CN111320744A - 聚合物染料的修饰和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及聚合物染料的修饰和应用。描述了水溶性光活性聚合物(包括聚合物串联染料)，及其制备方法和用途。光活性聚合物可通过用染料或其他官能团直接修饰核心聚合物(例如，可紫光激发的聚合物)来制备。还描述了使用所述聚合物来检测分析物的方法。

Description

聚合物染料的修饰和应用
技术领域
本发明涉及聚合物染料的修饰和应用。
背景技术
水溶性荧光聚合物可通过产生可实时监测的信号而用于多种生物学应用并且提供用于检测生物学靶标和事件的简单且迅速的方法。水溶性荧光聚合物通常通过使包含聚乙二醇单元以使聚合物增溶的单体(例如，可紫光激发的(violet excitable)二氢菲单体)聚合来制备。用于制备具有不同颜色/发射波长的聚合物的通用方法涉及将接受体(acceptor)染料分子共价连接至共同的聚合物主链，从而允许高效的荧光共振能量转移(flluorescence resonance energy transfer，FRET)。这些聚合物通常被称为“串联聚合物染料(tandem polymer dye)”。
串联聚合物染料方法需要引入另外的反应性单体，该单体带有一个或更多个可化学修饰的官能团用于接受体染料连接。然而，引入新的单体存在许多缺点。例如，制备新的单体需要额外的合成步骤(这可以是昂贵且费时的)，并且由于单体结构的变化，聚合条件需要进行调整或完全重新设计。此外，用用于染料连接的单体替代具有水增溶基团的单体可损害期望产物的溶解度。参见例如美国专利No.8,362,193和No.9,896,538。为了确定多种单体的正确组合和量以制备具有可接受的FRET特性和溶解度水平的聚合物，必需大量反复试验。
发明内容
本文中提供了水溶性光活性聚合物，其包括根据式I的共轭聚合物(conjugatedpolymer)：
Figure BDA0002314960650000021
其中：
每个A独立地选自芳族共聚单体和杂芳族共聚单体；
L1、L2和L3是接头部分；
W是水增溶部分；
每个E是独立选择的生色团、功能部分或结合剂；
每个B独立地选自芳族共聚单体、杂芳族共聚单体、带隙修饰单体(bandgap-modifying monomer)、任选取代的亚乙基(ethylene)、以及亚乙炔基(ethynylene)；
G1和G2独立地选自未经修饰的聚合物末端和经修饰的聚合物末端；
下标n和m独立地为1至10,000的整数，
下标p为0至10,000的整数，并且
下标n、m和p的总和为2至10,000；
下标q为1、2、3或4；
下标r为1、2、3或4；
下标s为0、1、2或3；
下标t为1或2；
下标r和s的总和为1至4；并且
A和B在共轭聚合物中随机或非随机分布。
本公开内容的一些实施方案提供了制备根据式II的共轭聚合物的方法：
Figure BDA0002314960650000031
所述方法包括将根据式IIa的共轭聚合物转化为根据式II的聚合物：
Figure BDA0002314960650000032
其中：
A、B、G1、G2、L2、W、E以及下标n、m、p、q、r和s如上所限定；
L1a是接头部分；并且
R1选自H和胺保护基。
还提供了用于检测样品中分析物的方法。所述方法包括提供被怀疑含有分析物的样品；以及将样品与共轭聚合物复合体合并，所述共轭聚合物复合体包含与如本文中所描述的水溶性共轭聚合物缀合的结合剂。例如流式细胞术的测定技术可用于检测与和目标分析物结合的聚合物相关的荧光。
附图说明
图1示出了使用CD4缀合串联聚合物染料(5)(包括BV786)产生的流式细胞术直方图的覆盖图(overlay)。
图2示出了含有Dy752生色团的磺酰氨基(PEG)DHP聚合物聚合物-染料串联体的UV-vis吸收光谱。
图3示出了与含有Dy752生色团的磺酰氨基(PEG)DHP聚合物聚合物-染料串联体缀合的CD4 mAb的荧光发射光谱。由于接受体生色团的存在，串联聚合物在450nm处表现出显著的猝灭效应。
具体实施方式
本文中提供了新的聚合物染料，其可通过用染料或其他官能团直接修饰核心聚合物(core polymer)(例如，可紫光激发的聚合物)来制备。染料可通过将其与已经存在于聚合物主链中的官能团连接来引入，从而不需要额外种类的单体来实现染料连接。起始聚合物可以是例如具有9，10-二氢菲二酮(9，10-dihydrophenanthrenedione，DHP)主链的紫色聚合物染料，该主链具有通过磺酰胺键连接的增溶性聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)基团。用染料分子或其他官能团修饰磺酰胺基团提供了新的串联聚合物染料。
本文中所述的组合物和方法提供了许多显著优点。例如，对于紫色聚合物和紫色串联聚合物仅需制造一个聚合物批次。然后，可使用共用的聚合物平台来用所选择的任何染料制备串联聚合物，从而避免了对新单体的需求。聚合物主链的整体组成将不受影响，并且聚合物的溶解度将保持令人满意且易于在最终产物的整个合成和实验使用中进行处理。此外，用于直接修饰聚合物主链的化学本身是快速且高效的。
I.定义
本文中使用的术语“烷基”(单独或作为另一取代基的一部分)是指具有指定数目碳原子的直链或支链的饱和脂肪族基团。烷基可包含任意数目的碳，例如C1-2、C1-3、C1-4、C1-5、C1-6、C1-7、C1-8、C1-9、C1-10、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C3-4、C3-5、C3-6、C4-5、C4-6和C5-6。例如，C1-6烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等。烷基还可指具有至多20个碳原子的烷基，例如但不限于庚基、辛基、壬基、癸基等。烷基可以是经取代的或未经取代的。除非另有说明，否则“经取代的烷基”基团可被选自卤素、羟基、氨基、烷基氨基、酰氨基、酰基、硝基、氰基和烷氧基的一个或更多个基团取代。
本文中使用的术语“烷氧基”(单独或作为另一取代基的一部分)是指具有式-OR的基团，其中R是烷基。
本文中使用的术语“亚烷基”是指连接至少两个另外的基团的如上所限定的烷基(即，二价烷基基团)。与亚烷基连接的两个部分可与亚烷基的同一碳原子或不同碳原子连接。
本文中使用的术语“杂烷基”(单独或作为另一取代基的一部分)是指具有任意合适长度并且具有1至3个杂原子(例如N、O和S)的烷基。例如，杂烷基可包括醚、硫醚和烷基胺。另外的杂原子也是可用的，包括但不限于B、Al、Si和P。杂原子可被氧化以形成例如但不限于-S(O)-和-S(O)2-的部分。杂烷基的杂原子部分可替代烷基的氢原子以形成羟基、硫基(thio)或氨基。或者，杂原子部分可以是连接原子，或插入在两个碳原子之间。
本文中使用的术语“亚杂烷基”是指连接至少两个另外的基团的如上所限定的杂烷基(即，二价杂烷基基团)。与亚杂烷基连接的两个部分可与亚杂烷基的同一原子或不同原子连接。
本文中使用的术语“环烷基”(单独或作为另一取代基的一部分)是指含有3至12个环原子或指定数目原子的饱和或部分不饱和的单环、稠合双环或桥连(bridged)多环环组合体(assembly)。环烷基可包含任意数目的碳，例如C3-6、C4-6、C5-6、C3-8、C4-8、C5-8、C6-8、C3-9、C3-10、C3-11和C3-12。饱和的单环环烷基环包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环辛基。饱和的双环和多环环烷基环包括例如降冰片烷、[2.2.2]二环辛烷、十氢化萘和金刚烷。环烷基也可以是部分不饱和的，在环中具有一个或更多个双键或三键。部分不饱和的代表性环烷基包括但不限于：环丁烯、环戊烯、环己烯、环己二烯(1，3-和1，4-异构体)、环庚烯、环庚二烯、环辛烯、环辛二烯(1，3-、1，4-和1，5-异构体)、降冰片烯和降冰片二烯。当环烷基为饱和的单环C3-8环烷基时，一些示例性基团包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。当环烷基是饱和的单环C3-6环烷基时，一些示例性基团包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基和环己基。环烷基可以是经取代的或未经取代的。除非另有说明，否则“经取代的环烷基”基团可被选自卤素、羟基、氨基、烷基氨基、酰氨基、酰基、硝基、氰基和烷氧基的一个或更多个基团取代。术语“低级环烷基”是指具有三至七个碳的环烷基基团，包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。
本文中使用的术语“亚环烷基”是指连接至少两个另外的基团的如上所限定的环烷基(即，二价环烷基基团)。与亚环烷基连接的两个部分可与亚环烷基的同一原子或不同原子连接。
本文中使用的术语“卤代”和“卤素”(单独或作为另一取代基的一部分)是指氟、氯、溴或碘原子。
本文中使用的术语“卤代烷基”(单独或作为另一取代基的一部分)是指其中一些或全部氢原子被卤素原子替代的烷基。对于烷基，卤代烷基可具有任意合适数目的碳原子，例如C1-6。例如，卤代烷基包括三氟甲基、氟甲基等。在一些情况下，术语“全氟”可用于限定其中全部的氢被氟替代的化合物或基团。例如，全氟甲基是指1，1，1-三氟甲基。
本文中使用的术语“卤代烷氧基”(单独或作为另一取代基的一部分)是指其中一些或全部氢原子被卤素原子替代的烷氧基。
本文中使用的术语“芳基”(单独或作为另一取代基的一部分)是指具有任意合适数目的碳环原子和任意合适数目的环的芳族环体系。芳基可包含任意合适数目的碳环原子，例如C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15或C16，以及C6-10、C6-12或C6-14。芳基可以是单环的、稠合以形成双环(例如，苯并环己基)或三环基团，或通过键连接以形成联芳基(biarylgroup)。一些代表性的芳基包括苯基、萘基和联苯基。另一些芳基包括具有亚甲基连接基团的苄基。一些芳基具有6至12个环成员，例如苯基、萘基或联苯基。另一些芳基具有6至10个环成员，例如苯基或萘基。另一些芳基具有6个环成员，例如苯基。芳基可以是经取代的或未经取代的。除非另有说明，否则“经取代的芳基”基团可被选自卤素、羟基、氨基、烷基氨基、酰氨基、酰基、硝基、氰基和烷氧基的一个或更多个基团取代。
