CN111386348A - 用于制备高表达和高性能靶蛋白的表达盒及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及靶蛋白的表达盒、表达载体和转化体，表达盒包含启动子、编码该靶蛋白的多核苷酸、内含子序列和poly A序列。根据本发明的用于靶蛋白的表达盒能够通过一次转导同时进行内含子序列和靶蛋白的表达，并表现出通过调节内源基因的表达来诱导靶蛋白的高表达和高性能。

Description

用于制备高表达和高性能靶蛋白的表达盒及其用途
技术领域
本发明涉及用于制备高表达和高性能靶蛋白的表达盒及其用途。
背景技术
动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，工业上广泛应用于重组蛋白的生产，尤其是治疗性蛋白质，例如抗体。使用哺乳动物细胞(如CHO细胞)产生的蛋白质经过翻译后修饰，然后进行糖基化，以实现完整的生物学活性。
尽管与过去相比，表达载体、表达方法、培养技术等方面都有改进，使得用哺乳动物细胞(如CHO细胞)生产重组蛋白能够高浓度生产，但是需要使用昂贵的培养基，而且细胞的生长速率很慢，导致与使用微生物或酵母的生产相比，生产成本高。因此，在使用哺乳动物细胞生产重组蛋白时，从商业角度出发，有必要尽可能地提高生产能力。
而且，当使用调节了特定内源基因的表达的动物细胞系生产重组蛋白，特别是治疗性抗体时，可以非常有效地用于提高生产能力或治疗效果并扩大治疗范围。
例如，据报道，对于IgG型治疗性抗体，当连接至Fc区天冬酰胺297的聚糖中不存在岩藻糖时，自然杀伤细胞与抗体Fc区受体的结合力就会增强，从而增加抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)(Shields，RL et al.，The Journal of Biological Chemistry，277(30)，26733-26740，2002)。因此，当抑制将岩藻糖附着于抗体的Fc区域的天冬酰胺297的酶时，可以产生具有高抗体依赖性细胞毒性的治疗性抗体。
为了提高重组蛋白的生产率并控制其质量，存在一种调节特定内源基因表达的方法。抑制内源基因表达的方法的实例可包括由于同源重组引起的基因敲除(Yamane-Ohnuki，N.等人，Biotechnology and Bioengineering，87(5)，614-622，2004)、RNA干扰包括使用具有与目标基因的mRNA互补的序列的RNA的目标基因的mRNA分解(Mori，K.等人，Biotechnology and Bioengineering，88(7)，901-908，2004)，等等。增加内源基因表达的方法可以包括通过转录具有强启动子的特定内源基因诱导高表达的方法。此外，已知从非编码DNA转录的小分子RNA(miRNA)具有调节蛋白质翻译的生物学功能，因此被报道为调节细胞功能和命运的新调节剂，并且已经有研究结果报道，为了控制细胞增殖和死亡，可使用此类miRNA在转录后调控过程中调控内源基因的表达(Amelia Cimmino et al，PNAS，102(39)，13944-13949，2005)。
为了通过上述方法调节特定内源基因的表达，需要具有能够调节特定内源基因的遗传信息的表达载体，并且应该选择通过向动物细胞转染，内源基因稳定增加或被抑制的细胞系。为了选择这样的细胞系，具有内源基因调控信息的载体还包括选择标记的遗传信息。首先制备特定内源基因表达被调节的细胞系，然后另外用表达载体转染以表达重组蛋白，然后使用不同类型的选择标记从包含在载体中的重组蛋白中选择重组蛋白来调节特定内源基因的表达。由于此过程的复杂性，在同时调节多个内源基因表达的同时生产重组蛋白更加困难。
作为增加重组蛋白生产力的另一种方法，可以使用内含子结构。内含子是在真核细胞中发现的序列，是在将通过RNA聚合酶转录的前体mRNA(pre-mRNA)通过剪接过程加工成成熟RNA的过程中除去的序列。已经有报道指出，通过使用内含子诱导的剪接过程可以增强蛋白表达(Herve’Le Hir.等人，Trends in Biochemical Sciences，28(4)，215-220，2003)。
因此，为了克服在同时调节多个内源基因时出现的现有困难，本发明人已经发明了一种载体，在该载体中内含了调控内源基因表达的短发夹RNA(shRNA)序列，目标重组蛋白序列通过单个启动子转录并表达，从而最终完成本发明，其能够通过一次转染来调节多个内源基因的表达，从而诱导重组蛋白的高表达和高性能。
发明内容
技术问题
常规的内源基因表达调节和靶蛋白产生，使用各自的表达盒，使得难以选择细胞系和适当地调节内源基因的表达。
本发明的目的是提供一种靶蛋白表达盒，其包括启动子、编码该靶蛋白的多核苷酸、内含子RNA序列和poly A序列，以产生高表达和高性能目标蛋白。
本发明的另一个目的是提供一种载体，其包括用于产生靶蛋白的表达盒。
本发明的又一个目的是提供包含用于产生靶蛋白的表达盒的转化体。
本发明的又一个目的是提供一种制备靶蛋白的方法，该方法包括培养包含表达盒的转化体以产生靶蛋白。
技术方案
本发明提供了用于产生靶蛋白的表达盒，其是包括启动子、编码靶蛋白的多核苷酸、内含子RNA序列和poly A序列的靶蛋白表达盒，其中内含子RNA序列包括剪接供体、分支和剪接受体。
在本发明的一个实施方案中，靶蛋白可以是抗体或其部分片段。
在本发明的一个实施方案中，至少一个内含子RNA序列存在于单个靶蛋白表达盒上。
在本发明的一个实施方案中，表达盒可以包括选自以下的至少一种内含子RNA序列：
a)至少一个位于启动子和编码靶蛋白的多核苷酸之间的内含子RNA序列；b)至少一个位于编码靶蛋白的多核苷酸和poly A之间的内含子RNA序列；c)至少一个位于启动子和编码靶蛋白的多核苷酸之间的内含子RNA序列和至少一个位于编码靶蛋白的多核苷酸和polyA之间的内含子RNA序列。
在本发明的一个实施方案中，内含子RNA序列可以进一步包括用于靶基因表达调节的RNA序列。
(在本发明的一个实施方案中，靶基因可以是选自以下的至少一种：FUT8(Alpha-1,6-fucosyltransferase)(α-1,6-岩藻糖基转移酶)、HDAC5(Histone Deacetylase 5),(组蛋白脱乙酰基酶5)、LDHA(Lactate dehydrogenase A)(乳酸脱氢酶A)、CXCR4(C-X-Cchemokine receptor type 4)(CXC趋化因子受体4型)、DHFR(Dihydrofolate reductase)(二氢叶酸还原酶)、PDK4(Pyruvate dehydrogenase lipoamide kinase isozyme 4)(丙酮酸脱氢酶脂酰胺激酶同工酶4)、MAPK3(Mitogen-activated protein kinase 3)(丝裂原活化蛋白激酶3)、KANK4(KN Motif And Ankyrin Repeat Domains 4)(KN基序和锚蛋白重复结构域4)、PDI(Protein disulfide isomerase)(蛋白质二硫键异构酶)、CNX(Calnexin)(钙连蛋白)、CRT(Calreticulin)(钙网蛋白)、elF2α(Non-phosphorylatable version ofthe eukaryotic translation initiation factor2alpha)(真核翻译起始因子2α的非磷酸化版本)、ZFP-TF(Artificial zinc finger protein transcription factor)(人工锌指蛋白转录因子)、ATF4(Activating transcription factor 4)(激活转录因子4)、GADD34(Growth arrest and DNA damage inducible protein 34)(生长抑制和DNA损伤诱导蛋白34)、mTOR(Mammalian target of rapamycin)(哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白)、BIP(Heatshock 70kDa protein 5)(热休克70kDa蛋白5)、ATF6C(Activating transcriptionfactor 6C)(激活转录因子6C)、XBP1(X-box binding protein 1)(X-盒结合蛋白1)、BCL2(B-cell lymphoma 2)(B-细胞淋巴瘤2)、BCLxL(BCL2-like 1)(BCL2-样1)、BCLxL的变异形式(Asp29Asn variant)(Asp29Asn变体)、XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis)(X连锁凋亡抑制剂)、XIAP突变体(EAX197)、AVEN(Apoptosis,caspase inhibitor)(凋亡、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂)、C-MYC(Myelocytomatosis oncogene)(骨髓细胞增生癌基因)、FAIM(Fas apoptotic inhibitory molecule)(Fas凋亡抑制分子)、30Kc6(Apoptosis-inhibiting 30K protein)(抑制凋亡的30K蛋白)、TERT(Telomerase reversetranscriptase)(端粒酶反转录酶)、E1B-19K(Control protein E1B 19K)(对照蛋白E1B19K)、MDM2(Murine double-mutant 2)(鼠双突变2)、E2F1(E2F transcription factor1)(E2F转录因子1)、HSP27(Heat shock proteins 27)(热激蛋白27)、HSP70(Heat shockproteins 70)(热激蛋白70)、MCL1(Myeliod cell leukemia 1)(骨髓细胞白血病1)、AKT1(RAC-alpha serine/threonineprotein kinase)(RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)、Beclin-1、ST6GAL(Alpha 2,6sialyltransferase)(α-2,6唾液酸转移酶)、GnT-IV(Alpha-1,3-D-mannoside beta 1,4Nacetylglucosaminyltransferase)(α-1,3-D-甘露糖苷β-1,4N-乙酰葡萄糖胺基转移酶)、GnT-V(alpha 1,6Dmannoside beta-1,6Nacetylglucosaminyltransferase),ST3GAL(Alpha 2,3sialyltransferase)(α-1,6甘露糖苷β-1,6N乙酰氨基葡萄糖转移酶)、ST3GAL(Alpha 2,3sialyltransferase)(α-2,3唾液酸转移酶)、GalT(beta 1,4galactosyltransferase)(β-1,4半乳糖基转移酶)、CMP-SAT(CMP-sialic acid transporter)(CMP唾液酸转运蛋白)、CMP-SAS(CMP-sialic acidsynthetase)(CMP-唾液酸合成酶)、GNE(Mutant uridine diphosphate-N-acetylglucosamine 2-epimerase)(突变型尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡糖2-差向异构酶)、GnT-III(Beta 1,4Nacetylglucosaminyltransferase III)(β-1,4N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶III)、ManII(Golgi