CN111411041B - 一种旋磁细胞培养装置及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种旋磁细胞培养装置，涉及旋转磁场技术领域，本发明包括旋磁装置和细胞培养筒，细胞培养筒位于罩体的顶端；旋磁装置包括罩体、旋转轴和两块永磁铁，旋转轴和两块永磁铁均位于罩体内，两块永磁铁相对于旋转轴的轴线对称设置，两块永磁铁之间设有连接杆，连接杆与旋转轴连接旋转轴转动致使两块永磁铁沿旋转轴的轴线旋转，每个永磁铁的一端均朝向罩体顶端，两块永磁铁的磁极方向相反。本发明还提供上述旋磁细胞培养装置的应用，本发明的有益效果在于：旋磁细胞培养装置可培养各种哺乳动物细胞及组织，包括癌细胞和正常细胞，用于检测各种细胞在旋磁处理条件下的变化，一定条件下培养乳腺癌细胞，可抑制乳腺癌细胞的粘附、迁移和侵袭。

Description

一种旋磁细胞培养装置及其应用

技术领域

本发明涉及旋转磁场技术领域，具体涉及一种旋磁细胞培养装置及其应用。

背景技术

目前乳腺癌的临床治疗手段主要有手术切除、放射疗法、化学疗法、内分泌综合治疗和光动力学疗法等。但由于乳腺癌具有较高的复发和转移等特性，手术已无能为力，而放化疗可引起诸多不良反应并产生耐药性，其治疗效果也不能满足临床需求，因此，寻找一种安全有效且经济的方法抑制肿瘤的生长和转移迫在眉睫。

如专利CN105670998A公开一种钙化癌细胞的方法，包括以下步骤：(1)将癌细胞接种于含有叶酸的培养基中，孵育，得到表面富集叶酸的癌细胞；(2)将表面富集叶酸的癌细胞置于钙化液中孵育，制得钙化的癌细胞，在癌细胞表面形成磷酸钙钙化层，可抑制细胞活性，破坏细胞膜的结构并最终导致癌细胞死亡；动物实验表明本发明的钙化处理对血液细胞没有影响，没有肝毒性，且对器官几乎没有损伤，具有较好的生物安全性。

专利CN103966334A公开CSF2RB基因在前列腺癌骨转移中的应用，其保护一种体外非治疗性抑制前列腺癌迁移的方法，包括步骤：在CSF2RB抑制剂存在下，培养前列腺癌细胞，从而抑制前列腺癌细胞迁移。

磁场和人的生活密切相关，地磁场的强度有50微特斯拉(μT)。磁场根据其强度和方向随时间变化的情况又可以分为稳态磁场和时变磁场。稳态磁场指的是强度和方向都不随时间而变化的磁场，地磁场可以看做是一种强度弱的稳态磁场。时变磁场指的是强度和方向会随着时间而变化的磁场，除了场强和空间分布之外，还有各种频率、波形等磁场变化情况，因此分类更为复杂。旋磁属于时变磁场，可通俗地理解为旋转着的磁场，包括由电磁场产生的旋转磁场以及由旋转的永磁铁产生的旋转磁场。

磁场是一种非侵入的物理方法，在生物医学领域具有广阔的前景，但目前磁场相关的基础生物学研究和临床实验还远远不够，同时，磁场类型、曝磁条件以及所测试对象不尽相同，导致所产生的生物学效应有所不同。而现有的“磁疗”产品，大部分属于自制类，主要是利用永磁铁提供的稳态磁场。比如，磁性床垫、磁疗枕头、磁疗鞋垫、磁性手环等。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种可以检测各种细胞在旋磁处理条件下的变化的旋磁细胞培养装置。

本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：

一种旋磁细胞培养装置，包括旋磁装置和细胞培养筒，所述细胞培养筒位于罩体的顶端；所述旋磁装置包括罩体、旋转轴和两块永磁铁，所述旋转轴和两块永磁铁均位于罩体内，所述两块永磁铁相对于旋转轴的轴线对称设置，所述两块永磁铁之间设有连接杆，所述连接杆与旋转轴连接，所述旋转轴转动致使两块永磁铁沿旋转轴的轴线旋转，每个永磁铁的一端均朝向罩体顶端，所述两块永磁铁的磁极方向相反；

所述细胞培养筒包括筒体和第一管道，所述筒体内部中空，所述筒体的底端设有开口，所述筒体外侧壁设有空腔夹层，所述第一管道的一端与筒体连接，所述第一管道的一端贯穿至筒体内壁。

