CN111315770A

CN111315770A - 无内毒素血红蛋白类原料药的生产系统和方法及无内毒素蛋白的纯化方法

Info

Publication number: CN111315770A
Application number: CN201880066677.1A
Authority: CN
Inventors: 卡尔·W·劳施
Original assignee: Second Medical Technology Alliance
Current assignee: Second Medical Technology Alliance
Priority date: 2017-09-12
Filing date: 2018-09-12
Publication date: 2020-06-19
Also published as: WO2019055489A1; MX2020002765A; JP2020533416A; EP3681905A1; US20200207806A1; US20240043469A1; EP3681905A4

Abstract

本发明涉及一项令人惊奇的发现，即之前的血红蛋白类药物纯化方法在可能与血红蛋白复合的各个步骤中不能充分消除内毒素接触情况。这些复合内毒素可能导致严重的健康并发症(例如，心脏病变发展)。此外，在血红蛋白类药物的生产过程中，不同的内毒素类型和浓度都会造成批次间差异性。与大型蛋白复合体相比，内毒素对肽的影响并不大。因此，本发明涉及在多个工序中使用一次性系统的纯化工艺(包括高效色谱系统)，从而去除内毒素，同时降低处理成本。

Description

无内毒素血红蛋白类原料药的生产系统和方法及无内毒素蛋白的纯化方法

背景技术

根据输血等医学治疗以及血液制品生产中的氧气输送来开发血红蛋白类氧载体等血红蛋白类药物。血红蛋白类药物拟用于预防或治疗因红细胞缺失“失血”(例如，因急性出血或在外科手术过程中出血)、贫血(经循环输送的氧气不足)(例如，恶性贫血、镰状细胞性贫血或急性血液稀释)或休克(例如，低血容量性休克、感染性休克或出血性休克)而导致的缺氧症状。

现有血红蛋白类药物和氧载体包括全氟化合物、合成血红蛋白类似物、脂质体包封血红蛋白、化学改性血红蛋白和血红蛋白类氧载体，其中血红蛋白分子呈交联状态。为去除会引起严重免疫应答的试剂和细胞成分，血红蛋白类药物制备包括多个纯化步骤。在含有血红蛋白的液体(例如，采集的血液)中，必须去除纤维蛋白原(一种可溶蛋白，在凝血过程中通过凝血酶的作用转化为纤维蛋白)以及可能产生的细胞表面物质和免疫球蛋白，并消除特异性血红蛋白试剂的不一致性。现有血液处理技术通常包括添加柠檬酸钠等化学试剂防止凝血。但是，人们正在寻找可能降低处理费用但不影响其他质量(如最终产品纯度)的其他技术。遗憾的是，从牛血中制备血红蛋白溶液的现有方法均利用药物纯化方法，在大多数情况下，此类方法均无法完全去除细胞脂质层等元素，更具体地说，无法完全去除在暴露于细菌内毒素物质的任何处理阶段与血红蛋白复合的脂多糖(内毒素)，因此，迫切需要提供一种血红蛋白类药物纯化和处理方法，与之前的技术相比，此种方法更具成本效益，产品纯度更高，且批次再现性更好。上述内容均证明需要合理、可再现的处理环境。

发明内容

本发明基于一项发现，即之前的血清蛋白类药物纯化方法无法去除在处理时产生变异的许多外来成分(蛋白质变性)，更具体地说，是与血红蛋白复合的内毒素。这些特异性复合内毒素可能会导致严重的健康并发症(例如，心脏病变发展)。此外，在血红蛋白类药物的生产过程中，不同的内毒素类型和浓度都会造成批次间存在差异。与大型蛋白复合体相比，内毒素对多肽的影响并不大，因为，在很多情况下都可以通过超滤分离内毒素。