alphamannosidase II)(高尔基α-甘露糖苷酶II)、C2GnT(Beta 1,6Nacetylglucosaminyltransferase)(β-1，6N乙酰基氨基葡萄糖氨基转移酶)、RMD(GDP-6-deoxy-d-lyxo-4-hexulose reductase)(GDP-6-脱氧-d-lyxo-4-己糖还原酶)、VHb(Vitreoscilla hemoglobin)(玻璃藻血红蛋白)、CPS I(Carbamoyl phosphatesynthetase I)(氨基甲酸酯磷酸合成酶I)、OTC(Ornithine transcarbamoylase)(鸟氨酸转氨甲酰酶)、PC(Pyruvate carboxylase)(丙酮酸羧化酶)、GLUT5(Glucose transporterprotein 5)(葡萄糖转运蛋白5)、MDH2(Malate dehydrogenase II)(苹果酸脱氢酶II)、TAUT(Taurine transporter)(牛磺酸转运蛋白)、ALT1(Alanine aminotransferase 1)(丙氨酸转氨酶1)、XBP1(X-box binding protein 1)(X-盒结合蛋白1)、XBP1s(Spliced formof XBP-1)(XBP-1的剪接形式)、SLY1(Suppressor of loss of YPT1 protein 1)(缺失YPT1蛋白1的抑制子)、MUNC18C(syntaxin binding protein 3)(突触融合蛋白结合蛋白3)、CERT(Ceramide transfer protein)(神经酰胺转移蛋白)、CERT的突变形式(S132A)、SNAP-23(Synaptosome-associated protein of 23kDa)(23kDa的突触体相关蛋白)、VAMP8(Vesicle-associated membrane protein 8)(囊泡相关的膜蛋白8)、SRP14(Humansignaling receptor protein 14)(人类信号受体蛋白14)、p21CIP1(Cyclin-dependentkinase Inhibitor 1A)(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A)、C/EBP-α(CCAAT/enhancer-binding protein alpha)(CCAAT/增强子结合蛋白α)、p27KIP1(Cyclin-dependent kinaseinhibitor1B)(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B)、CDKL3(Cyclin-dependent kinaselike 3)(细胞周期蛋白依赖性激酶3)、COX15(Cytochrome c oxidase subunit)(细胞色素c氧化酶亚基)、VCP(Valosin-containing protein)(含缬氨酸的蛋白)、BAX(BCL2-associated X protein)(BCL2相关的X蛋白)、BAK(BCL2-antagonist/killer)(BCL2拮抗剂/杀伤因子)、GS(Glutamine synthetase)(谷氨酰胺合成酶)、MGAT1(N-acetylglucosaminyltransferase 1)(N-乙酰氨基葡萄糖转移酶1)、SLC35C1(GDP-fucosetransporter)(GDP-岩藻糖转运蛋白)、SLC35A1(CMPsialic acid transporter)(CMP唾液酸转运蛋白)、B4GALT1(Beta 1,4galactosyltransferase 1)(β-1,4半乳糖基转移酶1)、B3GNT2(Beta 1,3Nacetylglucosaminyltransferase 2)(β-1,3N-乙酰葡萄糖胺酶)、PAM(Peptidylglycine alphaamidating monooxygenase)(肽基甘氨酸α酰胺化单加氧酶)、Caspase 3(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3)、Caspase 7(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶7)、Caspase8(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8)、Caspase 9(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9)、ALG2(Alpha-1,3/1,6-mannosyltransferase)(α-1,3/1,6-甘露糖基转移酶)、REQ(Requiem)、FADD(Fas(TNFRSF6)-associated via death domain)(Fas(TNFRSF6)-死亡结构域相关蛋白)、FAIM(Fas apoptotic inhibitory molecule)(Fas凋亡抑制分子)、NEU2(Sialidase2)(唾液酸酶2)、NEU1(Sialidases 1)(唾液酸酶1)、NEU3(Sialidases 3)(唾液酸酶3)、GMD(GDP-fucose 4,6-dehydratase)(GDP-岩藻糖4,6脱水酶)、GFT(GDP-fucose transporter)(GDP-岩藻糖转运蛋白)、CFL1(Cofilin)(肌动蛋白)、ATR((Ataxia telangiectasia and Rad3related)共济失调毛细血管扩张和Rad3相关蛋白)、ENO1(Enolase 1)(烯醇酶1)和PDHK(Pyruvate dehydrogenase kinase)(丙酮酸脱氢酶激酶)。
在本发明的一个实施方案中，用于靶基因表达调节的内含子RNA序列可以是选自以下至少一种序列：shRNA(short hairpin RNA)(短发夹RNA)、miRNA(micro RNA)、stRNA(small temporal RNA)(小时序RNA)、siRNA(small interfering RNA)(小分子干扰RNA)、piRNA(piwi-interacting RNA)(与Piwi蛋白相作用的RNA)、snoRNA(small nucleolarRNA)(核仁小分子RNA)、snRNA(small nuclear RNA)(核内小分子RNA)、exRNA(extracellular RNA)(细胞外RNA)、scaRNA(small cajal body RNA)(小鼻腔体RNA)、lncRNA(long non-coding RNA)(长链非编码RNA)、smRNA(small modulatory dsRNA(调节性小dsRNA)和snRNA(small noncoding RNA)(非编码小RNA)。
在本发明的一个实施方案中，用于靶基因表达调节的shRNA序列可以是选自以下至少一种：由序列SEQ ID NO：24表示的内含子FUT8 shRNA、由SEQ ID NOS：25至27中的任何一个序列表示的内含子HDAC5(组蛋白脱乙酰基酶5)shRNA、由SEQ ID NOS：28至30中任一个序列表示的内含子LDHA(乳酸脱氢酶A)shRNA和由SEQ ID NOS：31-33中任何一个序列表示的的内含子DHFR(二氢叶酸还原酶)shRNA。
在本发明的一个实施方案中，用于靶基因调节的内含子miRNA序列可以是由SEQID NO：34至36中的任一个序列表示的miR483。
在本发明的一个实施方案中，剪接供体序列可以是选自序列SEQ ID NOS：12-15中的至少一个，分支序列可以是选自序列SEQ ID NOS：16-18中的至少一个，剪接受体序列可以是选自序列SEQ ID NOS：19-22的至少一个。
在本发明的一个实施方案中，用于生产靶蛋白的表达盒可以具有选自以下的至少一种作用：通过内含子剪接或内源基因表达调节，靶蛋白的表达增加、乳酸生成的抑制、组蛋白脱乙酰化的调节、调节葡萄糖代谢，调节细胞生长、调节细胞增殖、增加靶蛋白的功能以及，降低靶蛋白的岩藻糖含量。
另外，本发明提供了一种载体，该载体包括用于产生靶蛋白的表达盒。
另外，本发明提供了转化体，其通过包含表达盒的载体转化以产生靶蛋白。
在本发明的一个实施方案中，转化体可以是真核细胞。
另外，本发明提供了一种制备靶蛋白的方法，该方法包括培养包含表达盒的转化体以产生靶蛋白。
有益效果
根据本发明，靶蛋白表达盒可以通过单次转染同时表达内含子序列和靶蛋白，并且具有通过调节内源基因表达来诱导靶蛋白的高表达和高性能的作用。另外，根据本发明提供一种表达载体，使得靶蛋白和内含子序列通过单个启动子转录连接，因此，即使当仅通过检查靶蛋白的表达选择细胞系时，可以有效地选择内含子序列转录有效的细胞系。
附图说明
图1示意性地示出了基于本发明原理的包括内含子shRNA/miRNA的重组蛋白表达盒的结构，其中shRNA/miRNA和重组蛋白在转染入细胞后通过内含子剪接过程制备；
图2示意性地显示了无内含子的重组蛋白(抗体)表达载体(对照)，包含无内源基因调控功能的内含子序列(IS)的抗体表达载体和包含用于内源基因调控的内含子shRNA/miRNA的抗体表达载体；
图3是表示用包含用于HDAC5调节的内含子shRNA的抗体表达载体转染后，通过定量RT-PCR法对shRNA调节的HDAC5的mRNA的量进行测定的结果的图。
图4是表示用包含用于LDHA调节的内含子shRNA的抗体表达载体转染后，通过定量RT-PCR法对shRNA调节的LDHA的mRNA量进行测定的结果的图。
图5是显示在用包含用于DHFR调节的内含子shRNA的抗体表达载体转染后，使用定量RT-PCR法测定shRNA调节的DHFR的mRNA量的结果的图。
图6是表示在将包含内含子miR483的抗体表达载体转染后，使用定量RT-PCR法测定由miR483调节的CXCR4的mRNA的量的结果的图。
图7是表示用包含内含子miR483的抗体表达载体转染后，通过定量RT-PCR法测定由miR483调节的PDK4的mRNA的量的结果的图。
图8是显示在用无内含子的抗体表达载体(对照)、包括没有内源基因调控功能的内含子序列(IS)的抗体表达载体和包括用于内源基因调节的内含子shRNA/miRNA的抗体表达载体在转染后通过瞬时表达在短时间内抗体产生水平的比较结果的图。
图9是显示通过用无内含子的抗体表达载体(对照)和包括用于内源基因调节的内含子shRNA/miRNA的抗体表达载体转染分别制备稳定细胞系后的抗体产生水平的测定结果的图。
图10是表示用包含用于DHFR调节的内含子shRNA的抗体表达载体转染后，使用甲氨蝶呤(mTX)选择的稳定细胞系的测定结果的图。
图11a至11f显示了在用包含用于内源基因调节的内含子shRNA的抗体表达载体转染后，使用Bio-LC分析在稳定细胞系中产生的抗体的多糖的分析结果(a：对照，b：包括FUT8内含子shRNA的测试组)，c：包括两个FUT8内含子shRNA的测试组，d：包括HDAC5和FUT8shRNA的测试组，e：包括LDHA和FUT8 shRNA的测试组，f：包括miR483miRNA和FUT8 shRNA的测试组)；和
图12是表示在通过包括用于内源基因调节的内含子shRNA/miRNA的抗体表达载体转染制备稳定的细胞系后，通过定量RT-PCR法测定内源基因的mRNA量的结果的图(a：HDAC5，b：LDHA，c：CXCR4，d：PDK4)。
具体实施方式
本发明涉及用于产生包括启动子的高表达和高性能靶蛋白的表达盒及其用途。
根据本发明，表达载体可以通过单次转染同时表达内含子序列和目的重组蛋白，并且通过调节内源基因的表达来诱导重组蛋白的高表达和高性能。此外，根据本发明，还提供表达载体，使得重组蛋白和shRNA序列通过单个启动子转录连接，因此，即使当仅通过检查重组蛋白的表达选择细胞系时，也可能有效地选择其中的shRNA转录是有效的细胞系。