本文中使用的术语“亚芳基”是指连接至少两个另外的基团的如上所限定的芳基(即，二价芳基基团)。
本文中使用的术语“杂芳基”(单独或作为另一取代基的一部分)是指含有5至16个环原子的单环或者稠合双环或三环芳族环组合体，其中1至5个环原子是杂原子，例如N、O或S。另外的杂原子也是可用的，包括但不限于B、Al、Si和P。杂原子可被氧化以形成例如但不限于-S(O)-和-S(O)2-的部分。杂芳基可包含任意数目的环原子，例如C5-6、C3-8、C4-8、C5-8、C6-8、C3-9、C3-10、C3-11或C3-12，其中至少一个碳原子被杂原子替代。杂芳基中可包含任意合适数目的杂原子，例如1、2、3、4或5，或1至2、1至3、1至4、1至5、2至3、2至4、2至5、3至4或3至5。例如，杂芳基可以是C5-8杂芳基，其中1至4个碳环原子被杂原子替代；或C5-8杂芳基，其中1至3个碳环原子被杂原子替代；或C5-6杂芳基，其中1至4个碳环原子被杂原子替代；或C5-6杂芳基，其中1至3个碳环原子被杂原子替代。杂芳基可包括例如以下的基团：吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、四唑、吡嗪、嘧啶、咔唑、哒嗪、三嗪(1，2，3-、1，2，4-和1，3，5-异构体)、噻吩、呋喃、噻唑、异噻唑、
Figure BDA0002314960650000071
唑和异
Figure BDA0002314960650000072
唑。杂芳基也可与芳族环体系(例如苯环)稠合，以形成包括但不限于以下的成员：苯并吡咯，例如吲哚和异吲哚；苯并吡啶，例如喹啉和异喹啉；苯并吡嗪(喹喔啉)；苯并嘧啶(喹唑啉)；苯并哒嗪，例如酞嗪和噌啉；苯并噻吩；以及苯并呋喃。另一些杂芳基包括通过键连接的杂芳环，例如联吡啶。杂芳基可以是经取代的或未经取代的。除非另有说明，否则“经取代的杂芳基”基团可被选自卤素、羟基、氨基、烷基氨基、酰氨基、酰基、硝基、氰基和烷氧基的一个或更多个基团取代。
杂芳基可通过环上的任何位置连接。例如，吡咯包括1-、2-和3-吡咯，吡啶包括2-、3-和4-吡啶，咪唑包括1-、2-、4-和5-咪唑，吡唑包括1-、3-、4-和5-吡唑，三唑包括1-、4-和5-三唑，四唑包括1-和5-四唑，嘧啶包括2-、4-、5-和6-嘧啶，哒嗪包括3-和4-哒嗪，1，2，3-三嗪包括4-和5-三嗪，1，2，4-三嗪包括3-、5-和6-三嗪，1，3，5-三嗪包括2-三嗪，噻吩包括2-和3-噻吩，呋喃包括2-和3-呋喃，噻唑包括2-、4-和5-噻唑，异噻唑包括3-、4-和5-异噻唑，
Figure BDA0002314960650000073
唑包括2-、4-和5-
Figure BDA0002314960650000074
唑，异
Figure BDA0002314960650000075
唑包括3-、4-和5-异
Figure BDA0002314960650000076
唑，吲哚包括1-、2-和3-吲哚，异吲哚包括1-和2-异吲哚，喹啉包括2-、3-和4-喹啉，异喹啉包括1-、3-和4-异喹啉，喹唑啉包括2-和4-喹唑啉，噌啉包括3-和4-噌啉，苯并噻吩包括2-和3-苯并噻吩，并且苯并呋喃包括2-和3-苯并呋喃。
一些杂芳基包括具有5至10个环成员和1至3个环原子(包括N、O或S)的那些，例如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪(1，2，3-、1，2，4-和1，3，5-异构体)、噻吩、呋喃、噻唑、异噻唑、
Figure BDA0002314960650000077
唑、异
Figure BDA0002314960650000078
唑、吲哚、异吲哚、喹啉、异喹啉、喹喔啉、喹唑啉、酞嗪、噌啉、苯并噻吩和苯并呋喃。另一些杂芳基包括具有5至8个环成员和1至3个杂原子的那些，例如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪(1，2，3-、1，2，4-和1，3，5-异构体)、噻吩、呋喃、噻唑、异噻唑、
Figure BDA0002314960650000079
唑和异
Figure BDA00023149606500000710
唑。另一些杂芳基包括具有9至12个环成员和1至3个杂原子的那些，例如吲哚、异吲哚、喹啉、异喹啉、喹喔啉、喹唑啉、酞嗪、噌啉、苯并噻吩、苯并呋喃和联吡啶。另一些杂芳基包括具有5至6个环成员和1至2个环原子(包括N、O或S)的那些，例如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、噻吩、呋喃、噻唑、异噻唑、
Figure BDA00023149606500000712
唑和异
Figure BDA00023149606500000711
唑。
一些杂芳基包含5至10个环成员和仅氮杂原子，例如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪(1，2，3-、1，2，4-和1，3，5-异构体)、吲哚、异吲哚、喹啉、异喹啉、喹喔啉、喹唑啉、酞嗪和噌啉。另一些杂芳基包含5至10个环成员和仅氧杂原子，例如呋喃和苯并呋喃。另一些杂芳基包含5至10个环成员和仅硫杂原子，例如噻吩和苯并噻吩。另一些杂芳基包含5至10个环成员和至少两个杂原子，例如咪唑、吡唑、三唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪(1，2，3-、1，2，4-和1，3，5-异构体)、噻唑、异噻唑、
Figure BDA0002314960650000081
唑、异
Figure BDA0002314960650000082
唑、喹喔啉、喹唑啉、酞嗪和噌啉。
本文中使用的术语“亚杂芳基”是指连接至少两个另外的基团的如上所限定的杂芳基(即，二价杂芳基基团)。
本文中使用的术语“杂环基”(单独或作为另一取代基的一部分)是指具有3至12个环成员和1至4个N、O和S中杂原子的饱和环体系。另外的杂原子也是可用的，包括但不限于B、Al、Si和P。杂原子可被氧化以形成例如但不限于-S(O)-和-S(O)2-的部分。杂环基可包含任意数目的环原子，例如C3-6、C4-6、C5-6、C3-8、C4-8、C5-8、C6-8、C3-9、C3-10、C3-11或C3-12，其中至少一个碳原子被杂原子替代。杂环基中任意合适数目的碳环原子可被杂原子替代，例如1、2、3或4，或1至2、1至3、1至4、2至3、2至4、或3至4。杂环基可包括例如以下的基团：氮杂环丙烷、氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、氮杂环庚烷(azepane)、氮杂环辛烷(azocane)、奎宁环(quinuclidine)、吡唑烷、咪唑烷、哌嗪(1，2-、1，3-和1，4-异构体)、环氧乙烷(oxirane)、氧杂环丁烷、四氢呋喃、
Figure BDA0002314960650000083
烷(四氢吡喃)、氧杂环己烷(oxepane)、硫杂丙环、硫杂环丁烷(thietane)、硫杂环戊烷(四氢噻吩)、硫杂环己烷(四氢噻喃)、
Figure BDA0002314960650000084
唑烷、异
Figure BDA0002314960650000085
唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、二氧杂环戊烷(dioxolane)、二硫杂环戊烷(dithiolane)、吗啉、硫代吗啉、二
Figure BDA0002314960650000086
烷或二硫杂环己烷。杂环基也可与芳族或非芳族环体系稠合以形成包括但不限于吲哚啉的成员。杂环基可以是未经取代的或经取代的。除非另有说明，否则“经取代的杂环基”基团可被选自卤素、羟基、氨基、氧代(＝O)、烷基氨基、酰氨基、酰基、硝基、氰基和烷氧基的一个或更多个基团取代。
杂环基可通过环上的任何位置连接。例如，氮杂环丙烷可以是1-或2-氮杂环丙烷，氮杂环丁烷可以是1-或2-氮杂环丁烷，吡咯烷可以是1-、2-或3-吡咯烷，哌啶可以是1-、2-、3-或4-哌啶，吡唑烷可以是1-、2-、3-或4-吡唑烷，咪唑烷可以是1-、2-、3-或4-咪唑烷，哌嗪可以是1-、2-、3-或4-哌嗪，四氢呋喃可以是1-或2-四氢呋喃，
Figure BDA0002314960650000087
唑烷可以是2-、3-、4-或5-
Figure BDA0002314960650000091
唑烷，异
Figure BDA0002314960650000092
唑烷可以是2-、3-、4-或5-异
Figure BDA0002314960650000093
唑烷，噻唑烷可以是2-、3-、4-或5-噻唑烷，异噻唑烷可以是2-、3-、4-或5-异噻唑烷，并且吗啉可以是2-、3-或4-吗啉。
当杂环基包含3至8个环成员和1至3个杂原子时，一些代表性的成员包括但不限于吡咯烷、哌啶、四氢呋喃、
Figure BDA0002314960650000094
烷、四氢噻吩、硫杂环己烷、吡唑烷、咪唑烷、哌嗪、
Figure BDA0002314960650000095
唑烷、异
Figure BDA0002314960650000096
唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、吗啉、硫代吗啉、二
Figure BDA0002314960650000097
烷和二硫杂环己烷。杂环基也可形成具有5至6个环成员和1至2个杂原子的环，其中一些代表性的成员包括但不限于吡咯烷、哌啶、四氢呋喃、四氢噻吩、吡唑烷、咪唑烷、哌嗪、
Figure BDA0002314960650000098
唑烷、异
Figure BDA0002314960650000099
唑烷、噻唑烷、异噻唑烷和吗啉。
本文中使用的术语“亚杂环基”是指连接至少两个另外的基团的如上所限定的杂环基(即，二价杂环基基团)。与亚杂环基连接的两个部分可与亚杂环基的同一原子或不同原子连接。
本文中使用的术语“胺保护基”是指使氨基不反应但是也是可除去的以便恢复氨基的化学部分。胺保护基的一些实例包括但不限于苄氧羰基；9-芴甲氧羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，Fmoc)；叔丁氧羰基(tert-butyloxycarbonyl，Boc)；以及烯丙氧羰基(allyloxycarbonyl，Alloc)。
