CN111394407A - 一种γ-环糊精的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种γ‑环糊精的制备方法，属于环糊精制备技术领域，包括淀粉溶液、伽马环糊精葡萄糖基转移酶、有机溶剂在温度为50‑80℃，pH值为6.6‑7.2的体系下反应2‑5小时生成γ‑环糊精的步骤，其特征是，在反应体系中按照每克淀粉加入0.02‑0.2g咪唑溴盐类离子液体。试验表明，本发明通过加入咪唑类离子液体以及在特定缓冲液配合下能够显著增加γ‑环糊精的疏水性，从而促进γ‑环糊精与有机溶剂形成共沉淀，显著增加了γ‑环糊精的转化率。

Description

一种γ-环糊精的制备方法

技术领域

本发明涉及一种γ-环糊精的制备方法，属于环糊精生产技术领域。

背景技术

环糊精(Cyclodextrins，简称CD)，是由环糊精葡萄糖基转移酶(Glycosytransferase，简称CGTase)酶解淀粉或淀粉类似物产生的由D-吡喃型葡萄糖单体通过α-1，4-糖苷键连接而形成的一类环状低聚化合物。常见的有6、7、8个葡萄糖单元的分子，根据环中葡萄糖单元的数量，分别称为α-、β-和γ-环糊精。

三种环糊精中，γ-环糊精具有最大的环结构和最大的空腔，能够包合α-、β-环糊精不能包合的客体大分子且其水溶性高，对活性大分子的增溶效果更加明显，且毒性、刺激性小，安全性高。目前γ-环糊精的制备最大的问题是采用γ酶转化法时，其产率低导致其成本很高。根据申请人所知，目前报道的转化率最高在40％左右。

《CGTase合成γ-环糊精的酶促反应条件优化》(曹新志等《开发应用》2012年第2期)公开了一种γ-环糊精的制备方法，其采用环糊精糖基转移酶生产γ-环糊精，其最佳工艺为反应体系的pH8.0，温度60℃，环糊精糖基转移酶的酶量500U/g·淀粉，甘草酸浓度2％，淀粉的DE值6～11，在该条件下制备的产品得率最高；蕉藕淀粉和木薯淀粉在生产γ-环糊精时是环糊精糖基转移酶比较合适的底物；普鲁蓝酶对γ-环糊精的产量增加作用有限。

公开号为CN102827900A的中国发明专利公开了一种生物法生产γ-环糊精的生产工艺，采用来源于嗜碱芽胞杆菌(AlkalophilicBacillus clarkii7364)的γ-环糊精葡萄糖基转移酶生产γ-环糊精；按照10％的浓度进行淀粉调浆，在60-90℃条件下搅拌5-15分钟；设定温度40-60℃，调pH10.0左右后，按照每克淀粉1-10个单位的量加入γ-环糊精葡萄糖基转移酶，加入2-5％(w/v)的有机溶剂后，充分反应8-10小时；回收有机溶剂，采用结晶方法得到γ-环糊精。

其中，所述的有机溶剂为环十二酮。

公开号为CN109694417A的中国专利公开了一种简单高效的α-和γ-环糊精的纯化和回收方法，其通过以下步骤实现从环糊精混合物和包结物中将α-或γ-环糊精在有机溶剂中通过自组装结晶而得到分离和纯化：(1)将不同环糊精混合物或包结物溶解在特定有机溶剂中配置成溶液，过滤去除不溶解的杂质；(2)将上述滤液经高温处理，α-或γ-环糊精会逐渐结晶并从溶剂中沉淀下来，分离，干燥后获得高纯度的α-或γ-环糊精。其中，步骤1的有机溶剂为：N,N-二甲基甲酰胺，二甲基亚砜，乙腈等极性溶剂。

另外，根据申请人所知，现有技术中的有机溶剂还经常采用甲苯、酒精、正癸醇、丙酮等，也有报道采用混合的有机溶剂进行处理。

发明内容

本发明提供一种γ-环糊精的制备方法，其在γ-环糊精分离提取步骤采用离子液体-有机溶剂的混合体系，其转化率高、纯度好。

本发明具体采用的技术方案是：

一种γ-环糊精的制备方法，其特征是，包括如下步骤：

1)配置2.5-10wt％的淀粉溶液，其中淀粉选自玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、麦芽淀粉、支链淀粉或可溶性淀粉中的一种，优选的是，可溶性淀粉；

