CN111320640A - 一种抗肿瘤化合物的制备方法及用途 - Google Patents

一种抗肿瘤化合物的制备方法及用途 Download PDF

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任凤霞
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Abstract

本发明公开了一种如式I所示的天然化合物及其制备方法和用途。该化合物具有抑制肿瘤细胞生殖生长的活性，可用于制备抑制真核生物肿瘤细胞增殖的药物或用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物。
Figure DSA0000175752360000011

Description

一种抗肿瘤化合物的制备方法及用途
技术领域
本发明涉及一种天然化合物及其制备方法和用途，该化合物具有抑制肿瘤细胞生殖生长的作用。
背景技术
肿瘤是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物。一般将肿瘤分为良性和恶性两大类，所有的恶性肿瘤总称为癌症。在恶性肿瘤的治疗药物中，绝对多数合成的化学类抗肿瘤药物都是以天然抗肿瘤活性成分为先导化合物。
在特殊生境或极端环境下形成的生物资源拥有特殊的基因及其表达产物，是人类的珍贵遗传资源宝库。如近年来发挥着巨大医疗作用的抗癌物质紫杉醇、治疗心血管病洛伐他汀、抗疟疾药物青蒿素等。特殊生境真菌和植物来源中功能性活性物质的开发利用，可产生丰富的自主知识产权成果，同时孕育着巨大的产业前景与经济效益。
发明内容
本发明的目的是提供一种天然化合物、其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的用途。
本发明的第一方面提供式I所示的化合物，
Figure BSA0000175752380000011
本发明的第二方面提供一种制备式I所述的化合物的方法，该方法使用保藏编号为CGMCC No.2673、分类命名为粘帚霉属(Gliocladium sp.)、名称为6.102的菌株制备所述化合物。
所述方法的特征包括下列步骤：
a)将粘帚霉属菌株6.102进行固体发酵，得到发酵培养物；
b)将步骤a)中获得的发酵培养物用合适的有机溶剂提取合适的次数，合并提取液，将所述提取液分离有机溶剂后，得到粗提物；
c)将步骤b)中获得的粗提物进行层析分离，得到活性组分溶液，将所述活性组分溶液用高效液相色谱分离，得到式(I)化合物。
上述制备方法中，制备式I所示的化合物中所用的生产菌株是粘帚霉属(Gliocladium sp.)6.102，该菌株分离自采集于西藏林芝地区的冬虫夏草样品，并于2008年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.2673。粘帚霉属菌株6.102属于子囊菌门(Ascomycota)，肉座菌目(Hypocreales)，肉座菌科(Hypoceraceae)，粘帚霉属(Gliocladium sp.)。
在如上所述的本发明方法中，本领域技术人员应当理解步骤b)中所用的有机溶剂包括多种不溶于水的在室温下是液态的有机溶剂，诸如氯仿、乙酸乙酯、苯、甲苯等，优选地，所述有机溶剂是乙酸乙酯。
本发明的第三方面涉及式I所示的化合物在制备抑制真核生物肿瘤细胞增殖的药物中的用途；
优选地，所述的真核生物为哺乳动物；
优选地，所述的肿瘤细胞为癌细胞；进一步优选地，所述的癌细胞为肺癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、宫颈癌细胞或膀胱癌细胞；更优选地，所述肺癌细胞为肺癌细胞A549，所述乳腺癌细胞为乳腺癌细胞MCF-7，所述结肠癌细胞为结肠癌细胞SW480或结肠癌细胞HCT116，所述宫颈癌细胞为宫颈癌细胞HeLa，所述膀胱癌细胞为膀胱癌细胞T24。
优选地，所述的肿瘤为癌；进一步优选地，所述癌为肺癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌和膀胱癌。
本发明所提供的式I所示的化合物是从微生物固体发酵提取物中首次分离得到的并命名的新化合物，同时是首次报道其抗肿瘤活性。
本发明通过构建细胞筛选模型以鉴定该化合物是否具有抑制肿瘤发生发展的作用。构建的细胞筛选模型有肺癌细胞(A549)、乳腺癌细胞(MCF-7)、结肠癌细胞(HCT116)、宫颈癌细胞(HeLa)和膀胱癌细胞(T24)等，采用体外细胞增殖实验MTT法筛选该化合物能够抑制何种肿瘤细胞的生殖生长，经试验发现该化合物能够较好的抑制上述肿瘤细胞的生殖生长过程，并且对该化合物呈现剂量效应即随着化合物浓度的增高对肿瘤细胞的生殖生长的抑制效果越好。
附图说明
图1为式I所示化合物的核磁共振1H NMR谱图；
图2为式I所示化合物的核磁共振13C NMR谱图；
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员应该理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例中所用的菌株Gliocladium sp.于2008年9月26日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.2673。粘帚霉属菌株6.102属于子囊菌门(Ascomycota)，肉座菌目(Hypocreales)，肉座菌科(Hypoceraceae)，粘帚霉属(Gliocladium sp.)。
实施例1、式I所示化合物的制备
a.菌株Gliocladium sp.的固体发酵
菌株Gliocladium sp.的活化。PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，纯净水1000mL，121℃高压蒸汽灭菌30分钟，制成试管斜面，挑取菌丝体接种于试管斜面上，25℃培养7天。
菌株Gliocladium sp.的固体发酵。大米培养基的制备(将80g大米和100mL纯净水加入500mL三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌30分钟，冷却待用)；从试管斜面上挑取菌丝体于装有无菌水的试管中配成菌悬液，将制备好的菌悬液5mL接种于大米培养基上，在25℃无菌培养间发酵培养40天。
b.粗提物的提取
将步骤a得到的发酵培养物用玻璃棒捣碎，按照乙酸乙酯与粉碎后发酵培养物的体积比为1∶1，将乙酸乙酯加入盛有粉碎后培养物的三角瓶中，静置浸泡1天，提取3次，将有机溶剂减压蒸馏至干燥，得到191.0g粗提物。
c.粗提物的分离纯化