工作原理：将细胞培养筒的第一管道与二氧化碳气体瓶连接，从第一管道内通入二氧化碳；通过空腔夹层调控细胞培养筒的培养温度；通过在培养筒内放置装有水的烧杯，保持培养筒内的湿度；

通过调整罩体顶壁与永磁铁顶壁之间的距离，调整细胞所受的磁场强度，距离越近，磁场强度越大。

旋转轴旋转使永磁铁沿旋转轴的轴线旋转，形成旋转磁场，其中两块永磁铁的磁极方向相反。

有益效果：本发明中的旋磁细胞培养装置可以培养各种哺乳动物细胞及组织，包括癌细胞和正常细胞，用于检测各种细胞在旋磁处理条件下的变化；

本发明中的旋磁装置体积较小，便于应用，成本较低，使用方便。

优选地，所述永磁铁呈柱状。

优选地，所述筒体的材质为无磁性的不锈钢材料。

优选地，所述永磁铁一端的磁极朝向筒体，所述永磁铁另一端的磁极朝向罩体的底端。

优选地，所述第一管道的一端与筒体的顶壁连接。

优选地，所述细胞培养筒还包括第二管道和第三管道，所述第二管道的一端与空腔夹层侧壁底端连接，所述第三管道的一端与空腔夹层侧壁顶端连接，所述第二管道和第三管道相对设置。

工作原理：将第二管道与循环水浴锅的出水口连接，将第三管道与循环水浴锅的进水口连接。

有益效果：二氧化碳的密度大于空气，二氧化碳从筒体的顶壁进入，使二氧化碳在细胞培养筒内均匀分布；通过循环水浴锅内的热水调节筒体的温度。

优选地，所述旋磁细胞培养装置的磁场强度为0-1T，旋转频率为0-4.2Hz。

优选地，所述旋转频率为0、2.5Hz、3.3Hz或4.2Hz。

本发明所要解决的技术问题之二在于提供一种非治疗为目的基于上述旋磁细胞培养装置在抑制乳腺癌细胞转移中的应用。

一种非治疗为目的基于上述旋磁细胞培养装置在抑制乳腺癌细胞转移中的应用，包括以下步骤：

(1)将乳腺癌细胞接种于含DMEM培养基的培养皿中，将培养皿置于旋磁细胞培养装置内培养，调节乳腺癌细胞受到的磁场强度为0.1-0.4T，旋转频率为4.2Hz；

(2)设定旋磁细胞培养装置的培养条件为：二氧化碳体积浓度为5％，培养温度为37℃，培养时间为1-24h。

有益效果：采用旋磁细胞培养装置在上述条件下培养乳腺癌细胞，可以抑制乳腺癌细胞的粘附、迁移和侵袭。

用旋磁细胞培养装置在上述条件下培养乳腺癌细胞，能够直接抑制F-actin蛋白的聚合，直接或者间接(通过影响F-actin)影响F-actin调节因子RHOA蛋白的活性，进而影响了细胞纤维状肌动蛋白的形成，而纤维状肌动蛋白是细胞运动的物质基础，所以细胞的迁移和侵袭受到影响。

优选地，所述乳腺癌细胞为乳腺癌细胞MDA-MB231或MCF7。

优选地，调节乳腺癌细胞受到的磁场强度为0.1T。

优选地，调节乳腺癌细胞受到的磁场强度为0.4T。

本发明的优点在于：

(1)本发明中的旋磁细胞培养装置可以培养各种哺乳动物细胞及组织，包括癌细胞和正常细胞，可以检测各种细胞在旋磁处理条件下的变化；

(2)本发明中的旋磁装置体积较小，便于应用，成本较低，使用方便；

(3)采用旋磁细胞培养装置在一定条件下培养乳腺癌细胞，可以抑制乳腺癌细胞的粘附、迁移和侵袭；

(4)采用本发明中的旋磁细胞培养装置在一定条件下培养乳腺癌细胞，能够直接抑制F-actin蛋白的聚合，直接或者通过影响F-actin间接影响F-actin调节因子RHOA蛋白的活性，进而影响了细胞纤维状肌动蛋白的形成，而纤维状肌动蛋白是细胞运动的物质基础，所以细胞的迁移和侵袭受到影响。