此外，根据本发明的表达载体具有通过单次转染调节多个内源基因的作用。
当使用根据本发明的表达载体制备抗体作为靶蛋白时，内含子shRNA序列可能抑制糖基化相关基因(例如，FUT8)的表达，从而制备具有岩藻糖糖基化被抑制的抗体。可选择的，内含子shRNA序列可抑制凋亡相关基因的表达，从而提高抗体的产生水平。
为了更容易地理解本发明的内容，下面定义在本发明使用的术语。
“靶蛋白”是指要产生的蛋白。
“内含子RNA序列”是指在DNA转录成mRNA过程中作为内含子除去的部分的RNA序列。它包括、剪接供体、剪接受体和分支。通常，剪接供体具有特定序列，例如AG_GTRAGT(R：A或G)，剪接受体具有特定序列，例如YYYYYYYYYYNCAG_G(Y：C或T；N：A、G、C或T)，分支具有特定的序列，例如YTRAC。除这些序列外，还包括所有可能剪接的序列。内含子RNA序列本身可能起作用或可能不起作用。
“Poly A序列”是指位于3'mRNA末端的腺苷酸的连续序列。
“剪接供体”和“剪接受体”是允许进行剪接过程的序列，剪接供体位于内含子的5'位置，剪接受体位于内含子的3'位置。
“分支”是包括核苷酸腺嘌呤并在剪接过程中参与套索结构形成的部分。
“表达盒”是指包含启动子和靶蛋白并能够表达靶蛋白以产生靶蛋白的单元盒。因此，表达盒可包括有助于有效生产靶蛋白的各种因素。更具体地，表达盒可包括启动子、编码靶蛋白的多核苷酸和poly A序列。
“抗体”是指由四个多肽链组成的免疫球蛋白分子，其中两条重链和两条轻链通过二硫键相互连接。该定义也包括其他具有改变的结构的天然存在的抗体，例如骆驼科动物抗体。每条重链由重链可变区和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。每条轻链由轻链可变区和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域(CL)组成。重链可变区和轻链可变区可进一步细分为称为框架区(FR)的更保守的区域和称为互补决定区(CDR)的高变区。每个重链可变区和轻链可变区均由3个CDR和4个FR组成，它们从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2，FR3、CDR3和FR4。
“表达调节”是指调节特定基因的表达水平，“调节”同时包括增加和减少的概念。
“shRNA”是包含短干扰RNA(siRNA)序列的发夹结构RNA，并通过细胞中称为剪切酶的RNase酶加工成短干扰RNA。
再进一步详细描述本发明的各个方面。
本发明涉及用于产生靶蛋白的表达盒，其为包括启动子、编码该靶蛋白的多核苷酸、内含子RNA序列和poly A序列的靶蛋白表达盒，该内含子RNA序列包括剪接供体、分支和剪接受体。
图1示意性地示出了包括内含子shRNA/miRNA的重组蛋白的表达盒的结构。这是基于本发明的原理，其中shRNA/miRNA和重组蛋白在转染入细胞后通过内含子剪接过程制备。
本发明涉及一种能够通过使用单个启动子将内含子RNA序列和靶蛋白序列转录成一个mRNA后进行剪接来提高靶蛋白的生产力和功能性的方法。
启动子可以不受限制地使用，只要它是能够操作本发明的表达盒的启动子即可，并且优选是polII型启动子。更优选的polII型启动子选自：CMV(cytomegalovirus)巨细胞病毒)、EF1α(elongation factor 1alpha)(延伸因子1α)、CEF(CMV early enhancer/EF1αpromoter and intron)(CMV早期增强子/EF1α启动子和内含子)、CBA(chickenbeta-actin)(鸡β-肌动蛋白)、CAG(CMV early enhancer/chicken beta-actin promoter&intron)(CMV早期增强子/鸡β-肌动蛋白启动子和内含子)、CBh(CMV early enhancer/chicken beta-actin promoter)(CMV早期增强子/鸡β-肌动蛋白启动子)、GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)(甘油醛3-磷酸脱氢酶)、SV40(Simian virus 40)(猿猴病毒40)、UBC(ubiquitin C)(泛素C)、PGK(phosphoglycerate kinase)(磷酸甘油酸激酶)、LTR(long terminal repeats)(长末端重复序列)、GUSB(βglucuronidase)(β葡萄糖醛酸糖苷酶)、UCOE((ubiquitous chromatin opening element)常染色质开放因子)、WAS近端启动子、CD4微型启动子/增强子、CD2基因座控制区、CD4最小启动子/近端增强子/沉默子、CD4微型-启动子/增强子，LTR中的GATA-1增强子HS2、锚蛋白-1/α-血影蛋白启动子/HS-40、GATA-1、ARE/内含子8增强子、锚蛋白-1启动子/β-珠蛋白HS-40增强子、GATA-1增强子HS1到HS2/逆转录病毒LTR、MCH II特异性HLA-DR启动子、Fascin启动子、Dectin-2基因启动子、来自DC-STAMP的5'非翻译区、重链内含子增强子(Eμ)/基质附着区、CD19启动子、混合免疫球蛋白启动子(Igk启动子、Ig基因的内含子增强子/3'增强子)、CD68L启动子/第一个内含子、糖蛋白Ibα启动子、hAAT(α1-antitrypsin)(α1-抗胰蛋白酶)、ApoE(Apolipoprotein E)(载脂蛋白E)、ApoE/hAAT(Apolipoprotein E enhancer/alpha1-antitrypsin)(载脂蛋白E增强子/α-1-抗胰蛋白酶)启动子、HAAT启动子/Apo E基因座控制区、白蛋白启动子、HAAT启动子/四份Apo E增强子、HAAT启动子/Apo E基因座控制区、hAAT启动子/四份Apo E增强子、甲状腺激素结合球蛋白启动子/α1-微球蛋白/比库宁增强子、DC172启动子(α1-antitrypsinpromoter/α1-microglobulin enhancer)(α1-抗胰蛋白酶启动子/α1-微球蛋白增强子)、LCAT、kLSP-IVS、ApoE/hAAT/肝脂肪酸结合蛋白启动子、RU486反应性启动子、肌酸激酶启动子、C5-12(Synthetic muscle-specific promoter)(合成肌特异性启动子)、MHCK7(Hybridenhancer/promoter regions ofα-myosin and creatine kinase)(α-肌球蛋白和肌酸激酶的杂交增强子/启动子区域)、心肌肌钙蛋白-I近端启动子、E-选择蛋白/KDR启动子、Prepro-内皮素-1启动子、KDR启动子/氧饱和度响应因子、Flt-1(fms-like tyrosinekinase-1)(fms样酪氨酸激酶-1)启动子、ICAM-2(intercellular adhesion molecule2)(细胞间粘附分子2)启动子、合成内皮启动子、内皮素-1基因启动子、淀粉酶启动子、胰岛素和人pdx-1启动子、TRE调节的胰岛素启动子、烯醇酶启动子、TRE调节的突触蛋白启动子、突触素1启动子、PDGF(platelet-derived growth factor)(血小板衍生的生长因子)、PDGF-β启动子/CMV增强剂、微管蛋白-α、Ca2+/钙调蛋白-PK2启动子/CMV增强子、磷酸激活的谷氨酰胺酶/囊状谷氨酸转运蛋白-1启动子、谷氨酸脱羧-67启动子、酪氨酸羟化酶启动子、神经丝重基因启动子、人红视蛋白启动子、角蛋白18启动子、角蛋白-14个启动子、角蛋白-5启动子、CD40L启动子、β-球蛋白启动子/LCR、β-球蛋白和-球蛋白启动子/HS-40，GATA-1、ARE/内含子8增强子、β-球蛋白、LCR HS4、HS3、HS2/截短的β-球蛋白内含子2、β-球蛋白启动子/LCR/cHS4、HSFE/LCR/β-球蛋白启动子、整合素αIib启动子、肌营养不良蛋白启动子/调节序列、内皮糖蛋白启动子、RPE65启动子、TBG(thyroxine binding globulin)(甲状腺素结合球蛋白)、结蛋白、MCK(muscle creatine kinase)(肌肉肌酸激酶)、NSE(neuronal-specific endolase)(神经元特异性内切酶)、MeCP2(methyl-CpG binding protein 2)(甲基-CpG结合蛋白2)、CaMKII(calcium/calmodulin dependent protein kinase II)(钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II)、mGluR2、NFL、NFH、nB2、PPE、Enk、EAAT2、GFAP(glialfibrillary acidic protein)(胶质纤维酸性蛋白)、MBP(Myelin basic protein)(髓磷脂碱性蛋白)、肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链、MND(a synthetic promoter that containsthe U3 region of a modified MoMuLV LTR with myeloproliferative sarcoma virusenhancer),(合成的启动子，包含带有骨髓增生性肉瘤病毒增强剂的修饰的MoMuLV LTR的U3区)、CYP2E1(Cytochrome P450 2E1)(细胞色素P450 2E1)、MeCP2(methyl-CpG bindingprotein 2)(甲基CpG结合蛋白2)CMV(巨细胞病毒)、EF1α(延伸因子1α)、CEF(CMV早期增强子/EF1α启动子和内含子)、CBA(鸡β-肌动蛋白)、CAG(CMV早期增强子/鸡β-肌动蛋白和内含子)、CBh(CMV早期增强子/鸡β-肌动蛋白启动子)、GAPDH(甘油醛3-磷酸脱氢酶)、SV40(猿猴病毒40)、UBC(泛素C)、PGK(磷酸甘油酸激酶)、LTR(长末端重复序列)、GUSB(β葡萄糖醛酸糖苷酶)、UCOE(常染色质开放因子)、WAS近端启动子、CD4微型启动子/增强子、CD2基因座控制区，CD4最小启动子/近端增强子/沉默子、CD4微型启动子/增强子、LTR中的GATA-1增强子HS2、锚蛋白1/α-血影蛋白启动子/HS-40、GATA-1、ARE/内含子8增强子、锚蛋白1启动子/β-球蛋白HS-40增强子、GATA-1增强子HS1到HS2/逆转录病毒LTR、MCH II特异性HLA-DR启动子、肌成束蛋白启动子，Dectin-2基因启动子、DC-STAMP的5'非翻译区、重链内含子增强子(Eμ)/基质附着区域、CD19启动子、混合免疫球蛋白启动子(Igk启动子、Ig基因的内含子增强子/3'增强子)、CD68L启动子/第一内含子、糖蛋白Ibα启动子、hAAT(α1-抗胰蛋白酶)、ApoE(载脂蛋白E)、ApoE/hAAT(载脂蛋白E增强子/α-1-抗胰蛋白酶)启动子、HAAT启动子/Apo E基因座控制区、白蛋白启动子、HAAT启动子/四份Apo E增强子、HAAT启动子/Apo E基因座控制区、hAAT启动子/四份Apo E增强子、甲状腺激素结合球蛋白启动子/α1-微球蛋白/bikunin增强子、DC172启动子(α1-抗胰蛋白酶启动子/α1-微球蛋白增强子)、LCAT、kLSP-IVS、ApoE/hAAT/肝脂肪酸-结合蛋白启动子、RU486反应性启动子、肌酸激酶启动子、C5-12(合成肌特异性启动子)、MHCK7(α-肌球蛋白和肌酸激酶的杂交增强子/启动子区域)、心肌肌钙蛋白-I近端启动子、E-选择素/KDR启动子、内皮素原-1启动子、KDR启动子/氧饱和度响应元件、Flt-1(fms样酪氨酸激酶-1)启动子、ICAM-2(细胞间粘附分子2)启动子、合成内皮启动子、内皮素-1基因启动子、淀粉酶启动子、胰岛素和人pdx-1启动子、TR