CN111328334B - 假单胞菌属的一个新菌种 - Google Patents

Abstract

本发明涉及识别为假单胞菌BR11571的假单胞菌属的一个菌种，被称为Candidatus Pseudomonas metallosolvens，保藏号DSM 32538。

Description

假单胞菌属的一个新菌种

发明领域

本发明涉及假单胞菌属(Pseudomonas)的一个新菌种，被称为Candidatus Pseu-domonas metallosolvens，其从固体材料中回收贵金属的用途，含有这一新菌种和一种分离核酸的组合物。

现有技术

数十年来，人们已经知道通过氰化物和合适的萃取剂如胍(LIX 7950)或胺(LIX7820)从矿石中回收铜(例如US 3,403,020,1968)。由于萃取剂萃取Cu(CN)₃ ^2-优于Cu(CN)₄ ^3-和CN^-，因此游离氰化物保留在水相中。高氰化物含量易于抑制铜氰化物和银氰化物的提取，但对金、锌、镍和铁氰化物的提取却没有显着影响。这种技术的综述可见于例如XIE等人的J.Hazardous Materials,Vol.169,p 333-338(2009)。

过去通过使用氰化钾或氰化钠来回收铜和贵金属，特别是金的过程导致了大量被有毒物质污染的废物堆放，而如今的过程是封闭循环的，不会像过去那样对环境产生影响。尽管如此，即使在封闭的系统中使用氰化物仍然很危险，特别是因为工厂通常含有数十万加仑的富含氰化物的萃取剂。

为此，毫不奇怪的是，目前用于矿石和废料的生物提取方法，即所谓的“生物浸提方法”具有很高的商业价值。通常将自养细菌用于这些目的，其能够产生硫酸，其中铜形成可溶性硫酸盐。如今，全世界约有24％的铜生产使用生物浸提工艺，该工艺在低于3的低pH值下操作，并使用二氧化碳作为微生物的唯一碳源。除了这些过程运行相当缓慢的事实，它们通常也不适用于贵金属如金，银或铂，因为这些金属不溶于硫酸。

在本文中，参考了欧洲专利EP 0432935B1和EP 0695809A1(GEOBIOTICS)，其公开了从矿石中回收和浓缩金的方法。该方法包括生物浸提步骤，优选使用藻类或蓝绿色蓝细菌作为合适的微生物，以产生和释放氢氰酸以形成金络合物。在各种其他微生物中，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和一些假单胞菌(Pseudomonas sp.)被提及。然而，该现有技术的技术教导旨在从矿石，即含有<10ppm痕量贵金属的天然初始原料中回收金。该文件未提供任何有关从人造矿物材料中，如比矿石含有显著更多贵金属的工业残渣和废料回收贵金属的指导。

另一种用于从例如电子废料中回收金的众所周知的微生物是紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)。不幸的是，发现该细菌在浸提过程中的效率相当差[参见CAMPBELL ET AL，J.Industrial Microbiology&Biotechnology,26,p 134-139(2001)或FARAMARZI ET AL，J.Biotechnology.113,321-326(2004)]。进一步地，紫色色杆菌是一种致病性微生物，可引起人类严重感染，因此被归为风险等级2。这一事实损害了该生物在经济上可行的工业装置中的使用。

但是，使用工业残渣和废料的一个特别缺点是它们通常有大量的有毒金属，特别是铅、铬、镉、砷或银，因为大多数能够进行生物开采或生物浸出的微生物对它们都非常敏感，特别是当以高剂量存在时。

因此，本发明的目的是提供一组用于从所谓的二次资源回收贵金属，如金、银、铂和/或钯的微生物，所述二次资源是指工业残渣或废料，其通常被多氯联苯(PCB)和其他有机材料污染，含有增加量的目标金属，通常达0.2％或更多。

本发明的另一个目的是提供一组耐受对于工业残渣和废料典型的高剂量有毒金属如铅、铬、镉和银的微生物，

最后，出于安全原因，本发明的另一个主题是提供一组属于风险等级1的微生物，因为在将来，任何包括风险等级2或更高等级微生物的技术工艺都不会通过政府卫生和风险管理部门的批准。

因为下文公开了代表实施方案的详细描述，本发明的这些和其他目的会更加清楚。

发明内容

目的通过本发明权利要求1解决，其涉及假单胞菌属的一个菌种，被称为Candidatus Pseudomonas metallosolvens(下文：假单胞菌BR11571)，保藏号DSM 32538。