附图说明

图1为本发明实施例1中旋磁细胞培养装置的截面结构示意图；

图2为本发明实施例1中细胞培养筒的结构示意图；

图3为本发明实施例1中罩体上表面0.01-0.15T的磁场分布图；图中原点表示0.1T位置；

图4为本发明实施例1中罩体上表面0.03-0.43T的磁场分布图；图中原点表示0.4T位置；

图5为本发明实施例1中罩体顶壁距磁铁表面距离与磁场强度变化图；

图6为本发明实施例5中对照组乳腺癌细胞的迁移图；

图7为本发明实施例5中旋磁细胞培养装置对细胞的旋转磁场强度为0.1T时乳腺癌细胞的迁移图；

图8为本发明实施例5中旋磁细胞培养装置对细胞的旋转磁场强度为0.4T时乳腺癌细胞的迁移图；

图9为本发明实施例6中旋磁细胞培养装置对乳腺癌细胞侵袭影响的细胞染色图；

图10为本发明实施例6中乳腺癌细胞转移数目测定结果图；

图11为本发明实施例7中乳腺癌细胞MDA-MB231贴壁后受磁场处理微管蛋白、肌动蛋白及细胞核免疫荧光染色结果图；

图12为本发明实施例7中乳腺癌细胞MCF7贴壁后受磁场处理微管蛋白、肌动蛋白及细胞核免疫荧光染色结果图；

图13为本发明实施例7中乳腺癌细胞MDA-MB231贴壁过程中受磁场处理微管蛋白、肌动蛋白及细胞核免疫荧光染色结果图；

图14为本发明实施例7中乳腺癌细胞MCF7贴壁过程中受磁场处理微管蛋白、肌动蛋白及细胞核免疫荧光染色结果图；

图15本发明实施例7中乳腺癌细胞MDA-MB231铺板后直接用旋磁细胞培养装置培养后的细胞伸展面积测定结果图；

图16本发明实施例7中乳腺癌细胞MCF7铺板后直接用旋磁细胞培养装置培养后的细胞伸展面积测定结果图；

图17本发明实施例8中乳腺癌细胞MDA-MB231贴壁细胞数的测定结果图；

图18本发明实施例8中乳腺癌细胞MCF7贴壁细胞数的测定结果图；

图19本发明实施例9中对照组、旋磁细胞培养装置在磁场强度为0.1T和0.4T时影响actin蛋白聚合的结果图；

图20本发明实施例9中对照组、旋磁细胞培养装置在磁场强度为0.4T时影响actin蛋白聚合的结果图；

图21本发明实施例10中F-actin聚合调控蛋白RHOA激活的结果图；

图22为本发明实施例11中小鼠的体重变化图；

图23为本发明实施例11中小鼠每日的食物消耗情况图；

图24为本发明实施例11中小鼠每日饮水量消耗情况图；

图25为本发明实施例11中不同时间点小鼠存活数量图；

图26为本发明实施例11中小鼠的平均存活天数；

图27为本发明实施例11中小鼠的肺转移肿瘤结节图；

图28为本发明实施例11中小鼠的肺转移肿瘤结节数；

图29为本发明实施例11中小鼠肺组织的HE染色结果图；

图30为本发明实施例11中小鼠肺组织Ki-67染色结果图；

图31为本发明实施例12中小鼠白细胞变化图；

图32为本发明实施例12中小鼠血红蛋白变化图；

图33为本发明实施例12中小鼠红细胞变化图；

图34为本发明实施例12中小鼠血小板变化图；

图35为本发明实施例12中小鼠血糖含量变化图；

图36为本发明实施例13中平衡木装置的结构示意图；

图37为本发明实施例13中小鼠爬行平衡木的时间变化图；

图38为本发明实施例14中抓握实验装置的结构示意图；

图39为本发明实施例14中小鼠抓握横杆的时间变化图；

图40为本发明实施例15中旷场实验装置的结构示意图；

图41为本发明实施例15中小鼠在中央区域停留时间变化图；

图42为本发明实施例15中小鼠总的运动距离变化图；

图中：罩体11；电机12；电机输出轴13；连接杆14；第一永磁铁15；第二永磁铁16；筒体21；第一管道22；第二管道23；第三管道24；空腔夹层25；木杆31；暗盒32；细绳41；缓冲垫42。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

乳腺癌细胞MDA-MB231和MCF7均购买于ATCC(American Type CultureCollection)；DMEM培养基(不含Glutamine)购自于CORNING公司；胎牛血清购自于Clark生物公司；

SPF级4周龄雌性裸鼠购买自南京大学。

所有细胞实验至少重复3次以上，利用Graphpad软件执行t-test检验计算p值，以平均值和标准差(Mean±SEM/SD)的方式表示统计数据，结果表示为ns、*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。