E调节胰岛素启动子、烯醇酶启动子、TRE调节突触蛋白启动子、Synapsin 1启动子、PDGF(血小板衍生生长因子)、PDGF-β启动子/CMV增强剂、微管蛋白-α、Ca2+/钙调蛋白-PK2启动子/CMV增强剂、磷酸激活的谷氨酰胺酶/囊状谷氨酸转运蛋白1启动子、谷氨酸脱羧酶67启动子、酪氨酸羟化酶启动子、神经丝重基因启动子、人红视蛋白启动子、角蛋白18启动子、角蛋白14启动子、角蛋白5启动子、CD40L启动子、β-球蛋白启动子/LCR、β-球蛋白和-球蛋白启动子/HS-40、GATA-1、ARE/内含子8增强子、β-球蛋白、LCR HS4、HS3、HS2/截短的β-球蛋白内含子2、β-球蛋白启动子/LCR/cHS4、HSFE/LCR/β-球蛋白启动子、整联蛋白αIib启动子、肌营养不良蛋白启动子/调节序列、内皮糖蛋白启动子、RPE65启动子、TBG(甲状腺素结合球蛋白)、结蛋白、MCK(肌肉肌酸激酶)、NSE(神经元特异性内切酶)、MeCP2(甲基CpG结合蛋白2)、CaMKII(钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II)、mGluR2、NFL、NFH、nB2、PPE、Enk、EAAT2、GFAP(神经胶质纤维酸性蛋白)、MBP(髓磷脂碱性蛋白)、肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链、MND(合成启动子，含有经过修饰的MoMuLV LTR的U3区、该区带有骨髓增生性肉瘤病毒增强剂)、CYP2E1(细胞色素P450 2E1)和MeCP2(甲基CpG结合蛋白2)启动子。最优选地，启动子是CMV(巨细胞病毒)启动子。
为了使短片段DNA，例如shRNA，有效转录，有必要使用polIII型启动子。然而，这些polIII型启动子难以诱导靶蛋白的高表达，因此需要具有各自启动子的表达盒来表达shRNA和靶蛋白。因此，由于表达盒的大小、转染和选择过程的问题，难以一次制备调节靶蛋白表达和内源基因表达的细胞系。为了克服这些问题，使用了强启动子polII型CMV启动子，并且在序列的两端排列了内含子序列，使得shRNA的DNA序列能够形成可以转录后基因调控的shRNA。因此，在转录过程中通过剪接产生shRNA，并且由此产生的shRNA调节特定内源基因的表达。同时，由于内源基因表达的调节，用相同的CMV启动子转录并表达的靶蛋白表现出增强的生产水平和功能。
靶蛋白可以是任一种，但是优选为抗体或抗体的片段。
在本发明的一个实施方案中，抗体或其片段可以对选自以下的任何一种具有特异性的靶抗原：CD19、CD20、CD22、CD33、CD52、Her2/neu、EGFR、EpCAM、MUC1、GD3、CEA、CA125、HLA-DR、TNF-α、VEGF、整联蛋白α4β7、IL-12、IL-23、抗CD20单抗、IL-6R、VEGF受体激酶抑制剂、补体因子C5、IL-1β、RANK配体、VEGFR2(KDR)、IL-6、GD20、IL-5、PDGF-Rα、CTLA-4、CD3、IL-17A、PD-L1、PD-1、BAFF、BLyS、(Dabigatran)达比加群酯、SLAMF7(cD319)、抗IL-4、IL-13单抗、炭疽杆菌炭疽、CD25、艰难梭菌毒素B、PCSK9、流感病毒的血凝素(HA)、RSV(呼吸道合胞病毒)的F蛋白、RSV的G蛋白、IgE(免疫球蛋白E)和狂犬病病毒的G蛋白。
在本发明的一个实施方案中，至少一个内含子RNA序列可以存在于单个靶蛋白表达盒上。本发明的表达载体包括目标动物细胞中靶向内源基因的至少一种shRNA/miRNA的序列信息，并且包括允许至少一种shRNA/miRNA产生的内含子序列。
在本发明的一个实施方案中，表达盒可以包含至少一种选自以下的内含子RNA序列：a)位于启动子和编码靶蛋白的多核苷酸之间的至少一个内含子RNA序列，b)至少一个位于编码靶蛋白的多核苷酸和poly A之间的内含子RNA序列，以及c)至少一个位于启动子和编码靶蛋白的多核苷酸之间的内含子RNA序列和至少一个内含子RNA序列位于编码靶蛋白的多核苷酸和poly A之间。
本发明的图2示意性地显示了无内含子的重组蛋白(抗体)表达载体(对照)、包含无内源基因调控功能的内含子序列(IS)的抗体表达载体和包含用于内源基因调控的内含子shRNA/miRNA的抗体表达载体，从中可以看出至少可以包含一个内含子RNA序列。
在本发明的一个实施方案中，内含子RNA序列可以进一步包括用于靶基因表达调节的RNA序列。
在本发明的一个实施方案中，靶基因可以是选自以下的至少一种：FUT8(α-1,6-岩藻糖基转移酶)、HDAC5(组蛋白脱乙酰基酶5)、LDHA(乳酸脱氢酶A)、CXCR4(CXC趋化因子受体4型)、DHFR(二氢叶酸还原酶)、PDK4(丙酮酸脱氢酶脂酰胺激酶同工酶4)、MAPK3(丝裂原活化蛋白激酶3)、KANK4(KN基序和锚蛋白重复结构域4)、PDI(二硫化蛋白)异构酶)、CNX(钙粘蛋白)、CRT(钙网蛋白)、elF2α(真核翻译起始因子2α的非磷酸化版本)、ZFP-TF(人工锌指蛋白转录因子)、ATF4(激活转录因子4)、GADD34(生长抑制和DNA损伤诱导蛋白34)、mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)、BIP(热休克70kDa蛋白5)、ATF6C(激活转录因子6C)、XBP1(X-盒结合蛋白1)、BCL2(B-细胞淋巴瘤2)、BCLxL(BCL2-样1)、BCL-xL(Asp29Asn变体)、XIAP(X连锁凋亡抑制剂)、XIAP(EAX197)、AVEN(凋亡、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂)、C-MYC(骨髓瘤癌基因)、FAIM(Fas凋亡抑制分子)、30Kc6(抑制凋亡的30K蛋白)的突变形式、TERT(端粒酶逆转录酶)、E1B-19K(对照蛋白E1B 19K)、MDM2(鼠双突变2)、E2F1(E2F转录因子1)、HSP27(热激蛋白27)、HSP70(热激蛋白70)、MCL1(骨髓细胞白血病1)、AKT1(RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)、Beclin-1、ST6GAL(α2,6唾液酸转移酶)、GnT-IV(α-1,3-D-甘露糖苷β1,4N-乙酰葡萄糖胺基转移酶)、GnT-V(α1,6甘露糖苷β-1,6N乙酰氨基葡萄糖转移酶)、ST3GAL(α2,3唾液酸转移酶)、GalT(β1,4半乳糖基转移酶)、CMP-SAT(CMP唾液酸转运蛋白)、CMP-SAS(CMP-唾液酸合成酶)、GNE(突变型尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡糖2-差向异构酶)、GnT-III(β1,4N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶III)、ManII(高尔基α-甘露糖苷酶II)、C2GnT(β-1，6-N乙酰基氨基葡萄糖氨基转移酶)、RMD(GDP-6-脱氧-d-lyxo-4-己糖还原酶)、VHb(玻璃藻血红蛋白)、CPS I(氨基甲酸酯磷酸合成酶I)、OTC(鸟氨酸转氨甲酰酶)、PC(丙酮酸羧化酶)、GLUT5(葡萄糖转运蛋白5)、MDH2(苹果酸脱氢酶II)、TAUT(牛磺酸转运蛋白)、ALT1(丙氨酸转氨酶1)、XBP1(X-盒结合蛋白1)、XBP1s(XBP-1的剪接形式)、SLY1(缺失YPT1蛋白1的抑制子)、MUNC18C(突触融合蛋白结合蛋白3)、CERT(神经酰胺转移蛋白)、CERT的突变形式(S132A)、SNAP-23(23kDa的突触体相关蛋白)、VAMP8(囊泡相关的膜蛋白8)、SRP14(人类信号受体蛋白14)、p21CIP1(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A)、C/EBP-α(CCAAT/增强子结合蛋白α)、p27KIP1(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B)、CDKL3(细胞周期蛋白依赖性激酶3)、COX15(细胞色素c氧化酶亚基)、VCP(含缬氨酸的蛋白)、BAX(BCL2相关的X蛋白)、BAK(BCL2拮抗剂/杀伤因子)、GS(谷氨酰胺合成酶)、MGAT1(N-乙酰氨基葡萄糖转移酶1)、SLC35C1(GDP-岩藻糖转运蛋白)、SLC35A1(CMP唾液酸转运蛋白)、B4GALT1(β1,4半乳糖基转移酶1)、B3GNT2(β1,3N-乙酰葡糖胺酶)、PAM(肽基甘氨酸α酰胺化单加氧酶)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶7、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9、ALG2(Α-1,3/1,6-甘露糖基转移酶)、REQ(Requiem)、FADD(Fas(TNFRSF6)-死亡结构域相关蛋白)、FAIM(Fas凋亡抑制分子)、NEU2(唾液酸酶2)、NEU1(唾液酸酶1)、NEU3(唾液酸酶3)、GMD(GDP-岩藻糖4,6脱水酶)、GFT(GDP-岩藻糖转运蛋白)、CFL1(肌动蛋白)、ATR(共济失调毛细血管扩张和Rad3相关蛋白)、ENO1(烯醇酶1)和PDHK(丙酮酸脱氢酶激酶)。更优选选自以下中至少一种：FUT8(α-1、6-岩藻糖基转移酶)、HDAC5(组蛋白脱乙酰基酶5)、LDHA(乳酸脱氢酶A)、DHFR(二氢叶酸还原酶)、PDK4(丙酮酸脱氢酶脂酰胺激酶同工酶)、CXCR4(4型CXC趋化因子受体)、MAPK3(促分裂原活化的蛋白激酶3)和KANK4(KN基序和锚蛋白重复结构域4)。
在本发明的示例性实施方案中，作为表达调节的内源基因，选择了α1，6-岩藻糖基转移酶(FUT8)并测试，其在与抗体依赖性细胞毒性有关的岩藻糖糖基化中起了重要作用，产生的抗体由于有效抑制FUT8表达几乎没有岩藻糖。
在本发明的一个实施方案中，用于靶基因表达调节的RNA序列可以是选自以下至少一种：shRNA(短发夹RNA)、miRNA(微小RNA)、stRNA(小时序RNA)、siRNA(小干扰RNA)、piRNA(小卵磷脂相互作用RNA)、snoRNA(核仁小分子RNA)、snRNA(核内小分子RNA)、exRNA(细胞外RNA)、scaRNA(小卡尔哈体RNA)、lncRNA(长链非编码RNA)、smRNA(小的调节性dsRNA)和snRNA(小的非编码RNA)。最优选的是选自shRNA(短发夹RNA)、miRNA(微小RNA)、stRNA(小时序RNA)和siRNA(小干扰RNA)的至少一种序列。
在本发明的一个实施方案中，用于靶基因表达调节的shRNA序列可以是选自以下序列中至少一种：由SEQ ID NO：24代表的内含子FUT8 shRNA、SEQ ID NOS：25-27中任一项代表的内含子HDAC5(组蛋白脱乙酰基酶5)shRNA的至少一个序列、SEQ ID NOS：28-30中任一项代表的内含子LDHA(乳酸脱氢酶A)shRNA和SEQ ID NOS：31-33中任一项代表的内含子DHFR(二氢叶酸还原酶)shRNA。
在此，抑制HDCA5的基因表达的shRNA优选由SEQ ID NO：25-27组成的组中的任一种，并且最优选为由SEQ ID NO：27表示的内含子HDAC5 shRNA。本发明的一个实施例中，基于SEQ ID NO：25-27表示的内含子HDAC5 shRNA抑制HDAC5表达的实验结果，由序列SEQ IDNO：27表示的内含子HDAC5 shRNA最有效地抑制了HDAC5的表达(图3)。
