CN111394477A - 基于二代测序技术的检测120个基因座的试剂盒及其使用的引物组合 - Google Patents

基于二代测序技术的检测120个基因座的试剂盒及其使用的引物组合 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于二代测序技术的检测120个基因座的试剂盒及其使用的引物组合。引物组合由230条引物组合，230条引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1—SEQ ID NO：230所示。本发明提供的试剂盒检测的120个基因座中扩增子长度大于300bp的仅为2.5％(3/120)，有利于降解检材的分析。实验证明，采用本发明提供的试剂盒检测标准品2800M中120个基因座的STR分型，分型结果准确。本发明具有重要的应用价值。

Description

基于二代测序技术的检测120个基因座的试剂盒及其使用的 引物组合
技术领域
本发明属于法医学技术领域，具体涉及基于二代测序技术的检测120个基因座的试剂盒及其使用的引物组合，尤其涉及基于二代测序技术的检测119个STR基因座和Amelogenin基因座的试剂盒及其使用的引物组合。
背景技术
STR分型技术简单、快速，结果可靠、灵敏度高，且重复性好，是法医遗传学研究的主要工具。STR分型主要采用的技术手段是通过毛细管电泳检测进行基因分型，该技术通过检测同一基因型DNA分子的总荧光强度来实现该基因型的判读，一方面只能对基因型进行定性分析，无法对该基因型所占比例进行准确定量，另一方面会限制STR分型可检测的基因座数量。二代测序STR分型技术，信息含量更大、数据准确性更高，不仅能够获得STR的长度信息，还能获得完整的序列信息，发现更多相同长度片段中存在的序列不一致的等位基因，而且还可以一次性获得所有要检测的位点信息，避免多次毛细管电泳分型的操作失误，保证得到的分型结果来源于同一样本，缩短时间、节省成本的同时提高检测准确率。
人类的Y染色体短串联重复(Y-chromosome short tandem repeats，Y-STR)是指存在于Y染色体上非重组区的短串联重复片段。Y-STR具有男性特有、父系遗传及单倍型遗传等三大特征，被广泛用于男性家系排查、个体识别以及在群体遗传学研究中追溯父系群体的起源、迁徙和融合等。人类的X染色体短串联重复(X-chromosome short tandemrepeats，X-STR)是指存在于X染色体上非重组区的短串联重复片段。X-STR遗传特征既不同于常染色体，也不同于Y染色体，表现为性连锁特征，在父女关系、母子关系、隔代亲缘关系、乱伦等特殊亲缘关系鉴定案件中，具有独特价值，可以作为对常染色体STR、Y-STR的重要补充。因此，将常染色体STR与Y-STR、X-STR进行联合分型，可显著提升法医DNA检测的信息量。
目前，二代测序STR分型产品应用最广泛、包含STR分型位点最多的两款试剂盒，分别为Illumina公司和Thermo Fisher公司产品。首先，此二者价格非常高昂；其次，可获得信息具有局限性，只能获得这些产品中固有基因座的数据和分析，并且基因座数目比较少，特别X-STR基因座更少；再次，由于人种差异，这些产品并不完全适用于我国人群STR群体遗传多态性分析。我国已建立庞大的DNA数据库，故基于我国人群群体遗传学数据筛选基因座，研究和开发联合常染色体、Y染色体和X染色体中较多基因座的法医学二代测序STR分型试剂，具有十分重要的研究意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的为制备适合我国人群STR群体遗传多态性分析的试剂盒。
本发明首先保护引物组合，可包括引物1—引物230；引物1—引物230均为单链DNA分子，核苷酸序列依次可如SEQ ID NO：1—SEQ ID NO：230所示。
所述引物组合具体可由引物1—引物230组成。
上述任一所述的引物组合中，引物1—引物230的摩尔比具体可为0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.04：0.04：0.04：0.04：0.12：0.12：0.04：0.04：0.08：0.08：0.16：0.16：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.06：0.06：0.06：0.06：0.08：0.08：0.08：0.08：0.16：0.16：0.24：0.24：0.48：0.48：0.24：0.24：0.04：0.04：0.08：0.08：0.12：0.12：0.48：0.48：0.12：0.12：0.16：0.16：0.08：0.08：0.12：0.12：0.06：0.06：0.12：0.12：0.12：0.12：0.06：0.06：0.16：0.16：0.08：0.08：0.12：0.12：0.12：0.12：0.24：0.24：0.04：0.04：0.08：0.08：0.02：0.02：0.02：0.02：0.08：0.08：0.04：0.04：0.16：0.16：0.02：0.02：0.08：0.08：0.08：0.08：0.03：0.03：0.03：0.03：0.08：0.08：0.04：0.04：0.16：0.16：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.02：0.02：0.08：0.08：0.04：0.04：0.04：0.04：0.08：0.08：0.08：0.08：0.04：0.04：0.08：0.08：0.02：0.02：0.08：0.08：0.02：0.02：0.04：0.04：0.04：0.04：0.02：0.02：0.08：0.08：0.12：0.12：0.02：0.02：0.08：0.08：0.16：0.16：0.04：0.04：0.24：0.24：0.08：0.08：0.24：0.24：0.05：0.05：0.08：0.08：0.12：0.12：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.16：0.16：0.08：0.08：0.08：0.08：0.16：0.16：0.12：0.12：0.08：0.08：0.24：0.24：0.12：0.12：0.04：0.04：0.16：0.16：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.12：0.12：0.24：0.24：0.12：0.12：0.12：0.12：0.08：0.08：0.04：0.04：0.08：0.08：0.32：0.32：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08。
上述任一所述的引物组合可用于扩增120个基因座。
本发明还保护一种基于120个基因座的复合扩增体系，可包括上述任一所述引物组合。
