CN111398219A - 采用石墨烯多重信号放大spr传感测定雌二醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种采用石墨烯多重信号放大SPR传感测定雌二醇的方法，其包括步骤：S1:试样准备：使用磁性石墨烯为吸附剂，对待测样品中的雌二醇进行吸附富集，然后洗脱液洗脱，将洗脱下来的雌二醇定容，得到待测试样；S2:将SPR芯片的贵金属片表面清洗干净并连接羧基化氧化石墨烯；S3:利用固定在SPR芯片贵金属表面的羧基化氧化石墨烯连接固定E2‑BSA；S4:基于间接竞争法利用SPR免疫传感测定待测试样中雌二醇的浓度：将含E2的待测试样和E2的单克隆抗体溶液混合进样，共同竞争被固定在SPR芯片表面的E2‑BSA，SPR产生的信号与待测试样中E2的浓度呈反比。本发明的雌二醇含量测定方法，LOD值低至3.605×10‑6ng/mL，检出限降低3400多倍，可实现对雌二醇超痕量检测。

Description

采用石墨烯多重信号放大SPR传感测定雌二醇的方法
技术领域
本发明涉及一种内分泌干扰的检测技术领域，尤其是一种采用石墨烯多重信号放大SPR传感测定雌二醇的方法。
背景技术
随着人们生活水平的提高，人们对环境激素也越来越重视，关注食源性激素与人类健康的研究也越来越多。食源性物质中雌激素的含量，对人们身体的健康有很大的影响。尤其是牛奶，牛奶的主要摄入人群是儿童。牛奶中有相当量的雌性激素，有些学者认为，目前消费的牛奶比100年前明显增加。据研究，雌二醇会使男性的生殖系统发育和功能异常，严重时会引发尿道下裂、性腺萎缩和睾丸癌等严重疾病，而外源性的雌二醇也会引起女性的月经不调，卵巢萎缩等疾病，甚至引发不孕和子宫肌瘤等疾病。雌二醇残留还会引发女性儿童提前发育、男性儿童乳腺发育呈女性化趋势，由于幼儿身体组织和器官血液分布尚未建立用来阻止或减缓外部污染物的屏障，所以雌二醇对幼儿和青少年的毒害性比成人大得多。
为了保证下一代的健康，需要对牛奶中雌二醇的含量进行控制，因此雌二醇是目前牛奶雌性激素的重点检测项目。Spr(Surface Plasmon Resonance)即表面等离子体共振，是一种用于表征表面折射系数改变的光学专业技术。SPR传感检测芯片包括金膜和金膜(或银膜等其他贵金属片)表面的微流通道，在微流通道内且在金膜表面固定着可与目标分子特异性结合的识别分子，金膜下方有棱镜。分析时，当试样从微流通道流过，试样中目标分子与识别分子相互结合，会引起金膜表面折射率变化，最终导致SPR角变化，通过检测SPR角度变化，获得被分析物的浓度、亲和力等信息。SPR传感测定雌二醇具有检测程序简单、无需标记、可实时快速动态检测的优点，且已成为最有希望用于生物痕量检测的技术之一。据相关报道称，采用SPR传感测定雌二醇，其最低检出限可达11.10ng/mL左右。然而，由于雌二醇具有巨大的危害性且能在人体内积累，人们希望对雌二醇实现超痕量的检测，而如何进一步降低检测限也是相关研究者的共同目标。
发明内容
(一)要解决的技术问题
为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种采用石墨烯多重信号放大SPR传感测定雌二醇的方法，通过优化检测程序结合修饰SPR检测芯片，结合采用间接竞争法进一步降低试样中雌二醇的检出限、提高检测的灵敏度，实现对试样中雌二醇超痕量的检测。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
一种采用石墨烯多重信号放大SPR传感测定雌二醇的方法，包括如下步骤：
S1:试样准备
使用磁性石墨烯为吸附剂，对待测样品中的雌二醇进行吸附富集，然后洗脱液洗脱，将洗脱下来的雌二醇定容，得到待测试样；
S2:对SPR芯片进行修饰：将SPR芯片的贵金属片表面清洗干净，并在贵金属片表面连接羧基化氧化石墨烯；
S3:利用固定在SPR芯片贵金属表面的羧基化氧化石墨烯连接固定E2-BSA；
S4:基于间接竞争法利用SPR免疫传感测定待测试样中雌二醇的浓度：将含E2的待测试样和E2的单克隆抗体溶液混合进样，共同竞争被固定在SPR芯片表面的E2-BSA，SPR产生的信号与待测试样中E2的浓度呈反比。
本发明实现检测信号的多重放大：其一为利用磁性石墨烯对待测样品中的雌二醇进行富集、经洗脱、定容制得待测试样，待测试样中具有较高浓度的E2；其二为利用石墨烯对SPR芯片的贵金属片表面进行修饰从而可增强SPR信号；其三为，利用石墨烯具有大比表面积及其表面含有丰富羧基的特点，固定更高浓度的E2-BSA，再次有效放大SPR信号。通过以上三重信号放大，可显著提高从待测样品中检出E2的灵敏度，降低其检出限，实现对E2的超痕量检测，LOD值低至3.605×10-6ng/mL。