另外，抑制LDHA的基因表达的shRNA优选为选自由SEQ ID NO：28至30组成的组中的任一种，最优选为由SEQ ID NO：30表示的内含子LDHA shRNA。本发明的一个实施例中，基于SEQ ID NOS：28至30表示的内含子LDHA shRNAs抑制LDHA表达的效果的实验结果，SEQ IDNO：30代表的内含子LDHA shRNA最有效地抑制了LDHA的表达(图4)。
另外，抑制DHFR的基因表达的shRNA优选为选自由SEQ ID NO：31-33组成的组中的任一种，最优选为由SEQ ID NO：32表示的内含子DHFR shRNA。本发明的一个实施例中，基于SEQ ID NO：31-33表示的内含子DHFR shRNA抑制DHFR表达的作用的实验结果，序列SEQ IDNO：32所示的内含子DHFR shRNA最有效地抑制了DHFR的表达(图5)。
在本发明的一个实施方案中，用于靶基因调节的miRNA序列可以是由序列SEQ IDNO：34-36中的任一个表示的内含子miR483。在本发明一个实施例中，当制备包括内含子miR483的表达盒时，为了最大化抑制PDK4靶表达和在CXCR4靶表达中的增加，进行了实验以确定最佳分支序列和剪接受体组合。使用不同的分支序列和剪接受体构建由SEQ ID NO：34-36表示的单个内含子RNA序列。此后，基于抑制PDK4表达和增加CXCR4表达的效果的测定结果，发现由SEQ ID NO：36代表的内含子miR483序列是最有效的(图6和7)。
在本发明的一个实施方案中，剪接供体序列可以是选自序列SEQ ID NOS：12-15的至少一个，分支序列可以是选自序列SEQ ID NOS：16-18的至少一个，剪接受体序列可以是选自序列SEQ ID NOS：19-22的至少一种。
在本发明的一个实施方案中，通过内含子剪接或内源基因表达调节，用于靶蛋白制备的表达盒可以具有以下作用的至少一种：靶蛋白的表达增加、乳酸盐产生的抑制、组蛋白脱乙酰化的调节、葡萄糖代谢调节、细胞生长调节、增殖调节和靶蛋白功能增强和岩藻糖的含量的降低。
在本发明的一个实施例中，如图8和图9所示，可以看出，与不包含内含子RNA的转化体相比，在包括内含子RNA的转化体中产生的抗体更多。特别地，当包括两个或更多个内含子RNA时，表现出更高的抗体生产率(图8和9)。
表达盒可以用于内源基因调控的内含子RNA序列来调控靶标内源基因的表达。基因表达的调节包括增加或降低基因表达水平的方法。表达盒使得内含子RNA序列和靶蛋白通过单个启动子转录连接，因此，即使当仅通过检查靶蛋白的表达选择细胞系时，也可以选择内源基因调节通过内含子RNA调节的细胞系。
在本发明的示例性实施方案中，证实了当选择二氢叶酸转化为四氢叶酸的过程中涉及的酶DHFR作为选择标记时，通过抑制二氢叶酸还原酶(DHFR)的表达，少数细胞系生长(图10)。
在本发明的示例性实施方案中，证实了通过调节α1、6-岩藻糖基转移酶(FUT8)的表达，由相同启动子表达的抗体的岩藻糖含量降低，所述α1，6-岩藻糖基转移酶是与天冬酰胺297的N-连接聚糖的岩藻糖基化相关的酶，其是抗体的Fc区(图11)。
在本发明的示例性实施方式中，证实了通过调节与组蛋白的脱乙酰化有关的组蛋白脱乙酰基酶5(HDAC5)的表达，降低了组蛋白脱乙酰基酶的表达(图12a)。
在本发明的示例性实施方案中，证实了通过调节乳酸脱氢酶A(LDHA)的表达，降低了乳酸脱氢酶A的表达，LDHA是参与丙酮酸向乳酸的转化的酶(图12b)。
在本发明的示例性实施方式中，证实了通过使用miR483调节CXCR4、PDK4、MAPK3和KANK4的表达，增加了CXCR4的表达而降低PDK4的表达(图12c和12d)。。
另外，本发明涉及包含用于产生靶蛋白的表达盒的载体。
另外，本发明涉及转化体，其用包含表达盒的载体转化以制备靶蛋白。转化体没有限制，只要其能够产生靶蛋白即可，优选为动物细胞。
在本发明的一个实施方案中，转化体可以是真核细胞。真核细胞优选为哺乳动物细胞。更优选地，哺乳动物细胞选自CHO(中国仓鼠卵巢)细胞、BHK(幼小仓鼠肾脏)细胞、小鼠骨髓瘤细胞、大鼠骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞、胚胎干细胞、受精卵细胞、CHO-K1细胞、CHODUXB11细胞、CHO DG44细胞、N50细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YB2细胞、HEK 293细胞、HEK293EBNA细胞、PER.C6细胞、Namalwa细胞和COS细胞。
另外，本发明涉及一种制备靶蛋白的方法，该方法包括培养包含用于靶蛋白制备的表达盒的转化体。
更具体地，根据本发明的制备靶蛋白的方法可以包括用载体转染动物细胞，其中通过单个启动子表达用于内源基因调控的内含子序列和靶蛋白；适合于靶蛋白表达的条件下培养转染的细胞和从动物细胞或细胞培养液中回收靶蛋白。
下面通过具体实施例对本发明的内容进行更好的解释。此处，阐述这些实施例是为了说明本发明，而不应解释为限制本发明的范围。
实施例1：内含子序列的制备
通过适当地组合剪接供体(SD)、基因靶shRNA序列、分支序列和剪接受体(SA)核苷酸序列，能够完成新的内含子DNA序列的剪接，并通过合成制备，如表1中所示。
表1
序号 类别 内含子序列的构建 序列号
1 内含子(IS) SD+分支+SA 23
2 FUT8 SD+FUT8靶shRNA+分支+SA 24
3 HDAC5 SD+HDAC5靶shRNA+分支+SA 25-27
4 LDHA SD+LDHA靶shRNA+分支+SA 28-30
5 DHFR SD+DHFR靶shRNA+分支+SA 31-33
6 miR483 SD+miR483靶miRNA+分支+SA 34-36
表1中的1号内含子(IS)没有插入基因靶shRNA，或插入了没有基因表达调控功能的shRNA序列，因此仅在基因DNA中发生剪接作用。另外，在2至5号内含子的情况下，通过插入shRNA来制备内含子DNA序列以诱导每个基因表达的抑制。最后，制备6号内含子以便评估miRNA，而不是shRNA，是否适用于本发明。
实施例2：表达盒的制备
如图1所示，通过将至少一个内含子shRNA序列插入表达靶蛋白的单个表达盒中，表达盒能同时表达内含的shRNA序列和靶蛋白。通过结合剪接供体、基因靶向shRNA或miRNA序列、分支序列和剪接受体核苷酸序列来请求GeneArt来合成表达盒。通过PCR向合成的DNA序列的两端添加HpaI/NheI或ClaI限制性酶切位点，然后克隆到由CMV(巨细胞病毒)启动子+帕利珠单抗轻链+poly A组成的表达盒中。使用HpaI和NheI限制酶在CMV启动子和帕利珠单抗轻链之间进行克隆，并使用ClaI限制酶在帕利珠单抗轻链与poly A之间进行克隆，得到最后的表达盒。
特定的表达盒的配置如图2和如下表2所示。
表2
Figure BDA0002510417620000241
设计表2中的3至5号是用来评估GOI之前的shRNA插入是否影响每个靶基因的表达。7号用来测试在GOI之后插入shRNA的情况，8至11号用来评估在GOI之前和之后都使用两种或更多种shRNA-shRNA组合或shRNA-miRNA组合，本发明的效果是否存在。
实施例3：载体克隆
使用帕利珠单抗的重链和轻链基因，对具有二氢叶酸还原酶(DHFR)作为选择标记的MarEx载体(韩国专利号10-1076602)进行克隆，用作防止呼吸道合胞病毒感染的治疗剂。将用于内源基因调节的内含子序列或至少一个内含子shRNA/miRNA序列(表1和2)插入表达帕利珠单抗的MarEx载体的轻链表达盒中。用大肠杆菌(DH5α)转化后，获得质粒。使用无内含子质粒的Maxi Kit(Qiagen)鉴定包含用于内源基因调控的内含子序列或至少一个内含子shRNA/miRNA序列的MarEx载体的序列和抗体序列的MarEx载体的序列，从而获得最终载体和质粒DNA。
实施例4：通过瞬时表达评估内源基因调控
实施例4-1：HDAC5表达调控的评估
制备实施例3中的靶向HDAC5的序列626bp的抑制性内含子shRNA1(SEQ ID NO：25)、靶向HDAC5的823bp序列的抑制性内含子shRNA2(SEQ ID NO：26)和靶向HDAC5的2326bp序列的抑制性内含子shRNA3(SEQ ID NO：27)。之后，通过瞬时表达来评估HDAC5在细胞中的表达是否被抑制。
为了确认基因的表达，获得了细胞，并使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)提取了总RNA。使用一步法SYBR PrimeScript RT-PCR试剂盒II(TaKaRa)和等量的总RNA(100ng)完成逆转录和cDNA合成后，通过实时PCR进行分析。为了扩增和检测HDAC5和GAPDH cDNA，使用了以序列SEQ ID NOS：37和38代表的GAPDH引物和以序列SEQ ID NOS：39和40代表的HDAC5引物。
使用应用生物系统7500实时PCR系统，在42℃下5分钟和95℃下10min进行逆转录，并在95℃下5秒和60℃下34个扩增循环40次。进行10秒，由此将HDAC5 cDNA水平标准化为持家基因GAPDH的水平。因此，如图3所示，在所有HDAC5 shRNA序列中均证实了抑制HDAC5表达的作用，其中由SEQ ID NO：27表示的HDAC5 shRNA3与对照相比抑制了HDAC5的表达37％，因此也被发现是最有效的。
实施例4-2：LDHA表达调控的评估
制备实施例3中的靶向LDHA序列273bp的抑制性内含子shRNA1(SEQ ID NO：28)、靶向LDHA序列473bp的抑制性内含子shRNA2(SEQ ID NO：29)和靶向LDHA的906bp序列的抑制性内含子shRNA(SEQ ID NO：30)。此后，通过瞬时表达来评估LDHA在细胞中的表达是否被抑制。
以与实施例4-1相同的方式确认基因的表达，并且为了扩增和检测GAPDH和LDHAcDNA，使用SEQ ID NOS：37和38代表的GAPDH引物和由SEQ ID NOS：41和42代表的LDHA引物。
因此，如图4所示，在所有LDHA shRNA序列中均证实了抑制LDHA表达的作用，其中由SEQ ID NO：30表示的LDHA shRNA3与对照相比抑制LDHA表达68.9％，因此被发现是最有效的。
实施例4-3：DFHR表达调控的评估
制备实施例3中靶向DHFR序列41bp的抑制性内含子shRNA1(SEQ ID NO：31)、靶向DHFR 307bp序列的抑制性内含子shRNA2(SEQ ID NO：32)和靶向DHFR的323bp序列的抑制性内含子shRNA(SEQ ID NO：33)。此后通过瞬时表达来评估DHFR在细胞中的表达是否被抑制。
以与实施例4-1相同的方式确认基因的表达，并且为了扩增和检测GAPDH和DHFRcDNA，使用SEQ ID NOS：37和38代表的GAPDH引物和由SEQ ID NOS：47和48代表的DHFR引物。
因此，如图5所示，确认了抑制DHFR表达的效果，其中，以SEQ ID NO：32表示的DHFRshRNA2与对照相比，抑制了DHFR表达58.8％，是最有效的。
实施例4-4：通过miR483表达评估CXCR4 and PDK4的表达调控
作为实施例3中用于诱导miR483表达的内含子序列，制备了miR483 1(SEQ ID NO：34)、miR483 2(SEQ ID NO：35)和miR483 3(SEQ ID NO：36)。此后，通过瞬时表达来测定作为mi483靶标的CXCR4(C-X-C趋化因子受体4型)的表达的增加和抑制PDK4(丙酮酸脱氢酶激酶4)的表达的效果。
以与实施例4-1相同的方式确认基因的表达，并且为了扩增和检测GAPDH、CXCR4和PDK4 cDNA，使用以SEQ ID NOS：37和38表示的GAPDH引物、SEQ ID NO：43和48表示的CXCR4引物以及由SEQ ID NO：45和46表示的PDK4引物。
