CN111375063A - 蛋白功能抑制剂在制备治疗功能性垂体腺瘤的药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种蛋白功能抑制剂在制备治疗功能性垂体腺瘤的药物中的用途，其中，所述蛋白抑制剂为能够抑制MITF的蛋白功能和/或蛋白表达量的蛋白抑制剂。本公开的蛋白抑制剂能够有效地抑制功能性垂体腺瘤尤其是泌乳素腺瘤的细胞增殖并诱导细胞发生凋亡，为功能性垂体腺瘤尤其是泌乳素腺瘤的治疗提供了一种新的解决方案。

Description

蛋白功能抑制剂在制备治疗功能性垂体腺瘤的药物中的用途
技术领域
本公开涉及一种蛋白功能抑制剂在制备治疗功能性垂体腺瘤的药物中的用途。
背景技术
泌乳素腺瘤是由垂体泌乳素细胞瘤分泌过量泌乳素(PRL)引起的下丘脑-垂体疾病，在垂体功能性肿瘤中的发生率约占40％，是最常见的神经内分泌疾病类型。临床上难治性泌乳素腺瘤的特征表现为侵袭邻近结构、肿瘤快速生长、肿瘤直径超过4cm、对常规治疗的抗性和高复发率。目前仍缺乏针对性的、有效的药物治疗手段。
因此有必要开发能够影响泌乳素腺瘤分化、增殖、凋亡和侵袭过程的方法和药品，从而为提高泌乳素腺瘤的治疗及预后效果提供有效途径。
发明内容
本公开的一个目的是提供一种能够影响肿瘤分化、增殖、凋亡和侵袭过程的蛋白功能抑制剂在制备治疗功能性垂体腺瘤的药物中的用途。
本公开的另一个目的是提供一种定量检测分子标志物的试剂在制备用于评价泌乳素腺瘤侵袭性行为和/或预后的产品中的用途和一种评价泌乳素腺瘤侵袭性行为和/或预后的系统。
为了实现上述目的，本公开第一方面：提供一种蛋白抑制剂在制备治疗功能性垂体腺瘤的药物中的用途，其中，所述蛋白抑制剂为能够抑制MITF的蛋白功能和/或蛋白表达量的蛋白抑制剂。
可选地，所述蛋白抑制剂为miR-137。
可选地，所述功能性垂体腺瘤为泌乳素腺瘤。
本公开第二方面：提供一种定量检测分子标志物的试剂在制备用于评价泌乳素腺瘤侵袭性行为和/或预后的产品中的用途，其中，所述分子标志物包括MITF。
可选地，所述分子标志物还包括miR-137。
可选地，定量检测分子标志物是通过以下步骤进行的：
1)获得泌乳素腺瘤组织样品；以及
2)确定样品中所述分子标志物的表达量。
本公开第三方面：提供一种定量检测分子标志物的试剂在制备用于评价泌乳素腺瘤侵袭性行为和/或预后的产品中的用途，其中，所述分子标志物包括miR-137。
可选地，定量检测分子标志物是通过以下步骤进行的：
1)获得泌乳素腺瘤组织样品；以及
2)确定样品中所述分子标志物的表达量。
本公开第四方面：提供一种评价泌乳素腺瘤侵袭性行为和/或预后的系统，该系统包括计算装置、用于输入泌乳素腺瘤患者个体的分子标志物的表达量的输入装置和用于输出泌乳素腺瘤诊断结果和/或泌乳素腺瘤预后结果的输出装置；其中，所述分子标志物包括MITF和miR-137；所述计算装置包括存储器和处理器；所述存储器中存储有计算机程序，用于将所述泌乳素腺瘤患者个体的分子标志物的表达水平与正常组织样品中分子标志物的表达水平进行比较，并判断与正常组织样品相比的分子标志物表达量差异；所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，并实现如下的判别：
当MITF表达量上调时，判定为泌乳素腺瘤具有侵袭性，和/或患者预后不良；
当MITF表达量下调时，判定为泌乳素腺瘤具有非侵袭性，和/或患者预后良好；
当miR-137表达量上调时，判定为泌乳素腺瘤具有非侵袭性，和/或患者预后良好；
当miR-137表达量下调时，判定为泌乳素腺瘤具有侵袭性，和/或患者预后不良。
本公开第五方面：提供一种评价泌乳素腺瘤侵袭性行为和/或预后的系统，该系统包括计算装置、用于输入泌乳素腺瘤患者个体的分子标志物的表达量的输入装置和用于输出泌乳素腺瘤诊断结果和/或泌乳素腺瘤预后结果的输出装置；其中，所述分子标志物包括miR-137；所述计算装置包括存储器和处理器；所述存储器中存储有计算机程序，用于将所述泌乳素腺瘤患者个体的分子标志物的表达水平与正常组织样品中分子标志物的表达水平进行比较，并判断与正常组织样品相比的分子标志物表达量差异；所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，并实现如下的判别：