因此，本文介绍了血红蛋白类氧载体纯化方法，通过这些方法，可以去除内毒素和此类其他物质，且处理成本较低。

具体实施方式

定义

除非特别说明或从上下文中可以明显看出，否则，本文所用的术语“约”应理解为在本领域的正常公差范围内，例如，在平均值的2个标准偏差内。“约”可理解为在规定值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％的范围内。除非上下文另有明确说明，否则本文中的所有数值均用“约”修饰。

短语“异常表达”用于指代偏离(即表达水平增加或降低)基因正常参考表达水平的一种表达水平。

“试剂”系指任何小蛋白化合物或其他化合物、抗体、核酸分子、多肽或其片段。

“改变”系指通过领域已知的标准方法(如本文所述的方法)检测到的稳定技术分子量分布或反应的变化(增加或降低)。本文所用的“改变”包括交联水平至少变化5％，例如，交联分子稳定水平至少变化5％到95％或100％。例如，“改变”包括蛋白稳定水平至少变化5％-10％，稳定分子大小变化优选25％，更优选80％，最优选590％或更大。

“改善”系指减少、抑制、减弱、减小、阻滞或稳定疾病的发展或进展。

本文所用的术语“抗体”(Ab)包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，但前提是它们均具有理想的生物活性。在本文中，术语“免疫球蛋白”(Ig)与“抗体”可互换使用。

与分子“结合”系指对该分子具有理化亲和力。

“对照”或“参考”系指比较标准。一方面，本文所用的“与对照样本或受试者相比发生变化”应理解为与从正常、未经处理或对照样本中采集的样本相比，水平显著不同。例如，对照样本包括培养的细胞、一只或多只实验室试验动物或一名或多名人类受试者。本领域技术人员有能力使用对照样本的选择和试验方法。分析物可能是由细胞或生物体(例如，抗体、蛋白)典型表达或产生的一种天然物质，或由反应物质形成共价键(例如，戊二醛)产生的一种物质。根据使用的检测方法，变化量和测量值可能不同。本领域技术人员有能力确定统计显著性，例如，与构成阳性结果的平均值相比，标准偏差的数量。

“检测”系指确定是否存在、缺少需检测的试剂(例如，脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)等核酸分子)，或者确定试剂量。

“可检测标记”系指一种组合物，在组合物与相关分子连接(例如，直接或间接结合)后，通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段可检测到相关分子。通过标签与分子连接的键合或相互作用可进行直接标记，通过使用直接或间接标记的连接体或桥接部分可进行间接标记。

“检测步骤”可使用任何一种已知方法来检测是否存在核酸(例如，甲基化DNA)或多肽。可以使用探针的检测方法类型包括蛋白印记、DNA印记、斑点或狭线印记和RNA印记。

制剂或制剂成分的“有效量”和“治疗有效量”系指单独或组合使用时提供预期效果的足够制剂或成分量。例如，“有效量”系指改善未经治疗病人的贫血和/或缺铁症状(例如，缺氧)时所需的单独或组合使用的化合物量。用于实施本发明治疗疾病的活性化合物有效量各有不同，具体取决于给药方式、受试者年龄、体重和总体健康状况。最终，主治医师或兽医将决定适用量和给药方案。上述适用量称为“有效”量。

“片段”系指蛋白分子的一部分。一部分至少优选包含分子的血红素铁部分或血红蛋白的原蛋白结构。例如，某一片段可能包含1、2或4条原生血红蛋白分子α和β片段侧链。但是，本发明还包括蛋白片段，但前提是这些蛋白片段均具有全长球形蛋白结构的理想生物活性。例如，本发明的许多实施例均包括总分子量大小约为16000Kd和约为32000kd(包括所有中等分子量)的示例性聚氨基酸片段。同样，如果蛋白片段是铁载体(血红素基)，则可以使用几乎任何长度的蛋白片段。

术语“分离”、“纯化”或“生物纯”系指不同程度地从物质中去除在原生环境中发现的且通常与之伴随的成分的过程。“分离”表示与原始来源或周边环境的分离程度。“纯化”表示比分离程度高的离析程度。