因此，如图6所示，由SEQ ID NO：36表示的miR483 3与对照相比使CXCR4的表达增加了270.4％或更多。如图7所示，与对照相比，由SEQ ID NO：36表示的miR483 3抑制了PDK4的表达23.2％。
实施例5：制备表达细胞系
使用实施例3中制备的载体，制备了稳定的细胞系，其中转录并表达了用于内源基因调控的抗体和内含子序列或至少一个内含子shRNA/miRNA。
具体地，使用Lipofectamine LTX(Invitrogen)利用上述载体转染CHO-K1细胞(美国典型培养物保藏中心，CCL-61，美国)，然后用作为DHFR抑制剂的500nM甲氨蝶呤(MTX)处以选择稳定转染的细胞系，从而生产出其中抗体稳定表达的细胞系。
实施例6：评估抗体的产生和表达水平
实施例6-1：通过瞬时表达评估短时抗体的产生水平
用无内含子的抗体表达载体(对照)、包含无内源基因调节功能的内含子序列(IS)的抗体表达载体和包含内源基因调节功能的内含子shRNA/miRNA序列的抗体表达载体转染后，通过瞬时表达在短时间内测定抗体产生水平。
使用酶联免疫吸附测定(ELISA)技术测定抗体的产生水平，尤其是抗体的Fc区特异性。
因此，如图8和下面的表3所示，在包括不具有内源基因调节功能的内含子序列的细胞系中，抗体产生水平是对照的1.3倍。此外，在包括具有内源基因调控功能的内含子序列的细胞系中，抗体产生水平提高了1.8倍。
表3
Figure BDA0002510417620000281
实施例6-2：评估在稳定细胞系中抗体的表达水平
用无内含子的抗体表达载体(对照)和包含用于内源基因调节的内含子shRNA/miRNA的抗体表达载体转染后，制备稳定的细胞系，然后测定其抗体产生水平。
使用酶联免疫吸附测定(ELISA)技术测定抗体的产生水平，尤其是抗体的Fc区特异性。
因此，如图9和下面的表4所示，在包括用于内源基因调节的内含子序列的细胞系中，抗体表达水平增加1.57倍至2.95倍。
表4
序号 类别 抗体表达水平 与对照相比的相对抗体表达水平
1 对照 126.6μg/ml 1.00倍
2 FUT8 198.5μg/ml 1.57倍
3 HDAC5 293.8μg/ml 2.32倍
4 LDHA 260.1μg/ml 2.05倍
5 miR483 217.7μg/ml 1.72倍
6 FUT8×FUT8 374.0μg/ml 2.95倍
7 HDAC5×FUT8 277.8μg/ml 2.19倍
8 LDHA×FUT8 234.3μg/ml 1.85倍
9 miR483×FUT8 257.6μg/ml 2.03倍
实施例7：评估选择的细胞系的减少
用无内含子的抗体表达载体(对照)和包含用于抑制DHFR的内含子shRNA的抗体表达载体转染后，然后用甲氨蝶呤(MTX)处理以抑制DHFR的表达，然后进行细胞系选择。
因此，如图10所示，表明，对于用包含用于抑制DHFR的内含子shRNA的载体转染的细胞系，选择了表达比选择对照相比少54.1％的细胞系。因此，可以仅使用少量细胞系来鉴定高表达细胞系。
实施例8：评估抗体的岩藻糖含量
从实施例5中制备的细胞系中纯化抗体，然后使用Bio-LC系统(DC ICS 3000系统，DIONEX，06110276)分析Fc区的多糖。使用4M TFA(三氟乙酸)将纯化的抗体在100℃加热4小时以分离单糖，并使用真空干燥器除去滤液，将其溶解在去离子水中，并使用Bio-LC系统进行测定。为了进行测定，使用了ED检测器(DIONEX，06110046)，并且使用了氨基捕获柱(DIONEX，046122)作为保护柱。此外，使用CarboPac PA 10色谱柱(DIONEX，046110)作为分析柱。通过Bio-LC的分析结果示于图11，量化每个峰的面积比，并示于下表5。
表5
Figure BDA0002510417620000301
*G0F、G1F和G2F，岩藻糖结合形式
Figure BDA0002510417620000302
：G0、G1或G2等形成之前形成的聚糖形式，因此不将其与非糖基化岩藻糖的比例求和。
在包括FUT8内含子序列的细胞系中，未结合岩藻糖的抗体的比例是对照的16.0倍。另外，在包含FUT8×FUT8内含子序列的细胞系中，可以确认未结合岩藻糖的抗体的比例是对照的20.9倍。
此外，在分别包括HDAC5×FUT8 FUT8内含子序列、LDHA×FUT8内含子序列和miR483×FUT8内含子序列的细胞系中，未结合岩藻糖的抗体的比例是对照组的22.2倍、20.1倍和16.4倍。
实施例9：通过稳定细胞系评估内源基因调节
实施例9-1：评估HDAC5表达调节
使用实施例5中制备的稳定细胞系，评估HDAC5的表达在细胞中是否被抑制。为了确认该基因的表达，获得了细胞，并使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)提取了总RNA。使用一步法SYBR PrimeScript RT-PCR试剂盒II(TaKaRa)与等量的总RNA(100ng)完成逆转录和cDNA合成后，进行了实时PCR分析。为了扩增和检测HDAC5和GAPDH cDNA，使用了以SEQ ID NOS：37和38代表的GAPDH引物和以SEQ ID NOS：39和40代表的HDAC5引物。
使用应用生物系统7500实时PCR系统，在42℃下5分钟和95℃下10min进行逆转录，并在95℃下5秒和60℃下34秒循环扩增40个循环，从而将HDAC5 cDNA水平标准化为管家基因GAPDH的水平。
因此，如图12a)，在用于HDAC5和HDAC5×FUT8表达调节稳定的细胞系中，与对照相比，HDAC5的表达水平分别被抑制了51.0％和30.2％。
实施例9-2：评估LDHA表达调节
使用实施例5中制备的稳定细胞系，评估LDHA的表达在细胞中是否被抑制。以与实施例9-1相同的方式确认基因调控，并且为了扩增和检测GAPDH和LDHA cDNA，使用SEQ IDNOS：37和38代表的GAPDH引物和由SEQ ID NOS：41和42代表的LDHA引物。
因此，如图12b)，在用于LHDA和LDHA×FUT8表达调节的稳定的细胞系中，与对照相比，LDHA的表达水平分别被抑制了71.52％和40.5％。
实施例9-3：通过miR483表达评估CXCR4和PDK4表达调节
使用实施例5中制备的稳定细胞系，评价了增加作为miR483的靶标的CXCR4的表达和抑制PDK4的表达的效果。以与实施例9-1相同的方式确认基因调控，并且为了扩增和检测GAPDH、CXCR4和PDK4 cDNA，使用以SEQ ID NOS：37和38代表的GAPDH引物、以SEQ ID NOS：43代表的CXCR4引物和以SEQ ID NOS：45和46所示的PDK4引物。
因此，如图12c)所示，在用于miR483和miR483×FUT8表达调节的稳定细胞系中，与对照相比，CXCR4的表达增加了112.2％或更多。而且，如图12d)，与对照相比，作为另一个靶标的PDK4的表达水平分别被抑制了56.9％和25.1％。
序列表
<110> 赛特瑞恩股份有限公司
<120> 用于制备高表达和高性能靶蛋白的表达盒及其用途
<130> CPP2018053PCT
<150> KR 10-2017-0129969
<151> 2017-10-11
<160> 48
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FUT8 shRNA
<400> 1
attacatacc agctttctgg cgttttggcc actgactgac gccagaaatg gtatgtaat 59
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HDAC5 shRNA1
<400> 2
aactctggtc caaagaagca tgttttggcc actgactgac atgcttctgg accagagtt 59
<210> 3
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HDAC5 shRNA2
<400> 3
aataacagta ccatcctttc ggttttggcc actgactgac cgaaaggagt actgttatt 59
<210> 4
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HDAC5 shRNA3
<400> 4
attccataca gtatcactgt cgttttggcc actgactgac gacagtgact gtatggaat 59
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LDHA shRNA1
<400> 5
tttgctgtca cactatagtc tgttttggcc actgactgac agactatagt gacagcaaa 59
<210> 6
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LDHA shRNA2
<400> 6
aattgcagcc actcccaata agttttggcc actgactgac ttattgggtg gctgcaatt 59
<210> 7
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LDHA shRNA3
<400> 7
gttagagtca ccttcacaac agttttggcc actgactgac tgttgtgagt gactctaa 58
<210> 8
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DHFR shRNA1
<400> 8
cgttcttgcc gatgcccata tgttttggcc actgactgac atatgggccg gcaagaacg 59
<210> 9
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DHFR shRNA2
<400> 9
tttatctgct aactctggtt ggttttggcc actgactgac caaccagata gcagataaa 59
<210> 10
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DHFR shRNA3
<400> 10
tccaaaccat gtccacttta tgttttggcc actgactgac ataaagtgca tggtttgga 59
<210> 11
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> miR483
<400> 11
aagacgggag aagagaaggg agttggtttt gggtgcctca ctcctcccct cccgtctt 58
<210> 12
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 剪接供体1
<400> 12
aggtgagcgg ctggaggctt gctgaaggct gtatgctg 38
<210> 13
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 剪接供体2
<400> 13
aggtgagcgg agacctgagt gtgtggggga gagaagg 37
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 剪接供体3
<400> 14
gtgctgaatc gataggtgag cggctggagg 30
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 剪接供体4
<400> 15
aggtgagcgg ctggagg 17
<210> 16
