CN111420060B - 一种抗肿瘤的联合用药组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗肿瘤的联合用药组合物，所述联合用药组合物包含FGFR抑制剂和PD‑1抗体药物。本发明还提供了所述联合用药组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明联合用药物可以有效治疗癌症，效果明显优于单独的anti‑PD‑1抗体治疗和FGFR抑制剂Erdafitinib治疗单独使用，说明二者在配合使用后具有协同增效的作用，并且可以克服获得性耐药的发生，具有良好的临床应用前景。

Description

一种抗肿瘤的联合用药组合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种抗肿瘤的联合用药组合物及其应用。

背景技术

原作为现代肿瘤综合治疗的一种新模式，抗PD-1/PD-L1免疫检查点疗法已逐步成为黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、头颈癌和前列腺癌等多种晚期实体瘤的新标准治疗方法。尽管以该治疗方法为代表的免疫检查点抑制剂(ICIs)单药治疗在超过50％的患者中无明显效果，表现为原发性耐药，并且其中部分患者经过免疫治疗后出现肿瘤快速进展，称为“超进展”(hyperprogression Disease,HPD)。但在另外20％-30％的治疗敏感患者中展现出惊人疗效，它在显著延长了广泛转移的晚期癌症患者的生存期的同时，提高了患者的生活质量。然而随着时间的推移，这部分初始治疗有效的患者可能会产生获得性耐药而导致肿瘤复发。因此更多的研究需要投入到免疫耐受以及肿瘤细胞在治疗中产生的免疫逃逸机制中，进而克服获得性耐药的发生。

获得性耐药是指在最初取得临床获益后一段时间发生进展的这部分患者。已有越来越多的临床证据表明，相当一部分免疫治疗初始应答患者最终会在数月或数年后再次出现疾病进展的情况。Nicholas L Syn等总结了免疫检查点抑制剂耐药机制的研究现状，提出6种免疫治疗耐药机制的假说：(1)肿瘤免疫识别缺陷，包括肿瘤抗原呈递信号通路异常及肿瘤新抗原谱的耗竭；(2)T细胞活化及杀伤功能异常；(3)免疫抑制性肿瘤微环境及新生血管生成；(4)免疫抑制性检查点的补偿性上调；(5)肿瘤的可塑性及肿瘤细胞的表型异质性；(6)肠道微生物组对肿瘤免疫治疗疗效的影响。Zaretsky等通过对Penbrolizumab(anti-PD-1)治疗前及复发耐药后的黑色素瘤患者肿瘤组织标本进行全外显子测序，发现复发后肿瘤标本分别存在JAK1、JAK2基因失活突变(IFN-γ信号通路失活)及B2M基因失活突变(MHC-Ⅰ功能缺陷)。Anagnostou等通过比较免疫治疗前与治疗后进展的非小细胞肺癌肿瘤组织的肿瘤新抗原谱，发现复发肿瘤丢失了7-8个预测新抗原。Koyama等通过构建抗PD-1耐药的小鼠模型，发现免疫治疗耐药后出现CD8⁺T淋巴细胞耗竭及抑制性检查点TIM3表达上调。肿瘤耐药作为宿主、肿瘤细胞与免疫微环境共同作用的结果，亦有研究发现其受到肿瘤细胞外环境中一系列趋化因子和相对丰富的免疫细胞亚群的影响，包括髓源性抑制细胞(MDSCs)、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)、肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)及调节性T细胞(Tregs)等。肿瘤免疫编辑作为一个连续动态变化的过程，对免疫治疗获得性耐药的原因及基于免疫治疗疗效的预测性生物标志物均仍有待于进一步的探索。

CCND1作为一种细胞周期调控蛋白，其与CDK4或CDK6结合形成的复合体可以抑制Rb蛋白活性，使细胞由G1期间进入S期，从而促进细胞增殖。FGF3、FGF4和FGF19同属于成纤维细胞生长因子家族的成员，可参与多种生物学过程，包括胚胎发育、细胞生长、组织修复。这些基因的多态性变异可能导致细胞异常增殖从而诱导肿瘤发生。CCND1和FGF家族成员同位于染色体11q13，目前多项研究显示染色体11q13区段的扩增可能与免疫治疗预后不良甚至超进展相关。Singavi等通过对接受免疫治疗之前的患者进行二代测序，发现位于染色体11q13的CCND1、FGF3、FGF4、FGF19等的扩增与免疫治疗超进展显著相关。徐瑞华等通过对接受特瑞普利单抗治疗的晚期转移性食管鳞癌患者进行二代测序，发现染色体11q13区段扩增的患者的无进展生存期显著降低，显示CCDN1和FGF家族基因可能是潜在介导免疫治疗耐药的基因。然而原无相关位点扩增的患者在经过免疫治疗后，肿瘤染色体11q13位点基因扩增导致耐药的情况却鲜有报道，对于该部分患者的后续治疗策略也有待明确。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述现有技术的缺点和不足，提供一种抗肿瘤的联合用药组合物及其应用。

