CN111386952A - 一种栓皮栎菌根化苗木的培育方法 - Google Patents

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高晓磊
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张丽仔
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朱景乐
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    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor

Abstract

本发明公开的一种栓皮栎菌根化苗木的培育方法，包括以下步骤：1)育苗：于3～4月将筛选消毒后的栓皮栎种子播入已消毒的育苗基质中，培育20～40天，得到栓皮栎幼苗；2)施肥：将所得栓皮栎幼苗栽种于杀菌后的培养基质中，待栓皮栎幼苗侧根发达后，将生物菌肥施于栓皮栎幼苗根系附近；3)苗木管理：定期浇水除草，选择菌根发育良好的栓皮栎苗木进行大田定植。本发明提供的培育方法使栓皮栎苗木根系与真菌形成共生体系，增加了苗木根系与土壤的接触面积，有效解决了栓皮栎幼苗根系不发达的问题，能够提高苗木移植后的成活率。

Description

一种栓皮栎菌根化苗木的培育方法
技术领域
本发明涉及育苗技术领域，更具体地，涉及一种栓皮栎菌根化苗木的培育方法。
背景技术
栓皮栎(Quercus variabilis)是壳斗科栎属落叶乔木，是中国传统的经济林树种、水土保持树种和防火树种,果实富含淀粉，亦被称为“木本粮食”。我国栓皮栎分布极其广泛,其水平纬向分布北起辽宁南部南至云南省中部,分布的海拔上限自北向南不断升高,在北方多为海拔500～800m阳坡，而在云南可在海拔2000～3000m分布。栓皮栎木材为环孔材，边材淡黄色，心材淡红色，树皮木栓层发达，具有比重小、浮力强、弹性好、不透水、不透气、耐酸碱等优良特性,是中国生产软木的主要原料；壳斗、树皮富含单宁，可提取栲胶，种壳可制活性炭。栓皮栎用途广，综合利用价值高，发展前景广阔。
然而，随着全球温室效应、水资源的匮乏等环境问题，使得在丘陵山地造林生产中，特别是干旱贫瘠的土壤环境条件下，存在成活率低、苗木生长缓慢等问题。如何提高栓皮栎造林成活率、节约水肥资源尤为重要。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种栓皮栎菌根化苗木的培育方法，以解决现有技术中栓皮栎苗木在丘陵山地栽植成活率低的技术问题。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种栓皮栎菌根化苗木的培育方法，包括以下步骤：
1)育苗：于3～4月将筛选消毒后的栓皮栎种子播入已消毒的育苗基质中，培育20～40天，得到栓皮栎幼苗；
2)施肥：将所得栓皮栎幼苗栽种于杀菌后的培养基质中，待栓皮栎幼苗的主根系长8～10cm，侧根发达后，将生物菌肥施于栓皮栎幼苗根系附近；所述生物菌肥为马勃子实体经分离、纯化、培养得到的生物活性菌肥；
3)苗木管理：定期浇水除草，保持培养基质含水量30％～45％，培养温室温度保持在25℃～28℃，空气相对湿度60％～70％，空气流通，施肥后3～5个月，选择菌根发育良好的栓皮栎苗木进行大田定植。
优选的，步骤1)中，所述筛选消毒具体为对栓皮栎种子进行水选除去空瘪、病虫害的种子，用0.5％多菌灵溶液浸泡消毒10～15分钟；所述育苗基质为黄心土和泥炭按体积比2～3：1混合得到，所述育苗基质的消毒同样采用多菌灵进行杀菌消毒处理。
优选的，步骤2)中，所述培养基质为黄心土和草炭按体积比2～3：1混合得到，所述培养基质的pH为5.5～5.7，所述培养基质的杀菌处理为经太阳曝晒杀菌5～10天。
优选的，步骤2)中，每株栓皮栎幼苗施用10～15g生物菌肥。
优选的，步骤2)中，所述生物菌肥的制备方法具体为：
S1、采集马勃子实体，经消毒、解剖得到马勃组织块；
S2、将所得马勃子组织块接种至MMN培养基，培养皿用封口膜密封后，置于24～26℃温度下避光培养20～30天，获得纯化菌丝；