本文中使用的术语“羰基”(单独或作为另一取代基的一部分)是指-C(O)-，即，在具有羰基的部分中，碳原子与氧双键键合并且与两个另外的基团结合。
本文中使用的术语“氨基”是指-NR2部分，其中每个R基团为H或烷基。可使氨基部分离子化以形成相应的铵阳离子。
本文中使用的术语“磺酰基”是指-SO2R部分，其中R基团为烷基、卤代烷基或芳基。
术语“磺酰胺”当其属于本文中所述的接头部分时是指-S(O)2NR-部分，其中R基团为H、烷基、卤代烷基或芳基。术语“磺内酰胺”是指环状磺酰胺(例如，其中R基团通过亚烷基部分与硫原子键合)。
术语“二磺酰胺”当其属于本文中所述的接头部分时是指-S(O)2NRS(O)2-部分，其中R基团为H、烷基、卤代烷基或芳基。
术语“硒酰胺(selenoamide)”当其属于本文中所述的接头部分时是指-Se(O)2NR-部分，其中R基团为H、烷基、卤代烷基或芳基。
术语“亚磺酰胺”当其属于本文中所述的接头部分时是指-S(O)NR-部分，其中R基团为H、烷基、卤代烷基或芳基。
术语“二亚磺酰胺”当其属于本文中所述的接头部分时是指-S(O)NRS(O)-部分，其中R基团为H、烷基、卤代烷基或芳基。
术语“亚硒酰胺(seleninamide)”当其属于本文中所述的接头部分时是指-Se(O)NR-部分，其中R基团为H、烷基、卤代烷基或芳基。
术语“膦酰胺(phosphonamide)”当其属于本文中所述的接头部分时是指-NR-PR(O)NR-部分，其中每个R基团独立地为H、烷基、卤代烷基或芳基。
术语“亚膦酰胺(phosphinamide)”当其属于本文中所述的接头部分时是指-PR(O)NR-部分，其中每个R基团独立地为H、烷基、卤代烷基或芳基。
术语“膦酰胺酯(phosphonamidate)”当其属于本文中所述的接头部分时是指部分-O-PR(O)NR-，其中每个R基团独立地为H、烷基、卤代烷基或芳基。
本文中使用的术语“羟基”是指-OH部分。
本文中使用的术语“氰基”是指与氮原子三键键合的碳原子(即，-C≡N部分)。
本文中使用的术语“羧基”是指-C(O)OH部分。羧基部分可被电离以形成相应的羧酸根阴离子。本文中使用的术语“羧酸根”是指羧酸的共轭碱，其通常可由式-C(O)O-表示。例如，术语“羧酸镁”是指羧酸的镁盐。
本文中使用的术语“酰氨基”是指-NRC(O)R或-C(O)NR2部分，其中每个R基团为H或烷基。
本文中使用的术语“硝基”是指-NO2部分。
本文中使用的术语“氧代”是指与化合物双键键合的氧原子(即，O＝)。
本文中使用的术语“铵”是指具有式NHR3 +的阳离子，其中每个R基团独立地为氢或者经取代或未经取代的烷基、芳基、芳烷基或烷氧基。优选地，每个R基团为氢。
本文中使用的“低聚醚”应理解为意指包含具有醚官能团的结构重复单元的低聚物。本文中使用的“低聚物”应理解为意指包含一个或更多个具有相同或不同式的可识别结构重复单元的分子。
本文中使用的术语“磺酸官能团”或“磺酸”是指游离的磺酸根阴离子(-S(＝O)2O-)及其盐。因此，术语磺酸涵盖磺酸盐，例如磺酸钠、磺酸锂、磺酸钾和磺酸铵。
本文中使用的术语“聚乙二醇”和“PEG”是指基于乙二醇单体单元的生物相容性水增溶性线性聚合物的家族。
本文中使用的术语“氨基甲酸/氨基甲酸酯”是指具有-NR”CO2R’结构的官能团，其中R’和R”独立地选自氢、(C1-C8)烷基和杂烷基、未经取代的芳基和杂芳基、(未经取代的芳基)-(C1-C4)烷基和(未经取代的芳基)氧基-(C1-C4)烷基。氨基甲酸酯的一些实例包括Boc、Fmoc、苄氧羰基、alloc、氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、氨基甲酸9-(2-磺基)芴基甲酯、氨基甲酸9-(2，7-二溴)芴基甲酯、Tbfmoc、Climoc、Bimoc、DBD-Tmoc、Bsmoc、Troc、Teoc、氨基甲酸2-苯基乙酯、Adpoc、氨基甲酸2-氯乙酯、氨基甲酸1，1-二甲基-2-卤代乙酯、DB-t-BOC、TCBOC、Bpoc、t-Bumeoc、Pyoc、Bnpeoc和氨基甲酸二甲基乙酯。
本文中使用的术语“活化的酯”是指肽化学中用于促进羧基与氨基酸衍生物的游离氨基的容易缩合的羧基活化基团。对这些羧基活化基团的描述可见于肽化学的一般教科书中，例如，K.D.Kopple，“Peptides and Amino Acids”，W.A.Benjamin，Inc.，New York，1966，pp.50-51和E.Schroder and K.Lubke，“The Peptides”；Vol.1，Academic Press，NewYork，1965，pp.77-128。
术语“肼”是指具有-NHNH2结构的部分。
本文中使用的术语“醛”是指具有-CHO基团的化合物。
本文中使用的术语“硫醇”是指包含由硫-氢键构成的官能团的化合物。硫醇官能团的一般化学结构为R-SH，其中R表示烷基、烯烃、芳基或其他含碳的原子基团。
本文中使用的术语“甲硅烷基”是指Si(Rz)3，其中每个Rz独立地为烷基芳基或其他含碳的原子基团。
本文中使用的术语“重氮盐”是指一组具有R-N2 +X-结构的有机化合物，其中R可以是任何有机残基(例如，烷基或芳基)，并且X是无机或有机阴离子(例如，卤素)。
术语“三氟甲磺酸盐/酯”，也称为三氟甲烷磺酸盐/酯，是具有式CF3SO3的基团。
本文中使用的术语“硼酸”是指-B(OH)2结构。本领域技术人员认识到，在本文中公开的合成步骤的多个阶段，硼酸可作为硼酸酯存在；硼酸意指包括这样的酯。本文中使用的术语“硼酸酯”是指包含-B(Z1)(Z2)部分的化合物，其中Z1和Z2一起形成了其中与硼连接的原子在每种情况下均为氧原子的部分。在一些实施方案中，硼酸酯部分是5元环。在另一些实施方案中，硼酸酯部分是6元环。在另一些实施方案中，硼酸酯部分是5元环和6元环的混合物。
II.聚合物
本文中提供了水溶性共轭聚合物，其包括具有单体亚单元(例如二氢菲(dihydrophenanthrene，DHP)、芴、及其组合)的荧光聚合物。本公开内容的一些实施方案提供了根据式I的共轭聚合物：
Figure BDA0002314960650000121
其中：
每个A独立地选自芳族共聚单体和杂芳族共聚单体；
L1、L2和L3是接头部分；
W是水增溶部分；
每个E是独立选择的生色团、功能部分或结合剂；
每个B独立地选自芳族共聚单体、杂芳族共聚单体、带隙修饰单体、任选取代的亚乙基、以及亚乙炔基；
G1和G2独立地选自未经修饰的聚合物末端和经修饰的聚合物末端；
下标n和m独立地为1至10,000的整数，
下标p为0至10,000的整数，并且
下标n、m和p的总和为2至10,000；
下标q为1、2、3或4；
下标r为1、2、3或4；
下标s为0、1、2或3；
下标t为1或2；
下标r和s的总和为1至4；并且
A和B在共轭聚合物中随机或非随机分布。
在一些实施方案中，L1包含磺酰胺、磺酰胺、磺内酰胺、二亚磺酰胺、酰胺、膦酰胺、膦酰胺酯、亚膦酰胺或仲胺。在一些实施方案中，L1包含磺酰胺、酰胺、膦酰胺或仲胺。
在一些实施方案中：
下标q等于下标r和s的总和，
下标r为1或2，
如果下标r为1，则下标s为0或1，并且
如果下标r为2，则下标s为0。
在一些实施方案中，每个L3为共价键。
在一些实施方案中，共轭聚合物具有根据式II的结构：
Figure BDA0002314960650000131
其中：
L1a是接头部分；并且
R1选自H和胺保护基。
如本文中所述的，多种接头L1a和L2可用于合成根据式I和式II的聚合物。在一些实施方案中：
L1a选自共价键、C1-8亚烷基、2至8元亚杂烷基(例如，二价烷氧基接头)、C3-8亚环烷基、C6-10亚芳基、5至12元亚杂芳基、5至12元亚杂环基、-NHC(O)La-、-C(O)NHLa-、-C(O)La-、及其组合；
L2选自共价键、C1-8亚烷基、2至8元亚杂烷基(例如，二价烷氧基接头)、C3-8亚环烷基、C6-10亚芳基、5至12元亚杂芳基、5至12元亚杂环基、-LbNHC(O)-、-LbC(O)NH-、-LbC(O)-、-C(O)NHLb-、-C(O)Lb-、及其组合；
La和Lb独立地选自C1-8亚烷基和2至8元亚杂烷基；并且
R1选自H和胺保护基。
在一些实施方案中，提供了根据式II的聚合物，其中：
L1a选自共价键、C1-8亚烷基、2至8元亚杂烷基、-NHC(O)La-、-C(O)NHLa-和C(O)La，
L2选自共价键、C1-8亚烷基、2至8元亚杂烷基、LbNHC(O)、LbC(O)NH、LbC(O)、C(O)NHLb和C(O)Lb；
La和Lb独立地选自C1-8亚烷基和2至8元亚杂烷基；并且
R1选自H和胺保护基。
在一些实施方案中，W包含一个或更多个乙二醇单体。在一些实施方案中，W包含聚(乙二醇)。
在一些实施方案中，L3为三价芳基烷基部分，其具有：与第一L1部分(或第一L1a部分)连接的第一点；与第二L1部分(或第二L1a部分)连接的第二点；以及与A单体连接的第三点。例如，本公开内容的一些实施方案提供了具有如式VI中所示连接的两个或更多个生色团的共轭聚合物：
Figure BDA0002314960650000151
其中
L3a选自共价键、C1-8亚烷基、2至8元亚杂烷基、-NHC(O)La、C(O)NHLa和C(O)La；
La和Lb独立地选自C1-8亚烷基和2至8元亚杂烷基；
并且波形线为与单体连接的点。
在一些实施方案中，每个A是相同的共聚单体。在一些实施方案中，A是荧光单体。在一些实施方案中，A是基于9，10-菲二酮的单体(例如，基于二氢菲(DHP)的单体)、基于芴的单体或基于芴并
Figure BDA0002314960650000153
庚因(fluorenooxepine-based monomer)的单体。在一些实施方案中，根据式I的聚合物中的“A”单体是基于DHP的单体，例如：
Figure BDA0002314960650000152
其中：
每个X独立地为C或Si；
每个Y独立地为CR1R2或SiR1R2；
每个R1独立地为烷基铵盐、烷基氧基铵盐、低聚醚铵盐、烷基磺酸盐、烷氧基磺酸盐、低聚醚磺酸盐、磺酰氨基低聚醚、或以下部分：
Figure BDA0002314960650000161
