CN111334443A - 耐受香草酸、对羟基苯甲酸和丁香酸的酿酒酵母菌株及其应用 - Google Patents

耐受香草酸、对羟基苯甲酸和丁香酸的酿酒酵母菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了耐受香草酸、对羟基苯甲酸和丁香酸的酿酒酵母菌株及其应用，所述酿酒酵母菌株是酿酒酵母经酚酸抑制物培养基适应性进化后，得到的能够耐受香草酸、对羟基苯甲酸和丁香酸中的一种或多种的菌株PAT01，分类命名：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.18021。所述酿酒酵母菌株可应用于生物质转化，在糖化和乙醇发酵过程中，其葡萄糖消耗速率、乙醇生产速率和乙醇得率均高于原始菌株。

Description

耐受香草酸、对羟基苯甲酸和丁香酸的酿酒酵母菌株及其 应用
技术领域
本发明属于在生物技术的领域，具体涉及一种可耐受香草酸、对羟基苯甲酸和丁香酸的酿酒酵母菌株及其在发酵生产乙醇中的应用。
背景技术
目前，木质纤维素类生物质以其环境友好性和可再生性特点成为最具发展潜力的化石资源替代品之一，对国家的安全和发展有着重大意义。但木质纤维素是由纤维素、半纤维素和木质素构成的结构复杂致密的复合物。其难以水解的生物顽抗性成为纤维素乙醇生产过程中的主要障碍。为解决此问题，则需要对木质纤维素原料进行高温高压和酸碱作用的预处理，然而很多具有毒性的降解产物随之产生，对微生物的生长明显抑制作用，主要包括：酚类、呋喃类和有机弱酸。
与弱酸类和呋喃类抑制物相比，酚类物质种类繁多、毒性强，且水中溶解度低，利用水洗脱毒方法不仅难以去除，反而容易导致其在水解物上积累。酚类抑制物根据芳香环上的官能团不同可以分为酚醛、酚酸和酚醇(酮)，其中酚酸抑制物广泛出现在多种木质纤维素类生物质经不同预处理方式(稀酸、稀碱、碱性过氧化氢和水热处理等)所得的水解物中。相比酚醛和酚醇，其具有化合物种类多、含量高和化学性稳定的特性。常见的酚酸抑制物包括：香草酸、对羟基苯甲酸、丁香酸、阿魏酸、对香豆酸和肉桂酸等。已有研究表明(Biotechnology and Bioengineering,2003,81:738-47；Bioprocess and BiosystemEngineering,2014,37:2215-22；Biotechnology for Biofuels,2019,12:268)，在培养基中存在一定浓度的香草酸、对羟基苯甲酸和丁香酸中的一种或多种混合时，对酿酒酵母(S.cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia stipitis)的生长和乙醇发酵速率有明显的抑制作用。香草酸、对羟基苯甲酸和丁香酸对普通酿酒酵母菌的最小致死浓度分别为3.0g/L、5.0g/L和3.8g/L。而且，木质素衍生酚酸类物质对酿酒酵母等真核微生物的抑制作用机制尚未完全阐明。
已有文献报道通过长期适应性进化方法获得耐受乙酸、糠醛和5-羟甲基糠醛的酿酒酵母菌株(Biotechnology for Biofuels,2012,5:32；Biotechnology for Biofuels,2016；9:173.)。但是，对酚类抑制物，特别是酚酸抑制物并没有利用进化工程策略构建酚酸耐受性酵母菌株的相关研究报道。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种酿酒酵母菌株，能够耐受酚酸，解决了木质纤维素类生物质经不同预处理方式得到的水解物香草酸、对羟基苯甲酸和丁香酸等对酿酒酵母的致死和明显抑制乙醇发酵速率的问题。本发明的另一目的是提供上述酿酒酵母菌株在发酵生产乙醇中的应用。