所述复合扩增体系可由上述任一所述引物组合组成。
引物1—引物230在所述复合扩增体系中的浓度分别可为0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.04μM、0.04μM、0.04μM、0.04μM、0.12μM、0.12μM、0.04μM、0.04μM、0.08μM、0.08μM、0.16μM、0.16μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.06μM、0.06μM、0.06μM、0.06μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.16μM、0.16μM、0.24μM、0.24μM、0.48μM、0.48μM、0.24μM、0.24μM、0.04μM、0.04μM、0.08μM、0.08μM、0.12μM、0.12μM、0.48μM、0.48μM、0.12μM、0.12μM、0.16μM、0.16μM、0.08μM、0.08μM、0.12μM、0.12μM、0.06μM、0.06μM、0.12μM、0.12μM、0.12μM、0.12μM、0.06μM、0.06μM、0.16μM、0.16μM、0.08μM、0.08μM、0.12μM、0.12μM、0.12μM、0.12μM、0.24μM、0.24μM、0.04μM、0.04μM、0.08μM、0.08μM、0.02μM、0.02μM、0.02μM、0.02μM、0.08μM、0.08μM、0.04μM、0.04μM、0.16μM、0.16μM、0.02μM、0.02μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.03μM、0.03μM、0.03μM、0.03μM、0.08μM、0.08μM、0.04μM、0.04μM、0.16μM、0.16μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.02μM、0.02μM、0.08μM、0.08μM、0.04μM、0.04μM、0.04μM、0.04μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.04μM、0.04μM、0.08μM、0.08μM、0.02μM、0.02μM、0.08μM、0.08μM、0.02μM、0.02μM、0.04μM、0.04μM、0.04μM、0.04μM、0.02μM、0.02μM、0.08μM、0.08μM、0.12μM、0.12μM、0.02μM、0.02μM、0.08μM、0.08μM、0.16μM、0.16μM、0.04μM、0.04μM、0.24μM、0.24μM、0.08μM、0.08μM、0.24μM、0.24μM、0.05μM、0.05μM、0.08μM、0.08μM、0.12μM、0.12μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.16μM、0.16μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.16μM、0.16μM、0.12μM、0.12μM、0.08μM、0.08μM、0.24μM、0.24μM、0.12μM、0.12μM、0.04μM、0.04μM、0.16μM、0.16μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.12μM、0.12μM、0.24μM、0.24μM、0.12μM、0.12μM、0.12μM、0.12μM、0.08μM、0.08μM、0.04μM、0.04μM、0.08μM、0.08μM、0.32μM、0.32μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM和0.08μM。
所述复合扩增体系还可包括进行PCR扩增反应所需的试剂；所述“进行PCR扩增反应所需的试剂”不包括PCR扩增反应所需的引物。
上述任一所述复合扩增体系可为20μL，由10μL PCR Master Mix、上述任一所述引物组合和模板组成。PCR Master Mix具体可为公安部物证鉴定中心产品。所述模板具体可为浓度为1ng/μL的标准品2800M的水溶液或样品的基因组DNA。所述样品可为人唾液采集卡。所述标准品2800M具体可为Promega公司的产品，产品目录号为DD7101。
含有上述任一所述引物组合的试剂盒也属于本发明的保护范围；所述试剂盒的用途可为(h1)或(h2)或(h3)或(h4)：(h1)STR分型；(h2)常染色体STR分型；(h3)Y-STR分型；(h4)X-STR分型。
本发明还保护上述任一所述复合扩增体系或上述任一所述试剂盒的制备方法；该制备方法包括将上述任一所述引物组合中的各条引物单独包装的步骤。
本发明还保护上述任一所述引物组合或上述任一所述复合扩增体系在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途可为(h1)或(h2)或(h3)或(h4)：(h1)STR分型；(h2)常染色体STR分型；(h3)Y-STR分型；(h4)X-STR分型。
本发明还保护上述任一所述引物组合或上述任一所述复合扩增体系的应用，可为(h1)或(h2)或(h3)或(h4)：(h1)STR分型；(h2)常染色体STR分型；(h3)Y-STR分型；(h4)X-STR分型。
上述任一所述120个基因座具体可由Amelogenin、CSF1PO、FGA、TH01、TPOX、VWA、Penta D、Penta E、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、DYS19、DYS385a/b、DYS389-I、DYS389-II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS456、DYS458、DYS481、DYS533、DYS576、DYS635、Y-GATA-H4、D1S1627、D1S1677、D2S1360、D2S1776、D2S441、D3S1744、D3S3045、D3S3053、D3S4529、D4S2364、D4S2366、D5S2500、D5S2800、D6S474、D6S477、D7S3048、D8S1132、D9S2157、D9S1122、D10S1248、D10S1435、D10S2325、D11S4463、D12ATA63、D13S325、D14S1434、D14S608、D15S659、D17S1301、D17S974、D18S1364、D18S535、D18S853、D19S253、D20S1082、D20S470、D20S482、D21S1270、D21S2055、D22S1045、D22GATA198B05、DYS388、DYS399S1、DYS404S1a/b、DYS504、DYS505、DYS508、DYS520、DYS531、DYS549、DYS552、DYS557、DYS570、DYS593、DYS596、DYS622、DYS641、DYS643、DYS645、DXS10079、DXS10103、DXS6789、DXS6799、DXS6800、DXS6801、DXS6804、DXS6809、DXS7130、DXS7132、DXS7423、DXS7424、DXS981、DXS9895、DXS9902、GATA165B12、GATA31E08和HPRTB组成。