每个R2独立地为H、烷基、烯基、炔基、环烷基、卤代烷基、烷氧基、(杂)芳氧基、芳基、(杂)芳基氨基、PEG基团、烷基铵盐、烷基氧基铵盐、低聚醚铵盐、烷基磺酸盐、烷氧基磺酸盐、低聚醚磺酸盐、磺酰氨基低聚醚或以下部分：
Figure BDA0002314960650000162
每个R3独立地选自H、烷基、烯烃、炔烃、环烷基、卤代烷基、烷氧基、(杂)芳氧基、芳基、(杂)芳基氨基和PEG基团；
每个Z独立地选自C、O和N；
每个Q独立地选自键、NH、NR4和CH2；并且
每个下标n独立地为0至20的整数。
在一些实施方案中，R1具有以下所示的结构，其中Q是NH：
Figure BDA0002314960650000163
在一些实施方案中，基于DHP的单体具有以下结构：
Figure BDA0002314960650000171
其中：
每个下标f独立地为0至50的整数，并且
每个下标n独立地为0至20的整数，并且
每个R5独立地为H、C1-C20烷基、C2-C20烯基、C2-C20炔基、C3-C20环烷基、C1-C20卤代烷基、C1-C20烷氧基、C2-C26芳氧基、C2-C26杂芳氧基、C2-C26芳基氨基或C2-C26杂芳基氨基。
在一些实施方案中，DHP单体具有以下结构：
Figure BDA0002314960650000172
其中：
每个下标f独立地为0至50的整数，并且
每个下标n独立地为0至20的整数，并且
每个R5独立地为H、C1-C20烷基、C2-C20烯基、C2-C20炔基、C3-C20环烷基、C1-C20卤代烷基、C1-C20烷氧基、C2-C26芳氧基、C2-C26杂芳氧基、C2-C26芳基氨基或C2-C26杂芳基氨基。
在一些实施方案中，根据式I的聚合物中的“A”单体是基于芴的单体，例如：
Figure BDA0002314960650000181
其中X、Z、R1、R2、R5、下标n、下标f如上所限定。
R1基团和R2基团，例如烷基铵盐、烷基氧基铵盐、低聚醚铵盐、烷基磺酸盐、烷氧基磺酸盐、低聚醚磺酸盐、磺酰氨基低聚醚或具有以下结构的部分：
Figure BDA0002314960650000182
可赋予在水/缓冲液中的溶解度。在一些实施方案中，例如，聚合物以超过10mg/mL、超过15mg/mL、超过20mg/mL、超过25mg/mL、超过30mg/mL、超过35mg/mL、超过40mg/mL、超过45mg/mL、超过50mg/mL、超过60mg/mL、超过70mg/mL、超过80mg/mL、超过90mg/mL或超过100mg/mL的水平可溶。
在一些实施方案中，本发明的单体还包括桥连单体(bridged monomer)。例如，本发明的桥连单体包括：
Figure BDA0002314960650000191
在一些实施方案中，根据式I的聚合物中的“A”单体是基于
Figure BDA0002314960650000194
庚因的单体(oxepine-based monomer)(例如，基于芴并
Figure BDA0002314960650000195
庚因的单体)，例如：
Figure BDA0002314960650000192
其中X、R1和R2如上所限定。
在根据包括以下描述的那些的方法进行聚合之前，单体的末端独立地为可经历钯或镍催化的聚合的卤素原子、硼酸酯或硼酸、甲硅烷基、重氮盐、三氟甲磺酸盐/酯基团、乙酰氧基、磺酸盐/酯基团或磷酸盐/酯。
在一些实施方案中，共轭聚合物具有根据式III的结构：
Figure BDA0002314960650000193
其中每个下标t为1至20的整数。
在一些实施方案中，根据式I的共轭聚合物中的“B”单体可改变聚合物带隙(bandgap)。改变带隙的单体包括例如以下的结构：
Figure BDA0002314960650000201
其中：
每个R4独立地为H、C1-C20烷基、C2-C20烯基、C2-C20炔基、C3-C20环烷基、C1-C20卤代烷基、C2-C26芳基、C2-C26杂芳基、烷基铵盐、烷基氧基铵盐、低聚醚铵盐、烷基磺酸盐、烷氧基磺酸盐、低聚醚磺酸盐、磺酰氨基低聚醚或(CH2)x(OCH2-CH2)yOCH3；
每个R5独立地为H、卤素、羟基、C1-C20烷基、C2-C20烯基、C2-C20炔基、C3-C20环烷基、C1-C20卤代烷基、C1-C20烷氧基、C2-C26芳基、C2-C26杂芳基、C2-C26芳氧基、C2-C26杂芳氧基、C2-C26芳基氨基、C2-C26杂芳基氨基、烷基铵盐、烷基氧基铵盐、低聚醚铵盐、烷基磺酸盐、烷氧基磺酸盐、低聚醚磺酸盐、磺酰氨基低聚醚或(CH2)x(OCH2-CH2)yOCH3；
每个x独立地为0至20的整数；并且
每个y独立地为0至50的整数。
在一些实施方案中，共轭聚合物中的“B”单体是任选取代的亚乙基部分，即具有碳-碳双键的式-CR＝CR-，其中每个R独立地为H、烷基、烯基、炔基、环烷基、卤代烷基、烷氧基、(杂)芳氧基、芳基、(杂)芳基氨基、PEG基团、烷基铵盐、烷基氧基铵盐、低聚醚铵盐、烷基磺酸盐、烷氧基磺酸盐、低聚醚磺酸盐、磺酰氨基低聚醚或如上限定的以下部分：
Figure BDA0002314960650000211
在一些实施方案中，共轭聚合物中的“B”单体可包括亚乙炔基部分，即具有式-C≡C-的碳-碳三键。
在一些实施方案中，G1和G2之一或二者以封端部分(capping moiety)进行修饰。在一些实施方案中，G1和G2之一以封端部分进行修饰，并且G1和G2之一以用于缀合的反应性基团进行修饰。封端单元G1和G2可以是例如氢、卤素、炔基、任选取代的芳基(例如，经卤素取代的芳基)、任选取代的杂芳基、甲硅烷基、重氮盐、三氟甲磺酸盐/酯、乙酰氧基、叠氮化物、磺酸盐/酯、磷酸盐/酯、经硼酸取代的芳基、经硼酸酯取代的芳基、硼酸酯或硼酸。封端单元还可包含一个或更多个用于缀合的反应性基团(例如，官能团，例如胺、氨基甲酸/氨基甲酸酯、羧酸、羧酸盐/酯、马来酰亚胺、活化的酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯)、肼、叠氮化物、炔烃、醛或硫醇)，其可与结合剂和底物物质共价键合，如下文更详地细描述的。
在一些实施方案中，本文中所述的聚合物的特征在于：最小数均分子量为大于5,000g/mol、大于10,000g/mol、大于15,000g/mol、大于20,000g/mol、大于25,000g/mol、大于30,000g/mol、大于40,000g/mol、大于50,000g/mol、大于60,000g/mol、大于70,000g/mol、大于80,000g/mol、大于90,000g/mol、或大于100,000g/mol。
在一些实施方案中，本文中所述的聚合物的特征在于：最小重均分子量为大于5,000g/mol、大于10,000g/mol、大于15,000g/mol、大于20,000g/mol、大于25,000g/mol、大于30,000g/mol、大于40,000g/mol、大于50,000g/mol、大于60,000g/mol、大于70,000g/mol、大于80,000g/mol、大于90,000g/mol或大于100,000g/mol。数均分子量和重均分子量的值可使用聚合物标准品(例如，聚苯乙烯或类似物质)通过凝胶渗透色谱(gel permeationchromatography，GPC)来确定。
III.用于聚合物制备的方法
本文中还提供了用于制备共轭聚合物的方法。
A.单体合成
本发明的DHP单体可如下所示制备。
Figure BDA0002314960650000221
例如，可如下制备2，7-二溴-反式-9，10-二氢菲-9，10-二醇(DHP-OH)。在锥形烧瓶(2L)中，将约26g NaBH4添加至搅拌的水-乙醇混合物(1∶6.5v∶v)。在约5分钟的时间内，向该溶液分批添加约24g 2，7-二溴菲，9，10-二酮。将反应混合物搅拌约24小时，并且在反应结束时溶液的颜色从橙红色变为浅黄色至白色。终止反应，并用稀HCl酸中和反应混合物。在中和之后，将白色沉淀物过滤并用过量的水洗涤。将分离的沉淀物用非常冷(＜-15℃)的乙醇(100mL)和甲醇(100mL)洗涤。
Figure BDA0002314960650000222
DHP-OSO3H可如下制备。在2颈圆底烧瓶中，将DHP-OH(3.6g)和18-冠醚-6(18-crown-6)(500mg)溶解在120mL THF中。将溶液用氮气净化(20分钟)，并且在继续氮气净化的同时添加NaH(2g)。在10至15分钟内溶液的颜色从无色变为浅粉色、深粉色、褐色和深绿色。在另一个烧瓶中，将12g 1，3丙烷磺酸内酯溶解在20mL THF中，并用氮气净化。将该磺酸内酯溶液在20至30分钟的时间中通过加料漏斗添加至DHP-OH溶液。将反应物在RT下搅拌4至5小时。蒸发溶剂，并将所得的固体物质溶解在水中。添加丙酮以获得二钠盐形式的白色沉淀物。过滤沉淀物，并将其重新溶解在水(极小量)中，用HCl中和，并再次在丙酮中沉淀。重复沉淀(2至3次)，然后离心，得到为白色固体的产物。
Figure BDA0002314960650000231
DHP-OSO2Cl可如下制备。量取5g DHP-OSO3H到圆底烧瓶中，并与25mL DMF混合。向其逐滴添加约10mL的SOCl2，并将混合物搅拌过夜。然后将反应混合物倒入到200mL水中，将产物沉淀物过滤并干燥。
Figure BDA0002314960650000232
DHP-磺酰胺PEG可如下制备。将DHP-OSO2Cl与2.2当量的PEG胺在二氯甲烷/TEA混合物中混合。在3小时声处理之后，将粗制产物在二氯甲烷中萃取，然后进行柱色谱(硅胶，MeOH-CHCl3)。
Figure BDA0002314960650000233
DHP-磺酰胺PEG，二硼酸酯可如下制备。在氮气下将经二溴官能化的DHP-磺酰胺与DMSO混合，并向其添加3当量的双频哪醇合二硼(Bispinacolatodiboron)。使试剂与12当量的乙酸钾和4当量的Pd(dppf)Cl2催化剂在80℃下反应5小时。将反应混合物冷却，并用CHCl3/水萃取。将有机层浓缩，并通过柱色谱(硅胶，MeOH-CHCl3)进行纯化。