将上述粗提物装入减压层析硅胶柱[减压硅胶柱(45cm×30cm)，购自欣维尔玻璃仪器公司；所用的硅胶为薄层层析硅胶H，购自青岛海洋化工有限公司。柱子中装700g硅胶]，用石油醚-二氯甲烷-甲醇体系(详细的体积比分别为100％石油醚；石油醚∶二氯甲烷＝1∶1；100％二氯甲烷；二氯甲烷∶甲醇＝200∶1，200∶1.5，200∶2，200∶4，200∶8，200∶20，200∶50，200∶100；100％甲醇(v/v))进行减压硅胶柱层析，按照极性由小到大的顺序将粗提物分成36个组分，在活性跟踪[测试36个组分对乳腺癌细胞(MCF-7)和肺癌细胞(A549)的抑制活性，具体的测试方法如实施例3所述，抑制率大于50％视为有抑制活性]指导下，发现在二氯甲烷∶甲醇＝200∶1(v/v)作为流动相洗脱得到的组分(命名为组分1)有抑制活性，收集活性组分1(14g)。
将活性组分1通过常压硅胶柱层析，[硅胶柱(45cm×8cm)，购自欣维尔玻璃仪器公司；所用的硅胶为薄层层析硅胶200-300目，购自青岛海洋化工有限公司。柱子中装300g硅胶]用石油醚-乙酸乙酯体系(详细的体积比分别为100％石油醚，石油醚∶乙酸乙酯＝90∶10，85∶15，80∶20，75∶25，70∶30，65∶35，60∶40，55∶45，50∶50，100％乙酸乙酯(v/v))进行常压硅胶柱层析，按照极性由小到大的顺序将组分1分成11个组分，在活性跟踪[测试11个组分对乳腺癌细胞(MCF-7)和肺癌细胞(A549)的抑制活性，具体的测试方法如实施例3所述，抑制率大于50％视为有抑制活性]指导下，发现在石油醚∶乙酸乙酯＝100∶70(v/v)作为流动相洗脱得到的组分(命名为组分1-6)有抑制活性，收集活性亚组分1-6(5g)。
将活性亚组分1-6再次通过常压硅胶柱层析分离，色谱柱规格为60cm×2.5cm(购自欣维尔玻璃仪器公司)，所用的硅胶为薄层层析硅胶200-300目，购自青岛海洋化工有限公司。柱子中装180g硅胶，流动相是二氯甲烷-丙酮体系(详细的体积比分别为100％二氯甲烷，二氯甲烷∶丙酮＝400∶1，200∶1，200∶2，200∶3，200∶6，200∶20，100％丙酮(v/v))，将组分1-6分为12个亚组分，然后再活性跟踪[测试12个组分对乳腺癌细胞(MCF-7)和肺癌细胞(A549)的抑制活性，具体的测试方法如实施例3所述，抑制率大于50％视为有抑制活性]分别测试这12个组分的抗肿瘤活性，得到620mg活性亚组分1-6-4。
将活性亚组分1-6-4通过HPLC纯化而得到3.0mg式I所示化合物，其中HPLC的条件是：采用Agilent 1260型半制备高压液相色谱仪，Agilent C18反相半制备色谱柱(5μm、9.4x 250mm)，流速2.0mL/min，用乙腈和水作为流动相，制备条件：乙腈/水(55/45，v/v)等度洗脱35分钟，得到式I所示化合物，其保留时间tR＝30.10分钟。
实施例2、式I所示化合物的结构表征
实施例1制备的式I所示化合物形状为白色粉末；分子式为C31H30N6O5S4；分子量为694(据ESI MS，测试仪器型号为Agilent Accurate-Mass-Q-TOF LC/MS 6520)；核磁共振波谱由中国医学科学院药物研究所提供测试(测试仪器型号为Varian INOVA 600)。氢谱(1HNMR)和碳谱(13C NMR)数据见表1、附图1和附图2：
表1.式I所示化合物的氢谱(1H NMR)和碳谱(13C NMR)数据
Figure BSA0000175752380000061
a在600MHz以CDCl3为溶剂测试。
b在150MHz以CDCl3为溶剂测试。
通过将上述式I所示化合物的核磁共振氢谱、碳谱、质谱数据与文献中所报道的“New Cytotoxic Epidithiodioxopiperazhes Related to Verticillin A from aMarine Isolate of the Fungus Penicillium”(Nat.Prod.Lett.1999，13，213-222.)中化合物11′-deoxyverticillin A的数据相比较，发现该化合物与11′-deoxyverticillin A非常相似，但是取代基不同，证实得到的产物是一种新的化合物，将其命名为Glioeladicillin J。确证化合物的化学式如式I所示：
Figure BSA0000175752380000071
综上所述，从真菌Gliocladium sp.的191g粗提物中经过分离纯化得到3.0mg纯化合物Gliocladicillin J。
实施例3、式I所示化合物对肿瘤细胞生殖生长的影响
构建细胞筛选模型：肺癌细胞(A549)、乳腺癌细胞(MCF-7)、结肠癌细胞(SW480、HCT116)、宫颈癌细胞(HeLa)和膀胱癌细胞(T24)(上述细胞均由中国科学院微生物研究所姜学军课题组提供)。
采用MTT法检验实施例1制备的式I所示化合物对以上6种肿瘤细胞生殖生长的影响。为了验证几种肿瘤细胞对该化合物的剂量效应，将实施例1制备的式I所示化合物和阳性对照药顺铂分别用DMSO(二甲基亚砜，Dimethyl sulfoxide，DMSO)作溶剂配制成浓度分别为0.4，2，4，10，20，40mg/ml的待测溶液。
具体实验方法如下：
1、将肿瘤细胞悬液接种至96孔板中，接种100μL(浓度1.0×105个/mL)，DMEM培养基(购自Invitrogen公司，使用前按说明书加适当体积的水配制成液体培养基灭菌待用)100μL。
2、将肿瘤细胞在37℃，5％CO2的培养箱内培养24小时，轻轻倒掉液体培养基，用PBS洗涤1次，加入适当浓度的化合物溶液，每个浓度接种3孔，每孔加入200μL，37℃，5％CO2的培养箱内孵育4小时。
3、培养结束后，用新鲜的DMEM培养基等体积替换化合物溶液，再在37℃，5％CO2的培养箱内培养48小时。
4、培养结束后，每孔加入50μL(浓度0.5mg/mL)的MTT(噻唑蓝)溶液，再将其置于37℃，5％CO2的培养箱内培养3小时。
5、离心(1500r/min，5min)除去培养基和MTT溶液，每孔加入200μL的DMSO溶液，37℃下静置1小时。
6、使用微量平板读数仪(SUNRISE-basic TECAN)读取培养后的混合物在570nm波长的条件下的光密度OD值。
7、以未处理细胞的吸收值相对于初始值的增长为增殖率100％，计算Gliocladicillin J的IC50值。
其中IC50表示导致50％细胞增殖抑制的药物浓度。实验结果需要通过三次独立实验决定。
式I所示化合物对测试的6种肿瘤细胞的IC50值见表2。
表2化合物Gliocladicillin J抑制人癌细胞增殖的IC50值(μM)测定结果
Figure BSA0000175752380000081
综上所述，本发明的式I所示化合物对肺癌细胞(A549)、乳腺癌细胞(MCF-7)、结肠癌细胞(SW480、HCT116)、宫颈癌细胞(HeLa)和膀胱癌细胞(T24)的抑制活性明显强于阳性对照药物顺铂(DDP)的抑制活性(20～35倍)。因此，本发明对研究与开发新的抗肿瘤(肺癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌和膀胱癌)药物提供了候选化合物，也为开发利用微生物来源的天然活性物质提供了科学依据。