其中，CSF1PO、FGA、TH01、TPOX、VWA、Penta D、Penta E、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、D1S1627、D1S1677、D2S1360、D2S1776、D2S441、D3S1744、D3S3045、D3S3053、D3S4529、D4S2364、D4S2366、D5S2500、D5S2800、D6S474、D6S477、D7S3048、D8S1132、D9S2157、D9S1122、D10S1248、D10S1435、D10S2325、D11S4463、D12ATA63、D13S325、D14S1434、D14S608、D15S659、D17S1301、D17S974、D18S1364、D18S535、D18S853、D19S253、D20S1082、D20S470、D20S482、D21S1270、D21S2055、D22S1045和D22GATA198B05为60个常染色体STR基因座。DYS19、DYS385a/b、DYS389-I、DYS389-II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS456、DYS458、DYS481、DYS533、DYS576、DYS635、Y-GATA-H4、DYS388、DYS399S1、DYS404S1a/b、DYS504、DYS505、DYS508、DYS520、DYS531、DYS549、DYS552、DYS557、DYS570、DYS593、DYS596、DYS622、DYS641、DYS643和DYS645为41个Y-STR基因座。DXS10079、DXS10103、DXS6789、DXS6799、DXS6800、DXS6801、DXS6804、DXS6809、DXS7130、DXS7132、DXS7423、DXS7424、DXS981、DXS9895、DXS9902、GATA165B12、GATA31E08和HPRTB为18个X-STR基因座。Amelogenin为性别决定基因座。DYS385a/b、DYS404S1a/b分别包含两个分型片段。DYS399S1包含三个分型片段。
本发明提供的基于二代测序技术检测120个基因座的试剂盒包括60个常染色体STR基因座、41个Y-STR基因座、18个X-STR基因座和1个性别决定基因座Amelogenin，可以检测更多的遗传信息。而且本发明提供的复合扩增体系中120个基因座中扩增子长度大于300bp的仅为2.5％(3/120)，而ForenSeqTM DNA Signature Prep Kit中扩增子长度大于300bp的约20.3％(12/59)，不利于降解检材的分析。实验证明，采用本发明提供的试剂盒检测标准品2800M中120个基因座的STR分型，分型结果准确。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为119个STR基因座的PCR扩增产物的长度范围分布。
图2为实施例1制备的试剂盒的物种特异性检测。
图3为实施例1制备的试剂盒的灵敏度检测。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
PCR Master Mix为公安部物证鉴定中心产品。标准品2800M为Promega公司的产品，产品目录号为DD7101。Agencourt AMPure XP 5mL Kit为Beckman Coulter公司的产品，货号为A63880。QubitTMdsDNA HS Assay Kit为Thermo Fisher公司的产品，货号为Q32854。NanoDrop 2000紫外分光光度计为Thermo Fisher公司的产品。TruSeq DNA PCR-Free HTLibrary Prep Kit为Illumina公司的产品，货号为FC-121-3003。KAPA LibraryQuantification Kit为KAPA公司的产品，货号为KK4824。Miseq reagent kit v3-600cycles测序试剂为Illumina公司的产品，货号为MS-102-3003。Miseq FGx二代测序仪为Illumina公司的产品。
实施例1、基于二代测序技术检测120个基因座(包括60个常染色体STR基因座、41个Y-STR基因座、18个X-STR基因座和1个性别决定Amelogenin基因座)的试剂盒的制备
一、120个基因座的筛选
本发明的发明人通过查阅文献和现有二代测序STR分型产品获得大量候选的常染色体STR基因座、Y-STR基因座和X-STR基因座，然后根据中国人群STR群体遗传多态性分析结果，最终筛选获得120个基因座，包括60个常染色体STR基因座、41个Y-STR基因座、18个X-STR基因座和1个性别决定基因座Amelogenin。
60个常染色体STR基因座分别为：CSF1PO、FGA、TH01、TPOX、VWA、Penta D、Penta E、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、D1S1627、D1S1677、D2S1360、D2S1776、D2S441、D3S1744、D3S3045、D3S3053、D3S4529、D4S2364、D4S2366、D5S2500、D5S2800、D6S474、D6S477、D7S3048、D8S1132、D9S2157、D9S1122、D10S1248、D10S1435、D10S2325、D11S4463、D12ATA63、D13S325、D14S1434、D14S608、D15S659、D17S1301、D17S974、D18S1364、D18S535、D18S853、D19S253、D20S1082、D20S470、D20S482、D21S1270、D21S2055、D22S1045、D22GATA198B05。
41个Y-STR基因座分别为：DYS19、DYS385a/b、DYS389-I、DYS389-II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS456、DYS458、DYS481、DYS533、DYS576、DYS635、Y-GATA-H4、DYS388、DYS399S1、DYS404S1a/b、DYS504、DYS505、DYS508、DYS520、DYS531、DYS549、DYS552、DYS557、DYS570、DYS593、DYS596、DYS622、DYS641、DYS643、DYS645；其中，DYS385a/b、DYS404S1a/b分别包含两个分型片段，DYS399S1包含三个分型片段。
