CN111413433A - 一种蔬菜植物中咖啡因及其代谢产物的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蔬菜植物中咖啡因及其代谢产物的测定方法，包括样品预处理、样品提取、浓缩纯化、分析检测。本方法采用甲醇震荡提取、固相萃取和高效液相色谱与质谱联用技术(HPLC‑MS)来测定蔬菜植物中的咖啡因及其代谢产物。取植物干粉，加入甲醇震荡提取；合并提取液旋蒸浓缩，通过固相萃取小柱除去杂质后，旋蒸、氮吹干后滤膜定容至1mL，待仪器分析；利用HPLC仪器，进行梯度洗脱；以四极杆‑飞行时间质谱检测器来检测分析蔬菜植物中的咖啡因及其代谢产物。该方法针对咖啡因这一环境有机污染物，对外源引入咖啡因的蔬菜样品进行测定，建立提取效率好、最大限度去除植物色素干扰、灵敏度高的分析方法。

Description

一种蔬菜植物中咖啡因及其代谢产物的测定方法
技术领域
本发明涉及植物中咖啡因提取和检测的技术领域，具体涉及一种蔬菜植物中咖啡因及其代谢产物的测定方法。
背景技术
药物和个人护理品(Pharmaceuticals and Personal Care Products，PPCPs)是一类对生态环境和人体健康具有潜在危害的新兴污染物，其环境存在、风险评价和毒理学等方面的研究引起了环境科学领域的广泛关注。咖啡因作为较为常见的PPCPs，在环境中具有极高的检出率，在世界各地的自然水环境和污水中均检测到咖啡因的存在，其检测浓度通常达到ng/L至μg/L的水平。环境中这些咖啡因污染物的主要来源是污水处理厂，在常规废水处理过程中，咖啡因通常不能完全被去除。含有咖啡因的生活废水经污水处理后，可用于农业灌溉，随后其中的咖啡因及其代谢产物可能进入食物链，最终给生态系统和人类健康带来不利影响。
咖啡因是一种中枢神经兴奋剂，有刺激中枢神经的功能，具有成瘾性；其作为最常用的精神活性物质，当达到平均摄入水平时，其通常被认为对机体健康有好处或者说并没有坏处，然而如今越来越多的研究证据表明，孕期摄入咖啡因可能会对婴儿健康有害，且世界卫生组织也限定了咖啡因的每日摄入量。2017年，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单，咖啡因属于3类致癌物，一旦人体过量使用对身体健康存在很大的威胁。因此，检测鉴定蔬菜吸收外源咖啡因及其代谢产物的含量，对于保障环境和食品安全具有重要意义。
在目前的相关研究中，咖啡因通常使用超声提取、固相萃取和液相色谱法分析。现有测定咖啡因的方法基本是通用的PPCPs检测方法，研究对象限于水体、土壤、饮料或含咖啡因的植物，没有提到对于不含咖啡因植物的咖啡因及其代谢产物的提取分析方法。由于植物基质复杂、影响因素多，特别是含有多糖，色素，有机酸等杂质难以去除。
发明内容
本发明提供了一种蔬菜植物中咖啡因及其代谢产物的测定方法，改善原有的提取检测条件，采用震荡提取、双柱固相萃取、HPLC-MS检测的方法，建立提取效率好、最大限度去除植物色素干扰、灵敏度高的分析方法。
一种蔬菜植物中咖啡因及其代谢产物的测定方法，包括：
(1)样品预处理；
(2)样品提取；
(3)浓缩纯化；
(4)分析检测。
步骤(1)中，所述的样品预处理具体包括：将样品冷冻干燥至恒重后，用研钵将其研磨均匀，并过50～70目筛。
所述的样品为生长在含咖啡因废水中的蔬菜样品，如生长在初始咖啡因浓度为1ppm的培养液中的菜心植株。
优选地，过60目筛
步骤(2)中，所述的样品提取，具体包括：
向预处理后的样品中加入Na2EDTA水溶液，充分搅拌并涡旋，再加入甲醇，震荡提取3～5次，每次1～3h，然后离心，合并上清液，得到样品提取液。
进一步优选，向预处理后的样品中加入100～200mg/L Na2EDTA水溶液，充分搅拌并涡旋0.5min～3min，再加入甲醇，20℃～30℃下150～250rpm震荡提取3～5次，每次1～3h，然后8000～12000rpm离心5～15min，合并上清液，得到样品提取液；
所述的预处理后的样品、Na2EDTA水溶液、甲醇的用量之比为500mg：1～4mL：10～40mL。