2)配置pH值为6.6-7.2的缓冲液；

本发明的缓冲液选自磷酸盐缓冲液、磷酸二氢钠柠檬酸缓冲液或柠檬酸钠缓冲液中的一种。

例如：磷酸盐缓冲液，可参照现有技术配置，例如：取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液50ml与0.2mol/L氢氧化钠溶液35ml，加纯化水稀释至200ml，即得pH值为7.2的磷酸盐缓冲液；

或者柠檬酸钠缓冲液，可参照现有技术配置pH为6.6的缓冲液，例如：取0.1mol/L的柠檬酸14ml，0.1mol/L的柠檬酸钠溶液186ml混合制得pH值为6.6的缓冲液。

3)淀粉溶液与缓冲液按照体积比1：1～1.5混合，加入5-8U/mg伽马环糊精葡萄糖基转移酶(γ-CGTase)，按照每克淀粉加入0.02-0.2g咪唑溴盐类离子液体，控制温度在50-80℃，搅拌，反应2-5小时；

优选的，如果选用柠檬酸钠缓冲液，首先将柠檬酸钠缓冲液升温至50℃，然后加入配量的伽马环糊精葡萄糖基转移酶，然后再与淀粉溶液混合。这样能充分发挥转移酶的特性。

4)加入反应液1-1.5倍体积的有机溶剂，搅拌混合，沸水浴灭酶，降温至30-35℃，加入柠檬酸调解反应液pH为6.0-6.2，过滤得滤饼；

其中，有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮中的一种。

5)用去离子水或纯化水冲洗滤饼2-4次，将滤饼置入溶解量的去离子水中，减压蒸馏除去有机溶剂，过滤得γ-环糊精水溶液；

步骤5)中，可加入螯合剂进一步去除钾、钠等金属离子。

本发明中的螯合剂为市售产品，主要目的是去除γ-环糊精水溶液可能过量的钠离子或/和钾离子，试验表明，多次冲洗滤饼可有效将金属离子控制在工艺范围之内。

6)浓缩γ-环糊精水溶液，低温结晶，得γ-环糊精。

其中，所述的咪唑类离子液体选自1-烷基-2，3-二甲基咪唑溴盐、1-烷基-3-甲基咪唑溴盐中的一种，其中，烷基为碳数为6以上的直链或支链烷基，例如：己基、辛基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基或十八烷基。

所述的咪唑类离子液体选自如下化学式中的一种：

一般认为，离子液体、无机盐类以及大分子有机物之间有复杂的相互作用，例如氢键、π键、静电、疏水等。

申请人发现，在本发明反应体系中，加入咪唑类离子液体与缓冲液中的磷酸盐或柠檬酸盐配合，在特定的温度、pH下能够显著增加γ-环糊精的疏水性，从而促进γ-环糊精与有机溶剂形成共沉淀，能显著增加γ-环糊精的转化率。

申请人的另一个发现是当侧链长度小于6时，无论如何调整温度、pH均不能有效提升转化率。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1)本发明的转化率高，在最优条件下，本发明γ-环糊精的转化率最高可达60％左右；

2)本发明添加的离子液体绿色无毒，可在反应过程中以沉淀的方式方便去除。

3)由于本发明添加了功能离子液体，促进γ-环糊精与有机溶剂共沉淀生成，因此，可选用分子量较小的有机溶剂。

具体实施方式

最佳实施例

步骤1)：配置5wt％的淀粉溶液，其中淀粉选自可溶性淀粉；根据申请人试验，淀粉溶液浓度最佳为5wt％，如果浓度大于10wt％或低于2.5wt％，其综合转化率在25％左右；

步骤2)：按照如下步骤配置pH值为6.6的缓冲液

取0.1mol/L的柠檬酸14ml，0.1mol/L的柠檬酸钠溶液186ml混合制得pH值为6.6的缓冲液。

步骤3)：淀粉溶液与缓冲液按照体积比1：1.5混合，加入5U/mg伽马环糊精葡萄糖基转移酶(γ-CGTase)，按照每克淀粉加入0.1g 1-十六烷基-2，3-二甲基咪唑溴盐，控制温度在70℃，搅拌，反应5小时；

