CN111315877A - 新型o-琥珀酰高丝氨酸转移酶变体及使用其生产o-琥珀酰高丝氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及O‑琥珀酰高丝氨酸转移酶变体、编码其的多核苷酸、包括变体的微生物、以及使用该微生物生产O‑琥珀酰高丝氨酸的方法。

Description

新型O-琥珀酰高丝氨酸转移酶变体及使用其生产O-琥珀酰高 丝氨酸的方法
技术领域
本公开涉及O-琥珀酰高丝氨酸转移酶变体、编码该变体的多核苷酸、包含该变体的微生物、以及使用该微生物生产O-琥珀酰高丝氨酸的方法。
背景技术
O-琥珀酰高丝氨酸充当甲硫氨酸(其是生物体内一种必需氨基酸)的前体。甲硫氨酸被用作饲料和食品添加剂，以及进一步被用作医用溶液和医疗用品的合成原料。
甲硫氨酸通过化学合成和生物合成生产。同时，公开了两步法(WO/2008/013432)，其中通过发酵生产L-甲硫氨酸前体，然后通过酶转化反应将其转化为L-甲硫氨酸。
在两步法中，O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰高丝氨酸被用作甲硫氨酸的前体，且为了经济地大量生产甲硫氨酸，以高产率生产O-琥珀酰高丝氨酸是至关重要的。
metA基因是编码高丝氨酸O-琥珀酰转移酶(MetA)(其是通过将琥珀酰辅酶A的琥珀酰基结合到高丝氨酸以生产O-琥珀酰高丝氨酸的酶)的基因，且metA基因是O-琥珀酰高丝氨酸生产菌株的开发中最重要的基因之一。
通过缺失编码甲硫氨酸生物合成途径中的胱硫醚γ合酶的metB基因，可能制备出积累O-琥珀酰高丝氨酸的菌株。然而，O-琥珀酰高丝氨酸生产菌株对L-甲硫氨酸有需求。为了这个原因，高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的活性通过被添加到培养基中的甲硫氨酸的反馈抑制而被抑制，且最终难以获得高浓度的O-琥珀酰高丝氨酸。
因此，许多先前的专利将它们的研究集中在从反馈控制系统解除metA的反馈抑制上。然而，metA编码的高丝氨酸O-琥珀酰转移酶存在的问题在于野生型蛋白本身具有低稳定性，并且为了解除反馈抑制而引入突变加剧了不稳定性。因此，为了开发具有高生产能力的O-琥珀酰高丝氨酸生产菌株，需要移除metA基因的反馈抑制并保证酶的稳定性。
已知自然界中存在的大多数微生物利用O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰高丝氨酸作为中间体用于甲硫氨酸的生物合成。通常，MetA产生O-琥珀酰高丝氨酸，且高丝氨酸O-乙酰转移酶(MetX)产生O-乙酰高丝氨酸。与MetA不同，MetX不受反馈抑制，并且具有很高的酶稳定性。
发明内容
技术问题
本发明人为增加O-琥珀酰高丝氨酸的生产进行了集中努力，且结果，他们发现了具有O-琥珀酰高丝氨酸合成活性的蛋白质，从而完成了本公开。
技术方案
本公开的目的是提供具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的多肽，多肽包括对SEQID NO：1的氨基酸序列中的第313位的氨基酸进行亮氨酸以外的氨基酸的取代。
本公开的另一个目的是提供编码该多肽的多核苷酸。
本公开的另一个目的是提供棒杆菌属(genus Corynebacterium)的O-琥珀酰高丝氨酸生产微生物，该微生物包含具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的多肽。
本公开的另一个目的是提供生产O-琥珀酰高丝氨酸的方法，该方法包括以下步骤：在培养基中培养微生物；以及从培养的微生物或培养基中分离或收集O-琥珀酰高丝氨酸。
本公开的另一个目的是提供生产L-甲硫氨酸的方法，该方法包括以下步骤：在培养基中培养微生物；以及使O-琥珀酰高丝氨酸与硫化物反应。
有益效果
根据本公开的O-琥珀酰高丝氨酸转移酶蛋白的变体可具有与其天然形式相比增强的O-琥珀酰高丝氨酸转化活性，从而(作为现有化学合成途径的替代)广泛应用于O-琥珀酰高丝氨酸的更有效的大量生产。
具体实施方式
以下，将更详细地描述本公开。
同时，本公开中公开的每个描述和实施方式还可应用于其它描述和实施方式。换句话说，本公开中公开的各种要素的所有组合落入在本公开的范围内。进一步，本公开的范围不受下面描述的具体描述的限制。
进一步，本领域技术人员仅使用常规实验即可认识到或确认本公开中描述的本公开的某些方面的许多等同物。同样，这样的等同物意图被包含在本公开中。
为了实现这些目的，本公开的一个方面提供了具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的新型多肽。新型多肽变体可以是具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的多肽，多肽包括将来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的氨基酸序列中(具体地，SEQ IDNO：1的氨基酸序列中)的第313位的氨基酸被亮氨酸以外的氨基酸取代。进一步，多肽可以包括在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的第313位处被亮氨酸以外的氨基酸的取代，并且可以具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性。更具体地，多肽可以是具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的多肽，其中多肽包括在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的第313位的氨基酸被精氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸或赖氨酸的取代，但不限于此。
这种多肽变体的特征在于，与SEQ ID NO：1的具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的多肽相比，具有增强的O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性。
如本文所用，术语“O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性”是指将高丝氨酸转化成O-琥珀酰高丝氨酸的活性。O-琥珀酰高丝氨酸转移酶统称为能够将琥珀酰辅酶A和L-高丝氨酸作为底物转化成辅酶A和O-琥珀酰高丝氨酸的酶。
[反应式]
琥珀酰辅酶A+L-高丝氨酸
Figure BDA0002385449060000031
辅酶A+O-琥珀酰高丝氨酸
在本公开中，O-琥珀酰高丝氨酸转移酶是指具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的酶，其通过将作为O-乙酰高丝氨酸转移酶的MetX蛋白的氨基酸序列的部分取代为另一种氨基酸而获得。MetX蛋白可以是来源于棒杆菌属的MetX，且更具体地，可以是来源于谷氨酸棒杆菌的具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的MetX，但不限于此。MetX蛋白可从作为已知数据库的NCBIGenBank获得。
在本公开中，本领域已知的各种方法可应用于获得O-琥珀酰高丝氨酸转移酶的方法。对于其方法的实例，通过使用基于可以高产率获得酶的密码子优化的基因合成技术或通过使用基于关于微生物的大量基因组信息的生物信息学方法筛选有用的酶资源的方法，O-琥珀酰高丝氨酸转移酶可从已广泛用于酶的表达的棒杆菌属的微生物中获得，但不限于此。
在本公开中，O-琥珀酰高丝氨酸转移酶变体可与“突变的O-琥珀酰高丝氨酸转移酶”或“变体O-琥珀酰高丝氨酸转移酶”互换使用。同时，变体可能是非自然发生的变体。
具体地，本公开的突变的O-琥珀酰高丝氨酸转移酶可以具有从来源于具有SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列的棒杆菌属(Corynebacterium sp.)的MetX的N端第313位的氨基酸残基被亮氨酸以外的氨基酸取代。具体地，第313位的亮氨酸氨基酸残基可以被精氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、或赖氨酸取代，但不限于此。本公开的突变的O-琥珀酰高丝氨酸转移酶可包括在从SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的N端第313位处包含变异的多肽，其中该变异包括选自精氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸和赖氨酸的氨基酸的取代，并且多肽可与SEQ ID NO：1具有至少85％的同源性或同一性，但不限于此。
进一步，本公开的具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的多肽可以是选自SEQ IDNO:59、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:81所示的氨基酸序列中的任意一种，具体地，其为具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的多肽的具体的氨基酸序列，其中SEQ IDNO：1的N端第313位的氨基酸分别被突变为精氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸或赖氨酸，但不限于此。只要该多肽包含上述变异并且与野生型相比具有增强的O-琥珀酰高丝氨酸转化活性，该多肽可以不受限制地包含与上述序列具有50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％或更高同源性或同一性的任何多肽。
进一步，本公开的MetX可以是由SEQ ID NO：1的氨基酸序列或具有与其80％或更多的同源性或同一性的氨基酸序列组成的MetX蛋白，但不限于此。具体地，本公开的MetX蛋白可以包括SEQ ID NO：1的蛋白和具有与SEQ ID NO：1至少80％或更多、85％或更多、具体地90％或更多、更具体地95％或更多、或更加具体地99％或更多同源性或同一性的蛋白质。
如本文所用，术语“多肽变体”指的是多肽，其一个或多个氨基酸在保守取代和/或修饰方面与所述序列不同，但它保留了多肽的功能或性质。变体多肽通过几个氨基酸的取代、缺失或添加而不同于鉴定的序列。通常可通过修饰上述多肽序列之一并评估修饰多肽的性质来鉴定这样的变体。换句话说，与天然蛋白质相比，变体的能力可以被增强、不变或减小。通常可通过修饰上述多肽序列之一并评估修饰多肽的反应性来鉴定这样的变体。进一步，一些变体可包括其中一个或多个部分(如N端前导序列或跨膜结构域)已被移除的变体。其它变体可包括其中一部分已从成熟蛋白质的N和/或C端移除的变体。术语“变体”还可以被用作修饰、修饰蛋白、修饰多肽、变体体、变体蛋白质(mutein)、趋异的(divergent)等，且只要它是在被突变的意义上被使用，任何术语不受限制。具体地，变体包括其中与野生型相比，谷氨酸棒杆菌来源的O-琥珀酰高丝氨酸转移酶的活性通过其氨基酸的变异而有效地提高的变体。
如本文所用，术语“保守取代”是指一氨基酸被具有类似结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代。例如，变体可具有一个或多个保守取代，同时保留一个或多个生物活性。这种氨基酸取代通常可基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、和/或两亲性性质的相似性而发生。例如，带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电的(酸性)氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸；芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；以及疏水氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。一般情况下，保守取代对产生的多肽的活性几乎没有或没有影响。
进一步，变体可包括其它修饰，包括对多肽的性质和二级结构影响最小的氨基酸的缺失或添加。例如，多肽可以与蛋白质N端处的信号(或前导)序列缀合，信号(或前导)序列共翻译时或翻译后指导蛋白质的转移。多肽也可以与另一序列或连接子缀合以鉴定、纯化或合成多肽。换句话说，尽管本文描述了“具有特定的SEQ ID NO的氨基酸序列的蛋白质或多肽”，但只要该蛋白质具有与由相应的SEQ ID NO的氨基酸序列组成的多肽的活性相同或相应的活性，则明显的是具有部分氨基酸序列被缺失、修饰、取代、保守取代、或添加的氨基酸序列的蛋白质也可用于本公开。例如，只要蛋白质具有与变体多肽的活性相同或相应的活性，则不排除在氨基酸序列前或后具有不改变蛋白质功能的序列的添加、其自然发生的变体或沉默变体、或保守取代。明显地是即使多肽具有这种序列的添加或突变，其落入本公开的范围内。
进一步，明显的是，由于密码子简并性，也可以包括可被翻译成包含选自SEQ IDNO:1、59、67、75和81的氨基酸序列的任何一种氨基酸序列的蛋白质或与其具有同源性或同一性的蛋白质的多核苷酸。或者，也可以不受限制地包括可由已知核苷酸序列(例如，与和多核苷酸序列全部或部分互补的序列在严格条件下杂交以编码具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的蛋白质的序列)生产的任何探针。术语“严格条件”是指允许多核苷酸之间特异性杂交的条件。这些条件被具体地描述于文献(例如J.Sambrook等人，同上)中。例如，严格条件可以包括例如具有高同源性或同一性(80％或更高、85％或更多、具体地90％或更高、更具体地95％或更高、更加具体地97％或更高、特别具体地99％或更高的同源性或同一性)的基因之间进行杂交，而在具有低于上述同源性或同一性的同源性或同一性的基因之间不进行杂交的条件，或在Southern杂交的常规洗涤条件(即，在对应于60℃、1×SSC和0.1％SDS，具体地60℃、0.1×SSC和0.1％SDS，和更具体地68℃、0.1×SSC和0.1％SDS盐浓度和温度下，洗涤一次、具体地两次或三次)。
虽然由于杂交的严格程度，而可能发生核苷酸之间的错配，但需要两个核苷酸具有互补序列。术语“互补”用于描述能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，关于DNA，腺苷与胸腺嘧啶互补，以及胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开不仅可包括实质上相似的核酸序列，而且可包括与整个序列互补的分离的核酸片段。
具体地，可以使用包括在55℃的Tm值下的杂交步骤的杂交条件和上述条件来检测具有同源性或同一性的多核苷酸。而且，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且可以由本领域技术人员根据目的适当地控制。