令人惊异地是发明人发现新菌种假单胞菌BR11571具备许多有利特征，例如

(a)能够由二次资源如工业残渣和废料提取贵金属；

(b)产生促进贵金属溶解的生物源物质；和

(c)属于风险等级1。

一般而言，生物源物质是生命过程中产生的物质。在本发明中，生物源物质是由新菌种假单胞菌BR11571产生的任何物质。在根据本发明的优选实施方案中，生物源物质包括氢氰酸。

在根据本发明的一个实施方案中，在氨基酸存在下产生生物源物质。在根据本发明的一个最优选实施方案中，在甘氨酸存在下产生生物源物质。在根据本发明的一个优选实施方案中，在氨基酸存在下产生含有氢氰酸的生物源物质。在根据本发明的一个最优选实施方案中，在甘氨酸存在下产生含有氢氰酸的生物源物质。

如本文所使用的，单数形式“一种”和“该”包括复数引用，除非上下文另外明确指出。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。因此，例如，提及“固体材料”，“这种固体材料”或“一种固体材料”也包括多种固体材料；实际上，术语“核酸”的使用任选地包括该核酸分子的许多拷贝。

如本文所使用的，术语“约”表示数值包括用于确定数值的方法的固有误差变化，或其中存在的变化。

如本文所使用的，术语“菌种”，“菌株”(对于假单胞菌BR11571)和“假单胞菌BR11571”可以同义使用，因为这些术语均涉及Candidatus Pseudomonas metallosolvens(具有保藏号DSM 32538)。

附图

图1:是一个距离矩阵，该距离矩阵是根据Jukes-Cantor校正方法使用基于部分16S rRNA基因序列的过滤cBR11571(大肠杆菌位置100至1465，使用arb程序，Ludwig等，2004)计算得出的。树状图通过邻接法生成。

图2:示出管家基因gyrB(arb程序，过滤cFN55420 675nt，Ludwig等，2004)的部分基因序列(675nt)的序列一致性(表达为百分比)。

图3:示出管家基因rpoB(arb程序，过滤SAI_AJ7174 912nt，Ludwig等，2004)的部分基因序列(912nt)的序列一致性(表达为百分比)。

图4:示出管家基因rpoD(arb程序，过滤cFM25190 560nt，Ludwig等，2004)的部分基因序列(560nt)的序列一致性(表达为百分比)。

图5:示出根据制造商的说明使用用于识别非苛求(non-fastidious)、非肠道革兰氏阴性杆菌的标准系统API 20NE和基于BIOLOG PM1和PM2A平板(BIOLOG)的碳利用率测试得出的BR11571生理特性的分析。将结果与相关菌株的选定结果进行比较。

图6:示出基于BLAST算法的平均核苷酸一致性(ANIb)。使用PYANI程序进行ANIb分析(百分比一致性)(Pritchard et al.(2016))。

图7:示出假单胞菌BR11571的16S rDNA序列，其为SEQ ID No.1。

金属回收:尽管根据本发明的假单胞菌BR11571基本上也可用于矿石的浸出，但是重点在于含有贵金属，特别是金和银，以及铂、钯、铑、铱及其混合物的固体材料。微生物也适用于浸提铜，其通常不被计入术语贵金属中。因此，术语“贵金属”包括金、银、铂、钯、铑、铱、铜及其混合物。

术语“二次资源”是指通常被PCB和其他有机材料污染的工业残渣或废料。根据本发明，优选的合适的二次资源是飞灰、垃圾焚烧灰、金属炉渣、电子废料等。

生物氰化物:假单胞菌BR11571从固体资源中提取贵金属的能力主要归因于在氨基酸特别是甘氨酸存在下产生氢氰酸。然而，此外，产生了其他生物源物质，其促进了贵金属的溶解。这导致与本发明相关的令人惊讶的效果，即与现有技术中已知的非生物化学方法相比，所需的(生物)氰化物更少。

假单胞菌BR11571:根据本发明，假单胞菌BR11571作为新有机体被提供。这种有机体可用于从固体材料中提取贵金属。令人惊异地是，该有机体还能够从含有较高含量的有毒金属，例如铅、铬、镉和银的材料中提取贵金属。这可以得出这样的结论，即该有机体不仅能够从固体材料中提取贵金属，而且还对外部条件具有高度耐受性。

