CN111398190B - 一种快速有效评估体外受精结局的无创检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种快速有效评估体外受精结局的无创检测方法，包括以下步骤：将获得的精子在培养液中进行精子调配；将调配好的预进行受精的培养液滴入至培养皿中，每个培养皿准备多个预受精培养液滴；将取出的单个卵子分别注入至每个预受精培养液滴中，培养4‑5个小时；深入受精滴中吸取部分体积的受精滴，离心，取上清液稀释；将稀释后的受精滴利用全自动生化分析仪检测钙离子浓度；统计受精滴中钙离子浓度差异，以此预测0PN结局和/或2PN结局的差异。本研究收集最初4‑5小时换液的受精滴（Day 0）进行早期检测，研究结果可直接预测2PN阶段（Day 1）的受精结局，有助于提高临床早期判断受精结局，对下一步诊治提供指导。

Description

一种快速有效评估体外受精结局的无创检测方法
技术领域
本发明涉及临床辅助生殖技术，特别涉及一种快速有效评估体外受精结局的无创检测方法。
背景技术
体外受精和胚胎移植(IVF-ET)俗称“试管婴儿”。其是一种特殊的临床辅助生殖技术，需要把精子和卵子在体外的环境下完成受精过程，然后将受精的早期胚胎移植到女性的子宫内，在女性子宫内发育成为胎儿，也就是俗称的试管婴儿。在此过程中，是否受精是最初也是最为关键的一步，如果可以快速准确的评估受精结局，就能在最佳的时间给予患者补救的措施，从而减少患者的精神及经济压力。目前临床评估受精结局的主要方法是胚胎实验员通过显微镜观察胚胎发育的形态，在最初的4-5小时可以观察，如果观察到2PB的数量超过体外培养数量的三分之一则等待次日继续动态观察受精结局，如果观察到2PB数量小于体外培养数量的三分之一则延长观察时间至6-8小时，根据观察结果确定是否需要行早期补救。当在次日观察到2PN则初步判定受精正常。但目前的体外受精结局的检测方法是胚胎实验员对精卵结合情况的实时观察。胚胎实验员主要是显微镜观察进行形态学评估，其受观察者的主观性影响很大，并且无法检测到一些隐藏的不能肉眼可见的异常，形态学评分高的胚胎不能代表最佳的发育潜能，所以体外受精结局的预测有限。
发明内容
本发明为解决上述技术问题提供一种快速有效评估体外受精结局的无创检测方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种快速有效评估体外受精结局的无创检测方法，包括以下步骤：
将获得的精子在培养液中进行精子调配；
将调配好的预进行受精的培养液滴入至培养皿中，每个培养皿准备多个预受精培养液滴；
将取出的单个卵子分别注入至每个预受精培养液滴中，培养4-5个小时；
深入受精滴中吸取部分体积的受精滴，离心，取上清液稀释；
将稀释后的受精滴利用全自动生化分析仪检测钙离子浓度；
统计受精滴中钙离子浓度差异，以此预测0PN结局和/或2PN结局的差异。
上述方案中，所述检测钙离子浓度的方法为偶氮砷III法。
上述方案中，离心步骤具体为在4℃，3000rpm离心5分钟。
上述方案中，0PN的钙离子浓度为1.72±0.6mmol/L。
上述方案中，2PN的钙离子浓度为1.62±0.4mmol/L。
上述方案中，调配好的预进行受精的培养液滴中精子的浓度为15万条/mL。
上述方案中，取上清液稀释是使用的去离子水稀释。
本发明与现有技术相比具有如下有益效果：本研究仅通过收集当天最初4-5小时(Day 0)换液的受精滴进行早期检测，研究结果可直接预测现有技术需要第二天才能观察到的2PN阶段(Day 1)的受精结局，有助于提高临床早期判断受精结局，对下一步诊治提供指导。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下面通过实施例详述本发明。
本发明提供一种快速有效评估体外受精结局的无创检测方法，包括如下步骤：
(一)标本收集：
本研究收集2019年6月-2019年8月在武汉大学中南医院进行体外受精-胚胎移植的病人的体外培养液进行检测，共收集受精滴标本144个，其中正常受精标本96个，未受精标本48个，以正常受精：未受精＝2:1进行分析。
(二)标本检测方法：
1)将获得的精子以15万条/mL的浓度在培养液中进行精子调配；此处的培养液为瑞典Vitrolife公司的G-IVFTM PLUS；
2)准备好预进行受精的培养液，每个培养皿准备5-6个预受精培养液滴，每个滴为150μl；
3)将取出的单个卵子注入预受精培养液中，培养4-5个小时；
4)由于受精滴表面有油脂覆盖，使用移液器将枪头深入受精滴中吸取100μl；