18个X-STR基因座分别为：DXS10079、DXS10103、DXS6789、DXS6799、DXS6800、DXS6801、DXS6804、DXS6809、DXS7130、DXS7132、DXS7423、DXS7424、DXS981、DXS9895、DXS9902、GATA165B12、GATA31E08、HPRTB。
二、引物组合的制备
1、人工设计并合成用于扩增每个基因座的引物(要求扩增长度最好300bp以下)，然后进行PCR扩增，获得每个基因座的特异性扩增产物。
2、综合单个基因座的扩增条件，选择适宜扩增程序，进行复合扩增。由于复合的基因座数目较多，引物间相互抑制情况复杂，所以需要一一排除，找出这些基因座，重新设计并合成引物。此外，不同基因座的引物之间还会形成引物二聚体，降低引物的扩增效率，也需要重新设计并合成引物。
3、初次复合扩增时，各个引物在反应体系中的浓度均为0.1μM；之后对引物浓度进行调整，获得进行PCR扩增时各个引物的最佳浓度。
经过上述步骤，获得引物组合。引物组合由230条引物组成，用于检测120个基因座。各个基因座的名称、扩增基因座对应的引物名称、引物的核苷酸序列和等位基因分型范围依次见表1中第1列、第2列、第3列和第6列。进行PCR扩增时各个引物的最佳浓度见表1中第5列。
表1
Figure BDA0002434844870000051
Figure BDA0002434844870000061
Figure BDA0002434844870000071
Figure BDA0002434844870000081
Figure BDA0002434844870000091
Figure BDA0002434844870000101
各个基因座对应的引物在hg38人类参考基因组(hg38人类基因组的信息见网址http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/hg38.2bit)中的PCR扩增产物的长度和核苷酸序列详见表2(示例性的)。各个STR基因座的PCR扩增产物的长度范围分布见图1。由此可见，120个基因座中扩增子长度大于300bp的仅为2.5％(3/120)，而ForenSeqTMDNA Signature Prep Kit中扩增子长度大于300bp的约20.3％(12/59)。
表2
Figure BDA0002434844870000111
Figure BDA0002434844870000121
Figure BDA0002434844870000131
Figure BDA0002434844870000141
Figure BDA0002434844870000151
Figure BDA0002434844870000161
Figure BDA0002434844870000171
Figure BDA0002434844870000181
Figure BDA0002434844870000191
Figure BDA0002434844870000201
三、基于二代测序技术检测120个基因座的试剂盒的制备
基于二代测序技术检测120个基因座的试剂盒包括引物混合物；引物混合物由步骤二制备的230条引物混合而成。
实施例2、采用实施例1制备的试剂盒检测标准品2800M的STR分型
1、DNA样本准备
取标准品2800M，用超纯水稀释，获得浓度为1ng/μL的标准品2800M水溶液。
2、PCR扩增
以标准品2800M水溶液为模板，采用实施例1步骤三制备的引物混合物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
反应体系为20μL，由10μL PCR Master Mix、1μL标准品2800M水溶液、引物混合物和无核酶水组成。该反应体系中，各个引物的浓度见表1中第5列。
反应程序：95℃5min；98℃30s，60℃90s，72℃1min，28个循环；72℃10min；4℃保存。
3、纯化和定量
(1)取PCR扩增产物，按照Agencourt AMPure XP 5mL Kit的说明书步骤进行纯化，得到PCR纯化产物。
(2)将PCR纯化产物按照QubitTMdsDNA HS Assay Kit说明书，采用NanoDrop 2000紫外分光光度计进行定量，得到PCR纯化产物的浓度。
4、文库制备
取PCR纯化产物，按照TruSeq DNA PCR-Free HT Library Prep Kit的说明书操作步骤依次进行末端修复、末端修复产物纯化、连接A-tail、连接Adapter和连接产物的纯化，然后按照KAPA Library Quantification Kit的说明书步骤进行文库定量及文库标准化步骤，完成文库制备。
5、上机测试
取步骤4制备的文库，使用Miseq reagent kit v3-600 cycles测序试剂于MiseqFGx二代测序仪上进行测序，测序完成后进行数据分析。
实验结果见表3。结果表明，标准品2800M得到了完整的STR分型，完全能够满足法医STR检验的要求。
表3
Figure BDA0002434844870000211
Figure BDA0002434844870000221
Figure BDA0002434844870000231
Figure BDA0002434844870000241
注：N与其后数字表示一段碱基序列，其后数字表示序列的碱基数目。
实施例3、实施例1制备的试剂盒的准确性验证
1、取1ng标准品2800M，分别按照Identifiler Plus试剂盒(Thermo Fisher)、Global FilerTM试剂盒(Thermo Fisher)、
Figure BDA0002434844870000243
Yfiler Plus试剂盒(ThermoFisher)、PowerPlex21试剂盒(Promega)和DNATyperTMY26试剂盒(公安部物证鉴定中心)的说明书步骤进行毛细管电泳检测，得到各个基因座的等位基因基因型。分型结果详见表4中第2列。
2、按照实施例2的步骤检测标准品2800M，得到基因座的等位基因基因型。分型结果详见表4中第3列。
结果表明，实施例1制备的试剂盒与上述毛细管电泳分型试剂盒重合的基因座，在标准品2800M样本中的分型结果完全一致(表4中第4列)。
表4
Figure BDA0002434844870000242
Figure BDA0002434844870000251
Figure BDA0002434844870000261
注：“-”表示不存在。
实施例4、实施例1制备的试剂盒的物种特异性检测