本发明所采用的技术方案如下：

一种抗肿瘤的联合用药组合物，包含FGFR抑制剂和PD-1抗体药物。

进一步地，所述FGFR抑制剂为Erdafitinib(厄达替尼)。

进一步地，所述PD-1抗体药物为Nivolumab(纳武单抗)、Avelumab、Durvalumab(德瓦鲁单抗)、Toripalimab(特瑞普利单抗)、Keytruda(派姆单抗)、Tislelizumab(替雷利珠单抗)、Pembrolizumab(帕母单抗)或Atezolizumab(阿特珠单抗)。

进一步地，所述FGFR抑制剂和PD-1抗体药物比例为5:4。

进一步地，所述FGFR抑制剂和PD-1抗体药物同时施用。

本发明还包括所述的联合用药组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步地，所述肿瘤为食管癌、肾上腺癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌或甲状腺肿瘤。

更进一步地，所述实体瘤为原发性肝细胞肝癌。

本发明联合用药物可以有效治疗癌症，效果明显优于单独的anti-PD-1抗体治疗和FGFR抑制剂Erdafitinib治疗单独使用，说明二者在配合使用后具有协同增效的作用，并且可以客服获得性耐药的发生，具有良好的临床应用前景。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1是实施例1中患者免疫治疗前后的肺部CT图。

图2是实施例1中患者免疫治疗后对免疫治疗出现耐药后的CT图。

图3是实施例1中患者免疫治疗前后肿瘤组织/血样本全外显子测序结果。

图4是实施例2中获得性耐药模型构建的验证结果图。

图5是实施例3中用RT-qPCR结果显示皮下耐药原代细胞株中CCND1、FGF3、FGF4、FGF15(FGF19)表达量图。

图6是实施例4中联合用药和单独用药后的对比结果图。

具体实施方式

本发明实施例使用的小鼠肝癌细胞系Hepa1-6与小鼠结肠癌细胞系MC38购买于美国ATCC(American Type Culture Collection)细胞库；C57BL/6J免疫完全小鼠购于广东省实验动物中心。本发明所使用的抗小鼠PD-1单抗为BP0146、同型对照抗体IgG2a为BP0089，均购买于美国BioXcell公司。Erdafitinib(JNJ-42756493，一种有效的、具有口服活性的泛FGFR酪氨酸激酶抑制剂)购买于美国Selleck公司。

本发明实施例使用的主要试剂，其中RPMI 1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清、细胞消化用胰蛋白酶、PBS缓冲液、青霉素和链霉素购自美国Gibco公司；IV型胶原酶(9001-12-1)购于德国默克公司旗下品牌sigma；DNA酶Ⅰ(D8071)购于中国Solarbio公司；总RNA提取试剂RNAiso Plus、逆转录试剂PrimeScripffM RT Master Mix和定量PCR试剂SYBR⑧Premix Ex Taq^TM(TliRNaseH Plus)均购自大连宝生物工程有限公司。

本发明实施例使用的主要设备，其中超净工作台、C02培养箱为美国ThermoFisher公司产品；恒温水浴锅为Pharamcia公司产品；倒置光学显微镜及荧光显微镜(IX71)为日本Olympus公司产品；各种微量加样器为德国Eppendorf公司产品；-80℃超低温冰箱为日本SANYO公司产品；高速低温离心机为Beckman公司产品；罗氏480荧光定量PCR仪为美国Roche公司产品。