类似地，可如下所述制备本发明的芴(fluorene，FL)单体。例如，可如下制备FL-OSO3H。在2颈圆底烧瓶中，将5g芴溶解在70mL DMSO中。将溶液用氮气净化(20分钟)，并在继续氮气净化的同时添加50％NaOH(12当量)。溶液的颜色从无色变为深褐色。称量丙烷磺酸内酯(3当量)并将其溶解在DMSO中。将其在5分钟的时间中逐滴添加至芴反应混合物。将反应物在RT下搅拌4至5小时。蒸发溶剂，并将沉淀物溶解在水中。添加丙酮以获得二钠盐形式的DPS的白色沉淀物。过滤沉淀物，并将其重新溶解在少量水中，用HCl中和，并再次在丙酮中沉淀。重复沉淀(2至3次)，然后离心，得到为白色固体的FL-OSO3H。
可如下制备FL-OSO2Cl。将5g FL-OSO3H置于圆底烧瓶中，并与25mL DMF混合。向其逐滴添加约10mL的SOCl2，并将混合物搅拌过夜。然后将反应混合物倒入200mL水中，将沉淀物过滤并干燥。
FL-磺酰胺PEG可如下制备。将FL-OSO2Cl与2.2当量的PEG胺在二氯甲烷/TEA混合物中混合。在3小时声处理之后，将粗制产物在二氯甲烷中萃取，然后进行柱色谱(硅胶，MeOH-CHCl3)。
FL-磺酰胺PEG的二硼酸酯可如下制备。在氮气下将相应的经二溴取代的化合物与DMSO混合，并向其添加3当量的双频哪醇合二硼。使试剂与12当量的乙酸钾和4当量的Pd(dppf)Cl2在80℃下反应5小时。将反应混合物冷却，并用CHCl3/水萃取。将有机层浓缩，并通过柱色谱(硅胶，MeOH-CHCl3)进行纯化。
B.聚合
通常来说，可使用本领域技术人员已知的聚合技术或使用与本文中描述的方法组合的本领域中已知的方法来完成上述单体单元的聚合。例如，由二卤化物单体合成二硼酸酯衍生物可通过与双(频哪醇合)二硼进行铃木偶联(Suzuki coupling)来完成：
Figure BDA0002314960650000241
类似地，聚合也可通过铃木偶联来实现：
Figure BDA0002314960650000251
其中J1和J2独立地为H、Br、B(OH)2或硼酸酯。
例如，聚合可如下进行。在圆底烧瓶中，将溴单体和硼酸单体二者溶解在DMF-水混合物中，并用氮气净化10分钟。在氮气下，将约20当量的CsF和Pd(OAc)2(10mol％)混合并在80℃下加热。使用UV-Vis光谱法和SEC色谱监测聚合。在聚合之后，添加包含合适官能团的第一封端剂(capping agent)，并在3小时之后添加第二封端剂。在反应之后，通过蒸发从粗制混合物中除去溶剂，并使粗制物质通过凝胶过滤柱以除去小有机分子和低MW低聚物。
C.封端单元
封端单元可通过如先前所述的类似机理与本发明的聚合物主链缀合。例如，封端单元的溴-和硼酸酯可附接至聚合物的一端或两端。利用封端单元的溴基团和硼酸酯二者将修饰聚合物的两端。利用封端单元的仅一种形式(溴基团或硼酸酯)将仅修饰以其相应互补物终止的那些末端，并且对于对称聚合，可用于统计地修饰聚合物的仅一个末端。对于不对称聚合物，该方法用于化学地确保聚合物仅在单链末端被修饰。封端单元还可通过首先使溴-封端单元与具有Y末端的聚合物反应，并随后使聚合物与硼酸酯封端单元反应来不对称地附接。
例如，可如下所示制备本发明的封端剂。
Figure BDA0002314960650000261
D.聚合物官能化
串联聚合物染料和其他官能化聚合物可通过在如本文中所述的聚合之后修饰聚合物中间体来制备。例如，可将根据式IV的增溶侧基转化为根据式V的经官能化增溶基团：
Figure BDA0002314960650000262
Figure BDA0002314960650000271
其中W是水增溶部分，并且L1和L2是连接部分。在一些实施方案中，每个E是独立选择的生色团、功能部分或结合剂。在一些实施方案中，每个E是独立选择的生色团(例如，以及独立选择的荧光团)。在一些实施方案中，聚合物中的所有E部分具有相同的荧光团结构。
根据式IV和式V的基团中的水增溶部分W可以是例如烷基铵盐、烷基氧基铵盐、低聚醚铵盐、烷基磺酸盐、烷氧基磺酸盐、低聚醚磺酸盐、磺酰氨基低聚醚、低聚(乙二醇)或聚(乙二醇)。连接部分L1、L2和L3可以是但不限于共价键、C1-8亚烷基、2至8元亚杂烷基。在一些实施方案中，接头是单原子、直链、支链、环状部分。在一些实施方案中，接头是长度为2至100个主链原子(例如碳原子)(例如长度为2至50个主链原子或长度为2至20个原子主链原子)的链。在某些情况下，接头主链的一个、两个、三个、四个或五个或更多个碳原子可任选地被硫、氮或氧替代。主链原子之间的键可以是饱和的或不饱和的；通常来说，在接头主链中将存在不多于一个、两个或三个不饱和键。接头可包含一个或更多个取代基(例如，烷基或芳基)。接头可包括但不限于低聚(乙二醇)、醚、硫醚、叔胺、以及亚烷基(即，二价烷基基团)，其可以是直链或支链的。接头主链可包含环状基团，例如二价芳基基团、二价杂环基团或二价环烷基基团，其中环状基团中的2个或更多个原子(例如2、3或4个原子)包含在主链中。
在一些实施方案中，L1包含磺酰胺、亚磺酰胺、二磺酰胺、二亚磺酰胺、磺内酰胺、酰胺、仲胺、膦酰胺、亚膦酰胺、膦酰胺酯、硒酰胺或亚硒酰胺。在一些实施方案中，L1包含磺酰胺、酰胺、仲胺或膦酰胺。在一些这样的实施方案中，L2包含直链或支链、饱和或不饱和的C1-30亚烷基；其中C1-30亚烷基中的一个或更多个碳原子任选地且独立地被O、S、NRa替代；其中C1-30亚烷基中相邻碳原子的两个或更多个组合(groupings)任选地且独立地被-NRa(CO)-或-(CO)NRa-替代；并且其中每个Ra独立地选自H和C1-6烷基。
在一些实施方案中，可如下使聚合物官能化：在第一步骤中将根据式IV的增溶侧基中L1的内部位置与接头部分L2的第一末端共价键合，并随后在第二步骤中将染料或其他官能团E与接头部分L2的第二末端共价键合。在一些实施方案中，使用在接头部分的第一末端具有合适离去基团的接头部分L2将L1中的氮原子(例如，酰胺氮、磺酰胺氮或膦酰胺氮)烷基化。在一些实施方案中，例如，离去基团为卤素(例如，氯、溴或碘)。在一些实施方案中，离去基团为磺酸酯(即，-OS(O)2R，其中R是烷基、卤代烷基、芳基或经取代的芳基)。合适的磺酸酯包括但不限于甲磺酸酯(甲烷磺酸酯)、三氟甲磺酸酯(三氟甲烷磺酸酯)、苯磺酸酯(苯-磺酸酯)、甲苯磺酸酯(对甲苯磺酸酯)和对溴苯磺酸酯(4-溴苯磺酸酯)。
在聚合物官能化期间，任何合适的溶剂可用于烷基化步骤。合适的溶剂包括但不限于甲苯、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、四氢呋喃、苯、氯仿、乙醚、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、石油醚、及其混合物。烷基化反应通常在约25℃至约100℃的温度下进行足以在聚合物中的一个或更多个侧基安装连接部分L2或连接的官能团-L2-E的时间。根据反应中使用的聚合物和试剂，反应可进行几分钟至数小时或更长的时间。例如，反应可在约40℃、或约50℃、或约60℃、或约70℃、或约80℃下进行约10分钟、或约30分钟、或约1小时、或约2小时、或约4小时、或约8小时、或约12小时。
连接部分L2的第二末端可包含官能团(例如，胺或羧酸)，其在第一步骤(例如，烷基化步骤)期间以受保护形式使用，然后在使染料或其他官能团E与连接部分的第二末端共价键合之前使其去保护。胺保护基的一些实例包括但不限于苄氧羰基；9-芴甲氧羰基(Fmoc)；叔丁氧羰基(Boc)；烯丙氧羰基(Alloc)；对甲苯磺酰基(p-toluene sulfonyl，Tos)；2，2，5，7，8-五甲基色满-6-磺酰基(2，2，5，7，8-pentamethylchroman-6-sulfonyl，Pmc)；2，2，4,6，7-五甲基-2，3-二氢苯并呋喃-5-磺酰基(2，2，4，6，7-pentamethyl-2，3-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl，Pbf)；均三甲苯基-2-磺酰基(mesityl-2-sulfonyl，Mts)；4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基磺酰基(4-methoxy-2，3，6-trimethylphenylsulfonyl，Mtr)；乙酰氨基；苯二甲酰亚氨基(phthalimido)；等。如例如Green and Wuts(ProtectiveGroups in Organic Synthesis，4thEd.2007，Wiley-Interscience，New York)描述的可使用已知技术将胺、羧酸、醇和其他官能团的这些和其他保护基添加至本公开内容的聚合物并从其中去除。
染料和其他官能团的添加可使用任何合适的方法进行。在一些实施方案中，在L2的去保护的伯胺基团与经羧酸官能化的染料之间形成酰胺键。染料可以以活化的形式使用，例如，可使用E-C(O)X作为试剂，其中X是离去基团。活化的经羧酸官能化试剂包括但不限于：酸酐(包括对称的酸酐、混合的酸酐或环状的酸酐)、活化的酯(例如，对硝基苯酯、五氟苯酯、N-琥珀酰亚胺酯等)、酰基唑(例如，使用羰基二咪唑制备的酰基咪唑等)、酰基叠氮化物和酰卤(例如，酰氯)。或者，可使用偶联剂以在L2的去保护的伯胺基团与经羧酸官能化的生色团E-C(O)OH之间形成键酰胺键。偶联剂可用于在与聚合物胺基反应之前形成活化的染料试剂。可使用任何合适的偶联剂。在一些实施方案中，偶联剂是碳二亚胺、胍盐、
Figure BDA0002314960650000292
盐、或脲盐。碳二亚胺的一些实例包括但不限于N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)等。
Figure BDA0002314960650000293
盐的一些实例包括但不限于，例如，(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基
Figure BDA0002314960650000294
六氟磷酸盐(PyBOP)、溴三(二甲基氨基)
Figure BDA0002314960650000295
六氟磷酸盐(BroP)等。胍盐/脲盐的一些实例包括但不限于，N，N，N’，N’-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)脲四氟硼酸盐(TSTU)；O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸盐(HBTU)；2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基-脲六氟磷酸盐(HATU)；1-[(1-(氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基-氨基氧基)二甲基氨基吗啉代)]脲六氟磷酸盐(COMU)等。如上所述，溶剂、反应时间和其他反应条件可根据例如具体聚合物和染料/官能团的性质的因素而变化。