通过进行16S rRNA基因分析揭示了新物种与假单胞菌属的联系(图1)。

已经发现假单胞菌BR11571代表假单胞菌属的一个新菌种。表型(API，BIOLOG)和基因型数据(管家基因rpoB，rpoD和gyrB的部分序列的进一步系统进化分析以及基于使用支架基因组的BLAST算法的平均核苷酸一致性(ANI)的计算)支持了将假单胞菌BR11571分类为假单胞菌属的新菌种。就支架基因组而言，ANI低于94％的菌株被视为属的新物种(根据例如Richter和Rosselló-Móra，2009年)。支架基因组DNA序列的BLAST分析显示，Candidatus Pseudomonas metallosolvens BR11571的下一个邻接共享约91％的ANI。

进一步地，据API(Biomerieux API 20NE)和BIOLOG(BIOLOG PM1，PM2A)分析表明，假单胞菌BR11571的生理机能不同于已知的假单胞菌

通过管家基因rpoD，rpoB和gyrB的部分序列分析以及使用支架基因组的ANI分析揭示了假单胞菌BR11571的最接近亲缘关系为P.helmanticensis OHA11(模式菌株)，P.granadensis F-278,770(模式菌株)和P.koreensis DSM16610(模式菌株)，均属于风险等级1(图2至6)。此外，如上所述的16S rRNA和部分序列分析表明，假单胞菌BR11571属于荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)复合体范围内的Pseudomonas koreensis亚组(Garrido-Sanz等，2016)。属于Pseudomonas koreensis亚组的已知模式菌株(Mulet等人，2010)已被归类为风险等级1。因此，新菌种Candidatus Pseudomonas BR11571可被归类为风险等级1。

生物材料的保藏：根据布达佩斯条约的规定，经分离和鉴定的假单胞菌BR11571物种于2017年6月13日存放在Leibniz Institute DSMZ-德国微生物和细胞培养学会中。已分配登记号为DSM 32538。

在根据本发明的优选实施方案中，新菌种属于风险等级1。术语“风险等级”是在许多国家中用于微生物分类的分类系统。隶属于风险等级取决于例如以下因素

·有机体的致病性

·传播方式和寄主范围

·有效预防措施的可获得性(例如疫苗)

·有效治疗的可获得性(例如抗生素)

属于风险等级1的所有微生物均与健康成年人类的疾病无关(参见NIHGuidelines in Re-combinant DNA，2002年4月)。

在根据本发明的一个实施方案中，假单胞菌BR11571的核糖体DNA具有SEQ IDNo.1。

如上所述，根据本发明的假单胞菌BR11571能够产生生物源物质。假单胞菌BR11571产生的这些生物源物质有助于在氨基酸存在下从固体材料中溶解贵金属。在根据本发明的一个优选实施方案中，由假单胞菌BR11571产生的生物源物质是氢氰酸。在另一个优选实施方案中，氨基酸是甘氨酸。在根据本发明的最优选实施方案中，氢氰酸由假单胞菌BR11571产生，其在甘氨酸存在下促进从固体材料中溶解贵金属。

用途:在根据本发明的一个实施方案中，假单胞菌BR11571用于从固体材料中提取贵金属。在根据本发明的一个优选实施方案中，固体材料是二次资源。在根据本发明的另一个优选实施方案中，固体材料选自组包括飞灰、垃圾焚烧灰、金属炉渣和电子废料。

优选地，贵金属选自组包括金、银、铂、钯、铑、铱、铜及其混合物。

组合物:根据本发明的另一个实施方案涉及一种组合物，含有：

(a)假单胞菌BR11571，其含量可有效地通过释放生物源物质来促进贵金属的溶解，

(b)至少一种固体材料，和

(c)至少一种氨基酸。

在一个优选实施方案中，至少一种氨基酸是甘氨酸。在根据本发明的另一个优选实施方案中，所述生物源物质包括氢氰酸。

方法:根据本发明的一个实施方案涉及一种使用假单胞菌BR11571从固体材料提取贵金属的方法。在一个优选实施方案中，该方法中使用的固体材料是二次资源。在一个更优选的实施方案中，固体材料选自组包括飞灰、垃圾焚烧灰、金属炉渣和电子废料。

