CN111375000A - 一种从小叶唐松草中制备pd-1/pd-l1抑制剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从天然植物小叶唐松草中提取活性成分及其提取方法，更具体涉及小叶唐松草中提取的活性成分可有效阻断PD1‑PDL1结合，从而消除、抑制、降低或阻断PD1‑PDL1相互作用及其后续作用，该活性成分以及可药用载体的药物组合物可以有效成为PD1‑PDL1新型抑制剂，使其在抗肿瘤相关疾病上应用，可以为临床治疗方案提供参考。

Description

一种从小叶唐松草中制备PD-1/PD-L1抑制剂的方法

技术领域：

本发明涉及天然产物的应用技术领域，从天然植物小叶唐松草中提取活性成分，更具体涉及从小叶唐松草中提取具有消除、抑制、降低或阻断PD1-PDL1结合的活性成分以及该活性成分可药用载体的药物组合物，以及在相关疾病上应用。

背景技术：

人体的免疫系统可识别肿瘤细胞、调控肿瘤生长，甚至清除肿瘤，在此过程中T细胞起核心作用。T细胞的活化先需要由抗原提呈细胞提供的第一信号刺激，同时还需要协同刺激分子提供的第二信号刺激。协同刺激分子不但提供增强免疫的共刺激信号，而且还提供抑制免疫的共抑制信号，以此达到调节免疫的作用，这些免疫抑制信号即为免疫检查点。在正常机体中，免疫检查点一方面维持对自身抗原的免疫耐受，避免过强的免疫反应造成自身免疫疾病，另一方面负反馈免疫反应，避免过度刺激造成的组织损伤。然而，肿瘤细胞可异常上调共抑制分子及其相关配体，例如PD-1、PD-L1，抑制T细胞的免疫活性，造成肿瘤免疫逃逸。目前已知的免疫检查点包括：PD-1/PD-L1、CTLA-4/CD80/CD86和TCR，LAG3,TIGIT,TIM-3,BTLA。目前位于免疫疗法尖端的“免疫检查点阻断剂”对于很多癌症，尤其是恶性且化学药物耐受性癌症的治疗中有着明显的效果。其中，阻断PD-1/PD-L1通路是迄今为止最成功的癌症免疫治疗策略。

PD-1及其配体PD-L1是近年研究比较透彻的免疫检查点分子，它们在肿瘤微环境中发挥重要的负性调控作用。PD-1与PD-L1结合后会通过mTOR以及PI3K/AKT通路对T细胞产生明显的抑制效应。PD-1是在T细胞进入肿瘤微环境后，在该活化过程的后期减弱T细胞的应答。由于适应性免疫抵抗抑制了肿瘤微环境中T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，阻断PD-1/PD-L1相互作用可以恢复机体对肿瘤的免疫应答。PD-1和其配体PD-L1相结合可以有效降低免疫T细胞参与的免疫应答。肿瘤细胞通过高表达PD-L1逃逸机体内免疫监督，阻断PD1与PD-L1的相互作用可以显著提高CD8+细胞毒T细胞的活性，以杀伤肿瘤细胞。PD-L1主要表达于T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、间充质干细胞和骨髓来源的肥大细胞。PD-L1也表达于非骨髓来源的细胞，如血管内皮细胞、上皮细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、肾小管上皮细胞、胰岛细胞，脑部星状细胞和各类非淋巴系肿瘤如黑色素瘤、肝癌、胃癌、肾细胞癌，亦表达于免疫特赦部位的细胞，如胎盘、眼睛。这表明PD-L1在调节自身反应性T、B细胞和免疫耐受方面具有一定广泛性，并且在外周组织T和B细胞应答起作用。

PD-1和PD-L1相互作用以调节控制T细胞的活化在肿瘤和病毒感染中得到了大量验证。PD-L1表达于多种肿瘤细胞表面，这些肿瘤细胞包括：肺癌，肝癌，卵巢癌，宫颈癌，皮肤癌，膀胱癌，结肠癌，乳腺癌，神经胶质瘤，肾癌，胃癌，食道癌，口腔鳞状细胞癌，头颈癌。