1、将实施例2中标准品2800M水溶液替换为大肠杆菌的基因组DNA、鱼的基因组DNA、鸡的基因组DNA、鸭的基因组DNA、猫的基因组DNA、狗的基因组DNA、牛的基因组DNA、羊的基因组DNA、猪的基因组DNA或猴的基因组DNA，其它步骤均不变。大肠杆菌的基因组DNA、鱼的基因组DNA、鸡的基因组DNA、鸭的基因组DNA、猫的基因组DNA、狗的基因组DNA、牛的基因组DNA、羊的基因组DNA、猪的基因组DNA和猴的基因组DNA的浓度均为1ng/μL。
2、按照实施例2的步骤检测标准品2800M。
3、以常染色体STR基因座、Y-STR基因座和X-STR基因座分类作为横坐标，等位基因的长度分型作为纵坐标，绘制图谱。
检测结果见图2(aSTRs为常染色体STR基因座)。结果表明，实施例1制备的试剂盒的人种特异性良好。
实施例5、实施例1制备的试剂盒的灵敏度检测
1、取标准品2800M，用超纯水稀释，分别获得浓度为5ng/μL的标准品2800M水溶液1、浓度为2ng/μL的标准品2800M水溶液2、浓度为1ng/μL的标准品2800M水溶液3、浓度为500pg/μL的标准品2800M水溶液4、浓度为200pg/μL的标准品2800M水溶液5、浓度为100pg/μL的标准品2800M水溶液6、浓度为50pg/μL的标准品2800M水溶液7。
2、将实施例2中标准品2800M水溶液替换为标准品2800M水溶液1、标准品2800M水溶液2、标准品2800M水溶液3、标准品2800M水溶液4、标准品2800M水溶液5、标准品2800M水溶液6或标准品2800M水溶液7，其它步骤均不变。
3、根据步骤2的测序结果，分别统计常染色体STR基因座、Y-STR基因座和X-STR基因座中等位基因的比例(目的为反映分型结果的完整性)。
检测结果见图3(aSTRs为常染色体STR基因座)。结果表明，实施例1制备的试剂盒的灵敏度较高，在DNA投入量为500pg/反应体系及以上时，常染色体STR、Y-STR和X-STR等位基因检出率均为100％；在DNA投入量为200pg/反应体系时，常染色体STR等位基因检出率在98％以上，Y-STR和X-STR等位基因检出均达到100％。
实施例6、实施例1制备的试剂盒的应用—唾液采集卡样本基因座分型
样本一、样本二、样本三、样本四和样本五为不同人唾液采集卡的基因组DNA，浓度均为1ng/μL。所有唾液采集卡由公安部物证鉴定中心日常DNA数据库建设所提供。
将实施例2中标准品2800M水溶液替换为样本一、样本二、样本三、样本四或样本五，其它步骤均不变。
样本一的检测结果见表5。样本二的检测结果见表6。样本三的检测结果见表7。样本四的检测结果见表8。样本五的检测结果见表9。结果表明，样本一、样本二、样本三、样本四和样本五均获得了完整的STR分型结果。
表5
Figure BDA0002434844870000271
Figure BDA0002434844870000281
Figure BDA0002434844870000291
Figure BDA0002434844870000301
注：N与其后数字表示一段碱基序列，其后数字表示序列的碱基数目。
表6
Figure BDA0002434844870000302
Figure BDA0002434844870000311
Figure BDA0002434844870000321
Figure BDA0002434844870000331
注：N与其后数字表示一段碱基序列，其后数字表示序列的碱基数目。
表7
Figure BDA0002434844870000332
Figure BDA0002434844870000341
Figure BDA0002434844870000351
Figure BDA0002434844870000361
注：N与其后数字表示一段碱基序列，其后数字表示序列的碱基数目。
表8
Figure BDA0002434844870000362
Figure BDA0002434844870000371
Figure BDA0002434844870000381
Figure BDA0002434844870000391
注：N与其后数字表示一段碱基序列，其后数字表示序列的碱基数目。
表9
Figure BDA0002434844870000392
Figure BDA0002434844870000401
Figure BDA0002434844870000411
Figure BDA0002434844870000421
注：N与其后数字表示一段碱基序列，其后数字表示序列的碱基数目。
实施例7、实施例1制备的试剂盒中引物具有不可替换性
实施例1制备的试剂盒是本发明的发明人经过大量实验获得的，主要包括扩增各个基因座引物的反复调试和引物浓度的摸索。由于复合的基因座数目较多，引物间相互抑制情况复杂，所以试剂盒中用于扩增各个基因座的引物不可替换。
一、增加基因座导致原有体系中的基因座被抑制
制备试剂盒的过程中逐渐增加了体系中基因座的数目，而每次向已建体系中增加基因座时，都会遇到体系中已有基因座或新增加基因座被抑制的情况。以其中一次增加基因座数目为例，具体如下：
1、已建体系包括基因座数目为91个(90个STR基因座和Amelogenin基因座)，用于扩增其中37个基因座的引物见表10，其余54个基因座CSF1PO、TH01、TPOX、VWA、Penta D、D3S1358、D7S820、D8S1179、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS456、DYS458、DYS481、DYS576、D1S1677、D2S1776、D2S441、D3S3053、D6S474、D10S1435、D11S4463、D20S482、D22S1045、DYS505、DYS508、DYS520、DYS557、DYS596、DYS622、DYS641、DYS643、DYS645、DXS10079、DXS10103、DXS6789、DXS6799、DXS6800、DXS6801、DXS6804、DXS7130、DXS7132、DXS7423、DXS9895、DXS9902、GATA165B12、GATA31E08、HPRTB的引物即实施例1中表1相应基因座的引物。新增加STR基因座27个，设计并合成表11所示的、用于扩增27个STR基因座的引物497-引物658。引物497—引物550组成引物组合1，引物551—引物604组成引物组合2，引物605—引物658组成引物组合3。
表10
Figure BDA0002434844870000422
Figure BDA0002434844870000431
Figure BDA0002434844870000441
表11
Figure BDA0002434844870000442
Figure BDA0002434844870000451
Figure BDA0002434844870000461
Figure BDA0002434844870000471
2、将表10所示的引物组合分别与引物组合1、引物组合2和引物组合3进行组合，获得三个引物混合物。