多核苷酸杂交的适当严格程度可取决于多核苷酸的长度和互补程度，并且变量在本领域是公知的(参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51，11.7-11.8)。
“同源性”或“同一性”是指两个给定氨基酸序列或核苷酸序列之间的相关程度，并且可以表示为百分比。
术语“同源性”和“同一性”经常可以互换使用。
保守的多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可以通过标准比对算法来确定，并且可以与由使用的程序建立的默认空位罚值(default gap penalty)一起使用。实质上，同源性或同一性序列可以在中等或高度严格的条件下杂交，使得序列的整个长度或整个长度的至少约50％、60％、70％、80％、或90％或更多可杂交。另外，可以考虑含有在杂交中代替密码子的简并密码子的多核苷酸。
任意两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性、或同一性，可利用已知的计算机算法(如“FASTA”程序)，例如利用如Pearson等人(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA85]:2444的默认参数来确定，或利用如EMBOSS包(EMBOSS：TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite，Rice等人,2000,Trends Genet.16:276-277)(5.0.0或更高版本)的Needleman程序中执行的Needleman–Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)(包括GCG程序包(Devereux,J.等人,Nucleic Acids Research 12:387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,[S.][F.][ET AL,J MOLEC BIOL 215]:403(1990)；Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,[ED.,]Academic Press,San Diego,1994,和[CARILLO ETA/.](1988)SIAM J AppliedMath 48:1073)来确定。例如，可利用美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)数据库的BLAST或ClustalW来确定同源性、相似性、或同一性。
例如，多核苷酸或多肽的同源性、相似性、或同一性可通过利用GAP计算机程序(如Smith and Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482中公开的Needleman等人,(1970),J MolBiol.48:443)比较序列信息来确定。简而言之，GAP程序将相似性定义为相似的比对符号(即，核苷酸或氨基酸)的数量除以两序列中较短者的符号总数。GAP程序的默认参数可包括：(1)一元比较矩阵(含有同一性值为1和非同一性值为0)和如Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas Of Protein Sequence And Structure,National Biomedical ResearchFoundation,pp.353-358(1979)中公开的Gribskov等人,(1986)Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵(或EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵)；(2)每个空位的罚值为3.0，且每个空位中为每个符号附加0.10罚值(或空位开放罚值(gap open penalty)为10和空位延伸罚值(gap extension penalty)为0.5)；和(3)末端空位无罚值。因此，如本文所用，术语“同源性”或“同一性”是指序列之间的相关性。
本公开的另一方面提供了编码具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的多肽的多核苷酸。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指具有预定的长度或更长的DNA或RNA链，其是通过核苷酸单体经由共价键连接形成核苷酸的长链聚合物。更具体地，多核苷酸是指编码变体多肽的多核苷酸片段。
在本公开中，编码O-琥珀酰高丝氨酸转移酶的氨基酸序列的基因可以是变体O-琥珀酰高丝氨酸转移酶的基因，具体地，来源于谷氨酸棒杆菌。基于遗传密码简并性，编码相同氨基酸序列的核苷酸序列及其变体也包括在本公开中，例如，由SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:68、SEQ ID NO:76或SEQ ID NO:82所示，但不限于此。
另外，至于变体多核苷酸，基于遗传密码简并性，编码相同氨基酸序列的核苷酸序列及其变体也包括在本公开中。
作为本公开的另一个方面，本公开提供包括编码变体多肽的多核苷酸的宿主细胞，或用包括编码变体多肽的多核苷酸的载体转化的微生物。具体地，可以通过转化进行引入，但不限于此。
具体地，由于与包括野生型O-琥珀酰高丝氨酸转移酶的多肽的微生物相比，包含变体O-琥珀酰高丝氨酸转移酶的多肽的微生物可具有在不抑制宿主细胞的生长的情况下增强的O-琥珀酰高丝氨酸产生能力，因此可以从这些微生物高产率地获得O-琥珀酰高丝氨酸。
如本文所用，术语“载体”是一种DNA构建体(construct)，该DNA构建体包含编码期望的蛋白(可操作地被连接至适当的调节序列)的多核苷酸的核苷酸序列以能够在适当的宿主细胞中表达期望的蛋白。调节序列可以包括能够起始转录的启动子、用于调节这种转录的任何操纵基因序列、编码适当的mRNA核糖体结合域的序列、和调节转录和翻译的终止的序列。在转化到适当的宿主细胞中后，载体可以独立于宿主基因组复制或起作用，和可以被整合到基因组本身中。
只要它可以在宿主中复制，本公开中使用的载体没有特别的限制，并且可以使用本领域中已知的任何载体。常用载体的实例可包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A等作为噬菌体载体或粘粒载体。作为质粒载体，可使用pBR型、pUC型、pBluescriptII型、pGEM型、pTZ型、pCL型、pET型等。具体地，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、和pCC1BAC载体，但不限于此。
本公开中可应用的载体没有特别的限制，且可以使用已知的表达载体。进一步，可以使用用于细胞内染色体插入的载体将编码期望的蛋白的多核苷酸插入到染色体中。多核苷酸的染色体插入可以通过本领域已知的任何方法(例如，同源重组)进行，但不限于此。可进一步包括用于确认染色体插入的选择标记。选择标记用于选择被载体转化的细胞，即确认所期望的多核苷酸的插入，且选择标记可包括提供可选择表型的标记(如耐药性、辅源营养(auxotrophy)、对细胞毒剂的耐性、或表面蛋白的表达)。由于只有表达选择标记的细胞能够在用选择剂处理的环境下存活或表现出不同的表型，因此转化的细胞可以被选择。
如本文所用，术语“转化”意指将包括编码期望的蛋白的多核苷酸的载体引入到宿主细胞中，以这种方式使由多核苷酸编码的蛋白在宿主细胞中表达。只要转化的多核苷酸可以在宿主细胞中表达，它就可能被整合到宿主细胞的染色体中并位于宿主细胞的染色体中、或存在于染色体外、或者包括这两种情况(or irrespective thereof)。进一步，多核苷酸包括编码目标蛋白的DNA和RNA。只要多核苷酸能够被引入到宿主细胞中并在其中表达，其可以以任何形式被引入。例如，可以以表达盒的形式将多核苷酸引入到宿主细胞中，表达盒是包括其自主表达所需的所有元件的基因构建体。一般地，表达盒包括可操作地连接到多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点、和翻译终止信号。表达盒可以是可自复制表达载体的形式。而且，多核苷酸可以原样被引入到宿主细胞中并可操作地被连接到在宿主细胞中表达所需的序列，但不限于此。进行转化的方法可包括将核酸引入到细胞中的任何方法，并且根据宿主细胞可以通过选择本领域已知的适当的标准技术进行转化。例如，方法可以包括电穿孔、磷酸钙(Ca(H2PO4)2、CaHPO4或Ca3(PO4)2)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀、显微注射、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法、和乙酸锂-DMSO法，但不限于此。
如本文所用，术语“可操作地连接”意指编码本公开的期望的蛋白的多核苷酸序列与起始和介导该多核苷酸的转录的启动子序列之间的功能性连接。可操作的连接可利用本领域已知的遗传重组技术制备，且位点特异性DNA切割和连接可使用本领域已知的切割酶和连接酶等制备，但不限于此。
如本文所用，“生产O-琥珀酰高丝氨酸的微生物”是指天然具有O-琥珀酰高丝氨酸生产能力的微生物、或通过向不具有O-琥珀酰高丝氨酸生产能力的亲株提供O-琥珀酰高丝氨酸生产能力来制备的微生物。
生产O-琥珀酰高丝氨酸的微生物可以是可包括编码变体多肽的多核苷酸的细胞或微生物、或者是通过用包含编码变体多肽的多核苷酸的载体转化而可表达变体多肽的细胞或微生物。就本公开的目的而言，只要它能够通过包含变体MetX多肽而产生O-琥珀酰高丝氨酸，宿主细胞或微生物可以是任何微生物。其具体实例可以包括属于埃希氏菌属(genus Escherichia)、沙雷氏菌属(genus Serratia)、欧文氏菌属(genus Erwinia)、肠杆菌属(genus Enterobacteria)、沙门氏菌属(genus Salmonella)、链霉菌属(genusStreptomyces)、假单胞菌属(genus Pseudomonas)、短杆菌属(genus Brevibacterium)、和棒杆菌属的微生物，具体地为棒杆菌属的微生物，和更具体地为谷氨酸棒杆菌，但不限于此。
如本文所用，术语“生产O-琥珀酰高丝氨酸的棒杆菌属的微生物”是指属于天然具有O-琥珀酰高丝氨酸生产能力或通过突变具有该能力的棒杆菌属的微生物。已经知道棒杆菌属的微生物的培养物包括O-琥珀酰高丝氨酸。然而，其O-琥珀酰高丝氨酸的生产能力非常低，并且参与其生产机制的基因或其机制尚未被揭示。因此，在本公开中，具有O-琥珀酰高丝氨酸生产能力的棒杆菌属的微生物是指天然形式的微生物本身，或者是指具有提高的O-琥珀酰高丝氨酸生产能力(通过O-琥珀酰高丝氨酸生产机制相关的外源基因的插入或通过内源基因的活性的增强或失活)的棒杆菌属的微生物。
在本公开中，“棒杆菌属的微生物”可具体是谷氨酸棒杆菌、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、热氨基棒杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)、有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)等，但不限于此。更具体地，在本公开中，棒杆菌属的微生物可以是即使暴露于高浓度的O-琥珀酰高丝氨酸下，其生长和存活也较少受到影响的谷氨酸棒杆菌。
在微生物中，选自胱硫醚合酶、O-乙酰高丝氨酸(硫醇)-裂解酶、和高丝氨酸激酶的至少一种蛋白质的活性可以被失活。也就是说，从中选择的一种蛋白质的活性、从中选择的两种蛋白质的活性、或所有三种蛋白质的活性可以被失活。
如本文所用，蛋白质活性的术语“失活”是指与其内在活性相比，包括活性的减弱、或没有活性。
蛋白质活性的失活可以通过应用本领域公知的各种方法实现。方法的实例可以包括：缺失染色体上编码蛋白质的基因的全部或部分的方法(包括当蛋白质的活性被消除的情况)；用突变的基因取代染色体上编码蛋白质的基因以降低酶活性的方法；将变异引入到染色体上编码蛋白质的基因的表达调节序列中的方法；用具有弱活性或无活性的序列置换编码蛋白质的基因的表达调节序列的方法(例如，用比内源性启动子弱的启动子置换基因的启动子的方法)；缺失染色体上编码蛋白质的基因的全部或部分的方法；引入经由与染色体上基因的转录物的互补结合而抑制从mRNA翻译成蛋白质的反义寡核苷酸(例如，反义RNA)的方法；通过在编码蛋白质的基因的SD序列前端上人工添加与SD序列互补的序列形成二级结构，使核糖体不可能附着的方法；在相应序列的开放阅读框(ORF)的3'末端上添加待逆转录的启动子的逆转录工程(RTE)方法；或它们的组合，但不特别限于此。
具体地，缺失编码蛋白质的基因的部分或全部的方法可以通过经由在微生物中用于染色体插入的载体，用具有部分缺失的核酸序列的多核苷酸或标记基因置换染色体内编码内源性期望的蛋白的多核苷酸来执行。对于其实例，可以使用通过同源重组缺失基因的方法，但不限于此。另外，尽管其可根据多核苷酸的种类而变化，且可由本领域技术人员适当地确定，“部分”可具体地为1个核苷酸至300个核苷酸，更具体地为1个核苷酸至100个核苷酸，且甚至更具体地为1个核苷酸至50个核苷酸，但并不特别限于此。
另外，修饰表达调节序列的方法可以通过经由缺失、插入、非保守或保守取代、或其组合诱导表达调节序列中的修饰来进行以进一步失活表达调节序列的活性，或通过用具有较弱活性的核酸序列置换该序列来进行。表达调节序列可包括启动子、操纵基因序列、编码核糖体结合域的序列、以及用于调节转录和翻译的序列，但不限于此。
此外，修饰染色体上的核苷酸序列的方法可以通过经由缺失、插入、保守或非保守取代、或其组合来诱导序列中的修饰以进一步失活蛋白质的活性，或者通过用改进为具有较弱活性的核苷酸序列或改进为没有活性的核苷酸序列置换该序列来进行，但不限于此。具体地，在微生物中，选自编码胱硫醚γ合酶的metB基因、编码作为O-琥珀酰高丝氨酸降解途径的O-乙酰高丝氨酸(硫醇)裂解酶的metY基因、和编码高丝氨酸激酶的thrB基因的至少一种基因可以进一步缺失或减弱。
如本文所用，术语“缺失”是指将期望的基因的从与起始密码子对应的核苷酸序列至终止密码子的核苷酸序列的部分或全部核苷酸序列区、或其调节区的核苷酸序列的部分或全部在染色体内移除的类型。
如本文所用，术语“减弱”是指在微生物菌株中由相应DNA编码的一种或多种酶的细胞内活性的移除或降低。例如，可以通过修饰基因的启动区和5′-UTR的核苷酸序列来减弱蛋白质的表达，或者可通过将突变引入到相应基因的ORF区中来减弱蛋白质的活性。
另外，棒杆菌属的微生物可以是与非变体微生物相比天冬氨酸激酶活性进一步增强的生产O-琥珀酰高丝氨酸的棒杆菌属的微生物。
如本文所用，术语“蛋白质活性的增强”是指蛋白质的活性的引入、或者与其内在活性相比蛋白质的活性的增加。活性的“引入”意思是微生物自然或人工不具有的特定多肽的活性的出现。
如本文所用，术语蛋白质活性相对于其内在活性的“增加”意思是与微生物的蛋白质的内在活性或修饰前的活性相比，活性被增强。术语“内在活性”是指当由于通过由自然或人工因素引起的遗传变异而使微生物的特性改变时，在改变其特性前，亲株或非修饰的微生物原本具有的特定蛋白质的活性。它也可以与修饰前活性互换使用。