当miR-137表达量上调时，判定为泌乳素腺瘤具有非侵袭性，和/或患者预后良好；
当miR-137表达量下调时，判定为泌乳素腺瘤具有侵袭性，和/或患者预后不良。
通过上述技术方案，本公开的蛋白抑制剂能够有效地抑制功能性垂体腺瘤尤其是泌乳素腺瘤的细胞增殖并诱导细胞发生凋亡，为功能性垂体腺瘤尤其是泌乳素腺瘤的治疗提供了一种新的解决方案。本公开所提供的用途和系统可以应用于通过检测分子标志物的表达量对泌乳素腺瘤患者进行诊断并判断预后，为指导临床诊疗提供有效依据。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1A为miR-137在正常人垂体组织样本(Normal)、非侵袭性泌乳素腺瘤组织样本(Non-invasive)和侵袭性泌乳素腺瘤组织样本(Invasive)中表达量的对比图；图1B为高、低表达miR-137泌乳素腺瘤患者的复发缓解时间差异，上侧线为低表达miR-137泌乳素腺瘤患者，下侧线代表高表达miR-137泌乳素腺瘤患者；图1C、D为IHC染色结果；图1E为蛋白质印迹实验结果，Control代表对照组，GAPDH代表甘油醛-3-磷酸脱氢酶，为蛋白印迹实验的内参。
图2A示出了miR-137模拟物转染到MMQ细胞和GH3细胞后，抑制MITF的mRNA和蛋白的表达，图2B示出了双荧光素酶报告基因试验提示MITF是miR-137直接作用的靶基因。
图3A为miR-137模拟物被转染到MMQ细胞和GH3细胞时的细胞增殖情况，图3B为高倍视野(HPF)下的侵袭性细胞数，图3C为细胞凋亡率，其中miR-137M代表miR-137模拟物，miR-137MC代表miR-137模拟物空载对照，C代表阴性对照组。
图4A为对大鼠注射miR-137后的肿瘤体积变化情况，图4B为对大鼠注射shMITF后的肿瘤体积变化情况，图4C为蛋白质印迹实验结果。
图5A为pEGFP-N1-MITF被转染到MMQ细胞和GH3细胞时的细胞增殖情况，图5B为高倍视野(HPF)下的侵袭性细胞数。
具体实施方式
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开第一方面：提供一种蛋白抑制剂在制备治疗功能性垂体腺瘤的药物中的用途，其中，所述蛋白抑制剂为能够抑制MITF的蛋白功能和/或蛋白表达量的蛋白抑制剂。
根据本公开，MITF(小眼畸形相关转录因子)是一种具有典型螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链结构的转录因子，参与生物体生长、发育、分化和功能调节等各个方面。本申请的发明人在研究中发现，MITF与功能性垂体腺瘤尤其是泌乳素腺瘤的肿瘤发生和侵袭有关，侵袭性泌乳素腺瘤组织比非侵袭性泌乳素腺瘤组织和正常垂体组织具有更高的MITF表达量。通过抑制MITF的蛋白功能和/或蛋白表达量，能够抑制功能性垂体腺瘤尤其是泌乳素腺瘤的发生和侵袭。
进一步地，所述蛋白抑制剂可以为miR-137。miR-137是位于染色体1p22上的miRNA。miRNA是含有20～22个核苷酸的非编码RNA，其通过与靶mRNA的3'UTR结合来调节基因表达，阻止蛋白质翻译或诱导mRNA不稳定。本申请的发明人在研究中发现，miR-137通过与MITF mRNA的3'UTR结合而下调MITF的表达，从而抑制泌乳素腺瘤细胞的增殖和侵袭，促进细胞凋亡，此外，低水平的miR-137还能够预测泌乳素腺瘤复发的高风险。
根据本公开，所述蛋白抑制剂特别适合用于治疗泌乳素腺瘤，因此在上述用途中，所述功能性垂体腺瘤优选为泌乳素腺瘤。
本公开第二方面：提供一种定量检测分子标志物的试剂在制备用于诊断泌乳素腺瘤和/或评价泌乳素腺瘤预后的产品中的用途，其中，所述分子标志物包括MITF。
进一步地，所述分子标志物还包括miR-137。
根据本公开，MITF在NCBI数据库中的参考编号为Gene ID：4286；miR-137在NCBI数据库中的参考编号为Gene ID：406928。
进一步地，定量检测分子标志物是通过以下步骤进行的：
1)获得泌乳素腺瘤组织样品；以及
2)确定样品中所述分子标志物的表达量。
其中，步骤2)的确定样品中所述分子标志物的表达量方法可以选自PCR方法、Western印迹、组织微阵列和其他免疫组织化学技术。
