CN111378593A - 一种用于制备发酵型植物蛋白饮料的菌剂 - Google Patents

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Abstract

本发明的包含副干酪乳杆菌LCX25菌株和乳酸乳球菌乳酸亚种LL9菌株的菌剂在对植物蛋白浆液原料进行发酵以制备发酵型植物蛋白饮料时，能够保留原料本身的风味并增加原料的乳风味；并且，由于该菌剂发酵获得的活菌数较高，可以在短时间完成发酵，节省生产成本；另外，本发明的菌剂中的菌株不含毒力基因，属于安全菌株，是适用于植物蛋白饮料发酵领域的新型牛源副干酪乳杆菌和乳酸乳球菌乳酸亚种。

Description

一种用于制备发酵型植物蛋白饮料的菌剂
技术领域
本发明涉及一种用于制备发酵型饮料的菌剂，更具体而言，本发明涉及一种用于制备发酵型植物蛋白饮料的菌剂、该菌剂的制备方法和用途、以及由该菌剂制备得到的发酵型植物蛋白饮料。
背景技术
根据GB10789-2007饮料通则5.3.2“植物蛋白饮料”的规定，植物蛋白饮料是指用具有一定蛋白质含量的植物果实、种子或果仁(例如大豆、花生、杏仁、核桃仁、椰子等)等作为原料，向经加工制得(可经乳酸菌发酵)的浆液中加入水或其它食品配料制成的乳状饮料(因此有时也称为“植物乳饮料”)，属于蛋白饮料类。植物蛋白饮料以其不含胆固醇或胆固醇含量较少、富含蛋白质和氨基酸、含适量不饱和脂肪酸以及营养成分较全面等特点，深受消费者欢迎。植物蛋白饮料产品根据其使用的主要原料的不同，可以分为核桃露(乳)饮料、杏仁露(乳)饮料、花生露(乳)饮料、椰子汁(乳)饮料、豆奶(乳)饮料以及含有多种植物蛋白的复合植物蛋白饮料等品种。
随着人们对生活品质的追求不断提高，对健康的诉求越来越强，体现在饮食方面，除了注重美味的体验，人们更重视饮食所带来的营养健康功效。相比其它饮料，植物蛋白饮料具备明显的优势，它拥有比动物蛋白更加完善的营养结构，原料来源上更有保障，因此近些年来，低脂肪、无胆固醇的植物蛋白资源受到人们越来越多的青睐。
前瞻产业研究院《2018-2023年中国植物蛋白饮料行业市场需求与投资规划分析报告》的统计数据显示，2007年以来各饮料子行业增速最快的是植物蛋白饮料，并且2016年植物蛋白饮料制造业市场规模占比最高，可见人们在饮食方面对健康诉求的体现；进而，预计2020年该行业的市场会进一步提升，仍为饮料制造业的主要细分品类。
其中，例如，花生内含丰富的脂肪和蛋白质，据测定花生内脂肪含量为约45％，蛋白质含量为约24-36％，糖含量为约20％；除此之外，花生含有丰富的维生素和矿物质，特别是含有人体必需的氨基酸，因此，花生又被称为“长生果”；花生还富含花生四烯酸和天然多酚类物质白藜芦醇，具有抗病毒、抗炎和抗菌等作用；另外，花生中含有的亚油酸可以减少胆固醇在体内的堆积，因而减少因胆固醇堆积而引发的多种心脑血管疾病的发生率。同时，核桃营养价值丰富，有“万岁子”、“长寿果”、“养生之宝”等多种美誉；核桃中约86％的脂肪是不饱和脂肪酸，并且富含铜、镁、钾、维生素B6、叶酸和维生素B1等，还含有纤维、磷、烟酸、铁、维生素B2和泛酸等；据测定每50克核桃中水分占3.6％，另含蛋白质7.2克、脂肪31克和碳水化合物9.2克；研究表明，核桃可降低血液中胆固醇的含量，降低冠心病和其它慢性病发病概率；核桃中丰富的ω-3 脂肪酸可以减少患抑郁症、注意力缺失多动症(ADHD)、癌症和老年痴呆症等的几率，并可以减少女性患乳腺癌、肿瘤和胆结石的风险。
另一方面，发酵型植物蛋白饮料是利用乳酸菌对经加工制得的植物果实、种子或果仁浆液进行发酵后再制成的乳状饮料。同样，根据使用的主要原料的不同，可分为发酵型核桃露(乳)饮料、发酵型杏仁露(乳) 饮料、发酵型花生露(乳)饮料、发酵型椰子汁(乳)饮料、发酵型豆奶(乳)饮料以及发酵型复合植物蛋白饮料等品种。其中，例如，作为发酵型复合植物蛋白饮料的一个示例，发酵型核桃花生露(乳)饮料是指将花生和核桃研磨成浆后接种乳酸菌而获得的产品。
就此而言，乳酸菌是国际公认的安全的发酵剂，乳酸菌在发酵植物蛋白饮料时产生的胞外多糖对铅等重金属有很好的吸附作用，同时又具有抗肿瘤、抗氧化、抗衰老和增强免疫力等作用；另外，植物蛋白饮料在发酵过程中不会产生乳糖，因而是乳糖不耐人群的良好替代选择；并且，植物蛋白不仅可以弥补大众植物性乳源的不足，而且在经过乳酸菌发酵后，蛋白质充分降解，提高了消化吸收率，营养价值大为提高，是理想的保健饮品。然而，作为兼具植物蛋白饮料与酸奶益生菌饮料两者优点于一身的产品，目前的研究和开发还不够充分，难以满足市场需求。
另一方面，植物蛋白饮料在经乳酸菌发酵后，虽然可以得到因发酵而产生的特殊风味，但植物果实、种子或果仁(例如大豆、花生、杏仁、核桃仁、椰子等)等原本的香味也会损失，导致口感下降。因此，本领域仍存在筛选出在发酵过程中既能保留原料乳本身的风味，又能赋予发酵产物独特的乳酸菌发酵风味的菌剂的需求，以解决发酵型植物蛋白饮料口感流失的问题。此外，本领域还希望获得能够同时适用于发酵诸如花生和核桃等多种植物乳源的用于发酵型植物蛋白饮料的菌剂。
发明内容
为了解决上述问题，本发明对多种可用于对植物蛋白饮料进行发酵而获得发酵型植物蛋白饮料的乳酸菌进行了筛选和分析，出人意料地发现通过采用包含两株特定菌株的菌剂对含植物蛋白的原料浆液进行发酵，可以获得既能保留原料乳本身的风味，又能呈现出独特的乳酸菌发酵风味的发酵型植物蛋白饮料，由此完成了本发明。
因此，在第一方面，本发明提供了一种用于制备发酵型植物蛋白饮料的菌剂，所述菌剂包含LCX25菌株和LL9菌株，其中，所述LCX25菌株的分类名称为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，于2018年11月6 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为 CGMCC No.16713；所述LL9菌株的分类名称为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus Lactis subsp Lactis)，于2018年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.16714。