3、取标准品2800M，用超纯水稀释，获得浓度为1ng/μL的标准品2800M水溶液。
4、以标准品2800M水溶液为模板，分别采用步骤2中三个引物混合物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。每条引物在反应体系的浓度均为0.1μM。
5、同实施例2中步骤3。
6、同实施例2中步骤4。
7、同实施例2中步骤5。
检测结果见表12。结果表明，原有体系中很多基因座与新增基因座相互影响，已有基因座在引物组合1、引物组合2和引物组合3的影响下被抑制情况不同，新增加基因座的三组引物表现也不相同，出现被抑制的情况。
表12
Figure BDA0002434844870000472
Figure BDA0002434844870000481
Figure BDA0002434844870000491
注：×表示未获得等位基因，-表示不存在。
二、随机替换试剂盒基因座的引物导致体系中的基因座被抑制
随机替换试剂盒基因座的引物会导致体系中一些基因座被抑制的情况，包括进行引物替换的和未进行引物替换的基因座。
1、人工设计并合成表13所示的、用于扩增基因座的引物659-引物704。引物659-引物684组成引物组合a，引物685-引物704组成引物组合b。
表13
Figure BDA0002434844870000492
Figure BDA0002434844870000501
2、将引物组合a涉及的基因座的引物取代实施例1引物组合中相应基因座的引物，得到引物组合甲。将引物组合b涉及的基因座的引物取代实施例1引物组合中相应基因座的引物，得到引物组合乙。
引物组合甲和引物组合乙均由230条引物组成。
3、取标准品2800M，用超纯水稀释，获得浓度为1ng/μL的标准品2800M水溶液。
4、以标准品2800M水溶液为模板，采用引物混合物甲或引物混合物乙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。引物混合物甲由引物组合甲中的230条引物混合而成。引物混合物乙由引物组合乙中的230条引物混合而成。
反应体系为20μL，由10μL PCR Master Mix、1μL标准品2800M水溶液、无核酶水、混合物(引物混合物甲或引物混合物乙)和组成。该反应体系中，引物组合a和引物组合b涉及的基因座的引物的浓度均为0.1μM，其它的引物的浓度见表1中第5列。
反应程序：95℃5min；98℃30s，60℃90s，72℃1min，28个循环；72℃10min；4℃保存。
5、同实施例2中步骤3。
6、同实施例2中步骤4。
7、同实施例2中步骤5。
检测结果见表14。结果表明，随机替换实施例1制备的试剂盒中的引物会导致一些基因座被抑制，且被抑制情况不同。
表14
Figure BDA0002434844870000502
Figure BDA0002434844870000511
Figure BDA0002434844870000521
注：×表示未获得等位基因。
上述结果表明，实施例1制备的试剂盒中引物具有不可替换性，本发明的发明人经过大量实验摸索，才获得了试剂盒中的引物组合及引物浓度。
<110>公安部物证鉴定中心
<120>基于二代测序技术的检测120个基因座的试剂盒及其使用的引物组合
<160>230
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>19
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<213>Artificial sequence
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ttttaatact caaccaaaac t 21
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cagtttgcat aggtagag 18
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aactggacag cttaggattg g 21
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tcattgaacc tcatgctctg 20
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gctctccagg gaaacagaa 19
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gatccctaga gggacagaac 20
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taaagacaca aaaatgcaca 20
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gggggctggt tcccctga 18
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cctattgtgg gaccttgt 18
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aactactcct ggtatcaaaa tctg 24
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cctgtaccat aatcacatga gt 22
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ccgcacctgg ccctattgaa 20
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acgctaccta cacactgtgc t 21
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ctcaaggagg accatgtttc a 21
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tcctagctca ggaatactga g 21
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gtgagccctg atcatgcc 18
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cctcccacat cagccttcct 20
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gaaccactcc tggtgccaa 19
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tccttaatag tgtgagccca tt 22