根据本发明较佳实施例，步骤S1中，磁性石墨烯按照如下方法制备得到：以纳米石墨烯粉、二价铁铁盐、三价铁铁盐为原料，其中二价铁和三价铁的摩尔比为1:2；向所述原料中加入浓盐酸后，超声脱氧并充分分散于超纯水与无水醇的混合溶剂中，机械搅拌12-24h，加入浓氨水调节pH>10，在加热条件下继续搅拌，得到沉淀物，分离该沉淀物；加入超纯水和无水醇清洗，并采用磁分离器去除无磁性杂质，将所得物分散到无水醇中，低温烘干，即得到磁性石墨烯。
根据本发明较佳实施例，步骤S1中，所述二价铁盐为硫酸亚铁或氯化亚铁，所述三价铁盐为氯化铁；加入浓氨水调节pH>10后，在70-85℃下搅拌，得到沉淀物，经超纯水和无水醇清洗后，于40-65℃烘干，制得磁性石墨烯材料。
根据本发明较佳实施例，步骤S1中：采用磁性石墨烯为吸附剂，在pH为酸性条件下对待测样品中的雌二醇进行吸附富集，吸附时间为4-10min，采用乙腈为洗脱液，将被磁性石墨烯吸附的雌二醇洗脱下来，氮气吹干定容至100-250μL。
根据本发明较佳实施例，步骤S2中，对SPR芯片进行修饰的方法包括如下步骤：
步骤1：清洗SPR芯片的贵金属片，去除其表面的有机物；
步骤2：在SPR芯片的贵金属片表面引入带负电荷的基团；
步骤3：借助所述带负电荷的基团的静电作用，在所述在SPR芯片的贵金属片表面引入带正电荷的基团；
步骤4：借助所述带正电荷的基团的静电作用，在所述在SPR芯片的贵金属片表面连接带负电荷的羧基化氧化石墨烯。
根据本发明较佳实施例，步骤S2中，所述SPR芯片的贵金属片为金片，具体步骤为：
步骤1：采用体积比为H202:H2S04＝1:3配制成piranha溶液，在室温下浸泡SPR芯片的金片，去除金片表面的有机物，用去离子水清洗、无水乙醇清洗，最后氮气吹干；其中H202为质量百分含量30％的双氧水；
步骤2：将所述SPR芯片的金片浸泡到MPA(巯基丙酸)的醇溶液中，放置过夜，取出并用乙醇冲洗金片以去除多余的MPA，用去离子水冲洗以去除多余的醇，取出后氮气吹干金片；通过浸泡，MPA与金片形成金硫键并引入带负电荷的羧基；
步骤3：将所述SPR芯片的金片浸泡到PAH(聚(烯丙胺·盐酸))溶液中，取出后用去离子水冲洗，氮气吹干金片；通过浸泡和静电作用，使金片表面连接带正电荷的PAH；
步骤4：将带有正电荷的金片浸泡在羧基化氧化石墨烯的分散液中，通过浸泡和PAH的静电作用，使羧基化氧化石墨烯连接到金片表面。
根据本发明较佳实施例，步骤S3中固定E2-BSA的方法为：
将SPR芯片及金片装入传感器中，以EDC(1-乙基3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐)溶液和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺酯)溶液对芯片表面的羧基进行活化5-10min；以pH＝4-5的醋酸盐缓冲溶液为耦合缓冲溶液，用所述耦合缓冲液配制一定质量浓度的E2-BSA反应15-30min，以乙醇胺为封闭液反应5-20min，以0.05mol/L的NaOH溶液为再生液再生1-3min，依次重复循环1-3次，使E2-BSA与SPR芯片的金片表面带羧基的氧化石墨烯连接，实现E2-BSA的固定化。上述方法，可先配制待用的溶液，再借助相关软件进行固定化程序，完成E2-BSA(E2-牛血清白蛋白包被原)的固定。
根据本发明较佳实施例，步骤S3中，活化时，EDC浓度为0.4mol/L，NHS的浓度为0.1mol/L，活化时间为7min；耦合缓冲溶液pH为4.5；其中用所述耦合缓冲液配制一定质量浓度的E2-BSA反应20min，以pH8.5的乙醇胺为封闭液反应10min，以0.05mol/L的NaOH溶液为再生液再生2min。
根据本发明较佳实施例，步骤S3中，在固定E2-BSA时，E2-BSA浓度为80μg/mL，此浓度可使E2-BSA在SPR芯片上的固定量接近饱和，SPR的响应值为580.17m°。相对地，通常情况下，在SPR芯片的金片表面未经氧化石墨烯修饰时，E2-BSA浓度为20μg/mL时，E2-BSA在SPR芯片上的固定量就已经达到饱和。
此外，SPR芯片的金片表面经修饰氧化石墨烯后，所固定的E2-BSA具有很好的稳定性、重复性。即便经30次再生处理后，同一浓度抗体产生的信号值仍能达到初始信号的90％以上，表明固定在SPR芯片表面的E2-BSA在多次再生后依然可以保持很好的活性，重复性良好。