最优选的，向预处理后的样品中加入150mg/L Na2EDTA水溶液，充分搅拌并涡旋1min，再加入甲醇，25℃下200rpm震荡提取4次，每次2h，然后10000rpm离心10min，合并上清液，得到样品提取液；
所述的预处理后的样品、Na2EDTA水溶液、甲醇的用量之比为500mg：2mL：20mL。
步骤(3)中，所述的浓缩纯化，具体包括：
将样品提取液旋转蒸发，旋蒸时20℃～40℃水浴加热；
依次用甲醇和去离子水活化固相萃取柱，将两种小柱ProElutCARB/NH2和ProElutCARB/PSA组装到一起，将浓缩液过以上两种小柱，并用甲醇分次不断抽真空洗脱；
洗脱液合并后旋蒸，然后氮吹浓缩至恰好吹干，用甲醇定容，过滤，保存。
所述的氮吹浓缩的干浴温度为30℃～40℃。
最优选的，将样品提取液旋转蒸发至2mL，旋蒸时30℃水浴加热；依次用6mL甲醇和去离子水活化固相萃取柱，将两种小柱ProElutCARB/NH2和ProElutCARB/PSA(规格为200mg，6mL)组装到一起，将2mL浓缩液过以上两种小柱，并用40mL甲醇分次不断抽真空洗脱；洗脱液合并后旋蒸至5mL，然后氮吹浓缩(干浴温度为35℃)至恰好吹干，用甲醇定容至1mL，过0.22μm尼龙针筒过滤器过滤，得到待检测纯品，保存于棕色样品瓶中，待仪器分析。
步骤(4)中，所述的分析检测，具体包括：
利用HPLC-MS/MS进行分析检测；
HPLC仪器的检测条件设置为：进样体积10～30μL，柱温30～50℃，流速为0.5～2mL/min，色谱柱为C18液相色谱柱，流动相为含体积百分数0.005％～0.02％甲酸的去离子水和含体积百分数0.005％～0.02％甲酸的乙腈，检测波长为262～282nm。
HPLC仪器的流动相的洗脱程序的时间为30～50min，流动相的洗脱程序从含体积百分数0.005％～0.02％甲酸的去离子水和含体积百分数0.005％～0.02％甲酸的乙腈体积比95：5至5：95进行梯度洗脱。
进一步优选，HPLC仪器的检测条件设置为：进样体积20μL，柱温40℃，流速为1mL/min，色谱柱为XBridgeC18液相色谱柱(5μm×4.6mm×250mm)，流动相为含体积百分数0.01％甲酸的去离子水和含体积百分数0.01％甲酸的乙腈，检测波长为272nm。
流动相的洗脱程序的时间为40min，流动相的洗脱程序从含体积百分数0.01％甲酸的去离子水与含体积百分数0.01％甲酸的乙腈体积比95：5至5：95进行梯度洗脱。
MS/MS仪器的检测条件为：电喷雾电离源(ESI)，扫描方式为正离子扫描，检测方式为多反应监测MRM，毛细管电压和锥孔电压分别为3500V～4500V和60V～70V，干燥气温度和流速为200℃～300℃和6L/min～10L/min。
最优选地，MS/MS仪器的检测条件为：电喷雾电离源(ESI)，扫描方式为正离子扫描，检测方式为多反应监测MRM，毛细管电压和锥孔电压分别为4000V和65V，干燥气温度和流速为250℃和8L/min。
与现有技术相比，本发明的有效效益主要体现在：
(1)在样品前处理和提取步骤中，通过优化研磨程度、提取液的种类和提取次数，减少了在样品处理过程中的损耗，提高了提取效率。
(2)蔬菜样品，特别是叶菜类，其叶绿素含量很高。色素等杂质的存在会对化合物的分析检测造成干扰，会影响仪器的灵敏度和色谱柱的分离效果。本发明在不影响纯化效率的前提下，采用两种固相萃取小柱对提取样品进行分离纯化，有效的减少了蔬菜提取样品中的有机酸、色素和金属离子等杂质，最大限度去除了植株色素的干扰。
(3)本发明不仅对蔬菜植株外源引入的咖啡因母体进行测定，同时分析鉴定了咖啡因在蔬菜植株的中的两种代谢产物。
(4)本发明蔬菜植物中咖啡因及其代谢产物的测定方法，包括样品预处理、样品提取、浓缩纯化、分析检测。本方法采用甲醇震荡提取、固相萃取和高效液相色谱与质谱联用技术(HPLC-MS)来测定蔬菜植物中的咖啡因及其代谢产物。以四极杆-飞行时间质谱检测器来检测分析蔬菜植物中的咖啡因及其代谢产物。该方法针对咖啡因这一环境有机污染物，对外源引入咖啡因的蔬菜样品进行测定，建立提取效率好、最大限度去除植物色素干扰、灵敏度高的分析方法。