Claims (10)

1.式I所示的化合物，
Figure FSA0000175752370000011
2.制备权利要求1的化合物的方法，该方法使用保藏编号为CGMCC No.2673、分类命名为粘帚霉属(Gliocladium sp.)、名称为6.102的菌株制备所述化合物。
3.权利要求1的制备方法，所述方法包括下列步骤：
a)将粘帚霉属菌株6.102进行固体发酵，得到发酵培养物；
b)将步骤a)中获得的发酵培养物用合适的有机溶剂提取合适的次数，合并提取液，将所述提取液分离有机溶剂后，得到粗提物；
c)将步骤b)中获得的粗提物进行层析分离，得到活性组分溶液，将所述活性组分溶液用高效液相色谱分离，得到式I化合物。
4.权利要求3的制备方法，步骤a)中，发酵使用的培养基是稻米培养基，所用的有机溶剂是乙酸乙酯。
5.权利要求1的式I化合物的应用，其能抑制肿瘤细胞的增殖。
6.权利要求5所述的应用，其中所述肿瘤细胞包括A549细胞、MCF-7细胞、SW480和HCT116细胞、HeLa细胞以及T24细胞。
7.权利要求1的式I化合物在制备抗肿瘤活性的药物中的应用。
8.权利要求1的式I化合物在制备抗肿瘤活性的试剂盒中的应用。
9.权利要求7或8所述的应用，其中所述肿瘤包括肺癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌和膀胱癌。
10.一种抗肿瘤活性试剂盒，其包括治疗有效量的权利要求1的式I化合物，以及药用载体等。
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