在根据本发明方法的另一个优选实施方案中，贵金属选自组包括金、银、铂、钯、铑、铱、铜及其混合物。

在根据本发明方法的一个实施方案中，假单胞菌BR11571在氨基酸存在下产生生物源物质，其有助于从固体材料中溶解贵金属。在根据本发明方法的一个优选实施方案中，假单胞菌BR11571释放的生物源物质包括氢氰酸。在根据本发明方法的另一个优选实施方案中，氨基酸是甘氨酸。

分离的核酸:根据本发明的另一个实施方案涉及与SEQ ID No.2具有至少91％一致性的分离的核酸。

在根据本发明的一个优选实施方案中，分离的核酸具有与SEQ ID No.2至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％的一致性。在根据本发明的另一个优选实施方案中，分离的核酸与SEQ ID No.2具有100％的同一性。换句话说，分离的核酸是SEQ ID No.2。

在根据本发明的一个最优选实施方案中，分离的核酸与SEQ ID No.2具有至少94％的一致性。

如本文所用，当术语“一致性”相对于核酸使用时，描述了两个或更多个核苷酸序列之间的相似度。可以通过在比较窗口上比较两个最佳比对序列来确定两个序列之间的“序列一致性”百分比，使得用于两个序列的最佳比对与参照序列(不包含添加或缺失)相比，比较窗口中的序列部分可以包括添加或缺失(缺口)。通过确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，来计算百分比，然后将结果乘以100可得出序列一致性的百分比。与参考序列相比，在每个位置都相同的序列被认为与参考序列相同，反之亦然。可以使用任何合适的计算机程序进行两个或更多个序列的比对。例如，用于进行序列比对的广泛使用的和被接受的计算机程序是CLUSTALW vl.6(Thompson,et al.(1994)Nucl.Acids Res.,22:4673-4680)。

SEQ ID NO.2代表人工序列。该人工序列是假单胞菌BR11571的支架基因组序列。如本文所用，术语“支架”是通过使用关于基因组中重叠群的相对位置和方向的附加信息将重叠群链接在一起而产生的一种测序类型。“重叠群”是仅包含A、C、G或T碱基而没有缺口的序列连续延伸。支架中的重叠群被缺口隔开，其由字母“N”的可变数量表示。

实施例

_____________________________________________________________________

实施例1:假单胞菌BR11571的分离和鉴定

根据以下步骤分离假单胞菌BR11571：在添加有4mM KCN和100μg/ml制霉菌素的0.5xHD营养琼脂平板上，将土壤悬浮液置于0.85％NaCl中。将出现的微生物菌落转移并通过“清洁条纹”在新鲜琼脂板上进行纯化，然后分析氢氰酸的产生以及从二次资源中提取贵金属的效率。通过16S rDNA分析对符合性能标准的微生物进行系统发育分析。通过使用程序arb(Ludwig et al.,2004)进行部分16S rRNA基因序列的16S rRNA基因分析(图1)，显示出BR11571菌株与假单胞菌属的隶属关系。

该菌株在LB培养基(例如Bacto胰蛋白胨#211705(BD)1％(w/v)，Bacto酵母提取物#212750(BD)0.5％(w/v)，NaCl#141659.1221(Applichem)0.5％(w/v)以及矿物介质，如M9[根据：Harwood,C.R.,and S.M.Cutting.1990.Chemically defined growth media andsupplements,p.548.In C.R.Harwood and S.M.Cutting(ed.),Molecular biologicalmethods for Bacillus.Wiley,Chichester,United Kingdom.]都补充了酪蛋白氨基酸(0.25％/w/v)和甘氨酸(0.5％(w/v))上培养。合适的温育温度优选在28-30℃的范围内。

假单胞菌BR11571的16S rDNA序列示于图7和SEQ ID No.1。分离和鉴定的菌株已于2017年6月13日提交给Leibniz Institute DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心。它的登记号为DSM 32538。