本公开内容的一些实施方案提供了制备根据式II的共轭聚合物的方法：
Figure BDA0002314960650000291
所述方法包括将根据式IIa的共轭聚合物转化为根据式II的聚合物：
Figure BDA0002314960650000301
其中：
A是荧光单体；
L1a选自共价键、C1-8亚烷基、2至8元亚杂烷基、-NHC(O)La-、-C(O)NHLa-和-C(O)La-；
L2选自共价键、C1-8亚烷基、2至8元亚杂烷基、-LbNHC(O)-、-LbC(O)NH-、-LbC(O)-、-C(O)NHLb-和-C(O)Lb-；
La和Lb独立地选自C1-8亚烷基和2至8元亚杂烷基；
W是水增溶部分；
每个E是独立选择的生色团、功能部分或结合剂；
每个B独立地选自芳族共聚单体、杂芳族共聚单体、带隙修饰单体、任选取代的亚乙基和任选取代的亚乙炔基；
G1和G2独立地选自未经修饰的聚合物末端和经修饰的聚合物末端；
R1选自H和胺保护基；
下标n和m独立地为1至10,000的整数，
下标p为0至10,000的整数，并且
下标n、m和p的总和为2至10,000；
下标q为1、2、3或4；
下标r为1、2、3或4；
下标s为0、1、2或3；
下标t为1或2；
A和B在荧光聚合物中随机或非随机分布。
在一些实施方案中，将式IIa的共轭聚合物转化为根据式II的共轭聚合物包括如上所述的一个或更多个烷基化步骤，或一个或更多个酰胺形成步骤。
任何合适的生色团或荧光团均可用于聚合物官能化。通常来说，合适的生色团和荧光团具有可与增溶侧基共价键合(例如，通过如上所述的连接部分L2)的反应性基团(例如，羧酸部分、氨基部分、卤代烷基部分等)。合适的生色团和荧光团的一些实例包括但不限于美国专利No.7,687,282、7,671,214、7,446,202、6,972,326、6,716,979、6,579,718、6,562,632、6,399,392、6,316,267、6,162,931、6,130,101、6,005,113、6,004,536、5,863,753、5,846,737、5,798,276、5,723,218、5,696,157、5,658,751、5,656,449、5,582,977、5,576,424、5,573,909和5,187,288中描述的那些，这些专利通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，生色团E是具有以下结构的硼-二吡咯亚甲基部分：
Figure BDA0002314960650000311
其中
R6a、R6b、R6c、R6d、R6e、R6f和R6g中的六个独立地选自H、卤素、C1-6烷基、C3-8环烷基、C6-10芳基、C7-16芳基烷基、C1-6酰基和-SO3H；并且其中
R6a、R6b、R6c、R6d、R6e、R6f和R6g中的一个是连接部分-L2-。
在一些实施方案中，R6a和R6c是独立选择的C1-6烷基(例如，甲基或乙基)，并且R6e、R6f和R6g中的一个是连接部分-L2-。在一些实施方案中，R6a和R6c是甲基，并且R6g是连接部分-L2-。
在一些实施方案中，生色团E是具有以下结构的菁(cyanine)部分：
Figure BDA0002314960650000312
其中
R6h和R6i独立地选自H、C1-6烷基、(CH2)tCOOH、(CH2)tSO3H和连接部分L2；
每个下标t独立地为1至10的整数；
R6j和R6k独立地选自H、卤素、C1-6烷基、任选取代的稠合C6-10芳基(例如，任选取代的苯并)、-SO3H、-PO3H2、-OPO3H2、-COOH、以及连接部分L2；
每个Y独立地选自O、S、C(R61)2、-CH＝CH-和NR61，其中每个R61独立地为H或C1-6烷基；并且
下标n为1至6的整数，前提是R6h、R6i、R6j和R6k中的一个且仅一个是连接部分-L2-。
在一些实施方案中，生色团E是具有以下结构的香豆素部分：
Figure BDA0002314960650000321
其中
W是N或CR6p；
Z是O、S或NR6q；并且
R6m、R6n、R6o、R6p各自独立地选自H、卤素、C1-6烷基、-CN、-CF3、-COOR3v、-CON(R3v)2、-OR3v和连接部分-L2-；
R6n选自-OR3v和-N(R3v)2；
每个R6q独立地选自H、C1-6烷基和连接部分-L2-；
前提是R6m、R6n、R6o、R6p和R6q中的一个且仅一个是连接部分-L2-。
在一些实施方案中，生色团E是具有以下结构的呫吨部分：
Figure BDA0002314960650000322
其中：
T选自O、S、C(R6u)2和NR6u；
U是O或N(R6u)2；
每个R6r独立地选自H、卤素、C1-6烷基、-SO3H和连接部分-L2-；
R6s选自H、-OH、-OR6u、-N(R6u)2和连接部分-L2-；
R6t选自H、C1-6烷基、R6v和连接部分-L2-；
每个R6u独立地为H或C1-6烷基；并且
R6v选自：
Figure BDA0002314960650000331
其中：
每个R6w独立地选自H和连接部分-L2-；
前提是R6r、R6s、R6t和R6v中的一个且仅一个是连接部分-L2-。
在一些实施方案中，呫吨部分是荧光素，其中T和U为O；R6s为OH且R6t为：
Figure BDA0002314960650000332
在一些实施方案中，呫吨部分是伊红，其中T和U为O；R6s为OH，每个R6r为卤素(例如，溴)，并且R6t为：
Figure BDA0002314960650000333
在一些实施方案中，呫吨部分是罗丹明，其中T为O；U为N(R6u)2(例如，＝NH2 +)；R6s为-N(R6u)2(例如-NH2)，并且R6t为：
Figure BDA0002314960650000341
在一些实施方案中，呫吨部分是具有以下结构的罗丹明：
Figure BDA0002314960650000342
其中R6v选自：
Figure BDA0002314960650000343
一个R6w为H，并且另一个R6w为连接部分-L2-。
除生色团之外，其他功能部分也可使用本文中提供的方法附接至经官能化聚合物。例如，功能部分“E”可以是生物素、地高辛配基(digoxigenin)、肽标签(例如FLAG肽)、寡核苷酸或多核苷酸。本文中使用的术语“FLAG肽”是指含有氨基酸序列Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(即，DYKDDDDK)的寡肽或多肽。FLAG肽及其变体描述于例如Hopp，et al.的美国专利No.4,703,004中，该专利通过引用并入本文。可用于替代FLAG肽的另外的肽包括但不限于含有序列Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala(即，YPYDVPDYA)的HA肽标签、含有序列His-His-His-His-His-His(即，HHHHHH)的His6肽标签、以及含有序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu(即，EQKLISEEDL)的Myc肽标签。肽标签可被抗体或其他结合部分识别，以与比色试剂、化学发光试剂等一起使用以便于鉴定和/或定量。核苷酸(例如，RNA、单链DNA或双链DNA)可被互补引物或其他互补核苷酸识别，如例如在WO2016/019929(Navratil，et al.)中所述的，该出版物通过引用并入本文。本文中使用的术语“地高辛配基”是指3-[(3S，5R，8R，9S，10S，12R，13S，14S，17R)-3，12，14-三羟基-10，13-二甲基-1，2，3，4，5，6，7，8，9，11，12，15，16，17-十四氢环戊烯并[a]-菲-17-基]-2H-呋喃-5-酮(CAS登记No.1672-46-4)及其经取代的类似物。本文中使用的术语“生物素”是指5-[(3aS，4S，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基]戊酸(CAS登记No.58-85-5)及其经取代的类似物。
E.结合剂
本发明的“结合剂”可以是能够与靶分析物特异性结合的任何分子或分子复合体。本发明的结合剂包括例如蛋白质(例如，抗体或抗体片段)、小有机分子、碳水化合物(例如，多糖)、寡核苷酸、多核苷酸、脂质、亲和配体、适配体等。在一些实施方案中，结合剂是抗体或其片段。在本发明的背景下，特异性结合是指在存在异质群体的情况下确定靶分析物存在的结合反应。因此，在一定的测定条件下，指定结合剂优先与特定蛋白质或特定蛋白质的同种型结合，而不与样品中存在的其他蛋白质或其他同种型以显著量结合。
当结合剂是抗体时，其可以是单克隆抗体或多克隆抗体。本文中使用的术语抗体是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)分子的免疫学活性部分。这样的抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性多克隆抗体、抗体模拟物、嵌合体、单链、Fab、Fab’和F(ab’)2片段、Fv、以及Fab表达文库。
在一些情况下，抗体包括静脉内免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin，IVIG)和/或来自IVIG(例如，从IVIG富集、从IVIG纯化(例如亲和纯化))的抗体。IVIG是一种血液产品，其包含由来自许多(例如，有时超过1,000至60,000个)正常和健康血液供体的血浆(例如，在一些情况下没有任何其他蛋白质)合并的IgG(免疫球蛋白G)。IVIG是可商购获得的。IVIG的一些方面描述于例如美国专利申请公开No.2010/0150942、2004/0101909、2013/0177574、2013/0108619和2013/0011388中。