S3、将所得纯化菌丝接种在新的MMN培养基中，置于24～26℃温度下培养至菌丝长满平板，获得活化菌丝；
S4、挑选所得活化菌丝，接种至装有MMN培养基的培养瓶中，在摇床中振荡培养，振荡培养温度为25℃±0.5℃，转速为160～180r/min，暗培养20～30天，获得液体菌剂；
S5、将所得液体菌剂接种至灭菌后的固体培养基，在温度为25℃±0.5℃下，暗培养30～45天，获得固体菌剂，即生物活性菌肥，其中，所述固体培养基成分为草炭和蛭石按体积比2～3：1混合得到。
优选的，步骤S1中，所述消毒为用70％酒精消毒；所述解剖具体为用解剖刀将马勃子实体纵向切开，挑取黄豆粒大小的组织块。
优选的，步骤S2至步骤S4中，所述MMN培养基pH为5.5～5.7，包含以下组分：(NH4)2HPO4 0.25g/L，KH2PO40.5g/L,NaCl 0.025g/L,MgSO4·7H2O 0.15g/L,CaCl2 0.05g/L,Thiamine HCl 0.1mg/L,FeCl3·6H2O0.02g/L,Malt Extract 3g/L,Glucose 10g/L。
优选的，步骤S4中，每100ml MMN培养基接种3～6个由所述活化菌丝组成的直径为0.2～0.6cm的菌块。
优选的，步骤S5中，按照液体菌剂与固体培养基的体积质量比为1ml：20～30g的比例接种液体菌剂。
本发明的有益效果为：
通过本发明提供的培育方法获得的栓皮栎菌根化苗木，增加了苗木根系与土壤的接触面积，有效解决了栓皮栎幼苗根系不发达的问题，能够提高栓皮栎苗木栽植的成活率和促进苗木生长，节约水肥资源；可增强苗木对磷等矿质元素的吸收，提高养分利用率；改善苗木根际环境，提高苗木抗逆性；可减少化肥的施用量，能够缓解因过量施肥而导致的土壤污染和N、P过多导致的水体富营养化问题，高效环保；可实现栓皮栎菌根化苗木的规模化、产业化生产，具有显著的社会效益、经济效益和生态效益。
附图说明
图1是本发明实施例1中栓皮栎施生物菌肥与未施生物菌肥的苗木生长对比图；
图2是发明实施例2中栓皮栎施生物菌肥与未施生物菌肥的苗木生长对比图；
图3是栓皮栎施生物菌肥形成菌根的形态图；其中，图A为实施例1接种菌根形态，B为实施例1未接种根系形态；C为实施例2接种菌根形态；D为实施例2未接种根系形态；
图4为实施例1中栓皮栎施生物菌肥与未施生物菌肥苗木根系对比图。
具体实施方式
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1
S1、培育栓皮栎幼苗
将黄心土和泥炭进行多菌灵杀菌消毒处理，按体积比2：1进行装盆；对栓皮栎种子进行水选除去空瘪、病虫害的种子，用0.5％多菌灵溶液浸泡消毒10～15分钟；栓皮栎种子为北京市种源栓皮栎；4月播种，将经过挑选的饱满栓皮栎种子横向播种至盆装基质5cm深处，放在温室培养1个月，待其长成均匀一致的幼苗。
S2、制备生物菌肥
首先于湖南省浏阳市板栗人工林采集获得马勃子实体，在无菌操作台将马勃子实体用70％酒精消毒，用解剖刀将子实体纵向切开，挑取黄豆粒大小的组织块，接种至MMN培养基，培养皿用封口膜密封后，放置于25℃恒温培养箱避光培养20～30天，培养获得纯化菌丝。将所述菌丝接种在新的MMN培养基中，在25℃下培养至菌丝长满平板，获得活化菌丝；挑取经活化的菌落边缘的菌块，菌块大小为直径0.4cm圆形，加入装有50ml MMN培养基的三角瓶中；其中，MMN培养基包含以下组分：(NH4)2HPO4 0.25g/L，KH2PO40.5g/L,NaCl 0.025g/L,MgSO4·7H2O 0.15g/L,CaCl2 0.05g/L,Thiamine HCl 0.1mg/L,FeCl3·6H2O0.02g/L,MaltExtract 3g/L,Glucose 10g/L；且MMN培养基pH为5.5～5.7；每瓶接种2块菌块，将三角瓶放置在摇床中震荡培养，温度设置为25℃±0.5℃下，转速为180r/min，暗培养30天，获得液体菌剂。每瓶液体菌剂接种固体菌剂5瓶。接种至高温灭菌的固体培养基，固体培养基成分为草炭(Klasmann,德国)和蛭石按体积比2:1混合；每瓶固体培养基为250g，并添加MMN营养液50ml，置于培养箱内暗培养30～45天，将培养温度设置为25℃±0.5℃，获得含马勃的生物菌肥。