根据本发明较佳实施例，步骤S4中，将含E2的待测试样和E2-mAb(E2的单克隆抗体)溶液以体积比1:1进行混合后，室温孵育并加入样品池中进样检测，进样中游离的E2和固定在传感基芯片上的E2-BSA共同竞争E2-mAb(浓度为12.50μg/mL)，测定SPR响应值。
根据本发明较佳实施例，步骤S4的具体步骤为：将25.00μg/mL的E2-mAb与不同浓度梯度的E2标准溶液进行等体积混合后，室温孵育并加入样品池中进样检测，监测SPR响应信号，得到E2-响应信号(SPR角度变化mo)的校准曲线；依据该校准曲线，将25.00μg/mL的E2-mAb与含E2的待测试样等体积混合，室温孵育进样，测定出待测试样中E2的浓度。
按照本发明的测定方法，使LOD值低至3.605×10-6ng/mL，IC50(半抑制浓度)为4.944×10-4ng/mL，检测范围为2.105×10-5ng/mL-1.403×10-2ng/mL，加标回收率在87.26～99.87％，RSD在4.93％～7.27％之间，检测限低至现有最低检测限的1/(3.087*106)
根据本发明较佳实施例，还包括步骤S5，SPR的再生：采用0.05mol/L NaOH溶液120min/次，再生2次以上，使抗体去除率达到99.32％以上。
该再生方法，可在保证固定在SPR芯片表面的全抗原(E2-BSA)的活性的前提下，尽可能地去除与全抗原特异性结合的抗体以及非特异吸附的物质。再生后，可对SPR芯片进行重复利用。
(三)有益效果
本发明的有益效果是：
(1)本发明提出了一种基于石墨烯材料的多重信号放大SPR传感测定雌二醇的方法，具有良好的特异性，可用于对牛奶中微量甚至超痕量雌二醇(E2)的测定，具有比常规ELISA方法更低的检出限和更高的灵敏度。
(2)本发明使用石墨烯修饰SPR芯片的金片(银片或铂片)使SPR信号进行放大；同时由于SPR芯片的金片表面具有羧基化氧化石墨烯，利用石墨烯具有大比表面积和丰富羧基的特点，可以在芯片表面固定浓度更高的E2-BSA(固定浓度达到80μg/mL，此时SPR响应值为580.17m°)，进一步有效放大SPR信号，使雌二醇的最低检出限为2.117×10-3ng/mL，IC50为0.2155ng/mL，检测范围0.01141-8.877ng/mL，检测限低至现有最低检测限的1/5000。
(3)本发明还利用磁性石墨烯对待测样品中雌二醇进行高倍富集，并洗脱定容处理后得到待测试样，使LOD值低至3.605×10-6ng/mL，IC50为4.944×10-4ng/mL，检测范围为2.105×10-5ng/mL-1.403×10-2ng/mL，加标回收率在87.26～99.87％。由此可见，相比现有技术，本发明具有相较于现有2-5个数量级的灵敏度，可实现对低浓度、痕量和超痕量样品的检测。
(4)本发明优化了E2-BSA的固定浓度、E2-mAb的进样浓度(12.50μg/mL)和再生条件，使本发明相较于常规SPR方法和ELISA方法具有更低的检出限和更高的灵敏度，有利于对食源性雌激素含量的严格控制。
附图说明
图1为制备磁性石墨烯的实验例中石墨烯与磁性石墨烯的红外光谱图。
图2为制备磁性石墨烯的实验例中石墨烯与磁性石墨烯的扫描电镜图。
图3为对SPR芯片的金片表面进行修饰过程中，不同阶段的金片表面的原子力显微镜。
图4为对SPR芯片的金片表面进行修饰过程中，不同阶段的金片表面的SPR角度变化曲线图。
图5为在SPR芯片表面(含石墨烯修饰)固定不同浓度的E2-BSA的SPR角偏移曲线图。
图6为在SPR芯片表面(不含石墨烯修饰)固定不同浓度的E2-BSA的SPR角偏移曲线图。
图7为对SPR芯片(含石墨烯修饰)进行再生处理时再生次数对E2-BSA稳定性的影响曲线图。
图8为采用SPR间接竞争免疫测定方法全程(含再生)的SPR响应曲线图。
图9为本发明实施例1中进样含不同浓度的E2-mAb时，与SPR芯片(有石墨烯修饰)上的E2-BSA结合产生的SPR角偏移曲线图。
图10为本发明实施例1将25.00μg/mL的E2-mAb与不同浓度梯度的E2标准溶液进行等体积混合进样时的SPR角偏移曲线图。
图11为本发明实施例1将25.00μg/mL的E2-mAb与不同浓度梯度的E2标准溶液进行等体积混合进样时，间接竞争抑制曲线(a)和E2检测的校准曲线(b)。