实施例1

一种旋磁细胞培养装置，如图1和图2所示，包括旋磁装置和细胞培养筒；旋磁装置包括罩体11、旋转轴和两块永磁铁。

罩体11成长方体状，其长、宽、高分别为44cm、41cm和52cm，旋转轴和永磁铁均位于罩体11内，罩体11的材质为木质。

为方便旋转轴旋转和调节旋转轴的转速，本实施例中的旋转轴为电机12的输出轴，输出轴的一端安装连接杆14，连接杆14的中心与输出轴连接，连接杆14的轴线与输出轴的轴线垂直，其连接方式为现有技术，电机12安装在罩体11的内底壁，电机输出轴13的最大旋转速度为250r/min，同时也可以调节旋转速度为200r/min、150r/min，其对应的旋转频率分别为4.2Hz、3.3Hz和2.5Hz。

永磁铁包括第一永磁铁15和第二永磁铁16，第一永磁铁15和第二永磁铁16分别固定安装在连接杆14的两端，第一永磁铁15和第二永磁铁16的规格相同，永磁铁的材质均为钕铁硼，第一永磁铁15和第二永磁铁16均呈长方体状，第一永磁铁15的轴线与第二永磁铁16的轴线平行，第一永磁铁15的轴线与连接杆14的轴线垂直，第一永磁铁15与第二永磁铁16相对于电机输出轴13对称设置，第一永磁铁15的N极朝向罩体11的顶端，第一永磁铁15的S极朝向罩体11的底端，第二永磁铁16的S极朝向罩体11的顶端，第二永磁铁16的N极朝向罩体11的底端。

细胞培养筒包括筒体21、第一管道22、第二管道23和第三管道24，筒体21的材质为无磁性的不锈钢材料，细胞培养筒放置在罩体11的顶端，筒体21内部中空，筒体21的底端设有开口，筒体21外侧壁设有空腔夹层25，第一管道22的一端与筒体21的顶壁连接，第一管道22的一端贯穿至筒体21内壁，第一管道22与筒体21内部连通，第一管道22的另一端与软管(图未示)连接，软管与气体瓶连接；

第二管道23的一端与空腔夹层25侧壁底端连接，第二管道23的另一端与软管连接，软管与循环水浴锅的出水口连接；第三管道24的一端与空腔夹层25侧壁顶端连接，第三管道24的另一端与软管连接，软管与循环水浴锅的进水口连接，第二管道23和第三管道24相对设置。

本实施例中筒体21呈圆柱状，外径为300mm，内径为200mm，第一管道22、第二管道23和第三管道24的内径均为10mm。

为保证对照组装置和实验组细胞培养筒内有相同的气体浓度和温度，将细胞培养筒通过并联的方式连接到同一个气体瓶上，将细胞培养筒通过串联的方式连接到同一台循环水浴锅上。其中对照组装置为将本实施例旋磁细胞培养装置中的两块永磁铁更换为不产生磁场的铁块。

罩体11上表面的磁场分布如图3和图4所示，图中圆点标注表示培养皿在0.1T和0.4T时的放置位置，根据图3和图4中的磁场强度分布，调整培养皿的放置位置。

本实施例中磁场强度的测定采用高斯计，如图5所示，图5为磁场强度最高的地方竖直方向不同高度的磁场强度，其中不同高度是指罩体顶面距磁铁表面的不同距离，可以看出，罩体顶壁距磁铁表面距离越近，磁场强度越大，因此，通过调整罩体顶壁距磁铁表面的距离，调整磁场强度。

工作原理：将细胞培养筒的第一管道22与二氧化碳气体瓶连接，从第一管道22内通入二氧化碳，循环水浴锅内的水从第二管道23的一端流入空腔夹层25，然后从第三管道24流出，从而调控细胞培养筒的培养温度；通过在筒体21内放置装有水的烧杯，保持筒体21内的湿度；通过调整罩体11顶壁与永磁铁顶壁之间的距离，调整癌细胞所受的磁场强度，距离越近，磁场强度越大。

电机输出轴转动使永磁铁沿电机输出轴的轴线旋转，形成旋转磁场，其中两块永磁铁的磁极方向相反，从而在两个磁极之间形成闭合磁力线。

有益效果：本发明中的旋磁细胞培养装置可以培养各种哺乳动物细胞及组织，包括癌细胞和正常细胞，用于检测各种细胞在旋磁处理条件下的变化。

本发明中的旋磁装置体积较小，便于应用，成本较低，使用方便。

实施例2

基于非治疗为目的采用旋磁细胞培养装置在抑制乳腺癌细胞转移中的应用，包括以下步骤：

(1)乳腺癌细胞MDA-MB231或MCF7复苏10d，并传代三次以上，将细胞按照4×10⁵个/ml的密度铺板到3个35mm的培养皿中，每皿含10％的血清的DMEM培养基2ml，在37℃，5％浓度的CO₂培养箱中培养24h；