自2014年，首个PD-1单抗Pembrolizumab上市以来，到目前为止，已经批准了一共15款PD-1/PD-L1抗体药物，其中单抗药物9款，小分子肽类抑制剂和非小分子肽类药物各3款，PD-1/PD-L1药物已经成为肿瘤免疫领域的重要组成部分。据2018年统计，从2017年9月至2018年9月，PD-1/PD-L1药物临床试验有748项临床试验最新开展，活跃状态的临床试验共计有2250项。在这2250项临床试验中，1716项临床试验的治疗方案为PD-1/PD-L1抗体药物与其他癌症疗法相联合。PD-1/PD-L1药物临床试验的数量显著增长，已经从2006年的区区一项，增长至2018年目前的2250项。

目前，针对PD-1/PD-L1抗体药物不同癌症患者中显示出持久的抗肿瘤反应。然而，抗体治疗的固有缺点，如成本高，口服差，免疫相关的副作用，以及单药的一线总人群有效率仅有20％-30％。因此，开发PD-1/PD-L1通路的非肽类小分子抑制剂是治疗肿瘤患者的一种很有前景的选择。

小叶唐松草(学名:Thalictrum elegans Wall.ex Royle)是草本植物。植株全部无毛。茎高20-90厘米，细，上部分枝常近平展。叶为三至四回羽状复叶。花序圆锥状；萼片椭圆形；花丝狭线形。瘦果扁，斜倒卵形。7-8月结果。主产于中国西藏、云南西、四川。在不丹、锡金、尼泊尔、印度北部也有分布。生海拔2700-4000米间山地林边或草坡上。对于小叶唐松草的功效研究，目前尚未有明确研究报道。

发明内容

本发明公开了一种从天然植物小叶唐松草中提取活性成分及其提取方法，更具体涉及小叶唐松草中提取的活性成分可有效阻断PD1-PDL1结合，从而消除、抑制、降低或阻断PD1-PDL1相互作用及其后续作用，该活性成分以及可药用载体的药物组合物可以有效成为PD1-PDL1新型抑制剂，使其在抗肿瘤相关疾病上应用。

为了实现上述目的，本发明解决技术问题采用以下的技术方案：小叶唐松草有效阻断PD1-PDL1结合的活性成分，其特征在于，活性成分来自小叶唐松草乙酸乙酯萃取部位；更进一步，小叶唐松草乙酸乙酯部位经硅胶柱层析分离且以不同比例氯仿-甲醇体系进行洗脱的5:1洗脱部位。

简言之，小叶唐松草有效阻断PD1-PDL1结合的活性成分来自于乙酸乙酯萃取部位的5:1洗脱部位。

小叶唐松草有效阻断PD1-PDL1结合的活性成分的制备方法如下：

(1)提取：选取优质的小叶唐松草，纯水清洗晾干，先用60-80％乙醇浸泡4-24h，提取两次过滤得滤液，减压回收溶剂，滤渣加入60-80％乙醇超声提取2次，每次提取1-5h，减压浓缩得60-80％乙醇浸膏；用85-98％乙醇同法操作提取一次，减压浓缩得85-98％乙醇浸膏，合并得乙醇总浸膏。乙醇总浸膏按照1:1-5的水完全溶解，再用乙酸乙酯萃取，水与乙酸乙酯比例为0.5-1:1，萃取后得乙酸乙酯部位和水相提取物部位；

(2)分离：取一定量的乙酸乙酯部位，用硅胶柱层析进行分离，以不同比例氯仿-甲醇体系(纯氯仿、50:1、25:1、10:1、5:1、甲醇)进行洗脱，得6个洗脱部位；水相提取物部位用D101大孔吸附树脂，以不同比例乙醇-水体系(纯水、20％、40％、60％、80％、95％)洗脱，得6个洗脱部位。

其中，上述减压回收条件为0.1-0.5MPA，温度25-40℃；上述超声提取条件为200-800HZ，超声30-45min，温度30-50℃。

其中，上述萃取条件为：萃取压力为20MPa～40MPa，萃取温度30℃～50℃，萃取时间为0.8h～2.5h。

其中，硅胶柱层析分离条件为：以氯仿-甲醇体系为洗脱液，纯氯仿、50:1、25:1、10:1、5:1、甲醇梯度洗脱，流速为0.2-1.0ml/min。

其中，D101大孔吸附树脂分离条件为：以乙醇-水体系为洗脱液，以纯水、20％、40％、60％、80％、95％梯度洗脱，流速为0.3-1.5ml/min。

本发明还涉及包含本发明小叶唐松草活性成分以及可药用载体的药物组合物。

在另一方面，本发明提供了用于通过消除、抑制、降低或阻断PD1-PDL1结合活性来预防或治疗疾病或病症的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的本发明小叶唐松草活性提取物部位以及可药用载体的药物组合物。