优选地，所述发酵型植物蛋白饮料为发酵型核桃乳饮料、发酵型杏仁乳饮料、发酵型花生乳饮料、发酵型椰子乳饮料、发酵型豆奶饮料或发酵型复合植物蛋白饮料；更优选地，所述发酵型植物蛋白饮料为发酵型核桃乳饮料、发酵型花生乳饮料或发酵型核桃花生乳饮料。
优选地，所述菌剂以1:10-10:1、优选1:8-8:1、更优选1:5-5:1、进一步优选1:3-3:1、特别优选1:2-2:1、最优选1:1的比例包含所述LCX25菌株和所述LL9菌株，但本发明不限于此。
优选地，所述菌剂为冻干粉形式，但本发明不限于此。
在第二方面，本发明提供了第一方面所述的用于制备发酵型植物蛋白饮料的菌剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将所述LCX25菌株和所述LL9菌株分别接种至种子培养基中，在30-37℃下以转速180-200rpm培养12-24h，得到种子培养液；
(2)将步骤(1)获得的所述种子培养液分别接种至灭菌后的发酵培养基中，在30-37℃下以转速180-200rpm连续发酵12-24h，发酵过程中将发酵液的pH维持为5-7，得到菌种发酵液，其中，以1-2v/v％的比例将所述种子培养液分别接种至所述发酵培养基中；
(3)对步骤(2)获得的所述菌种发酵液进行离心并收集菌泥，分别得到所述LCX25菌株的菌泥和所述LL9菌株的菌泥；
(4)将所述LCX25菌株的菌泥和所述LL9菌株的菌泥混合，得到所述用于制备发酵型植物蛋白饮料的菌剂。
优选地，所述种子培养基和所述发酵培养基为MRS液体培养基。
优选地，在步骤(3)中，所述离心以转速4000-5000rpm进行10-15min。
优选地，所述方法进一步包括如下步骤：在步骤(3)之后及步骤(4) 之前，按照菌泥与保护剂为1:(3-5)的体积比加入保护剂，充分混合后置于-80℃预冻过夜，并经真空冷冻干燥制成冻干粉；更优选地，所述保护剂选自于海藻糖、谷氨酸钠、脱脂乳和甘油中的一种或多种，进一步优选地，所述保护剂为等体积的海藻糖、谷氨酸钠、脱脂乳和甘油的混合物。
优选地，在步骤(4)中，以1:10-10:1、优选1:8-8:1、更优选1:5-5:1、进一步优选1:3-3:1、特别优选1:2-2:1、最优选1:1的比例将所述LCX25 菌株的菌泥和所述LL9菌株的菌泥混合。
在第三方面，本发明提供了第一方面所述的用于制备发酵型植物蛋白饮料的菌剂在制备发酵型植物蛋白饮料中的用途。
优选地，所述发酵型植物蛋白饮料为发酵型核桃乳饮料、发酵型杏仁乳饮料、发酵型花生乳饮料、发酵型椰子乳饮料、发酵型豆奶饮料或发酵型复合植物蛋白饮料；更优选地，所述发酵型植物蛋白饮料为发酵型核桃乳饮料、发酵型花生乳饮料或发酵型核桃花生乳饮料。
优选地，在制备得到的所述发酵型植物蛋白饮料中，以活菌数为 1010cfu/mL-1012cfu/mL、更优选2×1010cfu/mL-5×1011cfu/mL、进一步优选4×1010cfu/mL-2.5×1011cfu/mL、特别优选8×1010cfu/mL-1.25×1011cfu/mL、最优选1011cfu/mL的量包含所述LCX25菌株和所述LL9菌株。
在第四方面，本发明提供了利用第一方面所述的用于制备发酵型植物蛋白饮料的菌剂制备得到的发酵型植物蛋白饮料。
优选地，所述发酵型植物蛋白饮料为发酵型核桃乳饮料、发酵型杏仁乳饮料、发酵型花生乳饮料、发酵型椰子乳饮料、发酵型豆奶饮料或发酵型复合植物蛋白饮料；更优选地，所述发酵型植物蛋白饮料为发酵型核桃乳饮料、发酵型花生乳饮料或发酵型核桃花生乳饮料。
优选地，在制备得到的所述发酵型植物蛋白饮料中，以活菌数为 1010cfu/mL-1012cfu/mL、更优选2×1010cfu/mL-5×1011cfu/mL、进一步优选4×1010cfu/mL-2.5×1011cfu/mL、特别优选8×1010cfu/mL-1.25× 1011cfu/mL、最优选1011cfu/mL的量包含所述LCX25菌株和所述LL9菌株。
有益效果
本发明的包含副干酪乳杆菌LCX25菌株和乳酸乳球菌乳酸亚种LL9 菌株的菌剂在对植物蛋白浆液原料进行发酵以制备发酵型植物蛋白饮料时，能够保留原料本身的风味并增加原料的乳风味；并且，由于该菌剂发酵获得的活菌数较高，可以在短时间完成发酵，节省生产成本；另外，本发明的菌剂中的菌株不含毒力基因，属于安全菌株，是适用于植物蛋白饮料发酵领域的新型牛源副干酪乳杆菌和乳酸乳球菌乳酸亚种。
本发明的其它特征和优势将通过以下具体实施方式进行详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明的菌剂可用于制备各种发酵型植物蛋白饮料，所得到的发酵型植物蛋白饮料既能保留原料乳本身的风味，又能呈现出独特的乳酸菌发酵风味。在本发明一些优选的实施方式中，所述发酵型植物蛋白饮料为发酵型核桃乳饮料、发酵型杏仁乳饮料、发酵型花生乳饮料、发酵型椰子乳饮料、发酵型豆奶饮料或发酵型复合植物蛋白饮料。在本发明一些更优选的实施方式中，所述发酵型植物蛋白饮料为发酵型核桃乳饮料、发酵型花生乳饮料或发酵型核桃花生乳饮料。但是，本发明不限于此。
对于用于对其进行发酵以制备发酵型植物蛋白饮料的各种含植物蛋白的原料浆液(例如大豆、花生、杏仁、核桃仁、椰子等的浆液或它们的混合浆液)，可以采用本领域的常规方法进行制备。
在本发明中，术语“植物蛋白饮料”和“植物乳饮料”可以互换使用；根据植物原料的不同，术语“乳饮料”、“露饮料”和“汁饮料”也可以互换使用。同样，在本发明中，术语“发酵型植物蛋白饮料”和“发酵型植物乳饮料”可以互换使用；根据植物原料的不同，术语“发酵型乳饮料”、“发酵型露饮料”和“发酵型汁饮料”也可以互换使用。
在本发明的菌剂中，副干酪乳杆菌LCX25菌株和乳酸乳球菌乳酸亚种LL9菌株的比例不受特别限定，在本发明一些优选的实施方式中，本发明的菌剂可以按照1:10-10:1、优选1:8-8:1、更优选1:5-5:1、进一步优选1:3-3:1、特别优选1:2-2:1、最优选1:1的比例包含所述LCX25菌株和所述LL9菌株。但是，本发明不限于此。