(2)将步骤(1)中的培养皿置于实施例1中的细胞培养筒内，调节乳腺癌细胞MDA-MB231或MCF7受到的磁场强度为0.1T，旋转频率为4.2Hz；

(3)设定旋磁细胞培养装置的培养条件为：二氧化碳体积浓度为5％，培养温度为37℃，培养时间为24h。

实施例3

基于非治疗为目的采用旋磁细胞培养装置在抑制乳腺癌细胞转移中的应用，包括以下步骤：

(1)乳腺癌细胞MDA-MB231或MCF7复苏10d，并传代三次以上，将细胞按照4×10⁵个/ml的密度铺板到3个35mm的培养皿中，每皿含10％的血清的DMEM培养基2ml，在37℃，5％浓度的CO₂培养箱中培养24h；

(2)将步骤(1)中培养后的细胞置于实施例1中的细胞培养筒内，调节乳腺癌细胞MDA-MB231或MCF7受到的磁场强度为0.4T，旋转频率为4.2Hz；

(3)设定旋磁细胞培养装置的培养条件为：二氧化碳体积浓度为5％，培养温度为37℃，培养时间为4.5h。

实施例4

基于非治疗为目的采用旋磁细胞培养装置在抑制乳腺癌细胞转移中的应用，包括以下步骤：

(1)乳腺癌细胞MDA-MB231或MCF7复苏10d，并传代三次以上，将细胞按照4×10⁵个/ml的密度铺板到3个35mm的培养皿中，每皿含10％的血清的DMEM培养基2ml，在37℃，5％浓度的CO₂培养箱中培养24h；

(2)将步骤(1)中培养后的细胞至于实施例1中的细胞培养筒内，调节乳腺癌细胞MDA-MB231或MCF7受到的磁场强度为0.1T，旋转频率为4.2Hz；

(3)设定旋磁细胞培养装置的培养条件为：二氧化碳体积浓度为5％，培养温度为37℃，培养时间为4.5h。

实施例5

采用实施例1中的旋磁细胞培养装置培养癌细胞对乳腺癌细胞MDA-MB231迁移能力的影响：

乳腺癌细胞MDA-MB231，复苏10天，并且传代三次以上后用于实验。将细胞按照4×10⁵个/ml的密度铺板到3个35mm的培养皿中，每皿含10％血清的DMEM培养基2ml，在37℃，5％浓度的CO₂培养箱中培养24h，使细胞长成单细胞层，用灭菌的200μl的黄枪头垂直并且在单细胞层上划一条直线，将培养基更换成不含血清的培养基，用倒置显微镜拍照以记录初始状态，将三皿细胞分别置于0.1T和0.4T的实施例1中的旋磁细胞培养装置及对照组装置中继续培养24h，旋转频率为4.2Hz；每6h拍照一次看划痕愈合情况。

实验结果：如图6、图7和图8所示，图中0.1T旋磁组表示调节旋磁细胞培养装置对细胞的旋转磁场强度为0.1T，0.4T旋磁组表示调节旋磁细胞培养装置对细胞的旋转磁场强度为0.4T，经与对照组相比，经过本发明中的培养方法培养后，乳腺癌细胞MDA-MB231迁移能力明显减弱。

实施例6

采用实施例1中的旋磁细胞培养装置培养癌细胞对乳腺癌细胞MDA-MB231侵袭能力的影响：

transwell小室选用孔径为8nm的聚碳酸酯膜的24孔趋化室，乳腺癌MDA-MB231细胞先用无血清的培养基饥饿26h，胰酶消化细胞，用无血清培养基接种100μl细胞至趋化室的上层小室，细胞密度为3×10⁵个/ml，在趋化室的下层小室中加入600μl含10％血清的培养基作为趋化因子。将接种好细胞的24孔板置于0.1T和0.4T的旋磁装置和对照组装置中，旋转频率为4.2Hz；37℃，5％浓度CO₂培养14h。用棉签去掉上层小室中未转移的细胞，用4％的甲醛固定已经转移的细胞，用0.2％的结晶紫溶液染色，用10×的正置显微镜观察并计数转移细胞数目。

实验结果：如图9和图10所示，图中0.1T旋磁组表示调节旋磁细胞培养装置对细胞的旋转磁场强度为0.1T，0.4T旋磁组表示调节旋磁细胞培养装置对细胞的旋转磁场强度为0.4T，与对照组相比，经过本发明中的培养方法培养后，抑制了MDA-MB231细胞的侵袭，并且随着磁场强度的升高，这种抑制作用有一定的增强。