“纯化”或“生物纯”蛋白完全不含其他物质，因此，任何杂质都不会对蛋白的生物学特性产生重大影响或导致不良后果。换言之，在本发明中，如果聚合物片段的稳定蛋白基本上不含细胞物质、病毒物质或培养介质(采用DNA重组技术生产时)或化学前体等化学品(化学合成时)以及所有其他基质红细胞或其他血蛋白或血液成分和细胞碎片，即代表已进行纯化。通常采用分析化学技术确定纯度、均匀性和稳定性，例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法。术语“纯化”表示核酸或蛋白本质上在电泳凝胶中产生一条谱带。对于可进行修饰(例如，磷酸化、糖基化或聚合)的蛋白，不同修饰可能产生不同的分离蛋白，可以单独对这些分离蛋白进行纯化。

同样，“基本纯”系指从天然伴随的成分中分离出的蛋白或多肽。一般而言，当至少95％，甚至99％(按重量计)的蛋白和多肽不含与其天然相关的其他蛋白和天然有机分子时，它们即达到“基本纯”的水平。

“分离多肽”系指本发明中的多肽，从天然伴随的成分中分离。一般而言，当至少60％(按重量计)的多肽不含与其天然相关的蛋白和天然有机分子时，即已分离多肽。对于本发明中的多肽，优选制剂至少为75％，更优选为至少90％，最优选为至少99％(按重量计)。可通过从天然来源提取、重组核酸(对此类物质进行编码)表达或化学合成蛋白获得本发明中的分离多肽分段和/或蛋白。可通过任何适用方法测量纯度，例如，柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。

术语“固定”或“连接”系指探针(例如，核酸或蛋白)和固体载体，其中，探针和固体载体之间的结合在结合、洗涤、分析和去除条件下均足够稳定。可进行共价结合或非共价结合。共价键可在探针和固体载体之间直接形成，或通过交联剂或通过包含固体载体或探针或两种分子上的特异性反应基形成。非共价结合可能是一种或多种静电、亲水和疏水的相互作用。非共价结合包括分子与载体的共价连接以及生物素标记探针与分子的非共价结合。固定还可能包括共价和非共价相互作用组合。

“标志物”系指因疾病(例如，瘤变)而导致表达水平或活性改变的任何蛋白或多核苷酸。

“调控”系指改变(增加或降低)。通过领域已知的标准方法(如本文所述的方法)检测此类改变。

术语“正常量”系指已知未诊断患有癌症或各种代谢和生理疾病的个体体内的复合体正常量。可以在试样中测量分子量，并将其与“正常对照水平”进行比较，利用参考限值、辨别限值或风险定义阈值等技术定义截止点和异常值(例如，瘤变、缺氧、缺血的截止点和异常值)。“正常对照水平”系指通常在已知未患有癌症或生理性缺氧疾病的个体中发现的一种或多种蛋白(或核酸)的水平或组合蛋白指数(或组合核酸指数)。此类正常对照水平和截止点可能因单独使用分子还是在公式中将分子与其他蛋白结合为一个指数而不同。或者，正常对照水平可能是之前在临床相关的时间范围内未转化为癌症的受试者的蛋白图谱数据库。它还可能是一种氧张力减小的状态，用mmHg表示，以缺氧或缺血为特征。另一方面，正常对照水平可能是相对于正常细胞功能和氧合水平的一种水平。

测定的这一水平可能与对照水平、截止水平或阈值水平相同，或与它们相比增加或降低。在某些方面，对照受试者是物种、性别、种族、年龄组、吸烟状况、体质指数(BMI)、目前治疗方案状态、病史或其组合均相同的匹配对照，但与接受诊断和评估的受试者不同的是，匹配对照未患有相关疾病、没有患病风险或出现缺氧的体征和症状。