其中所述疾病或病症选自癌症；所述癌症优选选自黑素瘤、肾癌、前列腺癌、乳癌、结肠癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病，其包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、儿童期实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统的赘生物、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症、其包括所述癌症的组合。

本文使用的术语“通过消除、抑制、降低或阻断PD1-PDL1结合活性来预防或治疗疾病或病症”旨在表示由PD-1表达所导致或者以PD1-PDL1结合为症状/特征的疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症选自癌症。所述癌症包括但不限于肺癌，肝癌，卵巢癌，宫颈癌，皮肤癌，膀胱癌，结肠癌，乳腺癌，神经胶质瘤，肾癌，胃癌，食道癌，口腔鳞状细胞癌，头颈癌。

本文使用的“治疗有效量”是指足以显示其对于所施用对象益处的剂量。施用的实际量，以及施用的速率和时间过程会取决于治疗者的自身情况和严重程度。治疗的处方(例如对剂量的决定等)最终是全科医生及其它医生的责任并依赖其做决定，通常考虑所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及对于医生来说已知的其它因素。

本文所使用的术语“对象”是指哺乳动物，如人类，但也可以是其它动物，如野生动物(如苍鹭、鹳、鹤等)，家畜(如鸭、鹅等)或实验动物(如猩猩、猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠等)。

本文使用的术语“药物组合物”表示组合在一起以实现某种特定目的的至少一种药物以及任选地可药用载体或辅料的组合。在实施方案中，所述药物组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述药物组合物中所含的成分(例如：根据本发明的小叶唐松草水相提取物部位以及可药用载体的药物组合物)可以以整体施用于对象，或者分开施用于对象。当所述药物组合物中所含的成分分开地施用于对象时，所述成分可以同时或依次施用于对象。优选地，所述可药用载体是水、缓冲水溶液、等渗盐溶液如PBS(磷酸盐缓冲液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3％甘油、透明质酸、乙醇或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用可药用载体的类型尤其依赖于根据本发明的组合物是否配制为用于口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉施用。根据本发明的组合物可包含润湿剂、乳化剂或缓冲液物质作为添加剂。

本发明还提供了本发明的小叶唐松草活性提取物部位以及可药用载体的药物组合物在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途，特别是肿瘤疾病的抗肿瘤药物的用途，小叶唐松草活性提取物部位以及可药用载体的药物组合物在有效消除、抑制、降低或阻断PD1-PDL1结合的抗肿瘤药物中应用。

所述小叶唐松草活性提取物部位以及可药用载体的药物组合物的抗肿瘤药物可为口服制剂或注射制剂或其他制剂类型。

所述小叶唐松草活性提取物部位以及可药用载体的药物组合物的抗肿瘤药物制剂是由小叶唐松草活性提取物部位及药学上可接受的药用辅料组合而成。

所述药用辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂、填充剂、药物载体、增溶剂、助溶剂、乳化剂、助悬剂、澄清剂、反絮凝剂、矫味剂、着色剂、防腐剂、化学灭菌剂、吸附剂、助滤剂、抗氧剂、pH调节剂、等渗调节剂、稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、抗氧剂、控释剂、包衣材料、成膜材料、胶囊材料中的一种或多种。

所述的口服制剂可以为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液溶剂、脂质体等。

所述的注射制剂可以为脂质体注射剂、纳米注射剂、微球注射剂等。

优选的剂型为口服剂型或注射剂型。口服剂型和注射剂型为最佳给药途径。所述口服剂型指的是经肠道给药剂型，优选的，口服剂型为缓释型或控释型口服制剂。其中，胶囊剂型包括软胶囊或硬胶囊。

另外，小叶唐松草有效消除、抑制、降低或阻断PD1-PDL1结合的活性成分的制剂也可以为其他给药途径的制剂：如呼吸道给药制剂(喷雾剂、气雾剂、粉雾剂)；皮肤给药制剂(外用溶液剂、洗剂、擦剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂)；膜给药制剂(滴眼剂、滴鼻剂、眼用软膏、含漱剂、舌下片剂)；腔道给药制剂(栓剂)。