为了实现上述目的，本发明提供的一种酿酒酵母菌株PAT01，所述菌株分类命名：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.18021。
本发明还提供上述的酿酒酵母菌株在制备耐受酚酸的生物制剂的应用，所述酚酸包括香草酸、对羟基苯甲酸和丁香酸中的至少一种。
进一步地，当环境中只有一种酚酸存在时，耐受的上限浓度分别是3.50g/L香草酸；5.40g/L对羟基苯甲酸；4.35g/L丁香酸。
进一步地，当环境中多种酚酸同时存在时，耐受的上限浓度是2.20g/L香草酸、1.40g/L对羟基苯甲酸和1.20g/L丁香酸。
本发明还提供上述的酿酒酵母菌株在发酵生产乙醇中的应用。
优选地，发酵生产乙醇采用的原料包括木质纤维素。
优选地，所述木质纤维素包括农作物秸秆、木屑、竹子、稻壳、花生壳、玉米芯残渣、酒糟中的至少一种。
本发明还提供一种利用木质纤维素发酵生产乙醇的方法，先对木质纤维素原料进行预处理至木质纤维素原料能够进行酶解糖化，然后选择进行以下任意一种发酵方式：
(1)预处理产物接种纤维素酶，制备糖化液，再向糖化液中接种权利要求1或2所述酿酒酵母菌株，进行发酵；或
(2)直接向预处理产物中接种纤维素酶和权利要求1或2所述的酿酒酵母菌株，进行同步糖化和发酵。
优选地，对木质纤维素原料进行的所述预处理处理方式包括稀酸法、碱法和蒸汽爆破法中的至少一种。
优选地，对木质纤维素原料进行的所述预处理的处理方式为稀酸法时，预处理温度为120-200℃，处理时间为3-120分钟，硫酸溶液浓度为0.1-4wt％，料液比为1:3-1:25(质量比)。
优选地，对木质纤维素原料进行的所述预处理处理方式为碱法时，预处理温度为30-100℃，处理时间为1-48小时，氢氧化钠溶液浓度为0.5-5wt％，料液比为1:5-1:25(质量比)。
优选地，对木质纤维素原料进行的所述预处理处理方式为蒸汽爆破法时，预处理温度为180-200℃，压力为1.2-2.0兆帕，处理时间为3-10分钟。
本发明提供的酿酒酵母菌株，具有如下有益效果：
1、本发明的酿酒酵母菌株PAT01比原始菌株对酚酸抑制物耐受性明显增强，能在含有高浓度香草酸、对羟基苯甲酸和丁香酸的培养基中快速生长和乙醇发酵，并且耐受性状能够稳定遗传；并能够在含有较高浓度酚酸且不经脱毒处理的木质纤维素水解产物中进行发酵，表现出良好的生长和乙醇发酵性能；
2、酚酸抑制物为香草酸时，培养基中香草酸浓度为2.50g/L时，本发明的酿酒酵母菌株的比生长速率、最大生物量、葡萄糖消耗速率和乙醇发酵速率分别比原始菌株提高44.4％、36.7％、67.1％和185.7％；
酚酸抑制物为对羟基苯甲酸时，培养基中对羟基苯甲酸浓度为4.2g/L时，本发明的酿酒酵母菌株的比生长速率、最大生物量、葡萄糖消耗速率和乙醇发酵速率分别比原始菌株提高66.0％、125.7％、111.9％和159.3％；
酚酸抑制物为香草酸、对羟基苯甲酸和丁香酸的混合物时，在1.44g/L的香草酸、0.87g/L的对羟基苯甲酸和0.72g/L的丁香酸的混合酚酸抑制物培养基中，本发明的酿酒酵母菌株的比生长速率、最大生物量、葡萄糖消耗速率和乙醇发酵速率分别比原始菌株提高32.9％、61.9％、101.7％和220％；
3、在木质纤维素生物质糖化和乙醇发酵分离精制过程中，本发明的酿酒酵母菌株的葡萄糖消耗速率、乙醇生产速率和乙醇得率分别比原始菌株提高56.7％、147.0％(发酵最初24h)和25.9％；
4、当环境中只有一种酚酸存在时，本发明的酿酒酵母菌株的耐受上限浓度分别是3.50g/L香草酸；5.40g/L对羟基苯甲酸；4.35g/L丁香酸；当环境中多种酚酸同时存在时，本发明的酿酒酵母菌株的耐受上限浓度是2.20g/L香草酸、1.40g/L对羟基苯甲酸和1.20g/L丁香酸。
附图说明
图1为实施例2中酵母菌株PAT01和原始酵母菌株在混合酚酸平板点滴生长的菌落生长状况的对比示意图。