5)4℃，3000rpm离心5分钟，每滴取80μl微升上清液加入120μl无菌水稀释；
6)将稀释后的受精滴标本利用全自动生化分析仪检测钙离子浓度；
7)统计受精滴中钙离子浓度差异(即0PN结局与2PN结局的差异)；
通过SPSS17.0进行统计分析，统计分析结果如下表1至表3所示。由表1至表3可以看出，以分组作为因素做单因素方差分析，使用单因素同质性测试进行方差齐性检验，P＝0.755>0.05，说明方差是齐，可以使用单因素方差分析进行检验，通过单因素方差分析检验，结果显示P＝0.004，差异具有统计学意义(统计分析结果如下表1至表3所示)。
表1描述性统计资料
Figure GDA0002496050200000031
表2变异数同质性测试
Levene统计资料 df1 df2 显著性
.098 1 142 .755
表3变异数分析
Figure GDA0002496050200000032
故不同的受精结局的受精滴中的钙离子浓度是具有显著差异的，如表4所示。
表4
Figure GDA0002496050200000033
由表4可知，当0PN时，钙离子浓度为1.72±0.6mmol/L；当2PN时，钙离子浓度为1.62±0.4mmol/L。
本发明中对钙离子的检测方法具体如下：
检测仪器与试剂
1.仪器BECKMAN-COULTER AU5800生化分析仪
2.试剂和原理
2.1试剂
钙测定试剂盒(偶氮砷III法)。
2.2检测原理
钙离子与偶氮砷III发生反应，形成浓紫色的络合物。在660/700nm处测定Ca-偶氮砷III络合物的吸光率，混合物吸光率的增加与样本中的钙离子浓度成正比。
3.检测方法：
1)试剂准备：直接将试剂放在仪器上。
2)仪器校准：使用贝克曼库尔特AU生化分析系统专用校准品(Cat No.66300)。
3)质量控制：使用贝克曼库尔特AU生化分析系统专用质控(Cat.No.ODC0003/ODC0004)。
4)数据计算：贝克曼库尔特AU生化分析系统自动计算各样本的钙浓度。
结果验证：
1、将接受体外受精-胚胎移植患者的待测定的受精培养液1号进行钙离子检测，结果显示单滴受精滴标本中钙离子浓度分别为：1.725mmol/L。次日对比临床结果提示该标本为0PN。0PN钙离子浓度1.725在检测结果均值1.72(95％CI 1.66-1.78)范围内，代表结果可信。本发明可有效排除未受精配子。
2、将接受ICSI补救患者的补救前体外受精培养滴1-5号进行钙离子检测，结果显示单滴受精滴标本中钙离子浓度分别为
1.75mmol/L
1.775mmol/L
1.75mmol/L
1.725mmol/L
1.75mmol/L
补救前所有卵子在收集受精培养液时均未受精，对比分析结果所有钙离子结果在0PN钙离子浓度均值1.72(95％CI 1.66-1.78)范围内，进一步验证结果可信。
以上所述实施例仅展示了本发明的部分实施方式，并对其进行了较为详尽的阐述，但本发明并不局限于上述的具体实施方式。本领域的普通技术人员在不脱离本发明的构思前提下，还可以进行变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种快速有效评估体外受精结局的无创检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
将获得的精子在培养液中进行精子调配；
将调配好的预进行受精的培养液滴入至培养皿中，每个培养皿准备多个预受精培养液滴；
将取出的单个卵子分别注入至每个预受精培养液滴中，培养4-5个小时；
深入受精滴中吸取部分体积的受精滴，离心，取上清液稀释；
将稀释后的受精滴利用全自动生化分析仪检测钙离子浓度；
统计受精滴中钙离子浓度差异，以此预测0PN结局和/或2PN结局的差异；
其中，0PN的钙离子浓度为1.72±0.6mmol/L，2PN的钙离子浓度为1.62±0.4mmol/L。
2.如权利要求1所述的快速有效评估体外受精结局的无创检测方法，其特征在于，所述检测钙离子浓度的方法为偶氮砷III法。
3.如权利要求1所述的快速有效评估体外受精结局的无创检测方法，其特征在于，离心步骤具体为在4℃，3000rpm离心5分钟。
4.如权利要求1所述的无创检测方法，其特征在于，调配好的预进行受精的培养液滴中精子的浓度为15万条/mL。
5.如权利要求1所述的无创检测方法，其特征在于，取上清液稀释是使用的无菌水稀释。
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