具体地说，在本公开中，活性的增强可以通过以下被实现：
1)增加编码蛋白质的多核苷酸的拷贝数，
2)修饰表达调节序列以增加多核苷酸的表达，
3)修饰染色体上的多核苷酸序列以增强蛋白质活性，
4)引入显示蛋白质的活性的外源多核苷酸或其中多核苷酸是密码子优化的变体多核苷酸，或
5)为通过其组合增强而修饰，但所述方法不限于此。
1)多核苷酸拷贝数的增加可以(但不特别限制于)以其中多核苷酸可操作地连接到载体的形式、或通过将多核苷酸插入到宿主细胞染色体中的形式来进行。具体地，增加在宿主细胞染色体内多核苷酸的拷贝数可通过将载体引入到宿主细胞中来进行，该载体可与宿主无关地复制并起作用，并且编码本公开的蛋白质的多核苷酸被与其可操作地连接；或者通过将载体引入到宿主细胞中来进行，该载体可将多核苷酸插入到宿主细胞的染色体中，并且多核苷酸与其可操作地连接。
接下来，2)修饰表达调节序列以增加多核苷酸的表达，可以(但不特别限制于)通过核苷酸序列的缺失、插入、非保守或保守取代、或其组合来诱导序列的修饰来进行，以进一步增强表达调控序列的活性；或者通过用具有更强活性的核酸序列置换多核苷酸序列来进行。表达调节序列可包括(但不特别限制于)启动子、操作基因序列、编码核糖体结合位点的序列、以及用于调节转录和翻译的终止的序列。
代替原始启动子的强异源启动子可以被连接至多核苷酸表达单元的上游区域。强启动子的实例可以包括CJ7启动子(韩国专利号0620092和WO2006/065095)、lysCP1启动子(WO2009/096689)、EF-Tu启动子、groEL启动子、aceA或aceB启动子等，但不限于此。另外，3)染色体上的多核苷酸序列的修饰，可以(但不特别限制于)通过多核苷酸序列的缺失、插入、非保守或保守取代、或其组合来诱导表达调节序列上的修饰来进行，以进一步增强多核苷酸序列的活性；或者通过用改进以具有更强活性的多核苷酸序列置换多核苷酸序列来进行。
另外，4)外源多核苷酸序列的引入可以通过将编码显示与上述蛋白质的活性相同/相似活性的蛋白质的外源多核苷酸序列引入到宿主细胞中来进行，或通过将其密码子优化的变体多核苷酸引入到宿主细胞中来进行。只要其显示出与上述蛋白质的活性相同/相似活性，则可以在其来源或序列方面不受限制地使用任何外源多核苷酸序列。另外，外源多核苷酸可以在优化其密码子后被引入到宿主细胞中，使得在宿主细胞中可以发生优化的转录和翻译。引入可以通过由本领域技术人员适当选择已知转化方法来进行，且蛋白质可以通过引入的多核苷酸在宿主细胞中的表达生产，且结果，其活性可以被增加。
最后，5)通过1)至4)的组合来增强的修饰的方法可以通过应用以下方法的一种或几种来进行：增加编码蛋白质的多核苷酸的拷贝数、修饰表达调节序列以增加多核苷酸的表达、修饰染色体上的多核苷酸序列、以及修饰显示蛋白质的活性的外源多核苷酸或其中其密码子被密码子优化的变体多核苷酸。
在本公开中，基因或多核苷酸的序列可以从如美国国家生物技术信息中心(NCBI)的数据库获得。
本公开的另一个方面，本公开提供生产O-琥珀酰高丝氨酸的方法，方法包括以下步骤：培养上述微生物；及从培养的微生物或培养基中收集O-琥珀酰高丝氨酸。
本公开的另一个方面，本公开提供生产L-甲硫氨酸的方法，该方法包括以下步骤：培养上述微生物；及使培养的微生物或O-琥珀酰高丝氨酸与硫化物反应。
具体地，与硫化物反应的步骤意指使用任何已知方法从O-琥珀酰高丝氨酸生成L-甲硫氨酸。例如，L-甲硫氨酸可以通过使O-琥珀酰高丝氨酸与作为硫化物的甲硫醇反应而生产、或者甲硫氨酸可通过经由使O-琥珀酰高丝氨酸与作为硫化物的半胱氨酸反应产生胱硫醚之后的阶梯式反应(step-like reaction)而生产。另外，为提高反应速率和产率，可以添加催化剂或酶，或者可以在包含酶的微生物中进行反应。
“O-琥珀酰高丝氨酸”可以是含有由本公开的上述微生物生产的O-琥珀酰高丝氨酸的发酵液或其纯化形式。另外，“硫化物”可以是例如甲硫醇。甲硫醇是指能够提供硫原子的所有甲硫醇衍生物，如液相甲硫醇钠(CH3S-Na)形式、和气态或液态的甲硫醇(CH3SH)形式、以及在专利公开号WO2010/098629中公开的包括二甲基硫化物(DMS)的甲硫醇等。
生产L-甲硫氨酸的方法可由本领域技术人员在本领域已知的优化培养条件和酶活性条件下容易地确定。具体的培养方法和培养基与上面描述的相同。
进一步，生产L-甲硫氨酸的方法进一步可以包括从在培养步骤中培养的微生物或培养基中分离或收集O-琥珀酰高丝氨酸的步骤。
对本领域技术人员来说明显的是，本公开的“O-琥珀酰高丝氨酸”可以包括O-琥珀酰高丝氨酸本身和其盐形式的所有。
在上述方法中，培养微生物的步骤可以通过已知的分批培养法、连续培养法、或补料分批培养法来进行，但不特别限制于此。关于培养条件，可以使用碱性化合物(例如，氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)来调节合适的pH(即，pH5至pH9、具体地pH6至pH8、和最具体地pH6.8)，且可通过向培养物中添加氧或含氧气体混合物来维持好氧条件，但不特别限制于此。培养温度可维持在20℃至45℃，且具体地25℃至40℃，且可培养微生物约10小时至160小时，但不限于此。通过上述培养生产的O-琥珀酰高丝氨酸可以被分泌到培养基中或保持在细胞内。
另外，在待使用的培养基中，碳源，如糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油和脂肪(例如，大豆油、葵花油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如，棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如，甘油和乙醇)、和有机酸(例如，乙酸)可以被单独使用或以其混合物使用，但不限于此。氮源，如含氮有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽汁、玉米浆、大豆粉和尿素)、和无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)可以单独使用或以其混合物使用，但不限于此。钾源，如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、和与其对应的含钠盐可以被单独使用或以其混合物使用，但不限于此。另外，其它必需的促生长物质，包括金属盐(例如，硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸、和维生素可以被包括在培养基中。
收集本公开的培养步骤中产生的O-琥珀酰高丝氨酸或L-甲硫氨酸的方法可以根据培养方法使用本领域已知的适当方法从培养液收集期望的氨基酸。例如，可以使用离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶和HPLC等，并且可以使用本领域已知的适当的方法从培养基或微生物收集所期望的O-琥珀酰高丝氨酸或L-甲硫氨酸。
公开的方式
在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本公开。然而，这些实施例仅用于说明的目的，且不意图通过这些实施例限制本公开的范围。
实施例1：具有O-乙酰高丝氨酸转移酶活性的metX质粒的构建
为了扩增编码O-乙酰高丝氨酸转移酶(MetX)的基因，基于来源于WT(野生型)的报道序列，将BamHI限制酶位点插入到引物(SEQ ID NO:5和6)的两端以从启动区(自起始密码子上游约300bp)扩增到终止区(自终止密码子下游约100bp)。
[表1]
SEQ ID NO: 引物 序列(5’-3’)
5 引物1 GGATCCCCTCGTTGTTCACCCAGCAACC
6 引物2 GGATCCCAAAGTCACAACTACTTATGTTAG
在95℃下变性5分钟后，在以下条件下进行PCR共30次循环：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合90秒。其后，在72℃下进行聚合反应7分钟。结果，获得了metX基因的编码区的1546bp的DNA片段。将pECCG117(韩国专利号10-0057684)载体和metX DNA片段用限制酶BamHI处理，且使用DNA连接酶彼此连接，并克隆从而获得命名为pECCG117-metX WT的质粒。
实施例2：具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的变体metX质粒的构建
选择了新型metX变体位点，并且将SEQ ID NO:1的氨基酸序列中第313位的氨基酸用亮氨酸以外的氨基酸取代。
更具体地，为了制备变体载体(其中O-乙酰高丝氨酸转移酶的第313位的氨基酸被另一种氨基酸取代)，使用实施例1中构建的pECCG117-metX WT质粒作为模板，设计了引物对(SEQ ID NO:7和8)。
[表2]
SEQ ID NO: 引物 序列(5’-3’)
7 引物3 GTAGATACCGATATTCGGTACCCCTACCACCAG
8 引物4 CTGGTGGTAGGGGTACCGAATATCGGTATCTAC
使用引物和位点定向诱变试剂盒(stratagene，美国)以制备突变的metX基因。基于野生型质粒WT，L313R变体质粒命名为WT_L313R。
实施例3：具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的变体metX的底物特异性和活性的 比较实验
为了比较生产大量的O-琥珀酰高丝氨酸的变体metX的活性，制备了菌株，其中积累了高丝氨酸且缺失了生产的O-琥珀酰高丝氨酸的可用性。制备了其中缺失metB基因和metY基因的菌株，metB基因编码涉及O-琥珀酰高丝氨酸降解途径的胱硫醚γ合酶，metY基因编码涉及O-琥珀酰高丝氨酸降解途径的O-乙酰高丝氨酸(硫醇)-裂解酶。首先，为了缺失metB基因，基于WT来源的metB基因的核苷酸序列，设计了用于扩增metB基因的5'上游区域的引物对(SEQ ID NO:9和10)和用于扩增metB基因的3'下游区域的引物对(SEQ ID NO:11和12)。将XbaI限制酶位点(下划线)插入到SEQ ID NO:9和12的引物的每个末端中。
[表3]
Figure BDA0002385449060000131
使用WT染色体作为模板并使用SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10以及SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的引物进行PCR。在95℃下变性5分钟后，在以下条件下进行PCR共30次循环：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合90秒。其后，在72℃下进行聚合反应7分钟。结果，获得了metB基因的5'上游区域的450bp的DNA片段和metB基因的3'下游区域的467bp的DNA片段。
使用扩增的两种DNA片段作为模板并使用SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:12的引物进行PCR。在95℃下变性5分钟后，在以下条件下进行PCR共30次循环：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合3分钟。其后，在72℃下进行聚合反应7分钟。结果，扩增了仅包括上游和下游片段的917bp的DNA片段(通过metB基因的中部的缺失)。
将pDZ载体和917bp的DNA片段用限制酶XbaI处理，然后使用DNA连接酶彼此连接，并克隆，从而获得命名为pDZ-ΔmetB的质粒。
通过电脉冲法将pDZ-ΔmetB载体引入到WT菌株中，然后在含有25mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择转化菌株。获得了WTΔmetB菌株，其中通过二次重组过程(secondaryrecombination process)(交换(cross-over))插入到染色体中的DNA片段而缺失metB基因。
为了缺失O-琥珀酰高丝氨酸的另一降解途径的metY基因，基于WT来源的metY基因的核苷酸序列，设计了用于扩增metY基因的5'上游区域的引物对(SEQ ID NO:13和14)和用于扩增metY基因的3'下游区域的引物对(SEQ ID NO:15和16)。将XbaI限制酶位点(下划线)插入到SEQ ID NO:13和16的引物的每个末端中。
[表4]
Figure BDA0002385449060000141
使用WT染色体作为模板并使用SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14以及SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的引物进行PCR。在95℃下变性5分钟后，在以下条件下进行PCR共30次循环：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合90秒。其后，在72℃下进行聚合反应7分钟。结果，获得了metY基因的5'上游区的512bp的DNA片段和metY基因的3'下游区的520bp的DNA片段。
使用扩增的两种DNA片段作为模板且使用SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:16的引物进行PCR。在95℃下变性5分钟后，在以下条件下进行PCR共30次循环：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合3分钟。其后，在72℃下进行聚合反应7分钟。结果，扩增了仅包括上游和下游末端的1032bp的DNA片段(通过metY基因的中部的缺失)。
将pDZ载体和1032bp的DNA片段用限制酶XbaI处理，然后使用DNA连接酶彼此连接，并克隆，从而获得命名为pDZ-ΔmetY的质粒。
通过电脉冲法将pDZ-ΔmetY载体引入到制备的WTΔmetB菌株中，然后在含有25mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择转化菌株。获得了WTΔmetBΔmetY菌株，其中通过通过二次重组过程(交换)而插入到染色体中的DNA片段而缺失metY基因。
为了最大化O-琥珀酰高丝氨酸的生产，设计了用于扩增变异位点周围5'上游区域的引物对(SEQ ID NO:21和22)和用于扩增变异位点周围3'下游区域的引物对(SEQ ID NO:21和22)以构建对于编码WT来源的天冬氨酸激酶(SEQ ID NO:17)的lysC基因(SEQ ID NO:18)的变体引入载体。SEQ ID NO:19和22的引物在每个的末端插入XbaI限制酶位点(下划线)，并且允许SEQ ID NO:20和21的引物使核苷酸取代变异(下划线)位于被设计成彼此交换的区域处。
[表5]
SEQ ID NO: 引物 序列(5’-3’)
19 引物13 TCC<u>TCTAGA</u>GCTGCGCAGTGTTGAATACG
20 引物14 CACCGACATCA<u>T</u>CTTCACCTGCC
21 引物15 GGCAGGTGAAG<u>A</u>TGATGTCGGTG