本发明的菌剂可以为液体形式或固体形式，为了便于储存和使用的目的，本发明的菌剂可以为冻干粉形式。但是，本发明不限于此。
可利用乳酸菌的标准培养方法制备本发明的菌剂的种子培养液和菌种发酵液。例如，所述种子培养液可通过如下过程制备：从平板上挑取副干酪乳杆菌LCX25菌株和乳酸乳球菌乳酸亚种LL9菌株的单菌落分别接种至作为种子培养基的MRS液体培养基中，在30-37℃下以转速180- 200rpm培养12-24h，得到种子培养液。例如，所述菌种发酵液可通过如下过程制备：将本发明的菌剂的种子培养液分别接种至例如置于发酵罐中的作为发酵培养基的灭菌后的MRS液体培养基中，在30-37℃下以转速180-200rpm连续发酵12-24h，发酵过程中将发酵液的pH维持为5-7，得到菌种发酵液，其中，以1-2v/v％的比例将所述种子培养液分别接种至 MRS液体培养基中。但是，本发明不限于此，本领域技术人员能够选择合适的方法和试剂来制备本发明的菌剂的种子培养液和菌种发酵液。
由LCX25菌株和LL9菌株获得的菌种发酵液具有较高的活菌数，可直接将其真空冷冻干燥以获得本发明的菌剂的冻干粉。优选地，以转速 4000-5000rpm对菌种发酵液进行离心10-15min并收集菌泥。优选地，按照菌泥与保护剂为1:(3-5)的体积比加入保护剂，充分混合后置于-80℃预冻过夜(例如8-12h)，并经真空冷冻干燥制成冻干粉。优选地，所述保护剂可选自于海藻糖、谷氨酸钠、脱脂乳和甘油中的一种或多种；更优选地，所述保护剂为等体积的海藻糖、谷氨酸钠、脱脂乳和甘油的混合物。
本发明的包含副干酪乳杆菌LCX25菌株和乳酸乳球菌乳酸亚种LL9 菌株的菌剂可用于对多种植物蛋白浆液底物进行发酵，所述底物包括但不限于核桃乳、杏仁乳、花生乳、椰子乳、豆奶或复合植物乳(例如但不限于核桃花生乳)，从而得到发酵型核桃露(乳)饮料、发酵型杏仁露 (乳)饮料、发酵型花生露(乳)饮料、发酵型椰子汁(乳)饮料、发酵型豆奶(乳)饮料或发酵型复合植物蛋白饮料(例如但不限于发酵型核桃花生乳饮料)等。在本发明一些优选的实施方式中，将本发明的菌剂用于对核桃乳和/或花生乳进行发酵，从而得到发酵型核桃露(乳)饮料、发酵型花生露(乳)饮料或发酵型核桃花生露(乳)饮料。
在本发明一些优选的实施方式中，在制备得到的所述发酵型植物蛋白饮料中，以活菌数为1010cfu/mL-1012cfu/mL、更优选2×1010cfu/mL-5× 1011cfu/mL、进一步优选4×1010cfu/mL-2.5×1011cfu/mL、特别优选8× 1010cfu/mL-1.25×1011cfu/mL、最优选1011cfu/mL的量包含所述LCX25菌株和所述LL9菌株。在本发明一些优选的实施方式中，在本发明的菌剂为冻干粉的情况下，可以按照例如0.01-0.1g冻干粉/100mL，包括例如0.02g 冻干粉/100mL、0.04g冻干粉/100mL、0.06g冻干粉/100mL或0.08g冻干粉/100mL的浓度将本发明的菌剂的冻干粉直接添加到植物蛋白浆液底物(例如无菌花生乳和核桃乳)中，只要保证活菌数在上述范围内即可。
实施例
接下来，通过实施例对本发明进行进一步详细的说明，但本发明不仅限于这些实施例。下述实施例中，除非特别说明，所用试剂、培养基均为市售商品，所用方法均为常规方法。
实施例中使用的MRS液体培养基为：蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、牛肉膏10.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸二铵2.0g、无水乙酸钠5.0g、硫酸锰0.25g、硫酸镁0.58g、吐温80 1.0mL，蒸馏水补至终体积1000mL，调节pH至5-7，121℃灭菌15-20min；实施例中使用的MRS固体培养基(平板)为：在如上所述制备的1000mL MRS液体培养基中添加琼脂18g，调节pH至5-7后高压灭菌。
实施例中采用新疆牧民传统发酵制作的酸牛乳作为样品来源，该酸牛乳采集自新疆喀什牧区牧民家的自制酸牛乳，保存于-80℃。
实施例1.副干酪乳杆菌LCX25菌株和乳酸乳球菌乳酸亚种LL9菌株的分离、筛选和鉴定
以新疆牧民传统发酵制作的酸牛乳作为样品来源，采用梯度稀释法将酸牛乳稀释液涂布于MRS固体培养基上，30-37℃培养24-48h，通过平板划线法纯化获得多个单菌落。在MRS液体培养基中对每个单菌落进行培养活化，取2μL活化好的菌液，点种至含1w/v％碳酸钙的MRS固体培养基表面，观察融钙圈直径的大小，筛选产乳酸能力高的菌株。随后，再次采用梯度稀释法，挑取溶钙圈较大的单菌落在MRS固体培养基上反复划线，并在30-37℃培养24-48h，直至菌落在颜色、大小和形态方面完全一致，将纯化完成的单菌落转接至MRS液体培养基中扩大培养，将该纯化培养获得的菌株分别命名为LCX25菌株和LL9菌株。
菌株的形态学鉴定和16s rDNA鉴定：
(1)形态学鉴定：LCX25菌株在MRS固体培养基上呈白色圆形凸起不透明菌落，显微镜下呈直或弯的杆状，单个或成对呈链状排列，符合副干酪乳杆菌的基本形态特征；LL9菌株在MRS固体培养基上呈白色圆形凸起不透明菌落，显微镜下呈圆形或椭圆形的球状，成对或呈链状排列，符合乳酸乳球菌乳酸亚种的基本形态特征。
(2)16s rDNA鉴定：提取LCX25菌株和LL9菌株的基因组DNA，对16s rDNA序列进行测序，测序结果参见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。将所得16s rDNA序列与NCBI数据库进行比对，发现LCX25菌株与副干酪乳杆菌JCM1171(GenBank：D16550.1)的同源性最高(LCX25菌株的16s rDNA序列与副干酪乳杆菌JCM1171的16s rDNA序列的序列一致性为99.93％)；LL9菌株与乳酸乳球菌乳酸亚种JCM5805(T)(GenBank： BALX01000047.1)的同源性最高(LL9菌株的16s rDNA序列与乳酸乳球菌乳酸亚种JCM5805(T)的16s rDNA序列的序列一致性为99.04％)。