S3、幼苗进行施菌肥处理
将北京种源栓皮栎幼苗分为生物菌肥组和不施生物菌肥组(CK),栽种于培养基质中；培养基质为黄心土、草炭(Klasmann,德国)按2:1的体积比混合，培养基质的pH在5.5～5.7，且经太阳曝晒杀菌约7天后装盆；待北京种源栓皮栎幼苗主根系长8～10cm，侧根发达后，生物菌肥组开始施肥；将含有马勃的生物菌肥施埋于幼苗根系附近，每株10～15g。CK组不施该菌肥。每组处理20～30株，两次重复。
S4、施肥后苗木管理
施肥后保持培养基质含水量30％～45％，培养温室温度保持在25～28℃，空气相对湿度60％～70％，保持空气流通。每周用蒸馏水浇灌1～2次，夏季2～3天一次。同时每周人工除草，防止杂草滋生。施肥4个月后，根据菌根发育情况，选择菌根发育良好的栓皮栎苗木进行大田定植即可。
在施肥4个月后，调查苗木侵染率。用游标卡尺和直尺测量苗高和地径，对比苗木生长状态，参见图1。采用体式显微镜观察菌根形态结构，参见图3中的A图和B图。取新鲜栓皮栎叶片，研磨后溶于乙醇比色测量叶绿素浓度。采用英国Hansatech公司产FMS2型荧光仪于晴天上午9:00～11:00进行叶绿素荧光参数测定。对比根系生长状况，参见图4。利用根系扫描仪测定菌根苗和非菌根栓皮栎苗木根系体积和表面积，测定结果如下表1所示。
实施例2
S1、培育栓皮栎幼苗
将黄心土和泥炭进行多菌灵杀菌消毒处理，按体积比2：1进行装盆；对栓皮栎种子进行水选除去空瘪、病虫害的种子，用0.5％多菌灵溶液浸泡消毒10～15分钟；栓皮栎种子为河南省种源栓皮栎；4月播种，将经过挑选的饱满栓皮栎种子横向播种至盆装基质5cm深处，放在温室培养1个月，待其长成均匀一致的幼苗。
S2、制备生物菌肥
首先于湖南省浏阳市板栗人工林采集获得马勃子实体，在无菌操作台将马勃子实体用70％酒精消毒，用解剖刀将子实体纵向切开，挑取黄豆粒大小的组织块，接种至MMN培养基，培养皿用封口膜密封后，放置于25℃恒温培养箱避光培养20～30天，培养获得纯化菌丝；将所述菌丝接种在新的MMN培养基中，在25℃下培养至菌丝长满平板，获得活化菌丝；挑取经活化的菌落边缘的菌块，菌块大小为直径0.4cm圆形，加入装有50ml MMN培养基的三角瓶中；其中，MMN培养基包含以下组分：(NH4)2HPO4 0.25g/L，KH2PO40.5g/L,NaCl 0.025g/L,MgSO4·7H2O 0.15g/L,CaCl2 0.05g/L,Thiamine HCl 0.1mg/L,FeCl3·6H2O0.02g/L,MaltExtract 3g/L,Glucose 10g/L；且MMN培养基pH为5.5～5.7；每瓶接种2块菌块，将三角瓶放置在摇床中震荡培养，温度设置为25℃±0.5℃下，转速为160r/min，暗培养30天，获得液体菌剂。每瓶液体菌剂接种固体菌剂5瓶。接种至高温灭菌的固体培养基，固体培养基成分为草炭(Klasmann,德国)和蛭石按体积比2:1混合；每瓶固体培养基为250g，并添加MMN营养液50ml，置于培养箱内暗培养30～45天，将培养温度设置为25℃±0.5℃，获得含马勃的生物菌肥；
S3、幼苗进行施菌肥处理
将河南种源栓皮栎幼苗分为生物菌肥组和不施生物菌肥组(CK),栽种于培养基质中；培养基质为黄心土、草炭(Klasmann,德国)按2:1的体积比混合，培养基质的pH在5.5～5.7，且经太阳曝晒杀菌约7天后装盆；待河南种源栓皮栎幼苗主根系长8～10cm，侧根发达后，生物菌肥组开始施肥；将含有马勃的生物菌肥施埋于幼苗根系附近，每株10～15g。CK组不施该菌肥。每组处理20～30株，两次重复。
S4、施肥后苗木管理
施肥后保持培养基质含水量30％～45％，培养温室温度保持在25～28℃，空气相对湿度60％～70％，保持空气流通。每周用蒸馏水浇灌1～2次，夏季2～3天一次。同时每周人工除草，防止杂草滋生。施肥4个月后，根据菌根发育情况，选择菌根发育良好的栓皮栎苗木进行大田定植即可。
在施肥4个月后，调查苗木侵染率。定期用游标卡尺和直尺定期测量苗高和地径，对比苗木生长状态，参见图2。采用体式显微镜观察菌根形态结构，参见图3中的C图和D图。取新鲜栓皮栎叶片，研磨后溶于乙醇比色测量叶绿素浓度。采用英国Hansatech公司产FMS2型荧光仪于晴天上午9:00～11:00进行叶绿素荧光参数测定。利用根系扫描仪测定菌根苗和非菌根栓皮栎苗木根系体积和表面积，测定结果如下表1所示。