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tgtcacacaa ataaatgaat ga 22
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tgccctttat cacccagatt t 21
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gagaacatat acatttcagc a 21
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caaggcctgc ctgggaaa 18
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caccaccata ttgttccttg a 21
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gtagacatac ttctcgtttc c 21
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caattcaaga tgagatttgg 20
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tgttaggcct tttgacttgt ct 22
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gttcttgtaa cttttctgtc 20
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atacacattc atatcaggag ta 22
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atgtatcatc aatcatctat cc 22
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ctgtgtatgc tttaaaagtt ga 22
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gatgtataga cagagctggt g 21
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ggaccaagca aatcaataga aa 22
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tttccatctc tgtctccatc tt 22
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attcaataaa taggagaagg g 21

Claims (10)

1.引物组合，包括引物1—引物230；引物1—引物230均为单链DNA分子，核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1—SEQ ID NO：230所示。
2.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于：所述引物组合由引物1—引物230组成。
3.如权利要求1或2所述的引物组合，其特征在于：引物1—引物230的摩尔比为0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.04：0.04：0.04：0.04：0.12：0.12：0.04：0.04：0.08：0.08：0.16：0.16：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.06：0.06：0.06：0.06：0.08：0.08：0.08：0.08：0.16：0.16：0.24：0.24：0.48：0.48：0.24：0.24：0.04：0.04：0.08：0.08：0.12：0.12：0.48：0.48：0.12：0.12：0.16：0.16：0.08：0.08：0.12：0.12：0.06：0.06：0.12：0.12：0.12：0.12：0.06：0.06：0.16：0.16：0.08：0.08：0.12：0.12：0.12：0.12：0.24：0.24：0.04：0.04：0.08：0.08：0.02：0.02：0.02：0.02：0.08：0.08：0.04：0.04：0.16：0.16：0.02：0.02：0.08：0.08：0.08：0.08：0.03：0.03：0.03：0.03：0.08：0.08：0.04：0.04：0.16：0.16：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.02：0.02：0.08：0.08：0.04：0.04：0.04：0.04：0.08：0.08：0.08：0.08：0.04：0.04：0.08：0.08：0.02：0.02：0.08：0.08：0.02：0.02：0.04：0.04：0.04：0.04：0.02：0.02：0.08：0.08：0.12：0.12：0.02：0.02：0.08：0.08：0.16：0.16：0.04：0.04：0.24：0.24：0.08：0.08：0.24：0.24：0.05：0.05：0.08：0.08：0.12：0.12：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.16：0.16：0.08：0.08：0.08：0.08：0.16：0.16：0.12：0.12：0.08：0.08：0.24：0.24：0.12：0.12：0.04：0.04：0.16：0.16：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.12：0.12：0.24：0.24：0.12：0.12：0.12：0.12：0.08：0.08：0.04：0.04：0.08：0.08：0.32：0.32：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08：0.08。