22 引物16 GAC<u>TCTAGA</u>GTTCACCTCAGAGACGATTA
使用WT染色体作为模板并使用SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20以及SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的引物进行PCR。在95℃下变性5分钟后，在以下条件下进行PCR共30次循环：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合30秒。其后，在72℃下进行聚合反应7分钟。结果，获得了lysC基因变异周围的5'上游区域的509bp的DNA片段和lysC基因变异周围的3'下游区域的520bp的DNA片段。
使用扩增的两种DNA片段作为模板并使用SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:22的引物进行PCR。在95℃下变性5分钟后，在以下条件下进行PCR共30次循环：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合60秒。其后，在72℃下进行聚合反应7分钟。结果，扩增了1011bp的DNA片段，该DNA片段包括编码其中第311位苏氨酸被异亮氨酸取代的天冬氨酸激酶变体(SEQ ID NO:23)的lysC基因变异(SEQ ID NO:24)。
将不能在谷氨酸棒杆菌中复制的pDZ载体(韩国专利号0924065)和1011bp的DNA片段用限制酶XbaI处理，使用DNA连接酶彼此连接，并克隆，从而获得命名为pDZ-lysC(T311I)的质粒。
通过电脉冲法(Appl.Microbiol.Biothcenol.(1999)52:541-545)将pDZ-lysC(T311I)载体引入到WTΔmetBΔmetY中，然后在含有25mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择转化菌株。获得了WTΔmetBΔmetY,lysC(T311I)菌株，其中通过二次交换重组过程(cross-over)插入到染色体中的DNA片段而将核苷酸变异引入到lysC基因中，且菌株命名为谷氨酸棒杆菌WTΔmetBΔmetY,lysC(T311I)。
通过电脉冲法，将实施例1和2中制备的pECCG117-metX WT和pECCG117-metX WT_L313R载体引入到上述制备的WTΔmetBΔmetY中，然后在含有25mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择各转化菌株。
为了比较制备的菌株的O-乙酰高丝氨酸(O-AH)和O-琥珀酰高丝氨酸(O-SH)的生产能力，通过以下方法培养它们，并分析培养基中O-乙酰高丝氨酸和O-琥珀酰高丝氨酸的浓度。
将1个铂环(platinum loop)的每种菌株接种到含有25ml下列培养基的250ml角挡板烧瓶(corner-baffled flask)中，然后在37℃下以200rpm振荡培养20小时。通过HPLC分析O-乙酰高丝氨酸和O-琥珀酰高丝氨酸的浓度，且分析的浓度如表6中所示。
<培养基组成(pH7.0)>
100g葡萄糖、40g(NH4)2SO4、2.5g大豆蛋白、5g玉米浆固体(corn steep solids)、3g尿素、1g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、100μg生物素、1000μg硫胺素HCl、2000μg泛酸钙、3000μg烟酰胺、30g CaCO3和0.3g L-甲硫氨酸(每1升蒸馏水)。
[表6]
Figure BDA0002385449060000161
参考表6，确认了引入有对照metX WT质粒的菌株产生O-乙酰基高丝氨酸，而引入有metX变体质粒的菌株产生O-琥珀酰高丝氨酸。也就是说，引入变体的菌株中改变了转移酶的底物特异性，结果产生了O-琥珀酰高丝氨酸。
进一步，制备的WTΔmetBΔmetY,lysC(T311I)/pECCG117-metX WT_L313R菌株被指定为CA05-5132，并且然后根据布达佩斯条约于2017年5月11日保藏到韩国微生物保藏中心(国际保藏机构)，保藏号为KCCM12023P。
实施例4：通过饱和诱变的MetX变体的制备和O-乙酰高丝氨酸生产能力的评价
为了制备其中显示高O-琥珀酰高丝氨酸生产能力的在MetX变异位点被另一种氨基酸取代的变体，利用饱和诱变(saturated mutagenesis)。制备了其中metX的第313位的氨基酸被另一种氨基酸取代的18种变体，且使用实施例1中制备的质粒作为模板。每种变体、取代的氨基酸和每个变体中所用的引物的序列号示于下表7中。
[表7]
Figure BDA0002385449060000171
具体地，使用表2中建议的引物和位点定向诱变试剂盒(Stratagene，美国)以制备变体metX基因。制备的变体质粒中的每个被引入到WTΔmetBΔmetY,lysC(T311I)菌株中，且以与实施例4相同的方式进行烧瓶评估(flask evaluation)。结果示于下表8中。
[表8]
Figure BDA0002385449060000172
Figure BDA0002385449060000181
Figure BDA0002385449060000191
参考表3，确认了大多数变体不能产生O-琥珀酰高丝氨酸，然而具有metX的第313位的氨基酸变异的变体(L313R)、(L313C)、(L313I)或(L313K)分别以比野生型高的水平产生O-琥珀酰高丝氨酸。换句话说，当SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第313位的氨基酸被精氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、或赖氨酸取代时，可提供对琥珀酰辅酶A的底物特异性，且结果可以产生O-琥珀酰高丝氨酸。
总之，结果显示本公开的变体可增加O-琥珀酰高丝氨酸的生产。
基于上述描述，本领域技术人员将理解，在不改变其技术精神和必要特征的情况下，可以以不同的具体形式实施本公开。因此，应该理解上述实施方式在所有方面不是限制性的，而是说明性的。本公开的范围由所附权利要求限制，而不是由它们前面的说明限制，且因此所有改变和修改落入权利要求的边界和范围内，或这种边界和范围的等同物因此意在被权利要求涵盖。
Figure BDA0002385449060000201
<110> CJ第一制糖株式会社
<120> 新型O-琥珀酰高丝氨酸转移酶变体及使用其生产O-琥珀酰高丝氨酸的方法
<130> OPA18185
<150> KR 10-2017-0083438
<151> 2017-06-30
<160> 94
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 377
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒杆菌
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(377)
<223> metX
<400> 1
Met Pro Thr Leu Ala Pro Ser Gly Gln Leu Glu Ile Gln Ala Ile Gly
1 5 10 15
Asp Val Ser Thr Glu Ala Gly Ala Ile Ile Thr Asn Ala Glu Ile Ala
20 25 30
Tyr His Arg Trp Gly Glu Tyr Arg Val Asp Lys Glu Gly Arg Ser Asn
35 40 45
Val Val Leu Ile Glu His Ala Leu Thr Gly Asp Ser Asn Ala Ala Asp
50 55 60
Trp Trp Ala Asp Leu Leu Gly Pro Gly Lys Ala Ile Asn Thr Asp Ile
65 70 75 80
Tyr Cys Val Ile Cys Thr Asn Val Ile Gly Gly Cys Asn Gly Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Gly Ser Met His Pro Asp Gly Asn Phe Trp Gly Asn Arg Phe
100 105 110
Pro Ala Thr Ser Ile Arg Asp Gln Val Asn Ala Glu Lys Gln Phe Leu
115 120 125
Asp Ala Leu Gly Ile Thr Thr Val Ala Ala Val Leu Gly Gly Ser Met
130 135 140
Gly Gly Ala Arg Thr Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Pro Glu Thr Val
145 150 155 160
Gly Ala Ala Ala Val Leu Ala Val Ser Ala Arg Ala Ser Ala Trp Gln
165 170 175
Ile Gly Ile Gln Ser Ala Gln Ile Lys Ala Ile Glu Asn Asp His His
180 185 190
Trp His Glu Gly Asn Tyr Tyr Glu Ser Gly Cys Asn Pro Ala Thr Gly
195 200 205
Leu Gly Ala Ala Arg Arg Ile Ala His Leu Thr Tyr Arg Gly Glu Leu
210 215 220
Glu Ile Asp Glu Arg Phe Gly Thr Lys Ala Gln Lys Asn Glu Asn Pro
225 230 235 240
Leu Gly Pro Tyr Arg Lys Pro Asp Gln Arg Phe Ala Val Glu Ser Tyr
245 250 255
Leu Asp Tyr Gln Ala Asp Lys Leu Val Gln Arg Phe Asp Ala Gly Ser
260 265 270
Tyr Val Leu Leu Thr Asp Ala Leu Asn Arg His Asp Ile Gly Arg Asp
275 280 285
Arg Gly Gly Leu Asn Lys Ala Leu Glu Ser Ile Lys Val Pro Val Leu
290 295 300
Val Ala Gly Val Asp Thr Asp Ile Leu Tyr Pro Tyr His Gln Gln Glu
305 310 315 320
His Leu Ser Arg Asn Leu Gly Asn Leu Leu Ala Met Ala Lys Ile Val
325 330 335
Ser Pro Val Gly His Asp Ala Phe Leu Thr Glu Ser Arg Gln Met Asp
340 345 350
Arg Ile Val Arg Asn Phe Phe Ser Leu Ile Ser Pro Asp Glu Asp Asn
355 360 365
Pro Ser Thr Tyr Ile Glu Phe Tyr Ile
370 375
<210> 2
<211> 1134
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(1134)
<223> metX
<400> 2
atgcccaccc tcgcgccttc aggtcaactt gaaatccaag cgatcggtga tgtctccacc 60
gaagccggag caatcattac aaacgctgaa atcgcctatc accgctgggg tgaataccgc 120
gtagataaag aaggacgcag caatgtcgtt ctcatcgaac acgccctcac tggagattcc 180
aacgcagccg attggtgggc tgacttgctc ggtcccggca aagccatcaa cactgatatt 240
tactgcgtga tctgtaccaa cgtcatcggt ggttgcaacg gttccaccgg acctggctcc 300
atgcatccag atggaaattt ctggggtaat cgcttccccg ccacgtccat tcgtgatcag 360
gtaaacgccg aaaaacaatt cctcgacgca ctcggcatca ccacggtcgc cgcagtactt 420
ggtggttcca tgggtggtgc ccgcacccta gagtgggccg caatgtaccc agaaactgtt 480
ggcgcagctg ctgttcttgc agtttctgca cgcgccagcg cctggcaaat cggcattcaa 540
tccgcccaaa ttaaggcgat tgaaaacgac caccactggc acgaaggcaa ctactacgaa 600
tccggctgca acccagccac cggactcggc gccgcccgac gcatcgccca cctcacctac 660
cgtggcgaac tagaaatcga cgaacgcttc ggcaccaaag cccaaaagaa cgaaaaccca 720
ctcggtccct accgcaagcc cgaccagcgc ttcgccgtgg aatcctactt ggactaccaa 780
gcagacaagc tagtacagcg tttcgacgcc ggctcctacg tcttgctcac cgacgccctc 840
aaccgccacg acattggtcg cgaccgcgga ggcctcaaca aggcactcga atccatcaaa 900
gttccagtcc ttgtcgcagg cgtagatacc gatattttgt acccctacca ccagcaagaa 960
cacctctcca gaaacctggg aaatctactg gcaatggcaa aaatcgtatc ccctgtcggc 1020
cacgatgctt tcctcaccga aagccgccaa atggatcgca tcgtgaggaa cttcttcagc 1080
ctcatctccc cagacgaaga caacccttcg acctacatcg agttctacat ctaa 1134
<210> 3
<211> 379
<212> PRT
<213> 铜绿假单胞菌
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(379)
<223> metX1
<400> 3
Met Pro Thr Val Phe Pro Asp Asp Ser Val Gly Leu Val Ser Pro Gln
1 5 10 15
Thr Leu His Phe Asn Glu Pro Leu Glu Leu Thr Ser Gly Lys Ser Leu