实施例7

采用实施例1中的旋磁细胞培养装置培养癌细胞对乳腺癌细胞MDA-MB231和MCF7的F-actin的影响：

乳腺癌细胞MDA-MB231和MCF7，复苏10天，并且分别传代三次以上后用于实验。将细胞按照4×10⁵个/ml的密度铺板到3个35mm的培养皿中，每皿2ml DMEM培养基，铺板后细胞分别置于0.1T和0.4T的旋磁细胞培养装置及对照组装置中培养6h，或者是铺板后先置于细胞培养箱中培养18h待细胞贴壁，然后分别置于0.1T和0.4T的旋磁细胞培养装置及对照组装置中培养18h，旋转频率为4.2Hz。曝磁后的细胞用甲醛固定20min，然后对Tubulin、F-actin及细胞核进行免疫荧光染色，用激光共聚焦显微镜观察并拍照。

实验结果：如图11-图16所示，图11和图12分别为MDA-MB231、MCF7细胞贴壁后用旋磁细胞培养装置培养18h后的免疫荧光染色结果图，图中细胞核、肌动蛋白、微管蛋白分别表示对细胞核、肌动蛋白、微管蛋白的免疫荧光染色，合成图表示细胞核、肌动蛋白、微管蛋白免疫荧光染色的叠加图，可以看出F-actin的形成受到干扰而变少，图13和图14分别是MDA-MB231、MCF7细胞铺板后直接用旋磁细胞培养装置培养(细胞贴壁之前就放进旋磁细胞培养装置)后免疫荧光染色结果图。图15和图16分别为MDA-MB231、MCF7细胞铺板后直接用旋磁细胞培养装置培养后的细胞伸展面积测定结果图，从图11-16可以看出，细胞的贴壁粘附受到影响，细胞的伸展面积减小。

实施例8

采用实施例1中的旋磁细胞培养装置培养癌细胞对乳腺癌细胞MDA-MB231和MCF7的贴壁细胞数的影响

乳腺癌细胞MDA-MB231和MCF7，复苏10天，并且分别传代三次以上后用于实验。将细胞按照4×10⁵个/ml的密度铺板到3个35mm的培养皿中，每皿2ml DMEM培养基，铺板后细胞分别置于0.1T和0.4T的旋磁细胞培养装置及对照组装置中培养18h，旋转频率为4.2Hz。磁场处理结束后，用磷酸盐缓冲液PBS在摇床上震荡清洗掉未贴壁的细胞，每次洗5min，洗三次，然后用流式细胞仪检测剩余贴壁细胞数。

实验结果：如图17和图18所示，乳腺癌细胞MDA-MB231和MCF7细胞贴壁均受到影响，细胞贴壁数降低。

实施例9

采用实施例1中的旋磁细胞培养装置培养癌细胞对肌动蛋白actin体外聚合的影响：

用G缓冲液(含5mM Tris-HCl pH 8.0,0.2mM CaCl₂,0.2mM ATP,0.5mM DTT)稀释actin蛋白混合物(Cytoskeleton,Cat.#AKL99 and#AP05)至3.0μM，置于冰上2h使actin低聚蛋白解聚，然后14000rpm，4℃，离心30min去除残余的核物质，上清转移至96孔黑色不透明板中，将96孔板放入酶标仪读数3min以建立基线，每个样品中加入10×聚合反应缓冲液(500mM KCl,20mM MgCl2,10mM ATP)启动actin蛋白聚合，立即置于旋磁或对照组装置中处理5min，调节旋磁组及对照组细胞培养装置的温度为25℃，磁场强度为0.1T和0.4T，旋转频率为4.2Hz，处理过的样品再用酶标仪读数，每30s读数一次，连续读数1h。

实验结果：如图19、图20所示，采用本发明中的旋磁细胞培养装置培养乳腺癌细胞后，可以抑制actin蛋白的聚合，且随磁场强度的增大，抑制效果越明显。

实施例10

采用实施例1中的旋磁细胞培养装置培养癌细胞对F-actin调节因子RHOA的活性的影响：

取对数期生长的乳腺癌细胞MD-MB231和MCF7按照50000个/ml的密度铺到6cm的细胞培养皿中，在细胞培养箱中培养三天至细胞再生长到对数期时，置于实施例1中的旋磁细胞培养装置及对照组培养装置中，采用实施例3和实施例4中的培养方法进行培养后，利用RHO激活检测试剂盒(BK036,Cytoskeleton)检测RHO蛋白的激活情况，每个样品取800ug的蛋白和15ul的rhotekin-RBD beads(激活的RHO蛋白的亲和树脂珠)用于实验。