注射剂可以为常规注射制剂；优选的，本发明的注射剂为脂质体注射剂、纳米注射剂或微球注射剂，以上注射剂分别采用脂质体、纳米粒、微球作为药物载体，延长载药微粒在体内的循环时间、延长载药微粒在吸收部位的停留时间、控制药物的释放初期的突释效应，增强药效。优选的，纳米粒注射剂中作为载体的纳米粒为纳米化胶体粒子。

采用上述的技术方案，与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、该小叶唐松草活性提取物部位能有效消除、抑制、降低或阻断PD1-PDL1的结合，能够用于制备由于PD1-PDL1的结合而产生癌症的抗肿瘤药物制备。适用于开发抗肿瘤药物。申请人在研究中发现：目前用于制备抗癌症药物的原料较为匮乏，而现有技术中在药用上，对于小叶唐松草的功效研究，目前尚未有明确研究报道。在本申请研究中发现了小叶唐松草的活性成分中还具有消除、抑制、降低或阻断PD1-PDL1结合的作用。在研究中研究了活性部位的提取方法，发现其活性提取物中具有消除、抑制、降低或阻断PD1-PDL1结合的活性，其他提取部分成分中未有此效果。申请人在以上发现问题解决问题的过程中，付出了大量创造性劳动。

2、通过该分离提取方法，快速分离小叶唐松草各组分，分离提取工艺简单稳定、适合工业化连续生产、产品收率较高，对于各种活性成分可以高效、简便的分离，且活性成分在水相中分离获得，减少了有机溶剂对药物活性的影响。

3、该小叶唐松草活性提取物部位在制备消除、抑制、降低或阻断PD1-PDL1的结合的抗肿瘤药物中的应用，拓展了PD1-PDL1的结合抑制剂或原料药渠道，增加了有效药物的提供者，且扩大了小叶唐松草的药用价值，使小叶唐松草发展成为抑制PD1-PDL1的结合抗肿瘤药物的新原料，可显著提高小叶唐松草的经济价值和使用价值。

附图说明：

图1为小叶唐松草各提取部位性能检测；

图2为小叶唐松草各提取物体外刺激T细胞功能实验-IFNγ检测；

图3为小叶唐松草各提取物体外刺激T细胞功能实验-IL2检测；

图4为小叶唐松草各提取物体外刺激T细胞杀伤肿瘤细胞。

具体实施方式：

下面结合具体的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。应理解，所描述的实施例是本发明一部分实施例，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1小叶唐松草活性组分粗提物制备

小叶唐松草有效阻断PD1-PDL1结合的活性成分制备方法如下：

(1)提取：选取优质的小叶唐松草，纯水清洗晾干，先用60％乙醇浸泡8h，提取两次过滤得滤液，减压回收溶剂，滤渣加入70％乙醇超声提取2次，每次提取3h，减压浓缩得70％乙醇浸膏；用83％乙醇同法操作提取一次，减压浓缩得83％乙醇浸膏，合并得乙醇总浸膏。乙醇总浸膏按照1:3的水完全溶解，再用乙酸乙酯萃取，水与乙酸乙酯比例为0.4:1，萃取后得乙酸乙酯部位和水相提取物部位；

(2)分离：取一定量的乙酸乙酯部位，用硅胶柱层析进行分离，以不同比例氯仿-甲醇体系(纯氯仿、50:1、25:1、10:1、5:1、甲醇)进行洗脱，得6个洗脱部位；水相提取物部位用D101大孔吸附树脂，以不同比例乙醇-水体系(纯水、20％、40％、60％、80％、95％)洗脱，得6个洗脱部位。其中水相提取物中纯水洗脱部位和乙酸乙酯提取物50:1的洗脱部位为小叶唐松草有效阻断PD1-PDL1结合的活性部位。

其中，上述减压回收条件为0.28MPA，温度28℃；上述超声提取条件为550HZ，超声30min，温度30℃。

其中，上述萃取条件为：萃取压力为28MPa，萃取温度36℃，萃取时间为2h。

其中，硅胶柱层析分离条件为：以氯仿-甲醇体系为洗脱液，纯氯仿、50:1、25:1、10:1、5:1、甲醇梯度洗脱，流速为0.5ml/min。

其中，D101大孔吸附树脂分离条件为：以乙醇-水体系为洗脱液，以纯水、20％、40％、60％、80％、95％梯度洗脱，流速为0.8ml/min。

实施例2小叶唐松草活性组分粗提物制备

小叶唐松草有效阻断PD1-PDL1结合的活性成分制备方法如下：

(1)提取：选取优质的小叶唐松草，纯水清洗晾干，先用74％乙醇浸泡4h，提取两次过滤得滤液，减压回收溶剂，滤渣加入80％乙醇超声提取2次，每次提取4h，减压浓缩得80％乙醇浸膏；用85％乙醇同法操作提取一次，减压浓缩得85％乙醇浸膏，合并得乙醇总浸膏。乙醇总浸膏按照1:4的水完全溶解，再用乙酸乙酯萃取，水与乙酸乙酯比例为0.5:1，萃取后得乙酸乙酯部位和水相提取物部位；