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 分支 1
<400> 16
tgctaac 7
<210> 17
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 分支 2
<400> 17
ctcctac 7
<210> 18
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 分支 3
<400> 18
gcctcac 7
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 剪接受体 1
<400> 19
catgttcatg ccttcttctt tttcctacag 30
<210> 20
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 剪接受体 2
<400> 20
catgttcatg ccttcttctt tttcctacag ctcctgggca acgtg 45
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 剪接受体 3
<400> 21
cctatcttcc ctgtctcagc tcag 24
<210> 22
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 剪接受体 4
<400> 22
cctatcttcc ctgtctcagc tcagtgctgg gggt 34
<210> 23
<211> 181
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 内含子 IS
<400> 23
aggtgagcgg agccaggagt ggtggctcat gtctgtaatt ccagcacttg agaggtagaa 60
gtgggaggac tgcttgagct caagagtttg atattatcct ggacaacata gcaagacctc 120
gtctctactt aaaaaaaaaa aatttgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca 180
g 187
<210> 24
<211> 194
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FUT8 内含子 shRNA
<400> 24
aggtgagcgg ctggaggctt gctgaaggct gtatgctgat tacataccag ctttctggcg 60
ttttggccac tgactgacgc cagaaatggt atgtaatcag gacacaaggc ctgttactag 120
cactcacatg gaacaaatgg cctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc 180
tcctgggcaa cgtg 200
<210> 25
<211> 194
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HDAC5 内含子 shRNA 1
<400> 25
aggtgagcgg ctggaggctt gctgaaggct gtatgctgaa ctctggtcca aagaagcatg 60
ttttggccac tgactgacat gcttctggac cagagttcag gacacaaggc ctgttactag 120
cactcacatg gaacaaatgg cctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc 180
tcctgggcaa cgtg 200
<210> 26
<211> 194
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HDAC5 内含子 shRNA 2
<400> 26
aggtgagcgg ctggaggctt gctgaaggct gtatgctgaa taacagtacc atcctttcgg 60
ttttggccac tgactgaccg aaaggagtac tgttattcag gacacaaggc ctgttactag 120
cactcacatg gaacaaatgg cctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc 180
tcctgggcaa cgtg 200
<210> 27
<211> 194
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HDAC5 内含子 shRNA 3
<400> 27
aggtgagcgg ctggaggctt gctgaaggct gtatgctgat tccatacagt atcactgtcg 60
ttttggccac tgactgacga cagtgactgt atggaatcag gacacaaggc ctgttactag 120
cactcacatg gaacaaatgg cctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc 180
tcctgggcaa cgtg 200
<210> 28
<211> 194
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LDHA 内含子 shRNA 1
<400> 28
aggtgagcgg ctggaggctt gctgaaggct gtatgctgtt tgctgtcaca ctatagtctg 60
ttttggccac tgactgacag actatagtga cagcaaacag gacacaaggc ctgttactag 120
cactcacatg gaacaaatgg cctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc 180
tcctgggcaa cgtg 200
<210> 29
<211> 194
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LDHA 内含子 shRNA 2
<400> 29
aggtgagcgg ctggaggctt gctgaaggct gtatgctgaa ttgcagccac tcccaataag 60
ttttggccac tgactgactt attgggtggc tgcaattcag gacacaaggc ctgttactag 120
cactcacatg gaacaaatgg cctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc 180
tcctgggcaa cgtg 200
<210> 30
<211> 194
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LDHA 内含子 shRNA 3
<400> 30
aggtgagcgg ctggaggctt gctgaaggct gtatgctggt tagagtcacc ttcacaacag 60
ttttggccac tgactgactg ttgtgagtga ctctaaccag gacacaaggc ctgttactag 120
cactcacatg gaacaaatgg cctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc 180
tcctgggcaa cgtg 200
<210> 31
<211> 194
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DHFR 内含子 shRNA 1
<400> 31
aggtgagcgg ctggaggctt gctgaaggct gtatgctgcg ttcttgccga tgcccatatg 60
ttttggccac tgactgacat atgggccggc aagaacgcag gacacaaggc ctgttactag 120
cactcacatg gaacaaatgg cctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc 180
tcctgggcaa cgtg 200
<210> 32
<211> 194
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DHFR 内含子 shRNA 2
<400> 32
aggtgagcgg ctggaggctt gctgaaggct gtatgctgtt tatctgctaa ctctggttgg 60
ttttggccac tgactgacca accagatagc agataaacag gacacaaggc ctgttactag 120
cactcacatg gaacaaatgg cctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc 180
tcctgggcaa cgtg 200
<210> 33
<211> 194
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DHFR 内含子 shRNA 3
<400> 33
aggtgagcgg ctggaggctt gctgaaggct gtatgctgtc caaaccatgt ccactttatg 60
ttttggccac tgactgacat aaagtgcatg gtttggacag gacacaaggc ctgttactag 120
cactcacatg gaacaaatgg cctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc 180
tcctgggcaa cgtg 200
<210> 34
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> miR483 内含子 miRNA 1
<400> 34
aggtgagcgg agacctgagt gtgtggggga gagaaggaag acgggagaag agaagggagt 60
tggttttggg tgcctcactc ctcccctccc gtcttgttct ctcctaccct atcttccctg 120
tctcagctca gtgctggggg t 145
<210> 35
<211> 193
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> miR483 内含子 miRNA 2
<400> 35
aggtgagcgg agacctgagt gtgtggggga gagaaggaag acgggagaag agaagggagt 60
tggttttggg tgcctcactc ctcccctccc gtcttgttct ctcctaccct atcttccctg 120
tctcagctca gtgctggggg ttgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct 180
cctgggcaac gtg 199
<210> 36
<211> 193
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> miR483 内含子 miRNA 3
<400> 36
aggtgagcgg ctggaggctt gctgaaggct gtatgctgaa gacgggagaa gagaagggag 60