附图说明
图1为研磨程度(是否通过60目筛)对蔬菜样品中咖啡因提取效率的影响；
图2为提取试剂和提取次数对蔬菜样品中咖啡因提取效率的影响；
图3为提取方式对蔬菜样品中咖啡因提取效率的影响；
图4为咖啡因溶液的标准曲线，其中y＝64498x-411.98，R2＝0.9997；
图5为咖啡因标准液(2ppm、6ppm和8ppm)的重叠液相色谱图；
图6为菜心植物样品的咖啡因及其代谢产物的液相色谱图；
图7是蔬菜样品液质检测中咖啡因母体的的一级质谱图和二级质谱图；
图8是蔬菜样品液质检测中代谢产物M1的一级质谱图和二级质谱图；
图9是蔬菜样品液质检测中代谢产物M2的一级质谱图和二级质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例：
详细而言，一种蔬菜植物中咖啡因及其代谢产物的测定方法，具体操作步骤如下：
(1)样品预处理步骤：选取生长在初始咖啡因浓度为1ppm的培养液中的菜心植株，冷冻干燥至恒重，用研钵将其研磨均匀，并使其都能通过60目筛。
(2)样品提取步骤：称取500mg冻干研磨后的样品，放置到50ml离心管中，加入2mL的150mg/LNa2EDTA水溶液，充分搅拌并涡旋1min，再加入20mL甲醇，25℃下200rpm震荡提取4次，每次2h，然后10000rpm离心10min，合并上清液。
(3)浓缩纯化步骤：将上述所述提取液合并后，旋转蒸发至约2mL，旋蒸时30℃水浴加热；依次用6mL甲醇和去离子水活化固相萃取柱，将两种小柱ProElutCARB/NH2和ProElutCARB/PSA(规格为200mg，6mL)组装到一起，将2mL浓缩液过两种小柱，并用40mL甲醇不断抽真空洗脱；洗脱液合并后旋蒸至5mL，然后氮吹浓缩(干浴温度为35℃)至恰好吹干，用甲醇定容至1mL，过0.22μm尼龙针筒过滤器过滤，保存于棕色样品瓶中，待仪器分析。以上各步骤的回收率如表1所示，表1为咖啡因测定方法中各步骤的回收率，表中数据表示为均值和标准偏差，回收率均大于95％，说明本方法可行且高效。
表1 咖啡因测定方法中各步骤的回收率
步骤 回收率/％
提取 95.4±3.27
过0.22μm膜 100.2±2.64
固相萃取 95.4±5.79
旋蒸浓缩 99.8±4.85
(4)分析检测步骤：利用HPLC仪器对所述净化试样进行分析检测，仪器条件设置为：进样体积20μL，柱温40℃，流速为1mL/min，色谱柱为XBridgeC18液相色谱柱(规格为5μm×4.6mm×250mm)，流动相为含0.01％甲酸的去离子水和乙腈，检测波长为272nm，洗脱程序见附表2，表2为咖啡因液相检测方法中流动相的洗脱程序。MS/MS参数：电喷雾电离源(ESI)，扫描方式为正离子扫描，检测方式为多反应监测MRM，毛细管电压和锥孔电压分别为4000V和65V，干燥气温度和流速为250℃和8L/min。
表2 咖啡因的液相洗脱程序
时间/分钟 去离子水+0.1％甲酸/％ 乙腈+0.1％甲酸/％
0 95 5
5 95 5
30 0 100
33 0 100
34 95 5
40 95 5
本发明中称取10mg咖啡因标准品，置于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，得到浓度为100mg/L的咖啡因母液，将母液逐步稀释为1ppm、2ppm、4ppm、6ppm和8ppm的标准工作溶液。实验中对标准工作溶液进行HPLC分析，并以咖啡因标样峰面积(y)对其浓度(x)进行线性回归分析，得到咖啡因的标准工作曲线，结果如图4所示。由图4可见，线性方程为y＝64498x-411.98，相关系数为0.9997，说明咖啡因在线性范围内具有良好的线性关系。图5从里到外分别为为2ppm、6ppm和8ppm咖啡因标准液的重叠色谱图，从图中我们可以看出咖啡因的出峰时间为12.38min。