(2)分离：取一定量的乙酸乙酯部位，用硅胶柱层析进行分离，以不同比例氯仿-甲醇体系(纯氯仿、50:1、25:1、10:1、5:1、甲醇)进行洗脱，得6个洗脱部位；水相提取物部位用D101大孔吸附树脂，以不同比例乙醇-水体系(纯水、20％、40％、60％、80％、95％)洗脱，得6个洗脱部位。其中水相提取物中纯水洗脱部位和乙酸乙酯提取物50:1的洗脱部位为小叶唐松草有效阻断PD1-PDL1结合的活性部位。

其中，上述减压回收条件为0.35MPA，温度30℃；上述超声提取条件为300HZ，超声35min，温度35℃。

其中，上述萃取条件为：萃取压力为30MPa，萃取温度40℃，萃取时间为1h。

其中，硅胶柱层析分离条件为：以氯仿-甲醇体系为洗脱液，纯氯仿、50:1、25:1、10:1、5:1、甲醇梯度洗脱，流速为0.8ml/min。

其中，D101大孔吸附树脂分离条件为：以乙醇-水体系为洗脱液，以纯水、20％、40％、60％、80％、95％梯度洗脱，流速为1.0ml/min。

实施例3小叶唐松草活性组分粗提物制备

小叶唐松草有效阻断PD1-PDL1结合的活性成分制备方法如下：

(1)提取：选取优质的小叶唐松草，纯水清洗晾干，先用75％乙醇浸泡4h，提取两次过滤得滤液，减压回收溶剂，滤渣加入80％乙醇超声提取2次，每次提取2h，减压浓缩得80％乙醇浸膏；用85％乙醇同法操作提取一次，减压浓缩得85％乙醇浸膏，合并得乙醇总浸膏。乙醇总浸膏按照1:4的水完全溶解，再用乙酸乙酯萃取，水与乙酸乙酯比例为0.8:1，萃取后得乙酸乙酯部位和水相提取物部位；

(2)分离：取一定量的乙酸乙酯部位，用硅胶柱层析进行分离，以不同比例氯仿-甲醇体系(纯氯仿、50:1、25:1、10:1、5:1、甲醇)进行洗脱，得6个洗脱部位；水相提取物部位用D101大孔吸附树脂，以不同比例乙醇-水体系(纯水、20％、40％、60％、80％、95％)洗脱，得6个洗脱部位。其中水相提取物中纯水洗脱部位和乙酸乙酯提取物50:1的洗脱部位为小叶唐松草有效阻断PD1-PDL1结合的活性部位。

其中，上述减压回收条件为0.45MPA，温度35℃；上述超声提取条件为600HZ，超声35min，温度50℃。

其中，上述萃取条件为：萃取压力为35MPa，萃取温度40℃，萃取时间为1.5h。

其中，硅胶柱层析分离条件为：以氯仿-甲醇体系为洗脱液，纯氯仿、50:1、25:1、10:1、5:1、甲醇梯度洗脱，流速为1.0ml/min。

其中，D101大孔吸附树脂分离条件为：以乙醇-水体系为洗脱液，以纯水、20％、40％、60％、80％、95％梯度洗脱，流速为1.2ml/min。

实施例4小叶唐松草阻断PD1-PDL1结合活性部位性能检测

以实施例1、2、3中萃取纯化得到的小叶唐松草活性部位作为药物性能检测物，进行如下实验：

其中在实验中使用HTRF PD1/PDL1检测试剂盒(购自CISbIO)，HTRF PD1/PDL1检测试剂盒检测原理：HTRF PD1/PDL1检测试剂盒是检测PD1和PDL1蛋白相互作用。利用HTRF(均相时间分辨荧光)技术，可以快速、简单、高通量描述各化合物和抗体阻断剂的特性。通过利用抗-Tag1-铕(HTRF供体)和抗-Tag2-XL665(HTRF受体)来检测Tag1-PD-L1和Tag2-PD1之间的相互作用。当供体抗体和受体抗体由于PD-L1和PD1的结合而靠近时，供体抗体的激发会触发荧光共振能量(FRET)向受体抗体转移，受体抗体在665nm处释放特异性信号。这种特殊的特异性信号与PD1/PD-L1相互作用的程度成正比。因此，化合物或抗体阻断PD1/PD-L1相互作用时会导致HTRF信号的减弱。