图2为实施例2的酚酸耐受性遗传稳定性验证中酵母菌株PAT01和原始酵母菌株的OD600吸光值的对比示意图。
图3为实施例2中酵母菌株PAT01和原始酵母菌株在混合酚酸培养基中葡萄糖和乙醇浓度随时间变化的对比示意图。
图4为实施例3中酵母菌株PAT01和原始酵母菌株在玉米芯残渣同步糖化与乙醇发酵过程中葡萄糖和乙醇浓度随时间变化的对比示意图。
保藏信息
本发明的同时耐受香草酸、对羟基苯甲酸和丁香酸的酿酒酵母菌株PAT01，其分类命名为：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，菌株已于2019年6月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18021，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
本发明提供一种同时耐受香草酸、对羟基苯甲酸和丁香酸的酿酒酵母PAT01(S.cerevisiae PAT01)，提供的菌株能在含有高浓度香草酸、对羟基苯甲酸和丁香酸的培养基中快速生长和乙醇发酵，并能够在含有较高浓度酚酸且不经脱毒处理的木质纤维素水解产物中进行发酵，表现出良好的生长和乙醇发酵性能。
酿酒酵母菌株PAT01的选育是通过进化工程策略实现的，将原始酿酒酵母菌株置于含有混合酚酸抑制物培养基中进行长期驯化培养，并逐步提高培养基中抑制物的浓度，最终通过抑制物浓度梯度平板筛选耐受性更强的优良菌株。
实施例1酿酒酵母适应性进化
获得耐受高浓度香草酸、对羟基苯甲酸和丁香酸的酿酒酵母菌株PAT01的适应性进化方法，包括以下步骤：
(1)合成培养基的配置(g/L)：无水葡萄糖20，磷酸二氢钾2，硫酸镁1，硫酸铵1，酵母浸粉10；在121℃灭菌20min。
(2)酚酸抑制物培养基的配置：在上述灭菌后的合成培养基中添加香草酸、对羟基苯甲酸和丁香酸的混合物(其中香草酸浓度为0.80-2.50g/L、对羟基苯甲酸浓度为0.50-1.80g/L和丁香酸浓度0.40-1.20g/L)，制成酚酸抑制物培养基。
(3)酿酒酵母对混合酚酸抑制物适应性进化：将酿酒酵母干粉(湖北宜昌安琪酵母有限公司)进行活化培养，其中活化培养条件：在合成培养基中30℃，150r/min的条件下培养18h，获得菌体密度为OD600吸光值6.0-7.0的原始酵母菌株，然后以10％的接种量转接到混合酚酸抑制物培养基1中(见表1)进行适应性进化培养，其中适应性进化培养条件：在混合酚酸抑制物培养基中，30℃，150r/min培养，每培养12h后，以10％接种量转接到新鲜的混合酚酸抑制物培养基中继续培养，直到酵母菌株生长和发酵状况明显改善，并在5次转接培养过程中保持稳定，该过程经过转接培养60批次。然后将其转接到混合酚酸培养基2中(见表1)继续转接培养，经过64次转接培养，得到酚酸耐受性菌液。
(4)混合酚酸浓度梯度平板筛选：将步骤(3)所得菌液稀释涂布在混合酚酸抑制物浓度梯度平板上，在30℃恒温培养36-48h；挑取生长在高浓度抑制物一侧较大的单菌落进行菌种保存。最终获得对香草酸、对羟基苯甲酸和丁香酸混合酚酸抑制物具有显著耐受性的酵母菌株(S.cerevisiae PAT01)。
其中，混合酚酸抑制物浓度梯度平板的香草酸、对羟基苯甲酸和丁香酸浓度分别为2.00g/L、1.20g/L和1.00g/L。
实施例2酵母菌株PAT01对混合酚酸耐受性验证
(1)点滴混合酚酸平板生长比较：将活化18h的酵母菌株PAT01和原始酵母菌株细胞密度调节为OD600吸光值6.0，然后将细胞悬液依次稀释(10-1、10-2、10-3)，并吸取5μL菌液分别滴加到不同浓度的混合酚酸培养基平板上，30℃培养48h。如图1所示，酵母菌株PAT01的菌落生长状况明显优于原始酵母菌株。