ttggttttgg gtgcctcact cctcccctcc cgtcttcagg acacaaggcc tgttactagc 120
actcacatgg aacaaatggc ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct 180
cctgggcaac gtg 199
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GAPDH 上游引物
<400> 37
gtggaatcta ctggcgtctt c 21
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GAPDH 下游引物
<400> 38
tcttggttca cacccatcac 20
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HDAC5 上游引物
<400> 39
cgtggaatac ctaacagcct tc 22
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HDAC5 下游引物
<400> 40
tccttcgaca gcatcaaacc 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LDHA 上游引物
<400> 41
gacttggccg agagcataat 20
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LDHA 下游引物
<400> 42
agggacactg aggaagaca 19
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CXCR4 上游引物
<400> 43
acatctgtga ccgccattac 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CXCR4 下游引物
<400> 44
caatgcctgg caggataaga 20
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PDK4 上游引物
<400> 45
ggagttccat gagaagagtt cag 23
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PDK4 下游引物
<400> 46
gccattgtag ggaccacatt a 21
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DHFR 上游引物
<400> 47
ccaggccatc tcagactctt tg 22
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DHFR 下游引物
<400> 48
tgggaagaac gtgtcagttt ca 22

Claims (15)

1.一种用于制备靶蛋白的表达盒，其包含启动子、编码该靶蛋白的多核苷酸、内含子RNA序列和poly A序列，其特征在于：所述内含子RNA序列包含剪接供体、分支和剪接受体。
2.根据权利要求1所述的用于制备靶蛋白的表达盒，其特征在于：所述靶蛋白是抗体或其片段。
3.根据权利要求1的用于生产靶蛋白的表达盒，其特征在于：至少一个内含子RNA序列存在于单个靶蛋白表达盒上。
4.根据权利要求1的用于生产靶蛋白的表达盒，其特征在于：用于生产靶蛋白的表达盒包含至少一种选自以下的内含子RNA序列：
a)至少一个位于启动子和编码靶蛋白的多核苷酸之间的内含子RNA序列；
b)至少一个位于编码靶蛋白的多核苷酸和poly A之间的内含子RNA序列；和
c)至少一个位于启动子和编码靶蛋白的多核苷酸之间的内含子RNA序列和至少一个位于编码靶蛋白和poly A的多核苷酸之间的内含子RNA序列。
5.根据权利要求1所述的用于制备靶蛋白的表达盒，其特征在于：所述内含子RNA序列进一步包含用于靶基因表达调节的RNA序列。
6.根据权利要求5所述的用于制备靶蛋白的表达盒，其中所述靶基因是选自以下至少一种：FUT8(α-1，6-岩藻糖基转移酶)、HDAC5(组蛋白脱乙酰基酶5)、LDHA(乳酸脱氢酶A)、CXCR4(CXC趋化因子受体4型)、DHFR(二氢叶酸还原酶)、PDK4(丙酮酸脱氢酶脂酰胺激酶同工酶4)、MAPK3(丝裂原活化蛋白激酶3)、KANK4(KN基序和锚蛋白重复结构域4)、PDI(蛋白质二硫键异构酶)、CNX(钙调蛋白)、CRT(钙网蛋白)、elF2α(真核翻译起始因子2α的非磷酸化版本)、ZFP-TF(人工锌指蛋白转录因子)、ATF4(激活转录因子4)、，GADD34(生长停滞和DNA损伤诱导蛋白34)、mTOR(哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白)、BIP(热休克70kDa蛋白5)、ATF6C(激活转录因子6C)、XBP1(X盒结合蛋白1)、BCL2(B细胞淋巴瘤2)、BCLxL(BCL2-样1)、BCL-xL的突变形式(Asp29Asn变体)、XIAP(X连锁凋亡抑制剂)、XIAP(EAX197)的突变形式、AVEN(凋亡、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂)、C-MYC(骨髓瘤病致癌基因)、FAIM(Fas凋亡抑制分子)、30Kc6(凋亡抑制30K蛋白)、TERT(端粒酶逆转录酶)、E1B-19K(对照蛋白E1B 19K)、MDM2(鼠双突变2)、E2F1(E2F转录因子1)、HSP27(热激蛋白27)、HSP70(热激蛋白70)、MCL1(骨髓细胞白血病1)、AKT1(RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)、Beclin-1、ST6GAL(α2,6唾液酸转移酶)、GnT-IV(α-1,3-D-甘露糖苷β1,4N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶)、GnT-V(α1,6甘露糖苷β-1,6N乙酰基葡萄糖胺基转移酶)、ST3GAL(α2,3唾液酸基转移酶)、GalT(β1,4半乳糖基转移酶)、CMP-SAT(CMP-唾液酸转运蛋白)、CMP-SAS(CMP唾液酸合成酶)、GNE(突变尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡糖胺2-差向异构酶)、GnT-III(β1,4N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶III)、ManII(高尔基α-甘露糖苷酶II)、C2GnT(β1,6N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶)、RMD(GDP-6-脱氧-d-lyxo-4-己糖还原酶)、VHb(玻璃藻血红蛋白)、CPS I(氨基甲酸酯磷酸合成酶I)，OTC(鸟氨酸转氨甲酰酶)、PC(丙酮酸羧化酶)、GLUT5(葡萄糖转运蛋白5)、MDH2(苹果酸脱氢酶II)、TAUT(牛磺酸转运蛋白)、ALT1(丙氨酸氨基转移酶1)、XBP1(X-盒结合蛋白1)、XBP1s(XBP-1的剪接形式)、SLY1(缺失YPT1蛋白1的抑制子)、MUNC18C(突触融合蛋白结合蛋白3)、CERT(神经酰胺转移蛋白)、CERT的突变体(S132A)、SNAP-23(与突触体相关的蛋白23kDa)、VAMP8(囊泡相关膜蛋白8)、SRP14(人类信号受体蛋白14)、p21CIP1(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A)、C/EBP-α(CCAAT/增强子结合蛋白α)、p27KIP1(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B)、CDKL3(细胞周期蛋白依赖性激酶样3)、COX15(细胞色素c氧化酶亚基)、VCP(含缬沙蛋白)、BAX(与BCL2相关的X蛋白)、BAK(BCL2-拮抗剂/杀伤因子)、GS(谷氨酰胺合成酶)、MGAT1(N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶1)、SLC35C1(GDP-岩藻糖转运蛋白)、SLC35A1(CMP唾液酸转运蛋白)、B4GALT1(β1,4半乳糖基转移酶1)、B3GNT2β-1,3N乙酰基氨基葡萄糖氨基转移酶2)、PAM(肽基甘氨酸α酰胺化单加氧酶)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶7、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9、ALG2(α-1,3/1,6-甘露糖基转移酶)、REQ(Requiem)、FADD(Fas(TNFRSF6)-死亡结构域相关蛋白)、FAIM(Fas细胞凋亡抑制分子)、NEU2(唾液酸酶2)、NEU1(唾液酸酶1)、NEU3(唾液酸酶3)、GMD(GDP-岩藻糖4,6-脱水酶)、GFT(GDP-岩藻糖转运蛋白)、CFL1(肌动蛋白)、ATR(共济失调毛细血管扩张和Rad3相关蛋白)、ENO1(烯醇酶1)和PDHK(丙酮酸脱氢酶激酶)。
7.根据权利要求5所述的用于制备靶蛋白的表达盒，其特征在于：所述内含子RNA序列选自以下任一种：shRNA(短发夹RNA)、miRNA(微小RNA)、stRNA(小时序RNA)、siRNA(小分子干扰RNA)、piRNA(与Piwi蛋白相作用的RNA)、snoRNA(核仁小分子RNA)、snRNA(核内小分子RNA)、exRNA(细胞外RNA)、scaRNA(小卡哈尔体RNA)、lncRNA(长链非编码RNA)、smRNA(调节性小dsRNA)和snRNA(非编码小RNA)。
8.根据权利要求7所述的用于制备靶蛋白的表达盒，其特征在于：用于靶基因表达调节的shRNA序列选自以下至少一种：由SEQ ID NO：24表示的内含子FUT8 shRNA、EQ ID NOS：25-27中任一项代表的内含子HDAC5(组蛋白脱乙酰基酶5)shRNA、SEQ ID NOS：28-30中任一项代表的内含子LDHA(乳酸脱氢酶A)shRNA和SEQ ID NO：31-33中任一项代表的内含子DHFR(二氢叶酸还原酶)shRNA。
9.根据权利要求7所述的用于制备靶蛋白的表达盒，其特征在于：用于靶基因调节的miRNA序列是由SEQ ID NOS：34-36中的任一个表示的miR483。
10.根据权利要求1的用于制备靶蛋白的表达盒，其特征在于：所述剪接供体序列选自SEQ ID NOS：12-15的至少一种，
分支序列选自SEQ ID NO：16-18中的至少一种，并且
剪接受体序列选自SEQ ID NO：19-22的至少一种。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的用于产生靶蛋白的表达盒，其特征在于：通过内含子剪接或内源基因表达调控，用于制备靶蛋白的表达盒具有以下作用中的至少一种：诱导靶蛋白的高表达、抑制产生乳酸、调节组蛋白脱乙酰基、调节葡萄糖代谢、调节细胞生长、调节细胞增殖、诱导靶蛋白的高性能和降低靶蛋白的岩藻糖含量。
12.一种载体，其包含权利要求1至10中任一项所述的用于制备的靶蛋白的表达盒。
13.用权利要求12所述的载体转化的转化体。
14.根据权利要求13所述的转化体，其特征在于：所述转化体是真核细胞。
15.一种制备靶蛋白的方法，其包括培养权利要求13或14所述的转化体。
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