表1不同种源栓皮栎施菌肥与未施菌肥的苗木生长情况的结果
Figure BDA0002424877560000081
根据表1结果显示，本发明的生物菌肥施入栓皮栎幼苗后，菌根侵染率在80％以上，可以显著的提高苗木的苗高、地径及叶绿素含量，光合作用效率显著提高，极大促进了根系生长。有效解决了栓皮栎幼苗根系不发达的问题，能够提高苗木移植后的成活率，可大规模应用于栓皮栎苗木丘陵山地造林。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种栓皮栎菌根化苗木的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)育苗：于3～4月将筛选消毒后的栓皮栎种子播入已消毒的育苗基质中，培育20～40天，得到栓皮栎幼苗；
2)施肥：将所得栓皮栎幼苗栽种于杀菌后的培养基质中，待栓皮栎幼苗的主根系长8～10cm，侧根发达后，将生物菌肥施于栓皮栎幼苗根系附近；所述生物菌肥为马勃子实体经分离、纯化、培养得到的生物活性菌肥；
3)苗木管理：定期浇水除草，保持培养基质含水量30％～45％，培养温室温度保持在25℃～28℃，空气相对湿度60％～70％，空气流通，施肥后3～5个月，选择菌根发育良好的栓皮栎苗木进行大田定植。
2.根据权利要求1所述的栓皮栎菌根化苗木的培育方法，其特征在于，步骤1)中，所述筛选消毒具体为对栓皮栎种子进行水选除去空瘪、病虫害的种子，用0.5％多菌灵溶液浸泡消毒10～15分钟；所述育苗基质为黄心土和泥炭按体积比2～3：1混合得到，所述育苗基质的消毒同样采用多菌灵进行杀菌消毒处理。
3.根据权利要求1所述的栓皮栎菌根化苗木的培育方法，其特征在于，步骤2)中，所述培养基质为黄心土和草炭按体积比2～3：1混合得到，所述培养基质的pH为5.5～5.7，所述培养基质的杀菌处理为经太阳曝晒杀菌5～10天。
4.根据权利要求1所述的栓皮栎菌根化苗木的培育方法，其特征在于，步骤2)中，每株栓皮栎幼苗施用10～15g生物菌肥。
5.根据权利要求1所述的栓皮栎菌根化苗木的培育方法，其特征在于，步骤2)中，所述生物菌肥的制备方法具体为：
S1、采集马勃子实体，经消毒、解剖得到马勃组织块；
S2、将所得马勃子组织块接种至MMN培养基，培养皿用封口膜密封后，置于24～26℃温度下避光培养20～30天，获得纯化菌丝；
S3、将所得纯化菌丝接种在新的MMN培养基中，置于24～26℃温度下培养至菌丝长满平板，获得活化菌丝；
S4、挑选所得活化菌丝，接种至装有MMN培养基的培养瓶中，在摇床中振荡培养，振荡培养温度为25℃±0.5℃，转速为160～180r/min，暗培养20～30天，获得液体菌剂；
S5、将所得液体菌剂接种至灭菌后的固体培养基，在温度为25℃±0.5℃下，暗培养30～45天，获得固体菌剂，即生物活性菌肥，其中，所述固体培养基成分为草炭和蛭石按体积比2～3：1混合得到。
6.根据权利要求5所述的栓皮栎菌根化苗木的培育方法，其特征在于，步骤S1中，所述消毒为用70％酒精消毒；所述解剖具体为用解剖刀将马勃子实体纵向切开，挑取黄豆粒大小的组织块。
7.根据权利要求5所述的栓皮栎菌根化苗木的培育方法，其特征在于，步骤S2至步骤S4中，所述MMN培养基pH为5.5～5.7，包含以下组分：(NH4)2HPO4 0.25g/L，KH2PO40.5g/L,NaCl0.025g/L,MgSO4·7H2O 0.15g/L,CaCl2 0.05g/L,Thiamine HCl 0.1mg/L,FeCl3·6H2O0.02g/L,Malt Extract 3g/L,Glucose 10g/L。
8.根据权利要求5所述的栓皮栎菌根化苗木的培育方法，其特征在于，步骤S4中，每100ml MMN培养基接种3～6个由所述活化菌丝组成的直径为0.2～0.6cm的菌块。
9.根据权利要求5所述的栓皮栎菌根化苗木的培育方法，其特征在于，步骤S5中，按照液体菌剂与固体培养基的体积质量比为1ml：20～30g的比例接种液体菌剂。
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