在一些情况下，抗体是确定亚类的单克隆抗体(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。如果使用抗体的组合，则抗体可来自相同的亚类或来自不同的亚类。例如，抗体可以是IgG1抗体。在一些实施方案中，单克隆抗体是人源化的。
在一些实施方案中，抗体能够与选自以下的一种或更多种靶标结合：BRCA1、CTLA4、CD4、EGF、EGFR、ERBB2(Her-2)、IFN-a、IFNγ、IL-1、IL1R1(CD121a)、IL1R2(CD121b)、IL-IRA、IL-2、IL2RA(CD25)、IL2RB(CD122)、IL2RG(CD132)、IL-4、IL-4R(CD123)、IL-5、IL5RA(CD125)、IL3RB(CD131)、IL-6、IL6RA(CD126)、IR6RB(CD130)、IL-7、IL7RA(CD127)、IL-8、CXCR1(IL8RA)、CXCR2(IL8RB/CD128)、IL-9、IL9R(CD129)、IL-10、IL10RA(CD210)、IL10RB(CDW210B)、IL-11、IL11RA、IL-12、IL-12A、IL-12B、IL-12RB1、IL-12RB2、IL-13、IL13RA1、IL13RA2、IL14、IL15、IL15RA、IL16、IL17、IL17A、IL17B、IL17C、IL17R、JAG1、JAK1、JAK3、mTOR、MUC1(黏蛋白)、MYC、NOTCH、NOTCH1、NOX5、PI3激酶、PIK3CG、PTEN、PTN、TLR10、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TNF、TNF-a、TNFSF5(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8(CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TOLLIP、TOP2A(拓扑异构酶Iia)、VEGF、VEGFB、VEGFC、多能蛋白聚糖(versican)、VHL C5、VLA-4、Wnt-1。用于聚合物缀合的抗体的一些实例包括但不限于：阿达木单抗(adalimumab)(也称为HUMIRATM)、阿德木单抗(adecatumumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、柏替木单抗(bertilimumab)、本妥昔单抗(brentuximab)、西妥昔单抗(cetuximab)(也称为ERBITUXTM)、克立昔单抗(clenoliximab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、达昔单抗(dacliximab)、达克珠单抗(daclizumab)(也称为ZENAPAXTM)、地莫单抗(detumomab)、达利珠单抗(dorlixizumab)、丹图木单抗(duntumumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、英夫利昔单抗(infliximab)(也称为REMICADETM)、伊匹单抗(ipilimumab)(也称为YERVOYTM)、鲁昔单抗(1umiliximab)、马帕木单抗(mapatumumab)、马司莫单抗(maslimomab)、奈巴库单抗(nebacumab)、奈瑞莫单抗(nerelimomab)、派姆单抗(pembrolizumab)(也称为KEYTRUDATM)、瑞加韦单抗(regavirumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、利妥昔单抗(rituximab)(也称为RITUXANTM、MabTHERATM)、罗维珠单抗(rovelizumab)、他度珠单抗(tadocizumab)和曲妥珠单抗(trastuzumab)(也称为HERCEPTINTM)。
通常来说，可使用本领域技术人员已知的技术或使用与本文中描述的方法组合的本领域中已知的方法来使本发明的聚合物与结合剂缀合。结合剂也可如上所述通过接头部分L1、L2和L3安装在根据式I的聚合物中的“E”位置。
例如，聚合物NHS酯的制备可如下进行。将5mg的聚合物溶解在1mL的无水CH3CN中。向其添加15mg TSTU，并将混合物再搅拌2分钟。向其添加100μL DIPEA，并继续搅拌过夜。接下来，通过蒸发除去有机溶剂，并通过快速涡旋将粗制NHS产物溶解在约750μL的1×PBS缓冲液(pH 8.8)中，然后转移至Zeba离心柱(spin column)(40K MWCO)。将样品在2200RPM下离心2分钟，并且立即使用聚合物NHS酯。
聚合物NHS酯与抗体(例如，CD4 mAb)的缀合可如下进行。将在PBS缓冲液中的聚合物NHS酯添加至0.6mg的抗体并与100μL 0.5M硼酸盐缓冲液(pH 9.0)混合。将混合物快速涡旋30秒，并随后在Coulter混合器中混合3至4小时。
经His标记抗体缀合物通过Histrap HP柱的纯化可如下进行。方法1：使用HistrapHP柱纯化粗制反应混合物。使用1×PBS缓冲液上样样品，并收集未结合的级分。这可使用20个柱体积的缓冲液来完成。之后，改变缓冲液以洗涤具有缀合物和游离抗体二者的结合级分。这可使用具有0.25M咪唑的1×PBS运行10个柱体积来完成。
方法2：Hitrap SP琼脂糖FF柱。对柱进行平衡，使用20mM pH 3.5的柠檬酸盐缓冲液上样粗制反应混合物，并收集未结合的级分。这可使用20个柱体积的缓冲液来完成。之后，改变缓冲液以洗脱具有缀合物和游离抗体二者的结合级分。这可使用含有0.6M NaCl的20mM pH 7.6的柠檬酸盐运行20个柱体积来完成。
通过SEC柱的缀合物纯化可如下进行。使用1×PBS将反应混合物上样在尺寸排阻柱上。在检查UV-可见光吸收光谱之后将级分合并，并将其在具有30kDa MWCO离心浓缩器的Amicon Ultra-15管中浓缩。
如下文更详细地描述的，带有迈克尔接受体(Michael acceptor)(例如马来酰亚胺)的聚合物可与抗体的半胱氨酸残基中存在的巯基共价键合。游离巯基可通过还原链间二硫键来产生或游离巯基可作为经改造(即，非天然存在的)半胱氨酸残基引入。经改造半胱氨酸残基可位于抗体重链或抗体轻链中。在某些实施方案中，经改造半胱氨酸残基位于重链的Fc区中。可使用如例如美国专利No.7,855,275、8,309,300和9,000,130中描述的经改造抗体。
IV.检测分析物的方法
A.概述
还提供了用于检测样品中分析物的方法，其包括：提供被怀疑含有分析物的样品；以及将样品与共轭聚合物复合体合并，所述共轭聚合物复合体包含与如本文中所述的水溶性共轭聚合物缀合的结合剂。结合剂能够与分析物相互作用。将光源施加于样品，这可激发聚合物，并检测从共轭聚合物复合体发射的光。在典型的测定中，本发明的荧光聚合物可被波长为约395nm至约415nm的光激发。所发射的光通常为约415nm至约475nm。或者，激发光可具有约340nm至约370nm的波长，并且所发射的光为约390nm至约420nm。
B.样品
本发明方法中的样品可以是例如血液、骨髓、脾细胞、淋巴细胞、骨髓抽吸物(或从骨髓获得的任何细胞)、尿(灌洗液)、血清、唾液、脑脊液、尿、羊水、组织间液、粪便、黏液或组织(例如，肿瘤样品、分解的组织、分解的实体瘤)。在某些实施方案中，样品是血液样品。在一些实施方案中，血液样品是全血。全血可使用标准临床方法从对象获得。在一些实施方案中，样品是全血中一种或更多种细胞(例如，红细胞、白细胞、淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞或NK细胞)、吞噬细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、血小板或具有一种或更多种可检测标志物的任何细胞)的亚群。在一些实施方案中，样品可来自细胞培养物。
对象可以是人(例如，患有疾病的患者)、具有商业意义的哺乳动物，包括例如猴、牛或马。样品还可获自家养宠物，包括例如狗或猫。在一些实施方案中，对象是用作疾病的动物模型或用于药物筛选的实验动物，例如小鼠、大鼠、兔或豚鼠。
C.分析物
本文中使用的“分析物”是指丰度/浓度通过某种分析方法来确定的物质，例如分子。例如，在本发明中，分析物可以是蛋白质、肽、核酸、脂质、碳水化合物或小分子。
靶分析物可以是例如核酸(DNA、RNA、mRNA、tRNA或rRNA)、肽、多肽、蛋白质、脂质、离子、单糖、寡糖、多糖、脂蛋白、糖蛋白、糖脂、或其片段。在一些实施方案中，靶分析物是蛋白质，并且可以是例如结构微丝蛋白、微管蛋白和中间丝蛋白、细胞器特异性标志物、蛋白酶体、跨膜蛋白、表面受体、核孔蛋白、蛋白质/肽转位酶、蛋白质折叠伴侣、信号传导支架、离子通道等。蛋白质可以是可活化的蛋白质，或者在病变或异常细胞中差异表达或活化的蛋白质，包括但不限于转录因子、DNA和/或RNA结合和修饰蛋白、核输入和输出受体、凋亡或存活的调节因子等。
D.测定
利用结合剂和荧光标记来对结合的分子进行定量的测定系统是公知的。这样的系统的一些实例包括流式细胞仪、扫描细胞仪、成像细胞仪、荧光显微镜和共聚焦荧光显微镜。
在一些实施方案中，流式细胞术用于检测荧光。适用于此用途的许多设备是可用的，并且是本领域技术人员已知的。一些实例包括BCI Navios、Gallios、Aquios和CytoFLEX流式细胞仪。
在另一些实施方案中，测定是免疫测定。可用于本发明的免疫测定的一些实例包括但不限于荧光发光测定(fluoroluminescence assay，FLA)等。测定也可在蛋白质阵列上进行。
当结合剂是抗体时，也可使用抗体或多抗体夹心测定。夹心测定是指使用连续的识别事件来构建多种结合剂和报道元件的层以发出特定分析物存在的信号。夹心测定的一些实例公开于美国专利No.4,486,530以及其中引用的参考文献中。
V.实施例
实施例1.NHBoc聚合物的制备
如在WO 2017/180998中所述制备50mg可紫光激发的基础聚合物(1)，并称重在4mL小瓶(vial)中。将800μL无水DMF添加至小瓶，将混合物涡旋并声处理5分钟以使聚合物完全溶解。聚合物(1)包含平均48个经PEG官能化的DHP单体(m＝约24)；尺寸不同(例如，m＝约5至50，n＝约5至25)的聚合物可以以类似的方式制备。
Figure BDA0002314960650000401