基于上述形态学鉴定和16s rDNA鉴定结果，最终确定LCX25菌株和LL9菌株分别属于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和乳酸乳球菌乳酸亚种(LactococcusLactis subsp Lactis)。
其中，所述LCX25菌株于2018年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.16713；所述LL9菌株于2018年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.16714。
SEQ ID NO.1
CTCGCTCCCTAAAAGGGTTACGCCACCGGCTTCGGGTGTTACA AACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTA TTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGT GTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGA GATTAGCTTGACCTCGCGGTCTCGCAACTCGTTGTACCATCCATTGT AGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCA TCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTACTAGAGTGCCC AACTAAATGCTGGCAACTAGTCATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGA CTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCA CCTGTCATTTTGCCCCCGAAGGGGAAACCTGATCTCTCAGGTGATCA AAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAA CCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTT TCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGC TGCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCATTCATCGT TTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCT TTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCAC TGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTC CACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCGCTTCC TCGGTTAAGCCGAGGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGC GCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTA TTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGAT ACCGTCACGCCGACAACAGTTACTCTGCCGACCATTCTTCTCCAACA ACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGC TCCATCAGACTTGCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCC CGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCAACCT CTCAGTTCGGCTACGTATCATCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCA ACTAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCAAAAGCGATAGCTTACGCCATCTTTCAGCCAAGAACCATGCGGTTCTTGGATCTATGCGGTATTAGCA TCTGTTTCCAAATGTTATCCCCCACTTAAGGGCAGGTTACCCACGTG TTACTCACCCGTCCGCCACTCGTTCCATGTTGAATCTCGGTGCAAGCACCGATCATCAACGAGAACTCGTTCGACTG
SEQ ID NO.2