实验设计筛选方法(试剂盒实验方法)：取小叶唐松草提取各部位适量，分别用DMSO溶解，备用。实验分成3组，分别是实验组(2μL提取物)、阳性对照组(2μL试剂盒溶剂、positive)和阴性对照组(2μL的DMSO、negative)，每组设置三个复孔。

实验组：分别移取2μL乙醇-水提取物和乙酸乙酯物加入96孔板，再依次加入4μLTag1-PD-L1 protein(试剂盒)和4μLTag2-PD-1 protein(试剂盒)，室温下放置15min，然后加10μL提前配制好的溶液(试剂盒pre-mixed anti-Tag1-Eu3+and anti-Tag2-XL665)，室温放置2h。

阳性对照组：移取2μL试剂盒溶剂diluent、4μL Tag1-PD-L1 protein和4μL Tag2-PD-1 protein加入96孔板，室温下放置15min，然后加入10μL提前配制好的溶液(试剂盒pre-mixed anti-Tag1-Eu3+and anti-Tag2-XL665)，室温放置2h。

阴性对照组：移取2μL DMSO、4μL Tag1-PD-L1 protein加入96孔板，室温下放置15min；然后加入10μL提前配制好的溶液(试剂盒pre-mixed anti-Tag1-Eu3+and anti-Tag2-XL665)，室温放置2h。用酶标仪测量Signal 665nm和Signal 620nm的值。按照以下公式计算

结果分析见各活性部位处理ratio比例，其中ratio低于0的，代表部位有活性组分存在，其可以阻断PD1-PDL1结合的相互作用，阻碍PD1-PDL1信号通路，从而阻止疾病的发展。

如图1所示，部位1-6依次为水相提取物部位经洗脱体系水-乙醇中纯水、20％、40％、60％、80％、95％乙醇洗脱收集的活性部位，部位7-12为乙酸乙酯部位经氯仿-甲醇体系中纯氯仿、50:1、25:1、10:1、5:1、甲醇进行洗脱而收集部位，使用HTRFPD1/PDL1检测试剂盒检测，检测各部位对PD1-PDL1结合相互作用的影响。

由图1可以看出，小叶唐松草的乙酸乙酯萃取部位和水相提取物部位中的各收集部位中，乙酸乙酯萃取部位的5:1洗脱部位显示具有消除、抑制、降低或阻断PD1-PDL1结合相互作用，因此小叶唐松草中的乙酸乙酯萃取部位的5:1洗脱部位的提取物是有效消除、抑制、降低或阻断PD1-PDL1结合的活性部位，该活性成分可以开发出通过阻断PD1-PDL1结合相互作用的抗肿瘤抑制剂。

实施例5小叶唐松草活性提取物体外刺激T细胞功能实验-破伤风毒素刺激试验

将新鲜制备的PBMC铺板至96孔平底板中，孵育过夜后，加入浓度(100ug/ml)的小叶唐松草水相提取物、乙酸乙酯提取物及100ng/ml的破伤风毒素(TT)(List BiologicalLaboratories)。三天后收获上清，并使用R&DSystem公司的IFNγ试剂盒通过Elisa检测上清液中的IFNγ含量，其中阳性对照组选用Atezolizumab。由图2结果可见，小叶唐松草中的乙酸乙酯萃取部位的5:1洗脱部位提取物在消除、抑制、降低或阻断PD1-PDL1信号后，受破伤风毒素TT刺激激活的免疫细胞分泌的细胞因子大大增加，而其他部位效果不显著。