本公开第三方面：提供一种定量检测分子标志物的试剂在制备用于评价泌乳素腺瘤侵袭性行为和/或预后的产品中的用途，其中，所述分子标志物包括miR-137。
进一步地，定量检测分子标志物是通过以下步骤进行的：
1)获得泌乳素腺瘤组织样品；以及
2)确定样品中所述分子标志物的表达量。
其中，步骤2)的确定样品中所述分子标志物的表达量方法可以为PCR方法等。
本公开第四方面：提供一种评价泌乳素腺瘤侵袭性行为和/或预后的系统，该系统包括计算装置、用于输入泌乳素腺瘤患者个体的分子标志物的表达量的输入装置和用于输出泌乳素腺瘤诊断结果和/或泌乳素腺瘤预后结果的输出装置；其中，所述分子标志物包括MITF和miR-137；所述计算装置包括存储器和处理器；所述存储器中存储有计算机程序，用于将所述泌乳素腺瘤患者个体的分子标志物的表达水平与正常组织样品中分子标志物的表达水平进行比较，并判断与正常组织样品相比的分子标志物表达量差异；所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，并实现如下的判别：
当MITF表达量上调时，判定为泌乳素腺瘤具有侵袭性，和/或患者预后不良；
当MITF表达量下调时，判定为泌乳素腺瘤具有非侵袭性，和/或患者预后良好；
当miR-137表达量上调时，判定为泌乳素腺瘤具有非侵袭性，和/或患者预后良好；
当miR-137表达量下调时，判定为泌乳素腺瘤具有侵袭性，和/或患者预后不良。
本公开第五方面：提供一种评价泌乳素腺瘤侵袭性行为和/或预后的系统，该系统包括计算装置、用于输入泌乳素腺瘤患者个体的分子标志物的表达量的输入装置和用于输出泌乳素腺瘤诊断结果和/或泌乳素腺瘤预后结果的输出装置；其中，所述分子标志物包括miR-137；所述计算装置包括存储器和处理器；所述存储器中存储有计算机程序，用于将所述泌乳素腺瘤患者个体的分子标志物的表达水平与正常组织样品中分子标志物的表达水平进行比较，并判断与正常组织样品相比的分子标志物表达量差异；所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，并实现如下的判别：
当miR-137表达量上调时，判定为泌乳素腺瘤具有非侵袭性，和/或患者预后良好；
当miR-137表达量下调时，判定为泌乳素腺瘤具有侵袭性，和/或患者预后不良。
本公开所提供的用途和系统可以应用于通过检测分子标志物的表达量对泌乳素腺瘤患者进行诊断并判断预后，为指导临床诊疗提供有效依据。
以下对通过实施例对本公开进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
实施例中，所有统计分析均使用SPSS 18.0统计软件。所有数据表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。统计分析采用单因素方差分析或学生t检验。根据Kaplan-Meier估计计算存活曲线。P值<0.05则认为显著不同。
实施例
采用2010年至2013年在首都医科大学北京天坛医院接受肿瘤切除术的30例泌乳素腺瘤案例进行分析。根据血浆催乳素(PRL)>200ng/mL，磁共振成像(MRI)和PRL阳性免疫染色确诊泌乳素腺瘤。平均术后随访48.4个月(范围：15-60个月)。侵袭性垂体腺瘤定义为基于MRI的Hardy-WilsonIV级肿瘤和/或Knosp III级和IV级肿瘤。在上述标准下，15名患者被诊断为患有侵袭性泌乳素腺瘤，15名患者被诊断为具有非侵袭性泌乳素腺瘤。肿瘤复发定义为MRI上的肿瘤再生。无复发存活率的测定范围由手术日期到肿瘤复发日期。在最后一次神经影像学随访时对患者进行检查。30例泌乳素瘤患者的临床特征见表1。
表1
特征 患者
性别
男 13(43.3％)
女 17(56.7％)
年龄，岁(均值±标准差，区间) 38.4±12.8,16–64
侵袭性
非侵袭性 15(50％)
侵袭性 15(50％)
平均随访时间，月(均值±标准差，区间) 48.4±3.0,15–60
随访结果
复发 10(33.3％)
未复发 20(66.7％)
MiR-137表达
低水平表达 14(46.7％)
高水平表达 16(53.3％)
一、肿瘤样品和组织微阵列构建