GGGCCGGGGCGGCGTGCTATACATGCAAGTTGAGCGCTGAAGG TTGGTACTTGTACCGACTGGATGAGCAGCGAACGGGTGAGTAACGC GTGGGGAATCTGCCTTTGAGCGGGGGACAACATTTGGAAACGAATG CTAATACCGCATAAAAACTTTAAACACAAGTTTTAAGTTTGAAAGAT GCAATTGCATCACTCAAAGATGATCCCGCGTTGTATTAGCTAGTTGG TGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGATGATACATAGCCGACCTGAGAG GGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGG GAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGA GCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGT TGGTAGAGAAGAACGTTGGTGAGAGTGGAAAGCTCATCAAGTGAC GGTAACTACCCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCG GTAATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGC GAGCGCAGGTGGTTTATTAAGTCTGGTGTAAAAGGCAGTGGCTCAA CCATTGTATGCATTGGAAACTGGTAGACTTGAGTGCAGGAGAGGAG AGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAA CACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGCCTGTAACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC GCCGTAAACGATGAGTGCTAGATGTAGGGAGCTATAAGTTCTCTGTA TCGCAGCTAACGCAATAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAA GGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGA GCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTT GACATACTCGTGCTATTCCTAGAGATAGGAAGTTCCTTCGGGACACG GGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT GGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGTTGCCATCA TTAAGTTGGGCACTCTAACGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAA GGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACA CACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTCGCGAGACAGTGATGTT TAGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAAC TCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCC GCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCA CGGGAGTTGGGAGTACCCGAAGTAGGTTGCCTAACCGCAAGGAGG GCGCTCCTAAGTAAGACCCGTAGCCGG
实施例2.本发明的包含副干酪乳杆菌LCX25菌株和乳酸乳球菌乳酸亚种LL9菌株的菌剂的制备(冻干粉形式)
种子培养液的制备：挑取实施例1中得到的副干酪乳杆菌LCX25菌株和乳酸乳球菌乳酸亚种LL9菌株的单菌落，分别接种至MRS液体培养基中，在30-37℃下以转速180-200rpm培养12-24h，得到种子培养液。
菌种发酵液的制备(扩大培养)：在发酵罐中加入MRS液体培养基， 121℃灭菌20min，灭菌完成后冷却至30-37℃，以1-2v/v％的比例分别加入上述种子培养液，在30-37℃下以转速180-200rpm连续发酵24h，发酵过程中将发酵液的pH维持为5-7，得到菌种发酵液。
本发明的菌剂的冻干粉的制备：以4000-5000rpm对菌种发酵液进行离心10-15min并收集菌泥；按菌泥与保护剂为1:(3-5)的体积比添加保护剂(等体积的海藻糖、谷氨酸钠、脱脂乳和甘油的混合物)；充分混合后置于-80℃预冻过夜(例如8-12h)，并经真空冷冻干燥制成冻干粉。在对含植物蛋白的原料浆液进行发酵时，将两种菌株的冻干粉混合使用。
实施例3.副干酪乳杆菌LCX25菌株和乳酸乳球菌乳酸亚种LL9菌株产酸能力的测定
菌种活化：挑取实施例1中得到的副干酪乳杆菌LCX25菌株和乳酸乳球菌乳酸亚种LL9菌株的单菌落，分别接种至MRS液体培养基中，在 30-37℃下以转速180-200rpm培养12-24h，得到菌液。
产酸能力的检测：采用点种法将2μL菌液点种至含有1w/v％碳酸钙的MRS固体培养基表面，在30-37℃下培养24-48h，测量溶钙圈直径以评价各菌株的产酸能力。其结果是，副干酪乳杆菌LCX25菌株的融钙圈直径可达26mm，而乳酸乳球菌乳酸亚种LL9菌株的融钙圈直径可达24mm，两者均具有相当可观的产酸能力。
实施例4.利用本发明的包含副干酪乳杆菌LCX25菌株和乳酸乳球菌乳酸亚种LL9菌株的菌剂制备发酵型植物蛋白饮料
花生乳的制备：将新鲜花生仁除杂后在100℃烘炒15-20min，用木板搓揉去红衣以去除花生皮上的色素和单宁的涩味；将脱去红衣并经水冲洗干净的花生仁按1:2(w/v)的比例加入30℃的饱和食盐水中1min，再把花生仁按1:15(w/v)的比例加入100℃的0.5％碳酸氢钠水溶液中处理20min；取出沥干水分，并用清水清洗除去附着的碱液；加入花生仁质量15倍的80℃热水浸泡花生仁，先经磨浆机进行粗磨，然后经胶体磨进行细磨，使组织内蛋白质及油脂充分析出；然后将料液过300目滤布去除残渣，将残渣用80℃水搅拌分散，再进行研磨甩渣分离2次，提取出残渣中残存的水溶性蛋白质；将多次滤液合并，混匀即为花生乳。