将待测菜心植物样品进行HPLC分析，得到图6的液相色谱图，从图中我们可以看出图谱清晰，说明杂质去除的较为干净；同时通过标准品的出峰时间来确定菜心样品中咖啡因的出峰位置，继而将峰面积带入标准曲线方程得到咖啡因的含量。通过二级质谱的分析得到，咖啡因的质谱保留时间为12.66min，母离子195.0871、碎片离子138.0655和110.0701；并检测到了代谢产物M1为黄嘌呤，质谱保留时间为3.805min，母离子为152.0724，碎片离子110.0638和83.0585；其中，代谢产物M2为可可碱，质谱保留时间为8.739min，母离子为181.0884，碎片离子为138.0714和81.0360。图7、图8和图9分别是菜心样品质谱检测中咖啡因、代谢产物M1和代谢产物M2的一级质谱图和二级质谱图。
对比例1
本对比除研磨的程度不同，其余步骤与实例1完全相同，提取效率结果如图1所示。
研磨的粗细程度不同，提取效率不同。根据图中的结果我们可以看出，当把样品研磨至0.25mm以下(即可通过60目筛)，样品的提取效率显著提高，提高了约22％。综合考虑研磨程度与咖啡因提取效率之间的关系，本文最终采取将样品研磨至0.25μm以下颗粒大小的预处理方法。
对比例2
本对比除了提取液和提取次数不同，其余步骤与实例1完全相同，提取效率结果如图2所示。
提取液的种类和提取次数都会影响蔬菜样品中咖啡因的提取效率。根据图2中的结果我们可以看出，对于甲醇、乙醇、乙腈、丙酮这四种提取液来说，甲醇对蔬菜中咖啡因的提取效率是最高的，所以我们选取甲醇最为提取试剂。且我们从图2中也可看出，随着提取次数的增加，提取效率不断提高，甲醇提取四次后效率达到95.4％。综上，我们选择使用甲醇提取4次的提取方法。
对比例3
本对比除了提取方式不同，其余步骤与实例1完全相同，提取效率结果如图3所示。
在以往的咖啡因提取试验中，主要是采用超声提取和震荡提取的方式。在本咖啡因的提取试验中，在其他提取条件相同的情况下，分别超声提取和震荡提取2h重复4次。由图3可以看出，虽然超声提取的效率也超过了90％，但是震荡提取的效率更高为104.0±1.94％，所以我们选择震荡提取2h的提取方式。
综上所述，本发明的测定方法利用震荡提取的方式，使用HPLC测定蔬菜样品中的咖啡因含量，避免了样品提取效率低、检出限较高、叶片色素干扰严重等问题，建立了一套灵敏高效的检测方法。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，所作的任何修改、等同替换和改进等，这些也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种蔬菜植物中咖啡因及其代谢产物的测定方法，其特征在于，包括：
(1)样品预处理；
(2)样品提取，具体包括：
向预处理后的样品中加入Na2EDTA水溶液，充分搅拌并涡旋，再加入甲醇，震荡提取3～5次，每次1～3h，然后离心，合并上清液，得到样品提取液；
(3)浓缩纯化；
(4)分析检测。
2.根据权利要求1所述的蔬菜植物中咖啡因及其代谢产物的测定方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的样品预处理具体包括：将样品冷冻干燥至恒重后，用研钵将其研磨均匀，并过50～70目筛。
3.根据权利要求1所述的蔬菜植物中咖啡因及其代谢产物的测定方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的样品为生长在含咖啡因废水中的蔬菜样品。
4.根据权利要求1所述的蔬菜植物中咖啡因及其代谢产物的测定方法，其特征在于，步骤(2)中，样品提取，具体包括：
向预处理后的样品中加入100～200mg/L Na2EDTA水溶液，充分搅拌并涡旋0.5min～3min，再加入甲醇，20℃～30℃下150rpm～250rpm震荡提取3～5次，每次1～3h，然后8000～12000rpm离心5～15min，合并上清液，得到样品提取液；