本发明中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例1

染色体11q13位点基因(CCND1、FGF3、FGF4、FGF19)的扩增是抗PD-1单抗免疫治疗获得性耐药的机制之一

本院追踪的一患者为食管癌术后复发并肺转移患者，全外显子检测提示TMB高，以及CCND1扩增。给予放疗联合pembrolizumab单抗治疗，原发灶和转移灶都有明显缩小。如图1所示，(a-c)早在第7周，吻合口病灶(白色箭头)和左肺转移灶(白色箭头)显着缩小；(d)右肺转移灶(黑色箭头)从基线增长到第12周的0.7×0.8cm，第19周的1.0×1.1cm，随后在第26周减少到0.8×0.9cm，第36周0.6×0.7cm；(e)在两次pembrolizumab治疗后(第7周)检测到新的右肺转移灶(黑色箭头)，大小为0.8x0.7cm，并在第19周增加至1.3x1.1cm，随后第26周减小至1.2x0.9厘米。

该患者维持16个月后出现耐药，表现为原有转移灶增大，以及出现新发肺转移灶。如图2所示，免疫治疗16个月后，2018年6月复查CT时观察到右肺出现了新的转移灶，且原有病灶增大，判断肿瘤对免疫治疗产生了耐药。对右肺新发转移灶进行了SBRT(体部立体定向放疗)治疗，总剂量为50Gy/5F。在SBRT治疗2个月后进行复查，右肺病灶基本消失，但左肺原有病灶较前增大。

通过比较耐药前后肿瘤组织/血样本全外显子测序结果，显示新出现位于11q13位点的FGF3、FGF4和FGF19基因扩增，肿瘤突变负荷降低，此外免疫组化结果显示肿瘤浸润T淋巴细胞少。如图3所示，临床全外显子组测序(CWES)结果显示免疫治疗前，患者的肿瘤突变负荷(TMB)高达2271，同时无FGF基因扩增。免疫治疗耐药后的CWES结果显示EGFR突变消失，肿瘤突变负荷下降至200，出现FGF3、FGF4及FGF19的扩增。

以上病例提示染色体11q13位点的FGF3、FGF4、FGF19基因扩增可能是免疫治疗获得性耐药的原因。

实施例2

抗PD-1单抗获得性耐药动物肿瘤模型的构建

利用Hepa1-6细胞、MC38细胞，接种于4-6周龄C57BL/6J免疫完全小鼠皮下以构建小鼠皮下种植瘤模型，给予anti-PD-1抗体(BP0146)或同型对照IgG(BP0089)抗体干预，通过观察对比小鼠肿瘤体积生长变化情况及小鼠生存状况。

本实施例中细胞培养步骤为：将Hepa1-6(肝癌小鼠细胞系)置于含10％胎牛血清、100U/ml的青霉素、100U/ml链霉素的DMEM培养基培养，将MC38(结肠癌小鼠细胞系)置于含10％胎牛血清、100U/ml的青霉素、100U/ml链霉素的RPMI.1640培养基培养，所有细胞均在37℃、C0₂浓度为5％、0₂浓度为20％、饱和湿度培养箱内培养。取生长状态良好、处于指数生长期的细胞用于后续实验。

本实施例中获得性耐药动物肿瘤模型的构建过程为：消化、洗涤Hepa1-6及MC38细胞株，调整其浓度为1*10^7个/ml备用。4-6周龄C57BL/6J免疫完全小鼠皮下接种100ul含有1*10^6个Hepa1-6细胞或MC38细胞的悬液，两种细胞均各接种30只小鼠。待皮下瘤平均体积达到约50-60mm³时随机分为两组，anti-PD-1单抗(n＝8)实验组中每只鼠按10mg/kg体重的剂量进行抗PD-1单抗治疗，3天一次腹腔注射的方式持续给药4次。对照组(n＝10)按照与实验组相同的方式和剂量给与同型对照IgG抗体治疗。Anti-PD-1单抗治疗组肿瘤出现进展后，将肿瘤进展小鼠均分成anti-PD-1_anti-PD-1治疗组和anti-PD-1_IgG对照组，按照如上给药方式和剂量进行anti-PD-1单抗和同型对照IgG抗体治疗，观察对比小鼠肿瘤体积生长变化情况及小鼠生存状况。皮下瘤体积与小鼠体重测量周期均为两天一次。

结果如图4所示，为Hepa1-6、MC38细胞株获得性耐药模型的构建结果。anti-PD-1单抗治疗肿瘤在获益一段时间出现进展后，使用anti-PD-1单抗的治疗效果与同型对照无明显差异，说明获得性耐药模型构建成功。该结果显示部分anti-PD-1单抗治疗肿瘤在获益一段时间后出现进展，并且anti-PD-1单抗治疗无法抑制肿瘤体积的增长，呈现出明显的耐药趋势，以此获得anti-PD-1抗体免疫治疗获得性耐药肿瘤模型。