核桃乳的制备：挑选肉质饱满的优质核桃仁，用清水漂洗去除杂质；1kg核桃加2L清水浸泡4h，浸泡后的核桃仁按1:15(w/v)加入4％碳酸钠溶液，煮沸3min，用高压水枪去除皮衣；清水洗净后晾干；90℃烘烤15min，再将核桃仁按1:8(w/v)比例加入蒸馏水，于80℃经磨浆机进行粗磨，再经胶体磨进行细磨；滤液用200目滤布过滤，将残渣再进行研磨2次，以提高蛋白质得率；将多次滤液合并，混匀即为核桃乳。
将所制备的花生乳和核桃乳各取2.4L，分装为200mL/瓶，110-116℃灭菌5-10min，待其温度冷却至37-42℃，在无菌条件下按0.02％的接种比例(重量体积比)将实施例2中得到的本发明菌剂的冻干粉分别接种至无菌花生乳和核桃乳中。具体而言，在单独接种的情况下，将LCX25 菌株和LL9菌株的冻干粉各自分别接种至无菌花生乳和核桃乳中，接种比例为0.02％(重量体积比)；在共同接种的情况下，将LCX25菌株和 LL9菌株的冻干粉一起分别接种至无菌花生乳和核桃乳中，LCX25菌株和LL9菌株的混合接种比例为1:1和3:1，接种总比例为0.02％(重量体积比)。同时，将丹尼斯克YO-MIX611(市售产品)和科汉森YF903(市售产品)作为对照，同样在无菌条件下按0.02％的接种比例(重量体积比)分别接种至无菌花生乳和核桃乳中。
将接种菌剂后的花生乳和核桃乳混匀，静置于42℃进行发酵，pH达到4.5时终止发酵，检测发酵乳的质构，并由专家进行感官评价(请参见乌雪岩.酸奶感官评价与质构的相关性研究[J].中国乳品工业,2015, 43(10):52-54.)。检测和评价结果如表1-表4所示。
由表1-表2可知，与两种竞品丹尼斯克YO-MIX611和科汉森YF903 相比，利用本发明的包含副干酪乳杆菌LCX25菌株和乳酸乳球菌乳酸亚种LL9菌株的菌剂(LCX25:LL9＝1:1)对植物蛋白浆液原料进行发酵后，所得发酵型植物蛋白饮料的凝胶破裂强度为9.365g，拉丝长度为9.301 mm，硬度为30.261g，稠度为634.360g/s，粘度为222.530mPa·s，在最短的发酵时间内取得了最好的凝乳效果；利用本发明的包含副干酪乳杆菌LCX25菌株和乳酸乳球菌乳酸亚种LL9菌株的菌剂(LCX25:LL9＝3:1) 对植物蛋白浆液原料进行发酵后，也在相对较短的发酵时间内取得了相对较好的凝乳效果；单菌发酵(仅LCX25菌株或仅LL9菌株)及两种竞品丹尼斯克YO-MIX611和科汉森YF903的发酵时间较长且凝乳效果差。
进而，由表3-表4可知，与两种竞品丹尼斯克YO-MIX611和科汉森 YF903(发酵7-9h后活菌数仅为107-108cfu/mL的量级)相比，利用本发明的包含副干酪乳杆菌LCX25菌株和乳酸乳球菌乳酸亚种LL9菌株的菌剂(LCX25:LL9＝1:1)对植物蛋白浆液原料进行发酵时，发酵6-7h后活菌数即可高达1.8×1011cfu/mL；利用本发明的包含副干酪乳杆菌LCX25 菌株和乳酸乳球菌乳酸亚种LL9菌株的菌剂(LCX25:LL9＝3:1)对植物蛋白浆液原料进行发酵时，发酵8h后活菌数也可达到1010cfu/mL这一量级。即，本发明的菌剂可以在短时间完成发酵，节省生产成本。
此外，与两种竞品丹尼斯克YO-MIX611和科汉森YF903(所得发酵型植物蛋白饮料均无特殊香味，并且本身的花生或核桃香味消失，还产生了糊口感)相比，利用本发明的包含副干酪乳杆菌LCX25菌株和乳酸乳球菌乳酸亚种LL9菌株的菌剂(LCX25:LL9＝1:1以及LCX25:LL9＝3:1) 发酵得到的发酵型核桃乳饮料和发酵型花生乳饮料在口感方面容易入口且清爽，无糊口性，并且呈现出浓郁的花生味和核桃味，增加了原料本身的香味，口感更为丰富。与之相比，单独的LL9菌株发酵后有轻微糊口感并且造成本身的花生或核桃香味减弱；而单独的LCX25菌株发酵时间较长，发酵后的花生味和核桃味相较本发明的菌剂而言也有所减弱。
由此可见，本发明的包含副干酪乳杆菌LCX25菌株和乳酸乳球菌乳酸亚种LL9菌株的菌剂不仅相对于现有市售产品在凝乳效果、发酵时间和所得发酵型植物蛋白饮料的口感方面均取得了更为优异的效果，而且还通过将副干酪乳杆菌LCX25菌株和乳酸乳球菌乳酸亚种LL9菌株组合而获得了预料不到的协同效果。
表1发酵型核桃乳饮料的发酵时间和质构
Figure RE-GDA0002025759110000141
表2发酵型花生乳饮料的发酵时间和质构
Figure RE-GDA0002025759110000142
表3发酵型核桃乳饮料的感官评价结果
Figure RE-GDA0002025759110000151
表4花生乳饮料的感官评价结果
Figure RE-GDA0002025759110000152
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种变型，这些变型均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 中粮营养健康研究院有限公司
<120> 一种用于制备发酵型植物蛋白饮料的菌剂
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1431
<212> DNA
<213> 副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)
<400> 1
ctcgctccct aaaagggtta cgccaccggc ttcgggtgtt acaaactctc atggtgtgac 60
gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc gtgctgatcc gcgattacta 120
gcgattccga cttcgtgtag gcgagttgca gcctacagtc cgaactgaga atggctttaa 180
gagattagct tgacctcgcg gtctcgcaac tcgttgtacc atccattgta gcacgtgtgt 240
agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc caccttcctc cggtttgtca 300