其中，混合酚酸固体培养基：合成培养基中加入1.5％(w/v)的琼脂，在121℃灭菌20min。在灭菌后的合成培养基中加入香草酸、对羟基苯甲酸和丁香酸，配制成不同浓度的混合酚酸培养基，见表1。
表1.培养基中混合酚酸抑制物浓度(g/L)
Figure BDA0002360695980000061
(2)酚酸耐受性遗传稳定性验证：将活化18h的酵母菌株PAT01在不含酚酸抑制物的合成培养基中连续转接培养6次，其中培养条件：30℃，150r/min的条件下培养，每次培养12h，然后将其与原始酵母菌株分别以10％接种量转接到混合酚酸抑制物培养基中培养24h，其中混合酚酸培养基：在灭菌后的合成培养基中加入1.44g/L的香草酸、0.87g/L的对羟基苯甲酸和0.72g/L的丁香酸，在设定时间取样1mL，10000r/min离心5min。上清液用于液相色谱分析葡萄糖和乙醇含量，菌体用于测定OD600吸光值。
其中，液相色谱分析检测条件：样品上清液稀释10倍，通过孔径0.22μm的滤膜过滤，待测。样品中葡萄糖和乙醇含量在RID-20A示差检测器，Aminex-HPX-87H(300mm×7.8mm)色谱柱，柱温箱温度为65℃，流动相为0.005mol/L稀硫酸，流速为0.60mL/min，进样量为20μL条件下进行检测。
如图2和图3所示，结果表明：在消除混合酚酸胁迫压力后，适应进化酵母菌株PAT01仍然能够保持良好的酚酸耐受性。在含有1.44g/L的香草酸、0.87g/L的对羟基苯甲酸和0.72g/L的丁香酸的混合酚酸培养基中，其生长延滞期比原始菌株缩短6h，另外，比生长速率、最大生物量、葡萄糖消耗速率和乙醇发酵速率分别比原始菌株提高32.9％、61.9％、101.7％和220％。
本发明的酿酒酵母菌株PAT01比原始菌株对酚酸抑制物耐受性明显增强，并且耐受性状能够稳定遗传。在香草酸浓度为2.50g/L时，本发明的酿酒酵母菌株的比生长速率、最大生物量、葡萄糖消耗速率和乙醇发酵速率分别为0.26h-1、3.95g/L(细胞干重)、2.34g/L·h和0.80g/L·h，比原始菌株提高44.4％、36.7％、67.1％和185.7％。在对羟基苯甲酸浓度为4.20g/L时，本发明的酿酒酵母菌株的比生长速率、最大生物量、葡萄糖消耗速率和乙醇发酵速率分别为0.27h-1、4.55g/L(细胞干重)、2.31g/L·h和0.83g/L·h，比原始菌株提高66.0％、125.7％、111.9％和159.3％。
本发明的酿酒酵母菌株PAT01在乙醇发酵应用中，当环境中只有一种酚酸存在时，3.50g/L香草酸；5.40g/L对羟基苯甲酸；4.35g/L丁香酸。当环境中多种酚酸同时存在时，耐受的上限浓度是2.20g/L香草酸、1.40g/L对羟基苯甲酸和1.20g/L丁香酸。
实施例3利用工业玉米芯残渣同步糖化与乙醇发酵
将活化后的酵母菌株PAT01和原始酵母菌株分别以10％接种量转接到预糖化12h后的工业玉米芯残渣发酵物中进行同步糖化与乙醇发酵，每隔12h取样测定发酵液中乙醇和葡萄糖含量。
其中：工业玉米芯残渣为稀酸法处理玉米芯生产木糖的副产物从山东龙力生物科技股份有限公司获得，纤维素含量为56.5％(基于干物质)；
稀酸法处理条件：料液比1:10(质量比)、稀硫酸浓度4％，在121℃蒸煮1h，固液分离，固体部分为玉米芯残渣。
玉米芯残渣预糖化条件：在配有螺带式搅拌桨的5L发酵罐中，糖化体系总质量3000g。玉米芯残渣用量为25％(w/w)，纤维素酶用量为15FPU/g干的玉米芯残渣，在50℃、150r/min、pH4.8条件下糖化12h。
酚酸抑制物含量：上述发酵体系中总酚含量5.59g/L，主要包括：对羟基苯甲酸、丁香酸和香草酸；
同步糖化与乙醇发酵条件：在37℃、150r/min、pH5.5条件下同步糖化与乙醇发酵。
