7天）和X射线放射治疗，BTZ组、生理盐水(NS)组与前二组的用药方式相同，但不进行放射治疗，每周测量肿瘤体积一次，治疗周期为14天，治疗3周后处死小鼠剥离瘤块（如图10所示）。

结果显示，在放射处理后，BTZ-放疗X射线联合治疗组肿瘤体积较生理盐水(NS)-放疗X射线联合组显著减少，在治疗后一周即出现差异，随后BTZ与放疗联合组和NS-放疗X射线联合组体积差异逐渐增大（如图11所示）。而且，BTZ-放疗X射线联合治疗组的瘤块重量远低于NS-放疗X射线联合组（如图12所示），治疗后，BTZ-放疗X射线联合治疗组（81.25%）的抑瘤率明显高于NS-放疗X射线联合治疗组（59.02%）。

综上可知，蛋白酶体抑制剂对肿瘤放疗具有显著的增效作用，对于现有临床治疗中放疗敏感性低、疗效不够显著、副作用大的问题进行了有效地解决，在临床上使用蛋白酶体抑制剂将能够非常显著地提高肿瘤患者的放射治疗敏感性，从而大大提高肿瘤患者的治疗效果。

以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种用于癌症放疗增敏的组合物，其特征在于，包括一种或多种蛋白酶体抑制剂。

2.根据权利要求1所述的用于癌症放疗增敏的组合物，其特征在于，所述蛋白酶体抑制剂选自20S CP抑制剂。

3. 根据权利要求2所述的用于癌症放疗增敏的组合物，其特征在于，所述20S CP抑制剂选自硼替佐米、艾莎佐米、卡菲佐米中的一种或多种。

4.根据权利要求1-3任一项所述的用于癌症放疗增敏的组合物，其特征在于，所述癌症选自大肠癌、头颈肿瘤、食管癌、咽喉癌，宫颈癌、肛管癌、乳腺癌、淋巴瘤、脑转移瘤中的一种或多种。

5.根据权利要求6所述的用于癌症放疗增敏的组合物，其特征在于，所述大肠癌选自结肠癌、直肠癌中的一种或多种。

6.根据权利要求1-5任一项所述的用于癌症放疗增敏的组合物在制备用于癌症放疗增敏药物、制剂或试剂盒中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述蛋白酶体抑制剂选自20S CP抑制剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述20S CP抑制剂选自硼替佐米、艾莎佐米、卡菲佐米中的一种或多种。

9.根据权利要求6-8任一项所述的应用，其特征在于，所述癌症选自大肠癌、头颈肿瘤、食管癌、咽喉癌，宫颈癌、肛管癌、乳腺癌、淋巴瘤、脑转移瘤中的一种或多种。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述大肠癌选自结肠癌、直肠癌中的一种或多种。