20 25 30
Ala Glu Tyr Asp Leu Val Ile Glu Thr Tyr Gly Glu Leu Asn Ala Thr
35 40 45
Gln Ser Asn Ala Val Leu Ile Cys His Ala Leu Ser Gly His His His
50 55 60
Ala Ala Gly Tyr His Ser Val Asp Glu Arg Lys Pro Gly Trp Trp Asp
65 70 75 80
Ser Cys Ile Gly Pro Gly Lys Pro Ile Asp Thr Arg Lys Phe Phe Val
85 90 95
Val Ala Leu Asn Asn Leu Gly Gly Cys Asn Gly Ser Ser Gly Pro Ala
100 105 110
Ser Ile Asn Pro Ala Thr Gly Lys Val Tyr Gly Ala Asp Phe Pro Met
115 120 125
Val Thr Val Glu Asp Trp Val His Ser Gln Ala Arg Leu Ala Asp Arg
130 135 140
Leu Gly Ile Arg Gln Trp Ala Ala Val Val Gly Gly Ser Leu Gly Gly
145 150 155 160
Met Gln Ala Leu Gln Trp Thr Ile Ser Tyr Pro Glu Arg Val Arg His
165 170 175
Cys Leu Cys Ile Ala Ser Ala Pro Lys Leu Ser Ala Gln Asn Ile Ala
180 185 190
Phe Asn Glu Val Ala Arg Gln Ala Ile Leu Ser Asp Pro Glu Phe Leu
195 200 205
Gly Gly Tyr Phe Gln Glu Gln Gly Val Ile Pro Lys Arg Gly Leu Lys
210 215 220
Leu Ala Arg Met Val Gly His Ile Thr Tyr Leu Ser Asp Asp Ala Met
225 230 235 240
Gly Ala Lys Phe Gly Arg Val Leu Lys Thr Glu Lys Leu Asn Tyr Asp
245 250 255
Leu His Ser Val Glu Phe Gln Val Glu Ser Tyr Leu Arg Tyr Gln Gly
260 265 270
Glu Glu Phe Ser Thr Arg Phe Asp Ala Asn Thr Tyr Leu Leu Met Thr
275 280 285
Lys Ala Leu Asp Tyr Phe Asp Pro Ala Ala Ala His Gly Asp Asp Leu
290 295 300
Val Arg Thr Leu Glu Gly Val Glu Ala Asp Phe Cys Leu Met Ser Phe
305 310 315 320
Thr Thr Asp Trp Arg Phe Ser Pro Ala Arg Ser Arg Glu Ile Val Asp
325 330 335
Ala Leu Ile Ala Ala Lys Lys Asn Val Ser Tyr Leu Glu Ile Asp Ala
340 345 350
Pro Gln Gly His Asp Ala Phe Leu Met Pro Ile Pro Arg Tyr Leu Gln
355 360 365
Ala Phe Ser Gly Tyr Met Asn Arg Ile Ser Val
370 375
<210> 4
<211> 1140
<212> DNA
<213> 铜绿假单胞菌
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(1140)
<223> metX1
<400> 4
atgcccacag tcttccccga cgactccgtc ggtctggtct ccccccagac gctgcacttc 60
aacgaaccgc tcgagctgac cagcggcaag tccctggccg agtacgacct ggtgatcgaa 120
acctacggcg agctgaatgc cacgcagagc aacgcggtgc tgatctgcca cgccctctcc 180
ggccaccacc acgccgccgg ctaccacagc gtcgacgagc gcaagccggg ctggtgggac 240
agctgcatcg gtccgggcaa gccgatcgac acccgcaagt tcttcgtcgt cgccctcaac 300
aacctcggcg gttgcaacgg atccagcggc cccgccagca tcaatccggc gaccggcaag 360
gtctacggcg cggacttccc gatggttacg gtggaagact gggtgcatag ccaggcgcgc 420
ctggcagacc gcctcggcat ccgccagtgg gccgcggtgg tcggcggcag cctcggcggc 480
atgcaggcgc tgcaatggac catcagctat cccgagcgcg tccgtcactg cctgtgcatc 540
gccagcgcgc cgaagctgtc ggcgcagaac atcgccttca acgaagtcgc ccggcaggcg 600
attctttccg accctgagtt cctcggcggc tacttccagg agcagggcgt gattcccaag 660
cgcggcctca agctggcgcg gatggtcggc catatcacct acctgtccga cgacgccatg 720
ggcgccaagt tcggccgtgt actgaagacc gagaagctca actacgacct gcacagcgtc 780
gagttccagg tcgagagtta cctgcgctac cagggcgagg agttctccac ccgcttcgac 840
gccaatacct acctgctgat gaccaaggcg ctggactact tcgaccccgc cgccgcccac 900
ggcgacgacc tggtgcgcac cctggagggc gtcgaggcgg acttctgcct gatgtccttc 960
accaccgact ggcgtttctc gccggcccgc tcgcgggaaa tcgtcgacgc cctgatcgcg 1020
gcgaaaaaga acgtcagcta cctggagatc gacgccccgc aaggccacga cgccttcctc 1080
atgccgatcc cccggtacct gcaagccttc agcggttaca tgaaccgcat cagcgtgtga 1140
1140
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 1
<400> 5
ggatcccctc gttgttcacc cagcaacc 28
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 2
<400> 6
ggatcccaaa gtcacaacta cttatgttag 30
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 5
<400> 7
gtagataccg atattcggta cccctaccac cag 33
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 6
<400> 8
ctggtggtag gggtaccgaa tatcggtatc tac 33
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 7
<400> 9
tctagatgcg ctgattatct cacc 24
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 8
<400> 10
actggtgggt catggttgca tatgagatca actcctgtaa 40
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 9
<400> 11
ttacaggagt tgatctcata tgcaaccatg acccaccagt 40
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 10
<400> 12
tctagacctt gaagttcttg actg 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 11
<400> 13
tctagaagta gcgttgctgt acac 24
<210> 14
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 12
<400> 14
atcaatggtc tcgatgccca tatggcattt ggaggtcctt aag 43
<210> 15
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 13
<400> 15
cttaaggacc tccaaatgcc atatgggcat cgagaccatt gat 43
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 14
<400> 16
tctagatgga accgttgcaa ccac 24
<210> 17
<211> 421
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒杆菌
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(421)
<223> lysC
<400> 17
Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1 5 10 15
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
20 25 30
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
35 40 45
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
50 55 60
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65 70 75 80
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
85 90 95
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
100 105 110
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
115 120 125
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
130 135 140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145 150 155 160
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
165 170 175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
180 185 190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
195 200 205
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
210 215 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225 230 235 240
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
245 250 255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
260 265 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
275 280 285
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
290 295 300
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg
305 310 315 320
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
325 330 335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
340 345 350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
355 360 365
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
370 375 380
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385 390 395 400
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
405 410 415
Ala Gly Thr Gly Arg
420
<210> 18
<211> 1266
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(1266)
<223> lysC
<400> 18
atggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60
aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120
tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180
ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240
gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300
ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360
gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420
aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480
ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540
accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600
atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660
cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720
attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780
gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840
aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900
tcttctgtag aagacggcac caccgacatc accttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960
cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020
gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080
accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc 1140
tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200
ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260
cgctaa 1266
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 15
<400> 19
tcctctagag ctgcgcagtg ttgaatacg 29
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 16
<400> 20
caccgacatc atcttcacct gcc 23
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 17
<400> 21
ggcaggtgaa gatgatgtcg gtg 23
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 18
<400> 22
gactctagag ttcacctcag agacgatta 29
<210> 23
<211> 421
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒杆菌
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(421)
<223> lysC变体 (T311I)
<400> 23
Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1 5 10 15
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
20 25 30
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
35 40 45
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
50 55 60
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65 70 75 80
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
85 90 95
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
100 105 110
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
115 120 125
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
130 135 140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145 150 155 160
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
165 170 175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
180 185 190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
195 200 205
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
210 215 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225 230 235 240
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
245 250 255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
260 265 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
275 280 285
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
290 295 300
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Ile Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg
305 310 315 320
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
325 330 335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
340 345 350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
355 360 365
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
370 375 380
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385 390 395 400
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
405 410 415
Ala Gly Thr Gly Arg
420
<210> 24
<211> 1266
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(1266)
<223> lysC变体 (T311I)
<400> 24
atggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60
aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120
tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180
ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240
gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300
ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360
gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420
aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480
ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540
accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600
atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660
cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720
attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780
gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840
aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900
tcttctgtag aagacggcac caccgacatc atcttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960
cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020
gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080
accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc 1140
tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200
ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260
cgctaa 1266
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313F的正向引物
<400> 25
gtagataccg atatttttta cccctaccac cag 33
<210> 26
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313F的反向引物
<400> 26
ctggtggtag gggtaaaaaa tatcggtatc tac 33
<210> 27
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313S的正向引物
<400> 27
gtagataccg atatttctta cccctaccac cag 33
<210> 28
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313S的反向引物
<400> 28
gtagataccg atatttctta cccctaccac cag 33
<210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313Y的正向引物
<400> 29
gtagataccg atatttatta cccctaccac cag 33
<210> 30
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313Y的反向引物
<400> 30
ctggtggtag gggtaataaa tatcggtatc tac 33
<210> 31
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313C的正向引物
<400> 31
gtagataccg atatttgtta cccctaccac cag 33
<210> 32
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313C的反向引物
<400> 32
ctggtggtag gggtaacaaa tatcggtatc tac 33
<210> 33
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313P的正向引物
<400> 33
gtagataccg atattcctta cccctaccac cag 33
<210> 34
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313P的反向引物
<400> 34
ctggtggtag gggtaaggaa tatcggtatc tac 33
<210> 35
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313H的正向引物
<400> 35
gtagataccg atattcatta cccctaccac cag 33
<210> 36
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313H的反向引物
<400> 36
ctggtggtag gggtaatgaa tatcggtatc tac 33
<210> 37
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313Q的正向引物
<400> 37
gtagataccg atattcaata cccctaccac cag 33
<210> 38
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313Q的反向引物
<400> 38
ctggtggtag gggtattgaa tatcggtatc tac 33
<210> 39
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313I的正向引物
<400> 39
gtagataccg atattatcta cccctaccac cag 33
<210> 40
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313I的反向引物
<400> 40
ctggtggtag gggtagataa tatcggtatc tac 33