实验结果：如图21所示，乳腺癌细胞MD-MB231、MCF7经实施例3和实施例4的培养方法培养后，能明显抑制RHOA蛋白的活性，RHO家族的蛋白RHOA可以调节细胞转移和侵袭过程中F-actin的聚合状态。

从实施例5-9可以看出，通过本发明中的癌细胞培养方法，可以抑制癌细胞的粘附、迁移和侵袭，同时分析了采用本发明的培养方法抑制癌细胞转移的原理，采用本发明中的癌细胞培养方法，能够直接抑制F-actin蛋白的聚合，直接或者通过影响F-actin间接影响F-actin调节因子RHOA蛋白的活性，进而影响了细胞纤维状肌动蛋白的形成而纤维状肌动蛋白是细胞运动的物质基础，所以细胞的迁移和侵袭受到影响。

实施例11

旋磁装置对乳腺癌肺转移小鼠模型肿瘤转移及生存质量的影响：

将小鼠置于实施例1中的旋磁装置上方，调节小鼠受到的磁场强度为0.1T或0.4T，实验方案均经过伦理学认证。

SPF级4周龄雌性裸鼠在SPF级动物房适应性喂养，一周后开始尾静脉肿瘤细胞，取对数生长期的乳腺癌MDA-MB231细胞，用PBS重悬后置于冰上，然后以5×10⁶/200ul的量对裸鼠进行尾静脉注射。尾静脉注射肿瘤细胞的第二天对小鼠进行随机分组，分别为对照组、0.1T处理组、0.4T处理组，每组12只，分为两笼，每天上午9点到下午3点于旋磁装置上方对小鼠进行6小时的处理，连续处理4.5个月，每天经旋转磁场处理结束后称量小鼠体重以及小鼠每天饮水量和食物消耗量。磁场处理的第44天进行小鼠眼球取血，以进行血常规检测；饲养过程中进行小鼠的行为学检测以分析磁场对小鼠生存质量的影响。待小鼠自然死亡后，解剖并观察小鼠脏器上的肿瘤转移情况，收集小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺，拍照和称重，对肺和肝脏组织进行HE染色和Ki46染色，然后所有的组织用4％甲醛溶液固定24h，然后用70％酒精保存。

实验结果：小鼠的体重变化如图22所示，小鼠体重没有明显变化；小鼠每日的食物和水的消耗情况如图23、图24所示，经之后小鼠的饮食量明显增加，饮水量变化不大；如图25、图26所示，小鼠经旋磁装置饲养之后乳腺癌MDA-MB231荷瘤小鼠的存活时间明显延长；如图27、图28所示，经旋转装置处理后小鼠的肺转移肿瘤结节数明显下降，说明旋磁装置处理后抑制了肿瘤的转移；如图29所示，HE染色结果显示旋磁装置处理之后，小鼠的肺组织更趋向于正常；如图30所示，Ki-67染色结果也显示旋磁装置处理过的小鼠肺组织中，正在增殖的癌细胞明显减少。这些结果均显示经本申请实施例1中的旋磁装置处理后降低了小鼠乳腺癌肿瘤转移，并延长了小鼠的生存时间。

实施例12

对实施例10中经旋磁装置处理的乳腺癌肺转移小鼠的血常规进行检测：

使用毛细玻璃管从小鼠的眼眶中进行静脉采血，将血液收集到已经加入抗凝剂的离心管中，轻柔混匀后进行血常规检测，血常规检测由南京大学生物医学中心完成。

实验结果：如图31-图35所示，经旋磁装置处理后，小鼠的白细胞、红细胞、血红蛋白及血小板含量没有明显变化，血糖含量也没有明显变化，这说明低频旋转磁场处理之后对小鼠的血常规没有显著影响，证明了该旋磁装置的生物安全性。

实施例13

小鼠行为学实验1：平衡木实验

对实施例10中经旋磁装置处理的乳腺癌肺转移小鼠进行检测

制备平衡木装置，该装置为现有技术，平衡木装置由直径为1.5cm，长80cm的木杆31搭建而成，如图36所示，用于检测小鼠的平衡及协调运动能力。平衡木距离地面约30cm，实验前小鼠放在平衡木一侧的盒子里面2min使小鼠熟悉环境，然后对小鼠进行训练，依次让小鼠从终点线、中点线和起始线位置爬回暗盒32，每次爬回暗盒32后使小鼠在暗盒32内休息1分钟，训练完成后，开始正式实验。