与对照水平相比，测定的这一水平可能增加。在水平方面，本文所用的术语“增加”(例如，表达水平、生物活性水平等)系指高于对照水平的任何增加％。与对照水平相比，增加水平可能至少或约增加5％、至少或约增加10％、至少或约增加15％、至少或约增加20％、至少或约增加25％、至少或约增加30％、至少或约增加35％、至少或约增加40％、至少或约增加45％、至少或约增加50％、至少或约增加55％、至少或约增加60％、至少或约增加65％、至少或约增加70％、至少或约增加75％、至少或约增加80％、至少或约增加85％、至少或约增加90％，或至少或约增加95％。

与对照水平相比，测定的这一水平可能降低。在水平方面，本文所用的术语“降低”(例如，表达水平、生物活性水平等)系指低于对照水平的任何降低％。与对照水平相比，降低水平可能至少或约降低1％、至少或约降低5％、至少或约降低10％、至少或约降低15％、至少或约降低20％、至少或约降低25％、至少或约降低30％、至少或约降低35％、至少或约降低40％、至少或约降低45％、至少或约降低50％、至少或约降低55％、至少或约降低60％、至少或约降低65％、至少或约降低70％、至少或约降低75％、至少或约降低80％、至少或约降低85％、至少或约降低90％，或至少或约降低95％。

在本发明方法中有用的蛋白分子包括对本发明或其片段的血红素铁组合物多肽进行编码的任何核酸分子。此类蛋白稳定分子无需与内源性核酸序列100％相同，但通常具有本质同一性，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性。

对于多数应用，杂交后的洗涤步骤在严格性方面也有所不同。可以通过缓冲液浓度、戊二醛反应、分散条件和温度来定义洗涤和混合条件的受控严格性。如上所述，通过降低盐浓度或增加温度，可以增加受控严格性。本领域的技人术员可以明显看出这些条件的其他变化。本领域的技术人员熟知杂交/共轭技术，Benton和Davis(科学196∶180，1977年)、Grunstein和Hogness(美国科学院院报72∶3961，1975年)、Ausubel等人(《精编分子生物学实验指南》，威利跨学科，纽约，2011年)、Berger和Kimmel(《分子克隆技术指南》，1987年，学术出版社，纽约)及Sambrook等人(《分子克隆实验指南》，冷泉港实验室出版社，纽约)对这些技术进行了介绍。

“瘤变”系指以过度增殖或凋亡减少为特征的疾病。本发明可用于示例性肿瘤，包括但不限于胰腺癌、白血病(例如，急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性成髓细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性粒单核细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金病、非霍奇金病)、沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症、重链病以及肉瘤和癌等实体瘤(例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、肺小细胞癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。

本文所用的“获得试剂”中的“获得”包括合成、购买或以其他方式获得试剂。

除非特别说明或从上下文中可以明显看出，否则，本文所用的术语“或”应理解为包含在内。除非特别说明或从上下文中可以明显看出，否则，本文所用的术语“一个”、“所述”均应理解为单数或复数。

短语“可药用载体”已获得本领域的认可，包括可药用物质、组合物或载体，可向哺乳动物施用本发明的化合物。载体包括液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封料，用于从一个器官或身体的一部分向另一个器官或身体的一部分输送或运输目标试剂。在与制剂其他成分的相容性方面，每个载体必须“可接受”，且不会对患者造成伤害。可用作可药用载体的一些物质示例包括：糖类(如乳糖、葡萄糖和蔗糖)、明胶、赋形剂、无热原水、等渗盐水、林格氏液、乙醇、磷酸盐缓冲液以及药物制剂中使用的其他无毒相容物质。

“蛋白”、“多肽”或“肽”系指两种以上的天然或非天然氨基酸的任何链(无论翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)如何)，如本文所述，这些链构成所有或部分天然或非天然多肽或肽。

“引物组”系指PCR等反应可能使用的一组寡核苷酸。一个引物组至少由2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、30、40、50、60、80、100、200、250、300、400、500、600个或更多引物组成。