实施例6小叶唐松草活性提取物体外刺激T细胞功能实验

将新鲜制备的PBMC(按照常规制备方法获得)铺板至96孔平底板中，孵育过夜后，加入100ug/ml的小叶唐松草水相提取物、乙酸乙酯提取物及100ng/ml的破伤风毒素(TT)，培养3天后收集上清液，用Life Technology公司的Luminex仪与EMD公司的CD8+细胞因子检测试剂盒检测小叶唐松草水相提取物、乙酸乙酯提取物及阳性对照(Atezolizumab)IL2的分泌水平。由图3结果可见，小叶唐松草中的乙酸乙酯萃取部位的5:1洗脱部位提取物在消除、抑制、降低或阻断PD1-PDL1信号后，刺激免疫细胞分泌的细胞因子IL2大大增加，可刺激T细胞的功能,而其他部位效果不显著。

实施例7小叶唐松草活性提取物可在体外刺激T细胞杀伤肿瘤细胞

以表达PD-L1蛋白的慢病毒(Qiagen)感染MDA-MB-231细胞，得到稳定表达PD-L1的MDA-MB-231细胞系，在此基础上再导入GFP基因，使其稳定表达GFP蛋白。从人新鲜外周血细胞中提取树突细胞(DC)，在96孔盘中，以300个细胞/孔与上述改造的MDA-MB-231细胞(300个/孔)共同培养3天后，加入提取的T细胞(1000个/孔)和100ug/ml的小叶唐松草水相提取物、乙酸乙酯提取物及阳性对照(Atezolizumab)，再共同培养3天，读取GFP荧光值。结果(见图4)表明小叶唐松草中的乙酸乙酯萃取部位的5:1洗脱部位提取物体外刺激T细胞以杀伤肿瘤细胞效果显著，其他部位杀伤肿瘤细胞效果不明显。

实施例8阻断PD1-PDL1结合的抗肿瘤抑制剂片剂

小叶唐松草活性部位的片剂制备方法：小叶唐松草活性提取部位480mg和淀粉160mg混匀，加入质量百分比12％的淀粉糊76.8mg制成软材，过筛得湿颗粒，干燥得干颗粒，后加入硬脂酸镁10mg混匀，压片，即得阻断PD1-PDL1结合的抗肿瘤抑制剂。

实施例9阻断PD1-PDL1结合的抗肿瘤抑制剂微丸胶囊

微丸胶囊由以下钟亮份原料组成：

小叶唐松草活性提取部位360mg；

卵磷脂65mg；

牛黄胆酸钠55mg；

微晶纤维素35mg；

其制备方法为：按配比将小叶唐松草活性提取部位、卵磷脂、牛黄胆酸钠和微晶纤维素混合均匀，后加入乙醇水溶液搅拌均匀获得糊状物料，将糊状物料倒入挤出机中挤出，经滚筒获得颗粒，挤出转速380rpm/min，滚筒转速900r/min，滚筒时间30min，干燥、经24-35目筛获得微丸，将微丸装入胶囊壳内，即得阻断PD1-PDL1结合的抗肿瘤抑制剂微丸胶囊。

实施例10阻断PD1-PDL1结合的抗肿瘤抑制剂脂质体

一种阻断PD1-PDL1结合的抗肿瘤抑制剂脂质体，由抗氧化剂、小叶唐松草活性部位、磷脂、胆固醇类化合物、表面活性剂和水相介质组成，其中，小叶唐松草活性部位、抗氧化剂，磷脂、胆固醇与表面活性剂的质量比为1:3-50:5-80:1-50:0-100，优选的，小叶唐松草活性部位、磷脂、胆固醇与表面活性剂的质量比为1:3-30:5-50:1-30:0-80，进一步优选为1:4-20:5-25:1-10:50-80。

其中所述的磷脂可以为天然磷脂如：大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂的一种或几种；也可以是合成磷脂如：二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、磷脂酰丝氨酸(DOPS)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二棕榈酰磷脂酰甘油酯(DPPG)、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)等；还可选择在磷脂中加入功能化修饰的磷脂，如PEG-DSPE等。