图12为对比例1进样中含不同浓度的E2-mAb时，与SPR芯片(无石墨烯修饰)上的E2-BSA结合产生的SPR角偏移曲线图。
图13为对比例1将15μg/mL的E2-mAb与不同浓度梯度的E2标准溶液进行等体积混合进样时的间接竞争的SPR角偏移曲线。
图14为对比例1将15.00μg/mL的E2-mAb与不同浓度梯度的E2标准溶液进行等体积混合进样时，间接竞争抑制曲线(a)和E2检测的校准曲线(b)。
图15为本发明实施例2(引入磁性石墨烯富集的前处理)将25.00μg/mL的E2-mAb与不同浓度梯度的E2标准溶液进行等体积混合进样时的SPR角偏移曲线图。
图16为本发明实施例2(引入磁性石墨烯富集的前处理)将25.00μg/mL的E2-mAb与不同浓度梯度的E2标准溶液进行等体积混合进样时，间接竞争抑制曲线(a)和E2检测的校准曲线(b)。
图17为对比例2中ELISA的间接竞争结果：间接竞争抑制曲线(a)和E2检测的校准曲线(b)。
图18为本发明实施例2(引入磁性石墨烯富集的前处理)特异性测定的实验结果柱状图。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
以下各实验及实施例要用到的试剂、材料及仪器的说明如下：
Figure BDA0002434022220000081
Figure BDA0002434022220000091
Figure BDA0002434022220000101
实验中用到的水为实验室自制的超纯水。
0.01M pH 7.4的PBS溶液，被用做反应的缓冲液，用于E2-mAb以及待测溶液的稀释，并与10％的甲醇混合后用于E2标准溶液的配制，Phosphate Buffered Saline(1X)0.0067M(PO4)。
仪器
ESPRIT表面等离子共振生物传感器(Auto Lab，荷兰)，本仪器的入射波长为670nm，角度预设范围为62°-78°，动态检测范围为4000m°，角度分辨率小于0.02m°，平均基线波动为0.1m°。整个反应温度控制在25±0.5°。数据采集软件为Autolab ESPRIT DataAcquisition 4.3，数据分析软件为Kinetic Evaluation5.0。
酶标仪Microplate Spectrophotometer，美国BIO-RAD，Xmark
0.25μm过滤器，BIOFIC。
下述第1-6条为本发明方法的基本概述，包括：磁性石墨烯的制备、利用磁性石墨烯对待测样品的处理、石墨烯修饰SPR芯片、E2-BSA在SPR芯片表面固定、SPR间接竞争免疫测定、SPR芯片再生方法的基本概述。下述第7-8条，为本发明方法的特异性评价、牛奶样品中雌二醇的检测方法的基本概述。
1、制备磁性石墨烯
采用化学共沉淀法，将纳米石墨烯粉、硫酸亚铁、氯化铁摩尔比为4:3:4混合，加入0.8mL 37％的浓盐酸后超声脱氧并充分分散于200mL超纯水与无水乙醇的溶液中，机械搅拌1500rpm，1000min，加入浓氨水调节pH>10，80℃搅拌40min，利用磁分离器用超纯水和无水乙醇各清洗5次，去除无磁性杂质，分散到无水乙醇中，于60℃烘干，即可得到磁性石墨烯材料。
磁性石墨烯材料的表征：
石墨烯与磁性石墨烯的红外光谱图如图1，在1600cm-1和3430cm-1处，两材料均有吸收峰，3430cm-1处的中等强度的吸收峰是由O-H键伸缩振动引起的，1600cm-1处的较弱的吸收峰是由C＝C键伸缩振动引起的。而磁性石墨烯在617cm-1处有一强烈的吸收峰，是属于Fe-O键的伸缩振动，石墨烯的光谱图无此吸收峰，表明Fe3O4纳米颗粒被固定在石墨烯薄层上。
观察石墨烯与磁性石墨烯的扫描电镜图如图2所示，石墨烯呈现清晰的片层状，表面光滑，而在磁性石墨烯石墨烯片层表面包覆上数量不等的颗粒，表明石墨烯表面的位点被Fe3O4纳米颗粒占据。
从两种材料的红外光谱图和扫面电镜图可以看出Fe3O4磁性内核被包覆在石墨烯上，材料制备成功。
2、磁性石墨烯对待测样品的富集方法
采用高效液相色谱优化富集条件，用30mg磁性石墨烯在pH为酸性条件下对待测样品中的雌二醇吸附5min，2mL乙腈洗脱5min，氮气吹干定容至200μL，作为待测试样。
3、用石墨烯对SPR芯片的金片表面进行修饰
(1)将金片用新配置的piranha溶液(30％H202:H2S04＝1:3)室温下浸泡1-2h，去除金片表面的有机物，然后用大量的去离子水清洗，无水乙醇清洗，最后氮气吹干。