术语“预防”系指向易患特定不良疾病的无临床症状个体施用试剂或组合物，因此涉及症状预防和/或其潜在原因。

在本文中，以一个特定值(“约”)到另一个特定值(“约”)的形式表示范围。在表示此类范围时，另一方面包括从一个特定值到另一个特定值。同样，在通过使用先行词“约”以近似值表示数值时，应理解，特定值构成了另一方面。应进一步理解，每个范围的端点相对于另一个端点来说都很重要，且独立于另一个端点。还应理解，本文公开了许多数值，除数值自身之外，均以“约”加特定值的形式公开每个数值。此外，在整个申请过程中提供多种格式的数据，这些数据表示任意数据点组合的端点、起始点和范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点“15”，则应理解，大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10和15均视为已公开并在10到15之间。还应理解，也公开了两个特定单位之间的每个单位。例如，如果公开了10和15，则也公开了11、12、13和14。

应理解，本文中的范围是范围内所有数值的简写。例如，应理解，1到50的范围包括由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50以及上述整数之间的所有中间十进制值(例如，1.1、1.2、1.3、14、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9)组成的一组中的任何数字、数字组合或子范围。关于子范围，特别考虑了从范围的任一端点延伸的“嵌套子范围”。例如，示例性范围1到50的嵌套子范围可能包括1到10、1到20、1到30和1到40(朝一个方向)或50到40、50到30、50到20和50到10(朝另一个方向)。

“减少”系指至少10％、25％、50％、75％或100％的负向改变。

“参考序列”是一种定义序列，可用作序列比较或基因表达比较的依据。参考序列可能是指定序列的一个子集或其全部；例如，全长cDNA或基因序列片段，或全长cDNA或基因序列。对于多肽，参考多肽序列的长度通常至少约为16个氨基酸，优选为至少约20个氨基酸，更优选为至少约25个氨基酸，甚至更优选为约35个氨基酸、约50个氨基酸或约100个氨基酸。对于核酸，参考核酸序列的长度通常至少约为40个核苷酸，优选为至少约60个核苷酸，更优选为至少约75个核苷酸，甚至更优选为约100个、约300个或约500个核苷酸或任何其附近或之间的整数。

本文所用的术语“样本”系指为进行体外评价而获得的生物样本。本文所述方法所使用的示例性组织样本包括取自瘤变或循环外来体的组织样本。关于本文所公开的方法，样本或患者样本优选包括任何体液或组织。在一些实施例中，体液包括但不限于从受试者身上获得的血液、血浆、血清、淋巴液、母乳、唾液、粘液、精液、阴道分泌物、细胞提取物、炎性液体、脑脊液、粪便、玻璃体液或尿液。在某些方面，样本是由血液样本、血浆样本、血清样本和尿液样本中至少两种组成的复合组。在示例性方面，样本包括血液或其一部分(例如，血浆、血清或通过白细胞除去法获得的一部分)。首选样本包括全血、血清、血浆或尿液。样本也可以是经部分纯化的部分组织或体液。

参考样本可以是“正常”样本，来自未患病供体的体液，或来自患病受试者的正常组织。参考样本也可以来自未经治疗的供体或未使用活性剂处理的细胞培养物(例如，未进行任何处理或仅施用载体)。也可以在对细胞或受试者使用受试试剂或治疗性干预前的“零时间点”或前瞻性研究开始时采集参考样本。