ccggcagtct tactagagtg cccaactaaa tgctggcaac tagtcataag ggttgcgctc 360
gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacaaccatg caccacctgt 420
cattttgccc ccgaagggga aacctgatct ctcaggtgat caaaagatgt caagacctgg 480
taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg 540
tcaattcctt tgagtttcaa ccttgcggtc gtactcccca ggcggaatgc ttaatgcgtt 600
agctgcggca ctgaagggcg gaaaccctcc aacacctagc attcatcgtt tacggcatgg 660
actaccaggg tatctaatcc tgttcgctac ccatgctttc gagcctcagc gtcagttaca 720
gaccagacag ccgccttcgc cactggtgtt cttccatata tctacgcatt tcaccgctac 780
acatggagtt ccactgtcct cttctgcact caagtttccc agtttccgat gcgcttcctc 840
ggttaagccg agggctttca catcagactt aaaaaaccgc ctgcgctcgc tttacgccca 900
ataaatccgg ataacgcttg ccacctacgt attaccgcgg ctgctggcac gtagttagcc 960
gtggctttct ggttggatac cgtcacgccg acaacagtta ctctgccgac cattcttctc 1020
caacaacaga gttttacgac ccgaaagcct tcttcactca cgcggcgttg ctccatcaga 1080
cttgcgtcca ttgtggaaga ttccctactg ctgcctcccg taggagtttg ggccgtgtct 1140
cagtcccaat gtggccgatc aacctctcag ttcggctacg tatcatcgcc ttggtgagcc 1200
attacctcac caactagcta atacgccgcg ggtccatcca aaagcgatag cttacgccat 1260
ctttcagcca agaaccatgc ggttcttgga tctatgcggt attagcatct gtttccaaat 1320
gttatccccc acttaagggc aggttaccca cgtgttactc acccgtccgc cactcgttcc 1380
atgttgaatc tcggtgcaag caccgatcat caacgagaac tcgttcgact g 1431
<210> 2
<211> 1458
<212> DNA
<213> 乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus Lactis subsp Lactis)
<400> 2
gggccggggc ggcgtgctat acatgcaagt tgagcgctga aggttggtac ttgtaccgac 60
tggatgagca gcgaacgggt gagtaacgcg tggggaatct gcctttgagc gggggacaac 120
atttggaaac gaatgctaat accgcataaa aactttaaac acaagtttta agtttgaaag 180
atgcaattgc atcactcaaa gatgatcccg cgttgtatta gctagttggt gaggtaaagg 240
ctcaccaagg cgatgataca tagccgacct gagagggtga tcggccacat tgggactgag 300
acacggccca aactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttcggcaatg gacgaaagtc 360
tgaccgagca acgccgcgtg agtgaagaag gttttcggat cgtaaaactc tgttggtaga 420
gaagaacgtt ggtgagagtg gaaagctcat caagtgacgg taactaccca gaaagggacg 480
gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtccc gagcgttgtc cggatttatt 540
gggcgtaaag cgagcgcagg tggtttatta agtctggtgt aaaaggcagt ggctcaacca 600
ttgtatgcat tggaaactgg tagacttgag tgcaggagag gagagtggaa ttccatgtgt 660
agcggtgaaa tgcgtagata tatggaggaa caccggtggc gaaagcggct ctctggcctg 720
taactgacac tgaggctcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc 780
acgccgtaaa cgatgagtgc tagatgtagg gagctataag ttctctgtat cgcagctaac 840
gcaataagca ctccgcctgg ggagtacgac cgcaaggttg aaactcaaag gaattgacgg 900
gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca 960