(2)将0.01mol/L的MPA乙醇溶液过滤后置于培养皿中，然后将金片浸入溶液，避免金面上有气泡，放置过夜；用乙醇冲洗金片三次，去除多余的MPA；去离子水冲洗三次，去除多余的醇；氮气吹干金片。
(3)将MPA修饰好的金片(带羧基)浸泡在1％的PAH溶液中1h，水洗氮气吹干，此时金膜表面带正电荷的PAH。
(4)然后将带正电荷的金膜浸泡在0.1mg/mL的氧化石墨烯溶液中1h，通过PAH和带羧基的氧化石墨烯之间的静电作用，使带羧基的氧化石墨烯被固定在金片表面。
芯片表面的功能化修饰的表征：
由图3a可见，裸金片表面平滑；引入-COOH以后，粗糙度提升(图3b)；由图3c对比图3b可知，平滑度有所提升，说明引入-COOH，PAH正电化处理后，氧化石墨烯成功修饰在芯片表面。
SPR信号值的变化基于芯片表面介质折射率的变化以及芯片表面固定物的量。因此，考查SPR信号值的变化可以考查芯片表面是否被修饰成功。由图4可知，MPA自组装过程SPR角度变化约39.25m°；PAH正电化后SPR角度变化为275.47m°，GO修饰后SPR角变化值为45.62m°。在后续E2-BSA固定饱和后，SPR角变化值为580.17m°，最佳抗体浓度(12.50μg/mL)抗体反应后SPR角度变化值为198.30m°。由此进一步证明氧化石墨烯成功吸附于芯片表面。
4、将E2-BSA在SPR芯片的金片表面固定
将SPR芯片装入传感器中，以pH 4.5的醋酸盐缓冲溶液为耦合缓冲溶液，以0.4mol/L的EDC和0.1mol/L的NHS对芯片表面的羧基进行活化7min，用耦合缓冲液配制一定质量浓度的E2-BSA反应20min，以pH 8.5的乙醇胺为封闭液反应10min，0.05mol/L的NaOH溶液为再生液再生时间为2min。根据E2-BSA固定情况和SPR响应值，可依照前述程序重复1-3次，调用软件进行固定化程序。
随着全抗原质量浓度的增加，SPR角度变化值变大，说明全抗原在芯片表面的固定量逐渐增大。如图5所示，在80μg/mL时，固定量接近饱和，SPR的响应值为580.17m°。所以，选择80μg/mL作为全抗原的最佳固定质量浓度。当全抗原的固定浓度大于80μg/mL时，SPR的响应值几乎不再变化。因此全抗原E2-BSA浓度为80μg/mL时，固定量接近饱和。
传统的未经氧化石墨烯修饰的芯片20μg/mL时，固定量就已接近饱和，正如图6所示，SPR的响应值仅为220.01°。由此说明，引入羧基化氧化石墨烯以后，全抗原E2-BSA在芯片表面的固定量(固定浓度)明显增加。
5、SPR间接竞争免疫测定
将一定质量浓度的抗体，与不同浓度的E2溶液等体积混合后，室温孵育加入样品池中，使游离的E2和固定在传感基芯片上的E2-BSA共同竞争E2-mAb，分别测定SPR响应值。通过再生液将与E2-BSA结合的E2-mAb洗掉，从而实现对芯片的再生，反应过程如图8所示。为保证检测结果的重复性，每次实验均测量3次。
如图8所示，羧基化氧化石墨烯修饰的表面等离子共振生物传感器间接竞争法检测E2，SPR角度值的变化过程包括结合阶段、解离阶段和再生阶段。
6、再生
再生需要在保证固定在芯片表面的全抗原的活性的前提下，尽可能的除去与全抗原特异性结合的抗体以及非特异吸附的物质。选取了如表2所列的各试剂：0.1mol/L盐酸溶液，0.1mol/L盐酸+0.1％SDS溶液，0.1mol/L盐酸+0.1％Triton X-100溶液，0.05mol/LpH2.0甘氨酸-盐酸可溶液，0.05mol/L NaOH溶液再生一次；0.05mol/L NaOH溶液再生2次的抗体去除情况。分别可以去除86.21％、90.46％、83.45％、15.75％、95.21％、99.32％的结合抗体(表2)。
表2
Figure BDA0002434022220000131
因此，最优的再生条件为0.05mol/L NaOH溶液120min/次再生2次。
由图7所示，为再生次数对氧化石墨烯修饰的芯片表面E2-BSA活性的影响。由图示证明，经过30次再生，同一浓度抗体产生的信号值仍能达到初始信号的90％以上，表明固定在SPR芯片表面的E2-BSA在多次再生后依然可以保持很好的活性，重复性良好。
再生后，为研究SPR芯片表面的非特异性吸附的影响，用12.5μg/mL的BSA溶液代替抗体，其他反应条件和反应过程不变，监测SPR的响应值。重复7次，均未观察到SPR角度变化，说明：经再生的芯片表面的非特异性吸附可以忽略不计。
7、特异性
选择E2的结构和功能类似物双酚酸、己烯雌酚、雌二醇、雌酮，分别配制成不同的浓度梯度，用间接竞争法进行实验，通过计算反应的抑制率来进行特异性评价。