将福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片用苏木精和曙红(H&E)染色。从石蜡包埋的组织块中选择三个直径为2.0mm的核心活组织检查切片，并使用Minicore TissueArrayer全自动组织芯片仪(Mitogen，UK)转移至组织微阵列(TMA)。通过连续切片机将组织微阵列切成4μm切片。随机排列样品并在TMA载玻片上匿名化。为了减少抗原性的丧失，在1周内处理微阵列切片。
二、免疫组织化学实验检测结合抗体
在进行免疫组织化学(IHC)检测之前，用H&E染色TMA载玻片并评估质量和肿瘤含量。TMA在Leica BOND-III全自动免疫组化染色机(Leica Biosystems，Germany)自动随机连续进入载玻片染色系统中处理，同时进行几次IHC测定。使用Bond聚合物精制检测系统(Leica Biosystems，Germany)检测一抗。在同一运行中用针对MITF(Abcam，1：800)的一抗染色TMA以避免测定间变异。使用Aperio AT2数字扫描仪(Leica Biosystems，Germany)检查免疫染色的载玻片的表达。染色强度分为4个等级：0，阴性；1+，弱阳性；2+，阳性；以及3+，强阳性。记录免疫染色的百分比。H分数计算如下：
H分数＝(1+等级细胞占比)+2×(2+细胞等级占比)+3×(3+等级细胞占比)
由图1A可见，与5个正常人垂体组织样本相比，miR-137在非侵袭组中表达水平较低(倍数从正常变化，0.0135±0.0120)，低于侵袭组(倍数变化为正常，0.0978±0.0321)。选择所有30个泌乳素腺瘤样品的中值作为区分高表达miR-137的肿瘤和低表达miR-137的肿瘤的临界点。由图1B可见，14/30(46.7％)的泌乳素腺瘤样本具有低表达miR-137，患者中位无复发时间为54.0±3.1个月，而16/30(53.3％)的泌乳素腺瘤样本具有高表达miR-137，患者中位无复发时间为38.0±3.7个月。Kaplan-Meier分析显示高表达miR-137的肿瘤具有较长的无复发存活率(P<0.05)。由图1C，D可见，IHC染色显示MITF在非侵袭性组(H评分：108.2±18.4)中高于正常组(H评分：83.2±4.0)，在侵袭组中表达最高(H评分：142.4±37.2)。
三、免疫印迹试验
使用预冷的蛋白裂解缓冲液(50mM Tris，pH 7.5；250mM NaCl)；10mM乙二胺四乙酸；0.5％NP-40；1μg/mL亮肽素；1mM苯甲基磺酰氟；和含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的4mM NaF(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)(Roche，Mannheim，Germany)从垂体肿瘤组织或细胞中提取全细胞蛋白质。将膜与针对MITF(1：800，Abcam，Cambridge，USA)，WIF-1(1：2000，Abcam，Cambridge，USA)，β-连环蛋白(1：3000，Abcam，Cambridge，USA)的一抗孵育，或与GAPDH(1：10,000，北京冠兴宇科技有限公司，中国)在4℃过夜。将印迹与标记有辣根过氧化物酶(Santa Cruz Biotechnology，USA)的二抗一起温育。通过增强的化学发光使印迹可视化，并用Amersham Imager 6000(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)进行光密度测定。为了进一步确定细胞核和细胞质中β-连环蛋白表达的差异，使用核-浆蛋白提取试剂盒(APPLYGEN，北京，中国)分别提取核和细胞浆蛋白。TBP水平(1：2000，Abcam，Cambridge，USA)用作核蛋白的上样对照，GAPDH用于细胞浆蛋白的对照。
由图1E可见，蛋白质印迹实验证实，与正常组相比，泌乳素腺瘤组中MITF表达上调。侵袭性泌乳素腺瘤比非侵袭性泌乳素腺瘤具有更高的MITF表达。
四、细胞培养和细胞增殖，侵袭和凋亡测定