4.一种基于120个基因座的复合扩增体系，包括权利要求1至3任一所述引物组合；所述120个基因座由Amelogenin、CSF1PO、FGA、TH01、TPOX、VWA、Penta D、Penta E、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、DYS19、DYS385a/b、DYS389-I、DYS389-II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS456、DYS458、DYS481、DYS533、DYS576、DYS635、Y-GATA-H4、D1S1627、D1S1677、D2S1360、D2S1776、D2S441、D3S1744、D3S3045、D3S3053、D3S4529、D4S2364、D4S2366、D5S2500、D5S2800、D6S474、D6S477、D7S3048、D8S1132、D9S2157、D9S1122、D10S1248、D10S1435、D10S2325、D11S4463、D12ATA63、D13S325、D14S1434、D14S608、D15S659、D17S1301、D17S974、D18S1364、D18S535、D18S853、D19S253、D20S1082、D20S470、D20S482、D21S1270、D21S2055、D22S1045、D22GATA198B05、DYS388、DYS399S1、DYS404S1a/b、DYS504、DYS505、DYS508、DYS520、DYS531、DYS549、DYS552、DYS557、DYS570、DYS593、DYS596、DYS622、DYS641、DYS643、DYS645、DXS10079、DXS10103、DXS6789、DXS6799、DXS6800、DXS6801、DXS6804、DXS6809、DXS7130、DXS7132、DXS7423、DXS7424、DXS981、DXS9895、DXS9902、GATA165B12、GATA31E08和HPRTB组成。
5.如权利要求4所述复合扩增体系，其特征在于：引物1—引物230在所述复合扩增体系中的浓度分别为0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.04μM、0.04μM、0.04μM、0.04μM、0.12μM、0.12μM、0.04μM、0.04μM、0.08μM、0.08μM、0.16μM、0.16μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.06μM、0.06μM、0.06μM、0.06μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.16μM、0.16μM、0.24μM、0.24μM、0.48μM、0.48μM、0.24μM、0.24μM、0.04μM、0.04μM、0.08μM、0.08μM、0.12μM、0.12μM、0.48μM、0.48μM、0.12μM、0.12μM、0.16μM、0.16μM、0.08μM、0.08μM、0.12μM、0.12μM、0.06μM、0.06μM、0.12μM、0.12μM、0.12μM、0.12μM、0.06μM、0.06μM、0.16μM、0.16μM、0.08μM、0.08μM、0.12μM、0.12μM、0.12μM、0.12μM、0.24μM、0.24μM、0.04μM、0.04μM、0.08μM、0.08μM、0.02μM、0.02μM、0.02μM、0.02μM、0.08μM、0.08μM、0.04μM、0.04μM、0.16μM、0.16μM、0.02μM、0.02μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.03μM、0.03μM、0.03μM、0.03μM、0.08μM、0.08μM、0.04μM、0.04μM、0.16μM、0.16μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.02μM、0.02μM、0.08μM、0.08μM、0.04μM、0.04μM、0.04μM、0.04μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.04μM、0.04μM、0.08μM、0.08μM、0.02μM、0.02μM、0.08μM、0.08μM、0.02μM、0.02μM、0.04μM、0.04μM、0.04μM、0.04μM、0.02μM、0.02μM、0.08μM、0.08μM、0.12μM、0.12μM、0.02μM、0.02μM、0.08μM、0.08μM、0.16μM、0.16μM、0.04μM、0.04μM、0.24μM、0.24μM、0.08μM、0.08μM、0.24μM、0.24μM、0.05μM、0.05μM、0.08μM、0.08μM、0.12μM、0.12μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.16μM、0.16μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.16μM、0.16μM、0.12μM、0.12μM、0.08μM、0.08μM、0.24μM、0.24μM、0.12μM、0.12μM、0.04μM、0.04μM、0.16μM、0.16μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.12μM、0.12μM、0.24μM、0.24μM、0.12μM、0.12μM、0.12μM、0.12μM、0.08μM、0.08μM、0.04μM、0.04μM、0.08μM、0.08μM、0.32μM、0.32μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM、0.08μM和0.08μM。
6.如权利要求4或5所述复合扩增体系，其特征在于：所述复合扩增体系还包括进行PCR扩增反应所需的试剂；所述“进行PCR扩增反应所需的试剂”不包括PCR扩增反应所需的引物。
7.含有权利要求1至3任一所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为(h1)或(h2)或(h3)或(h4)：(h1)STR分型；(h2)常染色体STR分型；(h3)Y-STR分型；(h4)X-STR分型。
8.权利要求4至6任一所述复合扩增体系或权利要求7所述试剂盒的制备方法，包括将权利要求1至3任一所述引物组合中的各条引物单独包装的步骤。
9.权利要求1至3任一所述引物组合，或，权利要求4至6任一所述复合扩增体系，在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为(h1)或(h2)或(h3)或(h4)：(h1)STR分型；(h2)常染色体STR分型；(h3)Y-STR分型；(h4)X-STR分型。
10.权利要求1至3任一所述引物组合，或，权利要求4至6任一所述复合扩增体系，的应用，为(h1)或(h2)或(h3)或(h4)：(h1)STR分型；(h2)常染色体STR分型；(h3)Y-STR分型；(h4)X-STR分型。
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