为了评价构建的磁性石墨烯富集氧化石墨烯放大测定方法的特异性，对雌二醇和五种结构和功能类似物双酚A、己烯雌酚、己烷雌酚、雌酮、雌三醇Estriol分别进行测定。特异性实验结果，如图18所示，所有类似物的抑制率均低于6％，表明它们几乎不与抗体结合。所以，其它类似物对检测E2几乎无影响，该方法特异性良好。
8、牛奶样品的检测
牛奶样品购自本地超市，通过高效液相色谱分析验证不含E2，进行加标回收实验。采用磁性石墨烯富集，SPR间接竞争法进行检测，在检测范围内设高中低不同浓度(1×10- 4ng/mL；1×10-3ng/mL；1×10-2ng/mL)，每个浓度平行测定六次，计算加标收回率。
加标回收结果如表3所示，加标回收率在87.26％～99.87％之间，相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)在4.93％～7.27％之间，说明该方法准确可靠，在实际应用中如果待检测的样品E2质量浓度较低时，可以采取磁性石墨烯富集浓缩的步骤来检测E2残留。
表3
Figure BDA0002434022220000151
现结合本发明具体实施例和具体对比例，对本发明的特点和技术效果进一步说明如下。
实施例1
本实施例不包含采用磁性石墨烯对待测样品中的雌二醇进行富集的前处理步骤。本实施例包含如下步骤：
步骤一：用石墨烯对SPR芯片的金片表面进行修饰
(1)将金片用新配置的piranha溶液(30％H202:H2S04＝1:3)室温下浸泡1-2h，去除金片表面的有机物，然后用大量的去离子水清洗，无水乙醇清洗，最后氮气吹干。
(2)将0.01mol/L的MPA乙醇溶液过滤后置于培养皿中，然后将金片浸入溶液，避免金面上有气泡，放置过夜；用乙醇冲洗金片三次，去除多余的MPA；去离子水冲洗三次，去除多余的醇；氮气吹干金片。
(3)将MPA修饰好的金片(带羧基)浸泡在1％的PAH溶液中1h，水洗氮气吹干，此时金膜表面带正电荷的PAH。
(4)然后将带正电荷的金膜浸泡在0.1mg/mL的氧化石墨烯溶液中1h，通过PAH和带羧基的氧化石墨烯之间的静电作用，使带羧基的氧化石墨烯被固定在金片表面。
步骤二：将E2-BSA在SPR芯片的金片表面固定
将SPR芯片装入传感器中，以pH 4.5的醋酸盐缓冲溶液为耦合缓冲溶液，以0.4mol/L的EDC和0.1mol/L的NHS对芯片表面的羧基进行活化7min，用耦合缓冲液配制80μg/mL的E2-BSA结合反应20min，以pH 8.5的乙醇胺为封闭液反应10min，0.05mol/L的NaOH溶液为再生液再生时间为2min。依照前述程序重复1次。E2-BSA固定饱和后SPR角变化值为580.17m°。
步骤三：SPR间接竞争免疫测定
在测定样品中E2含量之前需确定E2-mAb抗体的浓度。如图9所示，采用不同浓度的E2-mAb进样，监测与SPR芯片(有石墨烯修饰)上的E2-BSA结合产生的SPR角偏移曲线，发现E2-mAb抗体浓度低于12.50μg/mL时，抗体在芯片表面的结合未达到饱和。因此，最佳抗体浓度12.50μg/mL。
用0.05M的NaOH溶液再生2次，再进行E2的测定。
在测定时，将25.00μg/mL的E2-mAb与不同浓度梯度的E2标准溶液进行等体积混合，监测响应信号，响应信号值如图10示。如图11所示，LOD(检测限)值为0.002117ng/mL，IC50为0.2155ng/mL，检测范围0.01141-8.877ng/mL。
对比例1
对比例1是在实施例1的基础上，不包含步骤一，即不包含采用石墨烯对SPR芯片的金片表面进行修饰的处理。本对比例包含步骤：
步骤1：将E2-BSA在SPR芯片的金片表面固定
(1)将金片用新配置的piranha溶液(30％H202:H2S04＝1:3)室温下浸泡1-2h，去除金片表面的有机物，然后用大量的去离子水清洗，无水乙醇清洗，最后氮气吹干。
(2)将0.01mol/L的MPA乙醇溶液过滤后置于培养皿中，然后将金片浸入溶液，避免金面上有气泡，放置过夜；用乙醇冲洗金片三次，去除多余的MPA；去离子水冲洗三次，去除多余的醇；氮气吹干金片。
(3)将SPR芯片装入传感器中，以pH 4.5的醋酸盐缓冲溶液为耦合缓冲溶液，以0.4mol/L的EDC和0.1mol/L的NHS对芯片表面的羧基进行活化7min，用耦合缓冲溶液配制浓度为20μg/mL的E2-BSA，结合反应20min，以pH 8.5的乙醇胺为封闭液反应10min，0.05mol/L的NaOH溶液为再生液再生时间为2min。依照前述程序重复1次。