实施例3

体外培养构建获得性耐药肿瘤细胞株

利用Ⅳ型胶原酶及DNA酶Ⅰ对获得性耐药肿瘤组织块进行消化以提取原代细胞，体外培养构建获得性耐药肿瘤细胞株(Hepa1-6/PD-1_R、MC38/PD-1_R)。

本实施例的具体步骤为：将小鼠酒精消毒固定后，用高压灭菌的器械小心剥取皮下瘤，剪切相对完整无淤血的小部分瘤块置于无菌培养皿中，充分剪碎瘤组织，加入胶原酶(工作浓度：0.5mg/ml)和DNA酶I(工作浓度：0.1mg/ml)工作液充分混匀，于37℃摇床充分消化瘤组织30分钟。组织混悬液倒入细胞滤网，进一步碾碎组织，收集滤液于离心机中以1000r/分钟的转速离心3分钟。倒掉上清液，用含血清与双抗的培养基重悬肿瘤细胞，两天后观察细胞状态并换液。

本实施例采用RT-qPCR方法检测皮下肿瘤及原代细胞株中染色体11q13.3区域CCND1、FGF3、FGF4及FGF19基因的表达情况，具体步骤如下：

(1)RNA的提取：

将细胞接种于培养皿钟，待其生长融合度达到80％左右，洗净培基，用PBS洗涤细胞两次，加入RNAiso Plus溶液，混匀后置于冰上静置10分钟。按lmlRNAiso Plus溶液加0.2ml的比例加入氯仿，剧烈震荡15秒后室温放置3分钟。按12000r/分钟转速4℃离心样品15分钟。离心后的样品分为三层：底层为红色有机相，上层为无色水相和中间层。RNA主要在水相中，小心吸取上层水相溶液，置于新的EP管中。按lmlRNAiso Plus溶液加入0.5ml异丙醇的比例加入4℃预冷的异丙醇，室温静置10分钟后按12000r/分钟转速4℃离心样品15分钟。离心后的样品底部可见白色沉淀，即为析出的RNA。弃去上清液，加入1-2ml 75％乙醇洗涤RNA沉淀，按8000r/分钟的转速4℃离心15分钟，洗涤两次，弃去上清液。EP管室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，用DEPC水溶解沉淀后用紫外可见分光光度计NanoDrop NDl000检测RNA的纯度及浓度。纯净RNA的A260/A280比值为2.0，通常正常范围为1.8-2.0，含有杂质则比值降低。测浓度后的RNA进行逆转录或置于-80℃保存。

(2)逆转录定量PCR(qRT-PCR)：

将逆转录试剂置于冰上解冻后备用；按逆转录试剂说明书将水、总ILNA(1ug)及逆转录相关试剂加入PCR管中，并将PCR管放入PCR仪中，按逆转录试剂说明书设定PCR反应程序，启动逆转录，获得cDNA。按定量PCR试剂说明书将cDNA、上游引物、下游引物、水及各种PCR反应试剂加入八连管中，使用罗氏480荧光定量PCR仪检测并用-2^△△Ct值比较目的基因表达情况.

本实施例中的引物序列如下：

FGF3：5'-TGCGCTACCAAGTACCACC-3'(sense)(SEQ ID NO:1)；

5'-CACTTCCACCGCAGTAATCTC-3'(antisense)(SEQ ID NO:2)；

FGF4：5'-GGGCATCGGATTCCACCTG-3'(sense)(SEQ ID NO:3)；

5'-GCTGCTCATAGCCACGAAGAA-3'(antisense)(SEQ ID NO:4)；

FGF15：5'-ATGGCGAGAAAGTGGAACGG-3'(sense)(SEQ ID NO:5)；

5'-CTGACACAGACTGGGATTGCT-3'(antisense)(SEQ ID NO:6)；

CCND1：5'-GCGTACCCTGACACCAATCTC-3'(sense)(SEQ ID NO:7)；

5'-CTCCTCTTCGCACTTCTGCTC-3'(antisense)(SEQ ID NO:8)；

结果如图5所示，获得性耐药肿瘤组织以及耐药原代细胞株中CCND1、FGF3、FGF4及FGF15(FGF19)的表达水平有显著上调。进而说明染色体11q13位点基因(CCND1、FGF3、FGF4、FGF19)的扩增可能是抗PD-1单抗免疫治疗获得性耐药的原因。