将MMQ和GH3细胞置于补充有15％(v/v)马血清和2.5％(v/v)胎牛血清的F-12K培养基中，在37℃，5％CO2的潮湿培养箱中培养。每隔一天更换培养基。将处于对数生长期的MMQ细胞(>99％存活)接种到6孔培养板(约1×106个细胞/孔)中并用miRNA模拟物(100nM)，miRNA模拟对照(100nM)(RiboBio，中国)，pEGFP-N1-MITF(1mg/L)，或pEGFP-N1-MITF-NC(1mg/L)(BGI，中国)转染。处理24小时，48小时或72小时后，收获细胞用于测定。使用CellTiterAQueous One SolutionReagent(Promega，USA)按照制造商的方案分析细胞增殖率。对于Transwell测定，将2×104预处理的MMQ和GH3细胞在具有BD Matrigel Matrix(Thermo Fisher Scientific，USA)的6.5-μm孔径基质胶预涂的Transwell室(Corning，USA)中孵育48小时。用4％多聚甲醛固定粘附在下膜上的细胞，并用苏木精染色。为了量化侵入细胞，使用显微镜(Zeiss，Germany)对每个室的5个随机高倍视野中的细胞数进行计数。将侵入细胞的平均数量作为入侵能力进行评估。使用膜联蛋白V-FITC/PI试剂盒(BDBiosciences，USA)测定细胞凋亡。收获细胞并根据制造商的说明用膜联蛋白V-FITC和PI染色。使用BD Accuri TM C6(BD Biosciences，USA)分析细胞。使用CFlow软件(BDBiosciences，USA)进行数据分析。
使用miRNeasy Mini Kits(Qiagen，Hilden，Germany)从垂体肿瘤组织和细胞中分离总RNA，并根据制造商的miScript II RT Kits(Qiagen，Hilden，Germany)的方案使用总RNA逆转录成cDNA。人miR-137和U6的引物来自TiangenBiolotech(中国北京)。大鼠MITF引物(正向：5'-aggtctgcctggtgctgta(SEQ ID NO.1)，反向：5'-ggctttctcttatcccatcca(SEQID NO.2))和GAPDH(正向：5'-ggcacagtcaaggctgagaatg(SEQ ID NO.3)，反向：5'-atggtggtgaagacgccagta(SEQ ID NO.4))由生工生物(中国上海)合成。使用AppliedBiotechnology实时PCR 7500快速系统和miScript SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)进行靶基因水平的定量。mRNA的扩增条件是50℃，2分钟，95℃。2分钟，40个循环，95℃，10秒和60℃，30秒。miRNA的扩增条件是95℃，15分钟，40个循环，94℃，15秒，55℃，30秒和70℃，34秒。相对于MITF的GAPDH和miR-137的U6标准化相对表达水平，并使用2-ΔΔCT定量法从循环阈值(CT)s值计算(Giulietti A,Overbergh L,Valckx D,Decallonne B,Bouillon R,Mathieu C.An overview of real-time quantitative PCR:applications to quantify cytokine gene expression[J].Methods.2001,25(4):386-401)。
由图2可见，当miR-137模拟物被转染到MMQ和GH3细胞中时，检测到MITF mRNA和蛋白质表达。与对照组相比，miR-137模拟物转染的MMQ细胞中MITF mRNA和蛋白水平被显著抑制至42.9±12.0％和38.2±9.8％。在miR-137模拟转染的GH3细胞中，MITF mRNA被显著抑制至53.3±8.7％，蛋白质水平被抑制至37.2±8.4％。这些结果表明miR-137在体外显著抑制泌乳素腺瘤中的MITF表达。