<210> 41
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313T的正向引物
<400> 41
gtagataccg atattaccta cccctaccac cag 33
<210> 42
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313T的反向引物
<400> 42
ctggtggtag gggtaggtaa tatcggtatc tac 33
<210> 43
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313N的正向引物
<400> 43
gtagataccg atattaacta cccctaccac cag 33
<210> 44
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313N的反向引物
<400> 44
ctggtggtag gggtagttaa tatcggtatc tac 33
<210> 45
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313K的正向引物
<400> 45
gtagataccg atattaaata cccctaccac cag 33
<210> 46
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313K的反向引物
<400> 46
ctggtggtag gggtatttaa tatcggtatc tac 33
<210> 47
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313V的正向引物
<400> 47
gtagataccg atattgttta cccctaccac cag 33
<210> 48
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313V的反向引物
<400> 48
ctggtggtag gggtaaacaa tatcggtatc tac 33
<210> 49
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313A的正向引物
<400> 49
gtagataccg atattgcata cccctaccac cag 33
<210> 50
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313A的反向引物
<400> 50
ctggtggtag gggtatgcaa tatcggtatc tac 33
<210> 51
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313D的正向引物
<400> 51
gtagataccg atattgacta cccctaccac cag 33
<210> 52
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313D的反向引物
<400> 52
ctggtggtag gggtagtcaa tatcggtatc tac 33
<210> 53
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313E的正向引物
<400> 53
gtagataccg atattgaata cccctaccac cag 33
<210> 54
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313E的反向引物
<400> 54
ctggtggtag gggtattcaa tatcggtatc tac 33
<210> 55
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313G的正向引物
<400> 55
gtagataccg atattggata cccctaccac cag 33
<210> 56
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313G的反向引物
<400> 56
ctggtggtag gggtatccaa tatcggtatc tac 33
<210> 57
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313W的正向引物
<400> 57
gtagataccg atatttggta cccctaccac cag 33
<210> 58
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于L313W的反向引物
<400> 58
ctggtggtag gggtaccaaa tatcggtatc tac 33
<210> 59
<211> 377
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> metX L313R
<400> 59
Met Pro Thr Leu Ala Pro Ser Gly Gln Leu Glu Ile Gln Ala Ile Gly
1 5 10 15
Asp Val Ser Thr Glu Ala Gly Ala Ile Ile Thr Asn Ala Glu Ile Ala
20 25 30
Tyr His Arg Trp Gly Glu Tyr Arg Val Asp Lys Glu Gly Arg Ser Asn
35 40 45
Val Val Leu Ile Glu His Ala Leu Thr Gly Asp Ser Asn Ala Ala Asp
50 55 60
Trp Trp Ala Asp Leu Leu Gly Pro Gly Lys Ala Ile Asn Thr Asp Ile
65 70 75 80
Tyr Cys Val Ile Cys Thr Asn Val Ile Gly Gly Cys Asn Gly Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Gly Ser Met His Pro Asp Gly Asn Phe Trp Gly Asn Arg Phe
100 105 110
Pro Ala Thr Ser Ile Arg Asp Gln Val Asn Ala Glu Lys Gln Phe Leu
115 120 125
Asp Ala Leu Gly Ile Thr Thr Val Ala Ala Val Leu Gly Gly Ser Met
130 135 140
Gly Gly Ala Arg Thr Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Pro Glu Thr Val
145 150 155 160
Gly Ala Ala Ala Val Leu Ala Val Ser Ala Arg Ala Ser Ala Trp Gln
165 170 175
Ile Gly Ile Gln Ser Ala Gln Ile Lys Ala Ile Glu Asn Asp His His
180 185 190
Trp His Glu Gly Asn Tyr Tyr Glu Ser Gly Cys Asn Pro Ala Thr Gly
195 200 205
Leu Gly Ala Ala Arg Arg Ile Ala His Leu Thr Tyr Arg Gly Glu Leu
210 215 220
Glu Ile Asp Glu Arg Phe Gly Thr Lys Ala Gln Lys Asn Glu Asn Pro
225 230 235 240
Leu Gly Pro Tyr Arg Lys Pro Asp Gln Arg Phe Ala Val Glu Ser Tyr
245 250 255
Leu Asp Tyr Gln Ala Asp Lys Leu Val Gln Arg Phe Asp Ala Gly Ser
260 265 270
Tyr Val Leu Leu Thr Asp Ala Leu Asn Arg His Asp Ile Gly Arg Asp
275 280 285
Arg Gly Gly Leu Asn Lys Ala Leu Glu Ser Ile Lys Val Pro Val Leu
290 295 300
Val Ala Gly Val Asp Thr Asp Ile Arg Tyr Pro Tyr His Gln Gln Glu
305 310 315 320
His Leu Ser Arg Asn Leu Gly Asn Leu Leu Ala Met Ala Lys Ile Val
325 330 335
Ser Pro Val Gly His Asp Ala Phe Leu Thr Glu Ser Arg Gln Met Asp
340 345 350
Arg Ile Val Arg Asn Phe Phe Ser Leu Ile Ser Pro Asp Glu Asp Asn
355 360 365
Pro Ser Thr Tyr Ile Glu Phe Tyr Ile
370 375
<210> 60
<211> 1134
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> metX L313R
<400> 60
atgcccaccc tcgcgccttc aggtcaactt gaaatccaag cgatcggtga tgtctccacc 60
gaagccggag caatcattac aaacgctgaa atcgcctatc accgctgggg tgaataccgc 120
gtagataaag aaggacgcag caatgtcgtt ctcatcgaac acgccctcac tggagattcc 180
aacgcagccg attggtgggc tgacttgctc ggtcccggca aagccatcaa cactgatatt 240
tactgcgtga tctgtaccaa cgtcatcggt ggttgcaacg gttccaccgg acctggctcc 300
atgcatccag atggaaattt ctggggtaat cgcttccccg ccacgtccat tcgtgatcag 360
gtaaacgccg aaaaacaatt cctcgacgca ctcggcatca ccacggtcgc cgcagtactt 420
ggtggttcca tgggtggtgc ccgcacccta gagtgggccg caatgtaccc agaaactgtt 480
ggcgcagctg ctgttcttgc agtttctgca cgcgccagcg cctggcaaat cggcattcaa 540
tccgcccaaa ttaaggcgat tgaaaacgac caccactggc acgaaggcaa ctactacgaa 600
tccggctgca acccagccac cggactcggc gccgcccgac gcatcgccca cctcacctac 660
cgtggcgaac tagaaatcga cgaacgcttc ggcaccaaag cccaaaagaa cgaaaaccca 720
ctcggtccct accgcaagcc cgaccagcgc ttcgccgtgg aatcctactt ggactaccaa 780
gcagacaagc tagtacagcg tttcgacgcc ggctcctacg tcttgctcac cgacgccctc 840
aaccgccacg acattggtcg cgaccgcgga ggcctcaaca aggcactcga atccatcaaa 900
gttccagtcc ttgtcgcagg cgtagatacc gatattcggt acccctacca ccagcaagaa 960
cacctctcca gaaacctggg aaatctactg gcaatggcaa aaatcgtatc ccctgtcggc 1020
cacgatgctt tcctcaccga aagccgccaa atggatcgca tcgtgaggaa cttcttcagc 1080
ctcatctccc cagacgaaga caacccttcg acctacatcg agttctacat ctaa 1134
<210> 61
<211> 377
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313F
<400> 61
Met Pro Thr Leu Ala Pro Ser Gly Gln Leu Glu Ile Gln Ala Ile Gly
1 5 10 15
Asp Val Ser Thr Glu Ala Gly Ala Ile Ile Thr Asn Ala Glu Ile Ala
20 25 30
Tyr His Arg Trp Gly Glu Tyr Arg Val Asp Lys Glu Gly Arg Ser Asn
35 40 45
Val Val Leu Ile Glu His Ala Leu Thr Gly Asp Ser Asn Ala Ala Asp
50 55 60
Trp Trp Ala Asp Leu Leu Gly Pro Gly Lys Ala Ile Asn Thr Asp Ile
65 70 75 80
Tyr Cys Val Ile Cys Thr Asn Val Ile Gly Gly Cys Asn Gly Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Gly Ser Met His Pro Asp Gly Asn Phe Trp Gly Asn Arg Phe
100 105 110
Pro Ala Thr Ser Ile Arg Asp Gln Val Asn Ala Glu Lys Gln Phe Leu
115 120 125
Asp Ala Leu Gly Ile Thr Thr Val Ala Ala Val Leu Gly Gly Ser Met
130 135 140
Gly Gly Ala Arg Thr Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Pro Glu Thr Val
145 150 155 160
Gly Ala Ala Ala Val Leu Ala Val Ser Ala Arg Ala Ser Ala Trp Gln
165 170 175
Ile Gly Ile Gln Ser Ala Gln Ile Lys Ala Ile Glu Asn Asp His His
180 185 190
Trp His Glu Gly Asn Tyr Tyr Glu Ser Gly Cys Asn Pro Ala Thr Gly