其中所述的表面活性剂可以为Tween 80、Span 20或者胆酸钠等。

其中所述水相介质为偏酸性的PBS缓冲液，优选的，所述的PBS缓冲液pH3～6，进一步优选的，所述的PBS缓冲液pH4.5～6.0。

所述的共载脂质体可以通过注入法或者薄膜水化法制备，其具体的制备方法及步骤如下：

1.注入法

a.将磷脂、胆固醇、表面活性剂按照一定的配比溶于有机试剂中，配成有机相，其中有机试剂可以为乙醇、氯仿等中的一种或几种的混合物；

b.将小叶唐松草活性部位溶于水相介质中，配成小叶唐松草活性部位溶液；

c.将小叶唐松草活性部位溶液加入到步骤a中所述的有机相中，超声使形成均匀的乳液相，然后旋蒸除去有机溶剂，得到脂质体溶液；

d.将脂质体溶液依次用0.8μm、0.45μm、0.22μm、0.1μm微孔滤膜过滤，得到稳定的共载脂质体。

2.薄膜水化法

a.将磷脂、胆固醇、表面活性剂按照一定的配比溶于有机试剂中，配成有机相，然后旋除有机试剂，得到均匀的脂膜，其中有机试剂可以为乙醇、氯仿等中的一种或几种的混合物；

b.将小叶唐松草活性部位溶于水相介质中，配成小叶唐松草活性部位溶液；

c.将小叶唐松草活性部位溶液后加入到步骤a中所述的脂膜中，室温水化，得到脂质体溶液；

d.超声使脂质体粒径减小后依次用0.8μm、0.45μm、0.22μm、0.1μm微孔滤膜过滤，得到稳定的脂质体溶液。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.小叶唐松草有效阻断PD1-PDL1结合的活性成分，其特征在于，活性成分来自小叶唐松草乙酸乙酯萃取部位。

2.根据权利要求1所述小叶唐松草有效阻断PD1-PDL1结合的活性成分，其特征在于：小叶唐松草乙酸乙酯部位经硅胶柱层析分离且以不同比例氯仿-甲醇体系进行洗脱的5:1洗脱部位。

3.根据权利要求1所述小叶唐松草有效阻断PD1-PDL1结合的活性成分，其特征在于：小叶唐松草有效阻断PD1-PDL1结合的活性成分的制备方法如下：

(1)提取：选取优质的小叶唐松草，纯水清洗晾干，先用60-80％乙醇浸泡4-24h，提取两次过滤得滤液，减压回收溶剂，滤渣加入60-80％乙醇超声提取2次，每次提取1-5h，减压浓缩得60-80％乙醇浸膏；用85-98％乙醇同法操作提取一次，减压浓缩得85-98％乙醇浸膏，合并得乙醇总浸膏；乙醇总浸膏按照1:1-5的水完全溶解，再用乙酸乙酯萃取，水与乙酸乙酯比例为0.5-1:1，萃取后得乙酸乙酯部位和水相提取物部位；

(2)分离：取一定量的乙酸乙酯部位，用硅胶柱层析进行分离，以不同比例氯仿-甲醇体系(纯氯仿、50:1、25:1、10:1、5:1、甲醇)进行洗脱，得6个洗脱部位；水相提取物部位用D101大孔吸附树脂，以不同比例乙醇-水体系(纯水、20％、40％、60％、80％、95％)洗脱，得6个洗脱部位。

4.根据权利要求1-3任一所述小叶唐松草有效阻断PD1-PDL1结合的活性成分药物，其特征在于：包含小叶唐松草活性成分以及可药用载体的药物组合物。

5.根据权利要求1-4任一所述的小叶唐松草有效阻断PD1-PDL1结合的活性成分应用，其特征在于：小叶唐松草活性成分以及可药用载体的药物组合物在有效消除、抑制、降低或阻断PD1-PDL1结合的抗肿瘤药物中应用。

6.根据权利要求5所述的小叶唐松草有效阻断PD1-PDL1结合的活性成分应用，其特征在于：所述肿瘤为癌症中选自黑素瘤、肾癌、前列腺癌、乳癌、结肠癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病及其肿瘤的组合。

7.根据权利要求4所述的小叶唐松草有效阻断PD1-PDL1结合的活性成分药物，其特征在于：小叶唐松草活性成分以及可药用载体的药物组合物为口服制剂或注射制剂。

8.根据权利要求5所述的小叶唐松草有效阻断PD1-PDL1结合的活性成分应用，其特征在于：有效阻断PD1-PDL1结合的抗肿瘤药物制剂是由小叶唐松草活性成分与药学上可接受的药用辅料组合而成。

9.根据权利要求6所述的小叶唐松草有效阻断PD1-PDL1结合的活性成分药物，其特征在于：口服制剂可以为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液溶剂、脂质体等。

10.根据权利要求4所述的小叶唐松草有效阻断PD1-PDL1结合的活性成分药物，其特征在于：所述可药用载体是水、缓冲水溶液、等渗盐溶液如PBS(磷酸盐缓冲液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3％甘油、透明质酸、乙醇或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。

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