预先在不含石墨烯修饰的SPR芯片表面固定不同浓度的E2-BSA，监测SPR角偏移曲线图；结果如图6所示，确定E2-BSA的最佳固定浓度为20μg/mL时，其固定量接近饱和(SPR响应值不会随E2-BSA的浓度增加而改变)。
步骤2：SPR间接竞争免疫测定
在测定样品中E2含量之前需确定E2-mAb抗体的浓度。如图12所示，采用不同浓度的E2-mAb进样，监测其与SPR芯片(不含石墨烯修饰)上E2-BSA结合产生的SPR角偏移曲线，最终确定E2-mAb抗体浓度为7.50μg/mL(SPR响应不随E2-mAb抗体浓度升高而变化)。
用0.05M的NaOH溶液再生2次，再进行E2的测定。
在测定时，将15.00μg/mL的E2-mAb与不同浓度梯度的E2标准溶液进行等体积混合，监测响应信号，响应信号值如图13所示。如图14所示，LOD(检测限)值为0.0137ng/mL，IC50为0.442ng/mL，检测范围0.0531-4.964ng/mL。由实施例1和对比例1相比，对比例1的检测限LOD是实施例1的6倍，IC50是实施例1的2倍。
实施例2
本实施例是在实施例1的基础上，还采用磁性石墨烯对待测样品中的雌二醇进行富集的前处理，处理后得到待测试样，该前处理具体为：
采用高效液相色谱优化富集条件，用30mg磁性石墨烯在pH为5-6的条件下对E2标准样品中的雌二醇进行吸附5min，过滤后，对磁性石墨烯用2mL乙腈洗脱5min，氮气吹干定容至200μL，作为待测试样。
其他步骤与条件均参照实施例1进行。
实验结果表明：在引入磁性石墨烯富集的前处理步骤后，用羧基化氧化石墨烯修饰的表面等离子共振生物传感器间接竞争法检测E2，监测响应信号，响应信号值如图15所示。实验结果如图16示，LOD值为3.605×10-6ng/mL，IC50为4.944×10-4ng/mL，检测范围2.105×10-5ng/mL–1.403×10-2ng/mL。
由实施例2和实施例1相比，实施例1的LOD值是实施例2的588倍，IC50是实施例2的436倍。
对比例2
本对比例采用间接竞争酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法测定E2的含量。以E2-BSA为包被原，E2-mAb为一抗，IgG：HRP为二抗，OVA作为封闭液，以TMB溶液作为显色剂。E2-BSA和E2单抗的最佳稀释倍数分别为1/20000(0.08695μg/ml)和1/64000(0.1589μg/ml)。
实验结果如图17所示，LOD值为0.036ng/mL，IC50为0.194ng/mL，检测范围0.064-0.674ng/mL。
上述几种间接竞争免疫检测方法使用相同的全抗原和抗体。
实施例1、实施例2、对比例1、对比例2四种检测方法的实验结果记录如表4所示，比较ELISA与未经石墨烯修饰的传统SPR实验结果可以看出：SPR检测方法较ELISA方法具有更低的检测限和更宽的检测范围，缺点是抗体的使用量较大。而当使用氧化石墨烯对芯片表面进行修饰以后，SPR的检出限进一步降低，灵敏度大约提高了2倍，并且具有更广阔的检出范围。而当按照本发明，进一步引入磁性石墨烯的前处理的富集步骤后，检出限降低了3400多倍，特别适合低浓度样品的检测。
表4
Figure BDA0002434022220000181
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上介绍仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种采用石墨烯多重信号放大SPR传感测定雌二醇的方法，其特征在于，其包括步骤：
S1:试样准备
使用磁性石墨烯为吸附剂，对待测样品中的雌二醇进行吸附富集，然后洗脱液洗脱，将洗脱下来的雌二醇定容，得到待测试样；
S2:对SPR芯片进行修饰：将SPR芯片的贵金属片表面清洗干净，并在贵金属片表面连接羧基化氧化石墨烯；
S3:利用固定在SPR芯片贵金属表面的羧基化氧化石墨烯连接固定E2-BSA；