“固体载体”是一种条状物、聚合物、珠状物或纳米颗粒。条状物可能是核酸探针(或蛋白)包覆的多孔或无孔固体载体条，包括将核酸探针与载体连接，以制备共轭物，并将共轭物固定在多孔固体载体上。熟知的载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、右旋糖酐、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿。在本发明中，载体可能在某种程度上可溶或不溶。只要耦联分子能够与结合剂结合(例如，抗体或核酸分子)，载体材料就可以具有几乎任何可能的结构配置。因此，载体配置可能呈球形(如在珠状物中)或柱形(如在试管的内表面或棒的外表面)。或者，表面可能是薄片或试纸条等平面，例如，载体包括聚苯乙烯珠。本领域的技术人员应能够了解适用于结合抗体或抗原的许多其他载体，或能够通过常规实验确定此类信息。在其他方面，固体载体包括与试剂化学结合、固定、分散或相关的聚合物。聚合物载体可能是一种聚合物网络，以珠状物形式制备(例如，通过悬浮聚合)。引入聚合物载体中的活性部位的位置取决于聚合物载体的类型。例如，在溶胀凝胶珠状聚合物载体中，活性部位均匀分布在整个珠状物上，而在大孔珠状聚合物载体中，它们主要分布在大孔的内表面。固体载体(例如，一种装置)仅包含一种结合剂，或还包含至少一个、两个、三个或更多其他分子的结合剂。

“特异性结合”系指化合物或抗体识别并结合本发明的多肽，但基本上不会识别并结合样本(例如，生物样本)中的其他分子，其中自然包含本发明的多肽/共轭纯化蛋白。

“基本相同”系指多肽/蛋白或核酸分子与参考氨基酸序列(例如，本文所述的任意一种氨基酸序列)或核酸序列(例如，本文所述的任意一种核酸序列)至少80％相同。优选为此类序列的氨基酸水平或核酸与用于比较的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同。

本文所用的术语“受试者”包括易患所述疾病的所有动物。在某些方面，受试者为哺乳动物或人类。方法也适用于伴侣动物(如狗和猫)、家畜(如牛、马、绵羊、山羊、猪)以及其它家养和野生动物。

“患有或怀疑患有”特定疾病或综合征的受试者存在足够数量的风险因素，或表现出足够数量的疾病或综合征，或疾病或综合征的体征或症状组合，使有能力的人员能够诊断或怀疑受试者患有疾病或综合征。本领域技术人员有能力使用患有或怀疑患有癌症相关疾病的受试者的鉴定方法。患有及怀疑患有特定疾病或综合征的受试者不一定是两个不同的群体。

本文所用的“怀疑患有”或“易患”特定疾病系指与普通群体相比，因遗传、环境、健康和/或其他风险因素而更可能患病的个体。患病可能性增加可能系指增加约10％、20％、50％、100％、150％、200％或更多。

本文所用的术语“治疗”系指向无临床症状的患病个体施用试剂或制剂，从而减轻症状的严重程度和/或频率，消除症状和/或其潜在原因，促进改善或修复损伤。应理解，治疗疾病并不需要完全消除与之相关的疾病或症状，但并不排除完全消除的情况。

在某些情况下，本发明的组合物采用口服或全身给药。其他给药方式包括局部、眼内、口腔、植入物内/上或胃肠外给药途径。术语“胃肠外”包括皮下、鞘内、静脉内、肌肉内、腹膜内或输注。静脉内或肌肉内给药途径不太适用于长期治疗和预防。但是，在紧急情况下，它们是首选给药途径。可以向生理体液(如血液)中加入包括本发明组合物的组合物。在预防性治疗时，考虑到对患者的便利性以及给药方案，首选口服给药途径。对于较急的疾病或在对因胃肠道不耐受、肠梗阻或其他伴随的重大疾病而无法经肠给药的患者进行治疗时，首选胃肠外给药途径(皮下或静脉内)。

药用组合物可组装成试剂盒或药用系统，用于快速分裂细胞(例如，肿瘤细胞)的细胞周期内的辅助治疗。符合本发明这一方面的试剂盒或药用系统包括一个承载器(如盒、纸箱、管)，其中密封装有一个或多个容器，如西林瓶、管、安瓿瓶、小瓶、注射器或袋子。本发明的试剂盒或药用系统还可能包括试剂盒的相关使用说明书。