所述的预处理后的样品、Na2EDTA水溶液、甲醇的用量之比为500mg：1～4mL：10～40ml。
5.根据权利要求4所述的蔬菜植物中咖啡因及其代谢产物的测定方法，其特征在于，步骤(2)中，样品提取，具体包括：
向预处理后的样品中加入150mg/L Na2EDTA水溶液，充分搅拌并涡旋1min，再加入甲醇，25℃下200rpm震荡提取4次，每次2h，然后10000rpm离心10min，合并上清液，得到样品提取液；
所述的预处理后的样品、Na2EDTA水溶液、甲醇的用量之比为500mg：2mL：20mL。
6.根据权利要求1所述的蔬菜植物中咖啡因及其代谢产物的测定方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的浓缩纯化，具体包括：
将样品提取液旋转蒸发，旋蒸时20℃～40℃水浴加热；
依次用甲醇和去离子水活化固相萃取柱，将两种小柱ProElutCARB/NH2和ProElutCARB/PSA组装到一起，将浓缩液过以上两种小柱，并用甲醇分次不断抽真空洗脱；
洗脱液合并后旋蒸，然后氮吹浓缩至恰好吹干，用甲醇定容，过滤，保存。
7.根据权利要求6所述的蔬菜植物中咖啡因及其代谢产物的测定方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的氮吹浓缩的干浴温度为30℃～40℃。
8.根据权利要求1所述的蔬菜植物中咖啡因及其代谢产物的测定方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的浓缩纯化，具体包括：
将样品提取液旋转蒸发至2mL，旋蒸时30℃水浴加热；依次用6mL甲醇和去离子水活化固相萃取柱，将两种小柱ProElutCARB/NH2和ProElutCARB/PSA组装到一起，将2mL浓缩液过以上两种小柱，并用40mL甲醇分次不断抽真空洗脱；洗脱液合并后旋蒸至5mL，然后氮吹浓缩至恰好吹干，氮吹浓缩的干浴温度为35℃，用甲醇定容至1mL，过0.22μm尼龙针筒过滤器过滤，得到待检测纯品，保存于棕色样品瓶中，待仪器分析。
9.根据权利要求1所述的蔬菜植物中咖啡因及其代谢产物的测定方法，其特征在于，步骤(4)中，分析检测，具体包括：
利用HPLC-MS/MS进行分析检测；
HPLC仪器的检测条件设置为：进样体积10～30μL，柱温30～50℃，流速为0.5～2mL/min，色谱柱为C18液相色谱柱，流动相为含体积百分数0.005％～0.02％甲酸的去离子水和含体积百分数0.005％～0.02％甲酸的乙腈，检测波长为262～282nm。
HPLC仪器的流动相的洗脱程序的时间为30～50min，流动相的洗脱程序从含体积百分数0.005％～0.02％甲酸的去离子水和含体积百分数0.005％～0.02％甲酸的乙腈体积比95：5至5：95进行梯度洗脱；
MS/MS仪器的检测条件为：电喷雾电离源，扫描方式为正离子扫描，检测方式为多反应监测MRM，毛细管电压和锥孔电压分别为3500V～4500V和60V～70V，干燥气温度和流速为200℃～300℃和6L/min～10L/min。
10.根据权利要求1所述的蔬菜植物中咖啡因及其代谢产物的测定方法，其特征在于，步骤(4)中，分析检测，具体包括：
利用HPLC-MS/MS进行分析检测；
HPLC仪器的检测条件设置为：进样体积20μL，柱温40℃，流速为1mL/min，色谱柱为XBridgeC18液相色谱柱，流动相为含体积百分数0.01％甲酸的去离子水和含体积百分数0.01％甲酸的乙腈，检测波长为272nm。
流动相的洗脱程序的时间为40min，流动相的洗脱程序从含体积百分数0.01％甲酸的去离子水与含体积百分数0.01％甲酸的乙腈体积比95：5至5：95进行梯度洗脱；
MS/MS仪器的检测条件为：电喷雾电离源，扫描方式为正离子扫描，检测方式为多反应监测MRM，毛细管电压和锥孔电压分别为4000V和65V，干燥气温度和流速为250℃和8L/min。
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