S4:基于间接竞争法利用SPR免疫传感测定待测试样中雌二醇的浓度：将含E2的待测试样和E2的单克隆抗体溶液混合进样，共同竞争被固定在SPR芯片表面的E2-BSA，SPR产生的信号与待测试样中E2的浓度呈反比。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，磁性石墨烯按照如下方法制备得到：以纳米石墨烯粉、二价铁铁盐、三价铁铁盐为原料，其中二价铁和三价铁的摩尔比为1:2；向所述原料中加入浓盐酸后，超声脱氧并充分分散于超纯水与无水醇的混合溶剂中，机械搅拌12-24h，加入浓氨水调节pH>10，在加热条件下继续搅拌，得到沉淀物，分离该沉淀物；加入超纯水和无水醇清洗，并采用磁分离器去除无磁性杂质，将所得物分散到无水醇中，低温烘干，即得到磁性石墨烯。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中：采用磁性石墨烯为吸附剂，在pH为酸性条件下对待测样品中的雌二醇进行吸附富集，吸附时间为4-10min，采用乙腈为洗脱液，将被磁性石墨烯吸附的雌二醇洗脱下来，氮气吹干定容至100-250μL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，对SPR芯片进行修饰的方法包括如下步骤：
步骤1：清洗SPR芯片的贵金属片，去除其表面的有机物；
步骤2：在SPR芯片的贵金属片表面引入带负电荷的基团；
步骤3：借助所述带负电荷的基团的静电作用，在所述在SPR芯片的贵金属片表面引入带正电荷的基团；
步骤4：借助所述带正电荷的基团的静电作用，在所述在SPR芯片的贵金属片表面连接带负电荷的羧基化氧化石墨烯。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S1中，步骤S2中，所述SPR芯片的贵金属片为金片，具体步骤为：
步骤1：采用体积比为H202:H2S04＝1:3配制成piranha溶液，在室温下浸泡SPR芯片的金片，去除金片表面的有机物，用去离子水清洗、无水乙醇清洗，最后氮气吹干；其中H202为质量百分含量30％的双氧水；
步骤2：将所述SPR芯片的金片浸泡到MPA的醇溶液中，放置过夜，取出并用乙醇冲洗金片以去除多余的MPA，用去离子水冲洗以去除多余的醇，取出后氮气吹干金片；通过浸泡，MPA与金片形成金硫键并引入带负电荷的羧基；
步骤3：将所述SPR芯片的金片浸泡到PAH溶液中，取出后用去离子水冲洗，氮气吹干金片；通过浸泡和静电作用，使金片表面连接带正电荷的PAH；
步骤4：将带有正电荷的金片浸泡在羧基化氧化石墨烯的分散液中，通过浸泡和PAH的静电作用，使羧基化氧化石墨烯连接到金片表面。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中固定E2-BSA的方法为：
将SPR芯片及金片装入传感器中，以EDC溶液和NHS溶液对芯片表面的羧基进行活化5-10min；以pH＝4-5的醋酸盐缓冲溶液为耦合缓冲溶液，用所述耦合缓冲液配制一定质量浓度的E2-BSA反应15-30min，以乙醇胺为封闭液反应5-20min，以0.05mol/L的NaOH溶液为再生液再生1-3min，依次重复循环1-3次，使E2-BSA与SPR芯片的金片表面带羧基的氧化石墨烯连接，实现E2-BSA的固定化。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S3中，活化时，EDC浓度为0.4mol/L，NHS浓度为0.1mol/L，活化时间为7min；耦合缓冲溶液pH为4.5；其中用所述耦合缓冲液配制一定质量浓度的E2-BSA反应20min，以pH8.5的乙醇胺为封闭液反应10min，以0.05mol/L的NaOH溶液为再生液再生2min。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S3中，在固定E2-BSA时，E2-BSA浓度为80μg/mL；E2-BSA固定后SPR的响应值为580.17m°。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中，将含E2的待测试样和E2-mAb溶液以体积比1:1进行混合后，室温孵育并加入样品池中进样检测，进样中游离的E2和固定在传感基芯片上的E2-BSA共同竞争E2-mAb，测定SPR响应值；其中E2-mAb溶液的E2-mAb浓度为25.00μg/mL，进样中E2-mAb浓度为12.50μg/mL。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤S5，SPR的再生：采用0.05mol/L NaOH溶液120min/次，再生2次以上，使抗体去除率达到99.30％以上。
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