ggtcttgaca tactcgtgct attcctagag ataggaagtt ccttcgggac acgggataca 1020
ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1080
cgcaacccct attgttagtt gccatcatta agttgggcac tctaacgaga ctgccggtga 1140
taaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca 1200
cacgtgctac aatggatggt acaacgagtc gcgagacagt gatgtttagc taatctctta 1260
aaaccattct cagttcggat tgtaggctgc aactcgccta catgaagtcg gaatcgctag 1320
taatcgcgga tcagcacgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1380
acaccacggg agttgggagt acccgaagta ggttgcctaa ccgcaaggag ggcgctccta 1440
agtaagaccc gtagccgg 1458

Claims (10)

1.一种用于制备发酵型植物蛋白饮料的菌剂，所述菌剂包含LCX25菌株和LL9菌株，其中，
所述LCX25菌株的分类名称为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，于2018年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.16713；
所述LL9菌株的分类名称为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus Lactis subspLactis)，于2018年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNo.16714。
2.如权利要求1所述的菌剂，其中，所述菌剂以1:10-10:1、优选1:8-8:1、更优选1:5-5:1、进一步优选1:3-3:1、特别优选1:2-2:1、最优选1:1的比例包含所述LCX25菌株和所述LL9菌株。
3.如权利要求1或2所述的菌剂，其中，所述菌剂为冻干粉形式。
4.如权利要求1-3中任一项所述的用于制备发酵型植物蛋白饮料的菌剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将所述LCX25菌株和所述LL9菌株分别接种至种子培养基中，在30-37℃下以转速180-200rpm培养12-24h，得到种子培养液；
(2)将步骤(1)获得的所述种子培养液分别接种至灭菌后的发酵培养基中，在30-37℃下以转速180-200rpm连续发酵12-24h，发酵过程中将发酵液的pH维持为5-7，得到菌种发酵液，其中，以1-2v/v％的比例将所述种子培养液分别接种至所述发酵培养基中；
(3)对步骤(2)获得的所述菌种发酵液进行离心并收集菌泥，分别得到所述LCX25菌株的菌泥和所述LL9菌株的菌泥；以及
(4)将所述LCX25菌株的菌泥和所述LL9菌株的菌泥混合，得到所述用于制备发酵型植物蛋白饮料的菌剂，
优选地，在步骤(4)中，以1:10-10:1、优选1:8-8:1、更优选1:5-5:1、进一步优选1:3-3:1、特别优选1:2-2:1、最优选1:1的比例将所述LCX25菌株的菌泥和所述LL9菌株的菌泥混合。
5.如权利要求4所述的制备方法，其中，所述种子培养基和所述发酵培养基为MRS液体培养基。
6.如权利要求4或5所述的制备方法，其中，所述制备方法进一步包括如下步骤：
在步骤(3)之后及步骤(4)之前，按照菌泥与保护剂为1:(3-5)的体积比加入保护剂，充分混合后置于-80℃预冻过夜，并经真空冷冻干燥制成冻干粉；优选地，所述保护剂选自于海藻糖、谷氨酸钠、脱脂乳和甘油中的一种或多种；更优选地，所述保护剂为等体积的海藻糖、谷氨酸钠、脱脂乳和甘油的混合物。
7.如权利要求1-3中任一项所述的用于制备发酵型植物蛋白饮料的菌剂在制备发酵型植物蛋白饮料中的用途，
优选地，所述发酵型植物蛋白饮料为发酵型核桃乳饮料、发酵型杏仁乳饮料、发酵型花生乳饮料、发酵型椰子乳饮料、发酵型豆奶饮料或发酵型复合植物蛋白饮料；更优选地，所述发酵型植物蛋白饮料为发酵型核桃乳饮料、发酵型花生乳饮料或发酵型核桃花生乳饮料。
8.如权利要求7所述的用途，其中，在制备得到的所述发酵型植物蛋白饮料中，以活菌数为1010cfu/mL-1012cfu/mL、更优选2×1010cfu/mL-5×1011cfu/mL、进一步优选4×1010cfu/mL-2.5×1011cfu/mL、特别优选8×1010cfu/mL-1.25×1011cfu/mL、最优选1011cfu/mL的量包含所述LCX25菌株和所述LL9菌株。
9.利用如权利要求1-3中任一项所述的用于制备发酵型植物蛋白饮料的菌剂制备得到的发酵型植物蛋白饮料，
优选地，所述发酵型植物蛋白饮料为发酵型核桃乳饮料、发酵型杏仁乳饮料、发酵型花生乳饮料、发酵型椰子乳饮料、发酵型豆奶饮料或发酵型复合植物蛋白饮料；更优选地，所述发酵型植物蛋白饮料为发酵型核桃乳饮料、发酵型花生乳饮料或发酵型核桃花生乳饮料。
10.如权利要求9所述的发酵型植物蛋白饮料，其中，所述发酵型植物蛋白饮料中以活菌数为1010cfu/mL-1012cfu/mL、更优选2×1010cfu/mL-5×1011cfu/mL、进一步优选4×1010cfu/mL-2.5×1011cfu/mL、特别优选8×1010cfu/mL-1.25×1011cfu/mL、最优选1011cfu/mL的量包含所述LCX25菌株和所述LL9菌株。
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