195 200 205
Leu Gly Ala Ala Arg Arg Ile Ala His Leu Thr Tyr Arg Gly Glu Leu
210 215 220
Glu Ile Asp Glu Arg Phe Gly Thr Lys Ala Gln Lys Asn Glu Asn Pro
225 230 235 240
Leu Gly Pro Tyr Arg Lys Pro Asp Gln Arg Phe Ala Val Glu Ser Tyr
245 250 255
Leu Asp Tyr Gln Ala Asp Lys Leu Val Gln Arg Phe Asp Ala Gly Ser
260 265 270
Tyr Val Leu Leu Thr Asp Ala Leu Asn Arg His Asp Ile Gly Arg Asp
275 280 285
Arg Gly Gly Leu Asn Lys Ala Leu Glu Ser Ile Lys Val Pro Val Leu
290 295 300
Val Ala Gly Val Asp Thr Asp Ile Phe Tyr Pro Tyr His Gln Gln Glu
305 310 315 320
His Leu Ser Arg Asn Leu Gly Asn Leu Leu Ala Met Ala Lys Ile Val
325 330 335
Ser Pro Val Gly His Asp Ala Phe Leu Thr Glu Ser Arg Gln Met Asp
340 345 350
Arg Ile Val Arg Asn Phe Phe Ser Leu Ile Ser Pro Asp Glu Asp Asn
355 360 365
Pro Ser Thr Tyr Ile Glu Phe Tyr Ile
370 375
<210> 62
<211> 1134
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 313F
<400> 62
atgcccaccc tcgcgccttc aggtcaactt gaaatccaag cgatcggtga tgtctccacc 60
gaagccggag caatcattac aaacgctgaa atcgcctatc accgctgggg tgaataccgc 120
gtagataaag aaggacgcag caatgtcgtt ctcatcgaac acgccctcac tggagattcc 180
aacgcagccg attggtgggc tgacttgctc ggtcccggca aagccatcaa cactgatatt 240
tactgcgtga tctgtaccaa cgtcatcggt ggttgcaacg gttccaccgg acctggctcc 300
atgcatccag atggaaattt ctggggtaat cgcttccccg ccacgtccat tcgtgatcag 360
gtaaacgccg aaaaacaatt cctcgacgca ctcggcatca ccacggtcgc cgcagtactt 420
ggtggttcca tgggtggtgc ccgcacccta gagtgggccg caatgtaccc agaaactgtt 480
ggcgcagctg ctgttcttgc agtttctgca cgcgccagcg cctggcaaat cggcattcaa 540
tccgcccaaa ttaaggcgat tgaaaacgac caccactggc acgaaggcaa ctactacgaa 600
tccggctgca acccagccac cggactcggc gccgcccgac gcatcgccca cctcacctac 660
cgtggcgaac tagaaatcga cgaacgcttc ggcaccaaag cccaaaagaa cgaaaaccca 720
ctcggtccct accgcaagcc cgaccagcgc ttcgccgtgg aatcctactt ggactaccaa 780
gcagacaagc tagtacagcg tttcgacgcc ggctcctacg tcttgctcac cgacgccctc 840
aaccgccacg acattggtcg cgaccgcgga ggcctcaaca aggcactcga atccatcaaa 900
gttccagtcc ttgtcgcagg cgtagatacc gatatttttt acccctacca ccagcaagaa 960
cacctctcca gaaacctggg aaatctactg gcaatggcaa aaatcgtatc ccctgtcggc 1020
cacgatgctt tcctcaccga aagccgccaa atggatcgca tcgtgaggaa cttcttcagc 1080
ctcatctccc cagacgaaga caacccttcg acctacatcg agttctacat ctaa 1134
<210> 63
<211> 377
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313S
<400> 63
Met Pro Thr Leu Ala Pro Ser Gly Gln Leu Glu Ile Gln Ala Ile Gly
1 5 10 15
Asp Val Ser Thr Glu Ala Gly Ala Ile Ile Thr Asn Ala Glu Ile Ala
20 25 30
Tyr His Arg Trp Gly Glu Tyr Arg Val Asp Lys Glu Gly Arg Ser Asn
35 40 45
Val Val Leu Ile Glu His Ala Leu Thr Gly Asp Ser Asn Ala Ala Asp
50 55 60
Trp Trp Ala Asp Leu Leu Gly Pro Gly Lys Ala Ile Asn Thr Asp Ile
65 70 75 80
Tyr Cys Val Ile Cys Thr Asn Val Ile Gly Gly Cys Asn Gly Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Gly Ser Met His Pro Asp Gly Asn Phe Trp Gly Asn Arg Phe
100 105 110
Pro Ala Thr Ser Ile Arg Asp Gln Val Asn Ala Glu Lys Gln Phe Leu
115 120 125
Asp Ala Leu Gly Ile Thr Thr Val Ala Ala Val Leu Gly Gly Ser Met
130 135 140
Gly Gly Ala Arg Thr Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Pro Glu Thr Val
145 150 155 160
Gly Ala Ala Ala Val Leu Ala Val Ser Ala Arg Ala Ser Ala Trp Gln
165 170 175
Ile Gly Ile Gln Ser Ala Gln Ile Lys Ala Ile Glu Asn Asp His His
180 185 190
Trp His Glu Gly Asn Tyr Tyr Glu Ser Gly Cys Asn Pro Ala Thr Gly
195 200 205
Leu Gly Ala Ala Arg Arg Ile Ala His Leu Thr Tyr Arg Gly Glu Leu
210 215 220
Glu Ile Asp Glu Arg Phe Gly Thr Lys Ala Gln Lys Asn Glu Asn Pro
225 230 235 240
Leu Gly Pro Tyr Arg Lys Pro Asp Gln Arg Phe Ala Val Glu Ser Tyr
245 250 255
Leu Asp Tyr Gln Ala Asp Lys Leu Val Gln Arg Phe Asp Ala Gly Ser
260 265 270
Tyr Val Leu Leu Thr Asp Ala Leu Asn Arg His Asp Ile Gly Arg Asp
275 280 285
Arg Gly Gly Leu Asn Lys Ala Leu Glu Ser Ile Lys Val Pro Val Leu
290 295 300
Val Ala Gly Val Asp Thr Asp Ile Ser Tyr Pro Tyr His Gln Gln Glu
305 310 315 320
His Leu Ser Arg Asn Leu Gly Asn Leu Leu Ala Met Ala Lys Ile Val
325 330 335
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340 345 350
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Trp Trp Ala Asp Leu Leu Gly Pro Gly Lys Ala Ile Asn Thr Asp Ile
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Tyr Cys Val Ile Cys Thr Asn Val Ile Gly Gly Cys Asn Gly Ser Thr
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Gly Pro Gly Ser Met His Pro Asp Gly Asn Phe Trp Gly Asn Arg Phe
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Pro Ala Thr Ser Ile Arg Asp Gln Val Asn Ala Glu Lys Gln Phe Leu
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Asp Ala Leu Gly Ile Thr Thr Val Ala Ala Val Leu Gly Gly Ser Met
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Gly Gly Ala Arg Thr Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Pro Glu Thr Val
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gaagccggag caatcattac aaacgctgaa atcgcctatc accgctgggg tgaataccgc 120
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<223> 313D
<400> 88
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245 250 255
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275 280 285
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PCT/RO/134表
Figure 0000011

Claims (14)

1.具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的多肽，所述多肽包含亮氨酸以外的氨基酸对SEQ ID NO:1的氨基酸序列中第313位的氨基酸的取代。
2.权利要求1所述的具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的多肽，其中所述第313位的氨基酸被精氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、或赖氨酸取代。
3.权利要求1所述的具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的多肽，其中所述多肽包含选自SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:81的氨基酸序列的任一氨基酸序列。
4.编码权利要求1所述的具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的多肽的多核苷酸。
5.权利要求4所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:82的核酸序列的任一核酸序列。
6.棒杆菌属(genus Corynebacterium)的产生O-琥珀酰高丝氨酸的微生物，其中包含或过表达权利要求1所述的具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的多肽或其变体多肽。
7.权利要求6所述的棒杆菌属的产生O-琥珀酰高丝氨酸的微生物，其中与非变体微生物相比天冬氨酸激酶活性被进一步增强。
8.权利要求6所述的棒杆菌属的产生O-琥珀酰高丝氨酸的微生物，其中所述棒杆菌属的微生物是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
9.权利要求6所述的棒杆菌属的产生O-琥珀酰高丝氨酸的微生物，其中选自胱硫醚合酶、O-乙酰高丝氨酸(硫醇)-裂解酶、和高丝氨酸激酶的一种或多种的活性被失活。
10.权利要求6所述的棒杆菌属的产生O-琥珀酰高丝氨酸的微生物，其中与非变体微生物相比天冬氨酸激酶活性被进一步增强，并且选自胱硫醚合酶、O-乙酰高丝氨酸(硫醇)-裂解酶、和高丝氨酸激酶的一种或多种的活性被失活。
11.生产O-琥珀酰高丝氨酸的方法，所述方法包括以下步骤：
在培养基中培养权利要求6至10中任一项所述的棒杆菌属的产生O-琥珀酰高丝氨酸的微生物；以及
从所述培养步骤中培养的所述微生物或所述培养基中分离或收集O-琥珀酰高丝氨酸。
12.生产L-甲硫氨酸的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在培养基中培养权利要求6至10中任一项所述的棒杆菌属的产生O-琥珀酰高丝氨酸的微生物；以及
(b)使所述O-琥珀酰高丝氨酸与硫化物反应。
13.权利要求12所述的生产L-甲硫氨酸的方法，进一步包括从所述步骤(a)中培养的所述微生物或所述培养基中分离或收集O-琥珀酰高丝氨酸。
14.权利要求12所述的生产L-甲硫氨酸的方法，进一步包括分离或收集通过在所述步骤(b)中使O-琥珀酰高丝氨酸与硫化物反应而产生的L-甲硫氨酸。
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