如图4所示，结果表明：在含有酚酸抑制物的玉米芯残渣同步糖化与乙醇发酵过程中，酵母菌株PAT01比原始酵母菌株表现出更好的发酵性能。酵母菌株PAT01的葡萄糖消耗速率、乙醇生产速率以及乙醇得率分别比原始菌株提高56.7％(从发酵开始至残糖消耗殆尽时)、147.0％(发酵最初24h)和25.9％。
本发明提供所述酿酒酵母菌株PAT01利用木质纤维素类生物质生产乙醇的工艺包括：原料预处理、糖化发酵和乙醇分离精制。木质纤维素类生物质原料预处理方法包括：稀酸法、碱法和蒸汽爆破法中的一种或多种进行，木质纤维素类生物质原料的预处理能够使原料能够进行酶解糖化。木质纤维素类生物质原料包括农作物秸秆、木屑、竹子、稻壳、花生壳、玉米芯残渣、酒糟中的一种或两种以上组合。
稀酸法，将木质纤维素类生物质用浓度为0.1-4wt％的硫酸溶液于120-200℃下反应3-120分钟，反应结束后进行过滤，得到料液比为1:3-1:25。
碱法，将木质纤维素类生物质用浓度为0.5-5wt％的氢氧化钠溶液于30-100℃下反应1-48小时，反应结束后进行过滤，得到料液比为1:5-1:25。
蒸汽爆破法，将木质纤维素类生物质在蒸汽爆破处理装置中于180-200℃和1.2-2.0兆帕下处理3-10分钟，反应结束后进行过滤。
酿酒酵母菌株糖化发酵工艺可分为：分步糖化发酵和同步糖化发酵。分步糖化发酵步骤：利用纤维素酶将上述预处理后的木质纤维素原料制备为糖化液，再通过所述酿酒酵母菌株PAT01发酵生产乙醇。同步糖化发酵：将纤维素酶水解上述预处理后的木质纤维素原料过程与酿酒酵母PAT01发酵乙醇过程同时在一个反应器中进行。
本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种酿酒酵母菌株，其特征在于，所述菌株分类命名：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.18021。
2.权利要求1所述的酿酒酵母菌株在制备耐受酚酸的生物制剂中的应用，所述酚酸包括香草酸、对羟基苯甲酸和丁香酸中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，当环境中只有一种酚酸存在时，耐受的上限浓度分别是3.50g/L香草酸；5.40g/L对羟基苯甲酸；4.35g/L丁香酸。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，当环境中多种酚酸同时存在时，耐受的上限浓度是2.20g/L香草酸、1.40g/L对羟基苯甲酸和1.20g/L丁香酸。
5.权利要求1所述的酿酒酵母菌株在发酵生产乙醇中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，发酵生产乙醇采用的原料包括木质纤维素。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述木质纤维素包括农作物秸秆、木屑、竹子、稻壳、花生壳、玉米芯残渣、酒糟中的至少一种。
8.一种利用木质纤维素发酵生产乙醇的方法，其特征在于，先对木质纤维素原料进行预处理，至木质纤维素原料能够进行酶解糖化，然后选择进行以下任意一种发酵方式：
(1)预处理产物接种纤维素酶，制备糖化液，再向糖化液中接种权利要求1或2所述酿酒酵母菌株，进行发酵；或
(2)直接向预处理产物中接种纤维素酶和权利要求1或2所述的酿酒酵母菌株，进行同步糖化和发酵。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，对木质纤维素原料进行的所述预处理处理方式包括稀酸法、碱法和蒸汽爆破法中的至少一种。
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