在氮气气氛下，将聚合物溶液转移至含有碳酸铯(100当量)的10mL反应烧瓶。从储备溶液(在无水DMF中10mg/mL)稀释3-碘丙基-氨基甲酸叔丁酯溶液，并将10当量添加至聚合物混合物。将密封的反应烧瓶加热至50℃，并且反应在以500rpm搅拌下继续1小时。将反应混合物冷却至RT，并将DMF在旋转蒸发仪中在高真空下蒸发。将粗制反应混合物用氯仿(25mL)稀释，并用15％w/v盐水溶液(25mL)洗涤。将有机层收集在250mL的锥形烧瓶中，添加另外的氯仿(12mL)，并将混合物用30％w/v盐水溶液(10mL)洗涤3次。通过添加20g无水硫酸钠来干燥有机级分，然后通过Whatman Paper 2将其过滤到150mL平底烧瓶中。将过滤的硫酸钠用氯仿(15mL)洗涤两次，以回收剩余的聚合物染料，并将其过滤到同一平底烧瓶中。将氯仿在旋转蒸发仪中于45℃和150至200rpm下蒸发。在高真空泵中于50℃下持续30至40分钟来除去残留的DMF。将经干燥的聚合物用乙醚(2×2mL)洗涤，并声处理两分钟以清除未反应的3-碘丙基-氨基甲酸叔丁酯。在高真空下干燥聚合物5分钟之后，相对于初始聚合物量计算聚合物的产率。使用1H NMR表征经干燥的聚合物产物(2)；1.4ppm处的质子信号表明聚合物中存在NH-Boc部分。经修饰的单体(下标ml)和未经修饰的单体(下标m2)沿聚合物主链随机分布。
Figure BDA0002314960650000411
实施例2.经胺官能化的聚合物的制备
将50mg根据实施例1制备的NHBoc聚合物添加至20mL圆底烧瓶，并通过涡旋5分钟和声处理5分钟溶解在1mL甲醇和1mL水中。向所得溶液添加12M HCl(2mL)，并使混合物在室温下反应2小时。然后将反应混合物转移至小烧杯，使用15％w/v的K2CO3溶液将pH调节至9至10，并再搅拌15分钟。在100mL分液漏斗中用25mL氯仿萃取聚合物，将有机层收集在锥形烧瓶中。将盐水溶液(15％w/v)添加至水层，并使用另外份的氯仿回收剩余的聚合物。用UV灯监测萃取过程。
使用约40g无水硫酸钠干燥有机层，并通过Whatman滤纸2将其过滤到250mL平底烧瓶中。使用另外的氯仿洗剂(2×20mL)从经过滤的硫酸钠回收剩余的聚合物。将合并的氯仿层在旋转蒸发仪中于约40℃下蒸发。在溶剂完全蒸发之后，将固体再次溶解在氯仿(10mL)中，并在3000rpm下离心5分钟以在15mL Falcon管中除去盐杂质。将上清液倒入20mL小瓶中，在旋转蒸发仪上浓缩，并在高真空下干燥。相对于受保护聚合物的量计算去保护的经胺官能化聚合物(3)的产率。通过1NMR以及通过确定接受体连接A/D比值来确认去保护。
Figure BDA0002314960650000421
实施例3.串联聚合物染料-抗体缀合和纯化
聚合物-接受体染料形成。称量10mg聚合物到玻璃小瓶中，并将其溶解在200μL无水DMSO中。为了确保聚合物完全溶解，应用了涡旋、声处理和在50℃水浴下孵育约10至15分钟的组合。向其添加200μL乙腈和20μL二异丙基乙胺。在无水DMSO中制备10mg/mL(w/v)的接受体染料(近IR吸收Dy752NHS；Dyomics GmbH)溶液，并将8当量的染料添加至聚合物溶液。将混合物在室温下搅拌2小时，避光，得到每条聚合物链包含平均2至3个染料的产物。可通过调节反应中使用的接受体染料的量来制备每条聚合物链包含1至6个染料的产物。如上文关于Dy752所述的，也使用Cy3.5-NHS(Lumiprobe Corp.)制备具有Cy3.5接受体的串联聚合物染料。
聚合物-接受体染料马来酰亚胺的制备。2小时之后，将溶解在50μL乙腈中的TSTU(20mg)添加至聚合物-接受体染料混合物，并在RT下避光通过不断搅拌进行活化过程持续30分钟。
如制造商所述进行的，用20mM硼酸盐pH 8.8缓冲液平衡两个5mL40K Zeba离心柱。同时，使用20μL无水DMSO制备2mg N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐溶液，并将其保持在Zeba收集管中。
将活化的串联聚合物溶解在1800μL的20mM硼酸盐pH 8.8缓冲液中，并使用经平衡的Zeba离心柱与马来酰亚胺合并。在Zeba柱步骤之后的聚合物量通过测量串联聚合物的UV414进行评估。回收了约5mg的串联聚合物(即，约50mol％)。通过在RT下滚动60至120分钟孵育串联聚合物-马来酰亚胺的所得混合物。任选地，反应可在声处理下进行90分钟。
在孵育期间，制备30％乙醇水和50mM MOPS、100mM高氯酸钠、4mM EDTA pH 7.0(MOPS缓冲液)。在反应之后，使用30或50kDa MWCO Amicon浓缩器用至少30至40mL 30％乙醇水洗涤串联聚合物-马来酰亚胺，然后使用至少30至40mL MOPS缓冲液将缓冲液更换为MOPS缓冲液。更换了缓冲液的聚合物-马来酰亚胺的最终体积为2至4mL。将该含有经马来酰亚胺官能化的串联染料聚合物(4)的混合物在进一步使用之前在4℃下储存过夜。
聚合物-抗体缀合物的制备。使用1×PBS平衡0.5mL 40K Zeba柱，并使1mg CD4mAb通过经平衡的Zeba柱。向更换了缓冲液的mAb添加30μL 10mg/mL(w/v)(在1×PBS中制备)DTT(约300当量)，并将所得混合物在RT下孵育30分钟。制备50mM MES、0.1M高氯酸钠、4mM EDTA pH 5.8(MES缓冲液)，并在暗处放置。30分钟之后，将还原的mAb稀释至500μL，并使其通过用MES缓冲液预先平衡的2mL 40K Zeba柱以除去过量的DTT。
Figure BDA0002314960650000431
将MES中的还原的CD4 mAb与聚合物-马来酰亚胺(在混合之前调至RT)混合，并避光、通过在RT下滚动孵育3小时以形成缀合物(5)。该未经纯化的缀合物可在4℃下储存过夜。
Figure BDA0002314960650000441
尽管出于清楚和理解的目的，已经通过举例说明和实例的方式详细地描述了前述内容，但是本领域技术人员将理解，可在所附权利要求书的范围内进行某些变化和修改。此外，本文中提供的每个参考文献通过引用整体并入，其程度如同每个参考文献单独通过引用并入。

Claims (16)

1.根据式I的共轭聚合物：
Figure FDA0002314960640000011
其中：
每个A独立地选自芳族共聚单体和杂芳族共聚单体；
L1、L2和L3是接头部分；
W是水增溶部分；
每个E是独立选择的生色团、功能部分或结合剂；
每个B独立地选自芳族共聚单体、杂芳族共聚单体、带隙修饰单体、任选取代的亚乙基和任选取代的亚乙炔基；
G1和G2独立地选自未经修饰的聚合物末端和经修饰的聚合物末端；
下标n和m独立地为1至10,000的整数，
下标p为0至10,000的整数，并且
下标n、m和p的总和为2至10,000；
下标q为1、2、3或4；
下标r为1、2、3或4；
下标s为0、1、2或3；
下标t为1或2；
下标r和s的总和为1至4；并且
A和B在所述共轭聚合物中随机或非随机分布。
2.权利要求1所述的共轭聚合物，其中L1包含磺酰胺、亚磺酰胺、二磺酰胺、二亚磺酰胺、磺内酰胺、酰胺、仲胺、膦酰胺、亚膦酰胺、膦酰胺酯、硒酰胺或亚硒酰胺。
3.权利要求1或权利要求2所述的共轭聚合物，其中L3是键。
4.权利要求1至3中任一项所述的共轭聚合物，其中：
下标q等于下标r和s的总和，
下标r为1或2，
如果下标r为1，则下标s为0或1，并且
如果下标r为2，则下标s为0。
5.权利要求1至4中任一项所述的共轭聚合物，其具有根据式II的结构：
Figure FDA0002314960640000021
其中：
L1a是接头部分；并且
R1选自H和胺保护基。
6.权利要求5所述的共轭聚合物，其中：
L1a选自共价键、C1-8亚烷基、2至8元亚杂烷基、-NHC(O)La-、-C(O)NHLa-和-C(O)La-；
L2选自共价键、C1-8亚烷基、2至8元亚杂烷基、-LbNHC(O)-、-LbC(O)NH-、-LbC(O)-、-C(O)NHLb-和-C(O)Lb-；并且
La和Lb独立地选自C1-8亚烷基和2至8元亚杂烷基。
7.权利要求1至6中任一项所述的共轭聚合物，其中W包含一个或更多个乙二醇单体。
8.权利要求1至7中任一项所述的共轭聚合物，其中W包含聚(乙二醇)。
9.权利要求1至8中任一项所述的共轭聚合物，其中每个A是相同的共聚单体。
10.权利要求1至9中任一项所述的共轭聚合物，其中A是紫色荧光单体。
11.权利要求1至10中任一项所述的共轭聚合物，其中A是基于9，10-菲二酮的单体、基于二氢菲的单体、基于二氢菲
Figure FDA0002314960640000032
庚因的单体、基于芴的单体或基于芴并
Figure FDA0002314960640000033
庚因的单体。
12.权利要求1所述的共轭聚合物，其具有根据式III的结构：
Figure FDA0002314960640000031
其中每个下标t为1至20的整数。
13.权利要求1至12中任一项所述的共轭聚合物，其中G1和G2之一或二者以封端部分进行修饰。
14.权利要求1至13中任一项所述的共轭聚合物，其中G1和G2之一以封端部分进行修饰，并且G1和G2之一以反应性官能团进行修饰。
15.权利要求1至14中任一项所述的共轭聚合物，其中每个E是独立选择的生色团。
16.制备根据式II的共轭聚合物的方法：
Figure FDA0002314960640000041
所述方法包括将根据式IIa的共轭聚合物转化为根据式II的聚合物：
Figure FDA0002314960640000042
其中：
A是荧光单体；
L1a和L2是接头部分；
W是水增溶部分；
每个E是独立选择的生色团；
每个B独立地选自芳族共聚单体、杂芳族共聚单体、带隙修饰单体、任选取代的亚乙基和任选取代的亚乙炔基；
G1和G2独立地选自未经修饰的聚合物末端和经修饰的聚合物末端；
R1选自H和胺保护基；
下标n和m独立地为1至10,000的整数，
下标p为0至10,000的整数，并且
下标n、m和p的总和为2至10,000；
下标q为1、2、3或4；
下标r为1、2、3或4；
下标s为0、1、2或3；
下标t为1或2；
下标r和s的总和为1至4；并且
A和B在荧光聚合物中随机或非随机分布。
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