对于MMQ和GH3两种细胞类型，miR-137模拟物仅在72小时内显著抑制细胞增殖。由图3A可见，与阴性对照组相比，miR-137模拟组的细胞增殖在MMQ细胞中被抑制至71.2％，在GH3细胞中的细胞增殖在72小时内被抑制至57.0％。由图3B可见，在MMQ细胞中，阴性对照组的每个高倍视野(HPF)的侵袭性细胞数为365±42，miR-137模拟组的该数据显着降低至89±29/HPF(P<0.01)。在GH3细胞中，阴性对照组的侵袭性细胞数为281±39/HPF，miR-137模拟组显著降低至72±23/HPF(P<0.01)。由图3C可见，在MMQ细胞中，miR-137模拟组的细胞凋亡率增加至25.4±3.4％，阴性对照组为15.7±2.6％(P<0.01)；在GH3细胞中，阴性对照组的细胞凋亡率为11.9±2.0％，miR-137-模拟组增加至19.3±2.7％(P<0.01)。以上表明，在MMQ和GH3细胞中，miR-137均抑制细胞增殖和侵袭，促进细胞凋亡。
由图5可见，当用pEGFP-N1-MITF转染时，MMQ和GH3细胞在72小时内显示出更多的增殖，分别为110％和107％。pEGFP-N1-MITF显著逆转两种细胞类型中miR-137对增殖的抑制作用(490nm OD值：MMQ，miR-137为0.64，miR137+MITF为0.73；GH3，miR-137为0.66，miR137+MITF为0.77)。与对照组相比，MITF转染细胞显示更多的侵袭性细胞(MMQ，MITF载体为251±49/HPF，MITF为378±35/HPF；GH3，MITF载体为295±39/HPF，MITF为342±42/HPF)。与miR-137模拟组相比，MITF和miR-137模拟物的共转染显著逆转了对侵袭细胞数的抑制(MMQ，miR-137为91±20，miR137+MITF为175±21；GH3，miR-137为89±29，miR137+MITF为198±25)。
五、双荧光素酶报告基因测定
pmiR-RB-REPORT载体(Riobio)用于克隆野生型(WT)和突变体(Mut)MITF 3'UTR(628bp)。使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis试剂盒(Agilent，Santa Clara，CA，United States)将miR-137的MITF 3'UTR靶位点从5'-GCAATA-3'沉默至5'-CGTTAT-3'。在293T细胞中用Lipofectamine2000共转染WT或Mut MITF 3'UTR载体和对照pmiR-RB-REPORT载体。48小时后，收获细胞并使用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega，Madison，WI，United States)进行测定。
由图2可见，miR-137模拟物显著抑制WT-MITF 3'UTR的荧光素酶活性，但不显示Mut-MITF 3'UTR的活性，证明miR-137直接靶向MITF mRNA，从而抑制MITF蛋白的表达。
六、对动物的泌乳素腺瘤诱导
20只4周龄雌性F344(Vital River Laboratories，中国，北京)的大鼠在受控的12小时光照/12小时黑暗环境中随意喂食。采用17β-雌二醇诱导泌乳素腺瘤6周，在高场BrukerClinscan 7.0-tesla磁共振扫描仪(Bruker，Ettlingen，Germany)上进行验证。腹膜内注射10％水合氯醛(3.5mL/kg)麻醉大鼠。将含有miR-137(2×108PFU)或载体对照(上海吉凯公司)，shMITF或载体对照(上海吉凯公司)的腺病毒载体(1μL)立体定向注射到肿瘤中。按照相对于前囟的坐标注射肿瘤：后部5.4mm，腹侧9.6mm，左右0.8mm。将26号针头的尖端安装到10μL注射器进行注射。2周后，进行第二次MRI检查以测量肿瘤大小。通过公式(前后径×横径×高度)×π/6计算肿瘤体积。处死所有大鼠并收集肿瘤组织。
由图4可见，对照组的平均肿瘤体积为35.0±6.9mm3，miR-137组的平均肿瘤体积降低至16.1±3.5mm3(P<0.01)，证实miR-137是体内肿瘤抑制因子。shMITF组的肿瘤体积为13.5±2.3mm3，而阴性对照组2周后的肿瘤体积减少至35±2.3mm3。蛋白质印迹显示，与相应的阴性对照组相比，miR-137模拟物或shMITF显著抑制MITF的表达。
以上实施例可以说明，MITF与泌乳素腺瘤的肿瘤发生和侵袭有关，通过MITF的表达量可以判断泌乳素腺瘤的侵袭性行为及患者预后。此外，以上实施例还可以说明，miR-137通过靶向MITF可充当肿瘤抑制剂，通过miR-137的表达量也可以判断泌乳素腺瘤的侵袭性行为及患者预后。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 北京市神经外科研究所