本发明所述的人体基因FGF19，在小鼠体内命名为FGF15，两者实际为同一个基因。因此，在本实施例中，小鼠实验中对应的基因为FGF15。

实施例4

FGFR抑制剂Erdafitinib联合anti-PD-1治疗可增强对获得性耐药肿瘤的抗肿瘤效应

利用获得性耐药细胞株(Hepa1-6/PD-1_R、MC38/PD-1_R)构建小鼠皮下移植瘤模型，观察比较同型对照IgG抗体治疗组、anti-PD-1抗体治疗组、Erdafitinib(JNJ-42756493，泛FGFR抑制剂)单药治疗组、抗PD-1抗体联合Erdafitinib治疗组小鼠皮下肿瘤的体积，体内检测其对anti-PD-1抗体治疗的敏感性。

本实施例的具体步骤为：消化、洗涤Hepa1-6/PD-1_R细胞株，调整其浓度为1*10^7个/ml备用，4-6周龄C57BL/6J免疫完全小鼠皮下接种100ul含有1*10^6个Hepa1-6/PD-1_R细胞的悬液。待皮下瘤平均体积达到约50-60mm³时随机分为四组，分别给予同型对照IgG(n＝8)、anti-PD-1单抗(n＝8)、Erdafitinib(n＝8)、anti-PD-1单抗联合Erdafitinib(n＝8)治疗。其中Erdafitinib均按照12.5mg/kg体重的剂量每日灌胃的方式给药,anti-PD-1单抗及其同型对照抗体则按照原发耐药模型中的剂量和方式使用。

结果如图6所示，anti-PD-1抗体单药治疗无法抑制肿瘤生长，而anti-PD-1抗体联合FGFR抑制剂(Erdafitinib)治疗可显著抑制获得性耐药肿瘤的生长增殖。该结果显示anti-PD-1单抗联合泛FGFR抑制剂Erdafitinib治疗显示出明显的优于两单药治疗组的抑制肿瘤效应，进而说明两药联合可克服获得性耐药的发生。

本研究通过分析免疫治疗获得性耐药临床患者的测序结果和预后情况，通过体内外实验证明抗PD-1单抗治疗初始有效动物模型可因位于染色体11q13位点的CCND1、FGF3、FGF4、FGF19的扩增从而引发获得性耐药，同时通过体内外实验评估了抗PD-1单抗联合FGFR抑制剂Erdafitinib治疗疗效，为上述相关基因扩增导致免疫治疗获得性耐药患者提供新的治疗方法。

本发明联合用药物可以有效治疗癌症，效果明显优于单独的anti-PD-1抗体治疗和FGFR抑制剂Erdafitinib治疗单独使用，说明二者在配合使用后具有协同增效的作用，并且可以克服获得性耐药的发生，具有良好的临床应用前景。

本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变动。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>南方医科大学南方医院

<120>一种抗肿瘤的联合用药组合物及其应用

<160> 13

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>FGF3的正义链引物序列

<400>1

tgcgctaccaagtaccacc19

<210>2

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>FGF3的反义链引物序列

<400>2

cacttccaccgcagtaatctc 21

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>FGF4的正义链引物序列

<400>3

gggcatcggattccacctg19

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>FGF4的反义链引物序列

<400>4

gctgctcatagccacgaagaa21

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>FGF15的正义链引物序列

<400>5

atggcgagaaagtggaacgg 20

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>FGF15的反义链引物序列

<400>6

ctgacacagactgggattgct 21

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CCND1的正义链引物序列

<400>7

gcgtaccctgacaccaatctc 21

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CCND1的反义链引物序列

<400>8

ctcctcttcgcacttctgctc 21

Claims (2)

1.一种联合用药组合物在制备治疗获得性PD-1抗体耐药性肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述联合用药组合物包含FGFR抑制剂和PD-1抗体药物；所述FGFR抑制剂为Erdafitinib；所述PD-1抗体克隆号为RMP1-14；所述肿瘤为肝癌或结肠癌。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述FGFR抑制剂和PD-1抗体药物比例为5:4。

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