步骤4)：加入反应液1倍体积的甲醇，搅拌混合，沸水浴灭酶，降温至35℃，加入柠檬酸调解反应液pH为6.0-6.2，过滤得滤饼；

步骤5)：用去离子水或纯化水冲洗滤饼3-4次，将滤饼置入溶解量的去离子水中，减压蒸馏除去甲醇，过滤得γ-环糊精水溶液；

本发明中，所述溶解量是指能够溶解生成γ-环糊精的水量，可根据工艺条件以及γ-环糊精的溶解度计算得出，一般只要大于γ-环糊精的饱和溶解度即可。

步骤6)：浓缩γ-环糊精水溶液，低温结晶，得γ-环糊精。

γ-环糊精含量分析：

采用现有技术的HPLC法对试验得到的γ-环糊精进行分析，分析条件可参照现有技术，例如采用德国电化学工业股份有限公司的条件进行含量分析。

结果表明，最佳实施例的γ-环糊精转化率为59.52％，综合转化率为65.01％。

对比例1：

其他条件同最佳实施例，只是步骤3)的离子液体选用1-丁基-2，3-二甲基咪唑溴盐，γ-环糊精转化率为34.69％。

对比例2：

其他条件同最佳实施例，只是步骤4)去除加柠檬酸调节pH步骤，γ-环糊精转化率为41.66％。

对比例3：

其他条件同最佳实施例，只是步骤4)过滤温度为45℃，γ-环糊精转化率为50.35％。

分析：

通过最佳实施例与对比例1-3对比表明：离子液体的侧链长度对γ-环糊精转化率影响极大，pH值过高以及过滤温度过高，均不同程度影响最终转化率。

Claims (9)

1.一种γ-环糊精的制备方法，包括淀粉溶液、伽马环糊精葡萄糖基转移酶、有机溶剂在温度为50-80℃，pH值为6.6-7.2的体系下反应2-5小时生成γ-环糊精的步骤，其特征是，在反应体系中按照每克淀粉加入0.02-0.2g咪唑溴盐类离子液体。

2.根据权利要求1所述的γ-环糊精的制备方法，其特征是，所述咪唑溴盐类离子液体选自1-烷基-2，3-二甲基咪唑溴盐、1-烷基-3-甲基咪唑溴盐中的一种，其中，烷基为碳数为6或6以上的直链或支链烷基。

3.根据权利要求2所述的γ-环糊精的制备方法，其特征是，所述烷基为己基、辛基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基或十八烷基中的一种。

4.根据权利要求1所述的γ-环糊精的制备方法，其特征是，所述咪唑溴盐类离子液体选自如下化学式中的一种：

5.根据权利要求1所述的γ-环糊精的制备方法，其特征是，所述γ-环糊精的制备方法，依此包括如下步骤：

1)配置2.5-10wt％的淀粉溶液；

2)配置pH值为6.6-7.2的缓冲液；

3)淀粉溶液与缓冲液按照体积比1：1～1.5混合，加入5-8U/mg伽马环糊精葡萄糖基转移酶(γ-CGTase)，按照每克淀粉加入0.02-0.2g咪唑溴盐类离子液体，控制温度在50-80℃，搅拌，反应2-5小时；

4)加入反应液1-1.5倍体积的有机溶剂，搅拌混合，沸水浴灭酶后降温至30-35℃，加入柠檬酸调解反应液pH为6.0-6.2，过滤得滤饼；

5)用去离子水或纯化水冲洗滤饼2-4次，将滤饼置入溶解量的去离子水中，减压蒸馏除去有机溶剂，过滤得γ-环糊精水溶液；

6)浓缩γ-环糊精水溶液，低温结晶，得γ-环糊精。

6.根据权利要求5所述的γ-环糊精的制备方法，其特征是，步骤1)所述淀粉选自玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、麦芽淀粉、支链淀粉或可溶性淀粉中的一种。

7.根据权利要求5所述的γ-环糊精的制备方法，其特征是，步骤2)所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、磷酸二氢钠柠檬酸缓冲液或柠檬酸钠缓冲液中的一种。

8.根据权利要求7所述的γ-环糊精的制备方法，其特征是，步骤2)所述缓冲液为pH值为7.2的磷酸盐缓冲液或者pH值为6.6的柠檬酸钠缓冲液。

9.根据权利要求5所述的γ-环糊精的制备方法，其特征是，步骤4)所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮中的一种。