经旋磁装置处理结束后，把小鼠放在平衡木起始线处，使它自行爬向终点线，记录小鼠通过平衡木所需时间。平衡木实验在小鼠经旋磁装置处理后的第21天到142天之间完成，重复16次。

实验结果：结果如图37所示，乳腺癌小鼠经过旋磁装置处理后，通过平衡木所需要的时间明显缩短，说明小鼠的平衡及协调运动能力增强。

实施例14

小鼠行为学实验2：平衡木实验

对实施例10中经旋磁装置处理的乳腺癌肺转移小鼠进行检测，检测小鼠的肌肉力量，具体实验步骤如下：

实验装置为现有技术，如图38所示，细绳41离地面高度为30cm，在细绳41下方铺设缓冲垫42以保护从细绳41上掉落下来的小鼠。实验前先对小鼠进行训练，使小鼠前爪能适应抓握细绳41，训练3次，然后开始正式实验。

经旋磁装置处理结束后，使小鼠前爪抓握住细绳41，直到小鼠无法抓握细绳41而落下，记录小鼠抓握细绳41所坚持的时间。抓握实验在旋磁装置处理后的第25天到81天之间完成，重复16次。

实验结果：如图39所示，乳腺癌小鼠经过旋磁装置处理后，抓握细绳41的时间明显延长，说明小鼠的前臂肌肉力量增强。

实施例15

小鼠行为学实验3：旷场实验

对实施例10中经旋磁装置处理的乳腺癌肺转移小鼠进行检测，检测小鼠的自主活动及探索能力，具体实验步骤如下：

旷场实验装置为现有技术，如图40所示：实验前小鼠被放入50×50×30cm的旷场中自由活动7min以使小鼠能够适应环境，适应训练完成后开始正式实验。

经旋磁装置处理结束后，把小鼠轮流放在矿场中心位置，让其在旷场内自由活动5分钟，用位于旷场正上方高120cm处的手机记录视频，使用ANYmaze软件分析小鼠在旷场内的活动情况。旷场实验在经旋磁装置处理结束后后的第25天到81天之间完成，重复16次。

实验结果：如图41和图42所示，乳腺癌小鼠经过旋磁装置处理后，在中央区域停留时间及总的运动距离明显延长，说明小鼠的自主运动能力及探索能力有所增强。

经实施例10-实施例14的小鼠实验均表明，乳腺癌小鼠经过旋磁装置处理，使乳腺癌小鼠受到的磁场强度为0.1T或0.4T时，可以延长乳腺癌荷瘤小鼠的存活时间，并且显著改善小鼠的生存质量。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种非治疗为目的采用旋磁细胞培养装置在抑制乳腺癌细胞转移中的应用，其特征在于：包括以下步骤：(1)将乳腺癌细胞接种于含DMEM培养基的培养皿中，将培养皿置于旋磁细胞培养装置内培养，调节乳腺癌细胞受到的磁场强度为0.1-0.4T，旋转频率为4.2Hz；

(2)设定旋磁细胞培养装置的培养条件为：二氧化碳体积浓度5％，培养温度为37℃，培养时间为1-24h；

所述旋磁细胞培养装置包括旋磁装置和细胞培养筒，所述细胞培养筒位于罩体的顶端；所述旋磁装置包括罩体、旋转轴和两块永磁铁，所述旋转轴和两块永磁铁均位于罩体内，所述两块永磁铁沿旋转轴的轴线相对设置，所述两块永磁铁之间设有连接杆，所述连接杆与旋转轴连接，所述旋转轴转动致使两块永磁铁沿旋转轴的轴线旋转，每个永磁铁的一端均朝向罩体顶端，所述两块永磁铁的磁极方向相反；

所述细胞培养筒包括筒体和第一管道，所述筒体内部中空，所述筒体的底端设有开口，所述筒体外侧壁设有空腔夹层，所述第一管道的一端与筒体连接，所述第一管道的一端贯穿至筒体内壁。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述永磁铁呈柱状。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述永磁铁一端的磁极朝向筒体，所述永磁铁另一端的磁极朝向罩体的底端。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述筒体的材质为无磁性的不锈钢材料。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述第一管道的一端与筒体的顶壁连接。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述细胞培养筒还包括第二管道和第三管道，所述第二管道的一端与空腔夹层侧壁底端连接，所述第三管道的一端与空腔夹层侧壁顶端连接，所述第二管道和第三管道相对设置。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述乳腺癌细胞为乳腺癌细胞MDA-MB231或MCF7。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：调节乳腺癌细胞受到的磁场强度为0.1T。

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