实施例2:假单胞菌BR11571的系统发育分析和一组新的假单胞菌属的确定部分16S rRNA基因的16S rRNA分析表明，BR11571属于假单胞菌属(图1)。分析了管家基因gyrB、rpoB和rpoD的部分基因序列，以进一步研究BR11571的系统发育关系(图2-4)。这四个核心“管家”基因通常用于分析假单胞菌的系统发育史(例如Mulet等，2010)。对于这些假单胞菌属内的物种分化，已经提出了使用这些管家基因的约97％的序列相似性阈值(Mulet等，2010；Gomila等，2015)。如图2、图3和图4所示，与最接近的相关模式菌株的最大相似性值约为97％。这些数据表明假单胞菌BR11571应该是一个新菌种。为了分析BR11571的生理特性，根据制造商说明，使用用于识别非苛求、非肠道革兰氏阴性杆菌的标准系统API 20NE和基于BIOLOG PM1和PM2A平板(BIOLOG)的碳利用率测试。将结果与相关菌株的生理测试文献中选择的结果进行比较。基于上述系统发育序列分析结果选择相关菌株(图5)。分析表明，假单胞菌BR11571的生理机能与迄今已知的假单胞菌属物种不同，如API和BIOLOG分析所示(图5)。这些数据进一步说明，假单胞菌BR11571可被归类为假单胞菌属的新菌种，被称为Candidatus Pseudomonas metallosolvens。

应用ANI分析取代了DNA-DNA杂交(例如Richter和Rossel-ló-Móra，2009)。提出的物种水平边界设定为约94％ANI(例如Richter和Rosselló-Móra，2009)。如图6所示，ANIb相似度值低于91％。这些结果进一步强调了假单胞菌BR11571代表假单胞菌属的新菌种。与假单胞菌BR11571的支架基因组共享至少94％ANI的假单胞菌菌株被视为新的假单胞菌群的一部分(Goris等，2007)。

实施例3:使用与假单胞菌BR11571回收贵金属

电子废料，即对印刷卡板(PCB)进行生物浸提，使用

(a)假单胞菌BR11571(根据本发明)

(b)紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)，DSMZ 30191(用于对比)

作为能够产生和释放氢氰酸的异养微生物。废料中的金属主要由铜(6％b.w.)、铁(6％b.w.)、铝(4％b.w.)和锌(2％b.w.)组成。也可以含有大量贵金属，特别是银、金和钯。样本材料在冲击磨中精细研磨。得到的细料(<1mm)用于浸提实验。将1g这种材料加入体积为0.3l的浸提容器。向容器中加入0.1l含有微生物(a)或(b)的水溶液，微生物含量分别为约1g/l湿重量，该水溶液还含有矿物质和碳水化合物，其用量适用于为微生物提供营养。加入0.5g甘油以维持氢氰酸产生。将混合物加热至约30℃并在约180rpm下搅拌120h。随后，通过离心分离收集浆体，并通过ICP-MS分析对液相中释放贵金属和铜的含量进行分析。将实验重复三次。结果示于表1。

表1

由PCB回收贵金属

假单胞菌BR11571与紫色色杆菌相比表现出对银提高5倍的浸提效率和对金30％更好的浸提。进一步地，假单胞菌BR11571属于风险等级1，而紫色色杆菌属于风险等级2，使后一种微生物可在经济上可行的工业设备中折衷使用。

Claims (12)

1.识别为假单胞菌BR11571的假单胞菌属的一个菌种，被称为Candidatus Pseudomonas metallosolvens，保藏号DSM 32538，存放在德国微生物和细胞培养学会。

2.根据权利要求1所述的假单胞菌BR11571用于从固体材料提取贵金属的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其中固体材料为二次资源。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述二次资源选自包括飞灰、垃圾焚烧灰、金属炉渣和电子废料的组。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的用途，其中贵金属选自金、银、铂、钯、铑、铱、铜及其混合物。

6.根据权利要求2至4中任一项所述的用途，其中菌种产生生物源物质，其促进从固体材料中溶解贵金属。

7.根据权利要求6所述的用途，其中菌种在氨基酸存在下产生生物源物质。

8.根据权利要求6所述的用途，其中生物源物质含有氢氰酸。

9.一种组合物，含有

(a)根据权利要求1所述的菌种，其含量使得可通过释放生物源物质来有效地促进贵金属的溶解，

(b)至少一种固体材料，和

(c)至少一种氨基酸。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中至少一种固体材料（b）选自包括飞灰、垃圾焚烧灰、金属炉渣和电子废料的组。

11.根据权利要求9所述的组合物，其中贵金属选自金、银、铂、钯、铑、铱、铜及其混合物。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的组合物，其中至少一种氨基酸(c)是甘氨酸。