<120> 蛋白功能抑制剂在制备治疗功能性垂体腺瘤的药物中的用途
<130> 11810BJNI-CL
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggtctgcct ggtgctgta 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggctttctct tatcccatcc a 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcacagtca aggctgagaa tg 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggtggtga agacgccagt a 21

Claims (10)

1.蛋白抑制剂在制备治疗功能性垂体腺瘤的药物中的用途，其中，所述蛋白抑制剂为能够抑制MITF的蛋白功能和/或蛋白表达量的蛋白抑制剂。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述蛋白抑制剂为miR-137。
3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述功能性垂体腺瘤为泌乳素腺瘤。
4.一种定量检测分子标志物的试剂在制备用于评价泌乳素腺瘤侵袭性行为和/或预后的产品中的用途，其中，所述分子标志物包括MITF。
5.根据权利要求4所述的用途，其中，所述分子标志物还包括miR-137。
6.根据权利要求4或5所述的用途，其中，定量检测分子标志物是通过以下步骤进行的：
1)获得泌乳素腺瘤组织样品；以及
2)确定样品中所述分子标志物的表达量。
7.一种定量检测分子标志物的试剂在制备用于评价泌乳素腺瘤侵袭性行为和/或预后的产品中的用途，其中，所述分子标志物包括miR-137。
8.根据权利要求7所述的用途，其中，定量检测分子标志物是通过以下步骤进行的：
1)获得泌乳素腺瘤组织样品；以及
2)确定样品中所述分子标志物的表达量。
9.一种评价泌乳素腺瘤侵袭性行为和/或预后的系统，其特征在于，该系统包括计算装置、用于输入泌乳素腺瘤患者个体的分子标志物的表达量的输入装置和用于输出泌乳素腺瘤诊断结果和/或泌乳素腺瘤预后结果的输出装置；其中，所述分子标志物包括MITF和miR-137；所述计算装置包括存储器和处理器；所述存储器中存储有计算机程序，用于将所述泌乳素腺瘤患者个体的分子标志物的表达水平与正常组织样品中分子标志物的表达水平进行比较，并判断与正常组织样品相比的分子标志物表达量差异；所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，并实现如下的判别：
当MITF表达量上调时，判定为泌乳素腺瘤具有侵袭性，和/或患者预后不良；
当MITF表达量下调时，判定为泌乳素腺瘤具有非侵袭性，和/或患者预后良好；
当miR-137表达量上调时，判定为泌乳素腺瘤具有非侵袭性，和/或患者预后良好；
当miR-137表达量下调时，判定为泌乳素腺瘤具有侵袭性，和/或患者预后不良。
10.一种评价泌乳素腺瘤侵袭性行为和/或预后的系统，其特征在于，该系统包括计算装置、用于输入泌乳素腺瘤患者个体的分子标志物的表达量的输入装置和用于输出泌乳素腺瘤诊断结果和/或泌乳素腺瘤预后结果的输出装置；其中，所述分子标志物包括miR-137；所述计算装置包括存储器和处理器；所述存储器中存储有计算机程序，用于将所述泌乳素腺瘤患者个体的分子标志物的表达水平与正常组织样品中分子标志物的表达水平进行比较，并判断与正常组织样品相比的分子标志物表达量差异；所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，并实现如下的判别：
当miR-137表达量上调时，判定为泌乳素腺瘤具有非侵袭性，和/或患者预后良好；
当miR-137表达量下调时，判定为泌乳素腺瘤具有侵袭性，和/或患者预后不良。
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