本文中的任何组合物或方法均可以与任何其他一种或多种组合物和方法组合使用。

过渡词“包括”与“包含”、“含有”或“以…为特征”是同义词，具有包含性或开放性，且不排除其他未列举的元素或方法步骤。相比之下，过渡短语“由…组成”不包括发明要求保护范围中未指定的元素、步骤或成分。过渡短语“主要由…组成”将发明要求保护范围限制为指定物质或步骤“以及不会在实质上影响本发明基本和新颖特性的物质或步骤”。

从以下的优选实施例说明及发明要求保护范围中，可以明显看出本发明的其他特点及优势。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域普通技术人员公知的相同含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法和材料，但适用方法和材料描述如下。本文所引用的所有已发表国外专利和专利申请文件均通过引用结合到本文中。本文所引用的所有其他已发表文献、文件、手稿或科学文献均通过引用结合到本文中。如有冲突，应以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和示例仅作说明之用，而非加以限制。

附图说明

图1为可从中获得纯化血红蛋白的液体(例如，血液)的图像。

图2为用于纯化液体中蛋白(例如，血红蛋白)的细胞洗涤工艺示意图。

图3为用于纯化蛋白(例如，血红蛋白)溶液的细胞溶解工艺示意图。

图4为蛋白(例如，血红蛋白)溶液脱氧和过滤工艺示意图。

图5为用于过滤蛋白(例如，血红蛋白)溶液的阴离子交换色谱法纯化工艺示意图。

图6A至图6B为蛋白(例如，血红蛋白)脱氧工艺示意图。图6A为用于蛋白溶液脱氧第一步的浓缩和脱氧系统示意图。图6B为用于蛋白溶液脱氧第二步的缓冲液更换和过滤系统示意图。

图7为用于稳定蛋白(例如，血红蛋白)的聚合工艺示意图。

图8为硼氢化物还原工艺示意图。

图9为用于纯化液体中的蛋白(例如，血红蛋白)的细胞洗涤工艺替代实施例的示意图。

图10为用于纯化蛋白(例如，血红蛋白)溶液的细胞溶解工艺替代实施例的示意图。

图11为蛋白(例如，血红蛋白)溶液脱氧和过滤工艺替代实施例的示意图。

图12为用于过滤蛋白(例如，血红蛋白)溶液的阴离子交换色谱法纯化工艺替代实施例的示意图。

图13A至图13B为蛋白(例如，血红蛋白)脱氧工艺替代实施例的示意图。图13A为用于蛋白溶液脱氧第一步的浓缩和脱氧系统替代实施例的示意图。

图13B为用于蛋白溶液脱氧第二步的缓冲液更换和过滤系统替代实施例的示意图。

图14为用于稳定蛋白(例如，血红蛋白)的聚合工艺替代实施例的示意图。

图15为硼氢化物还原工艺替代实施例的示意图。

图16为蛋白(例如，血红蛋白)溶液无菌过滤工艺的示意图。

图17为细胞回收液或离心液澄清装置(例如，CARR Centritech UniFuge)的图像。

图18为分离系统(例如，CARR UniFuge Pilot Centritech分离系统)的图像，其特点包括一次性模块、无需CIP或SIP、全自动、高细胞回收率、哺乳动物和昆虫细胞处理潜力、集成推车、直观软件、低剪切处理以及回收细胞的存活率极小降低。可在最先进的生产设施中生产装置。

图19A至图19B为分离室(例如，UniFuge一次性“GR-AC”分离室)的图像，其特点包括玻璃增强进料和离心液管、带有叶片加速器法兰的先进核心及0.2”的间隙。装置规格包括进料量范围为每分钟0.1-4.0L。图19A为分离室(例如，UniFuge一次性“GR-AC”分离室)的透视图。图19B为分离室(例如，UniFuge一次性“GR-AC”分离室)的俯视图。

图20为系统(例如，UniFuge系统)分离室和管组全组装模块的典型安装图。

图21为分离室和管组全组装模块(例如，UniFuge一次性“GR-AC”模块)的图像，其特点包括4夹管阀配置、玻璃增强进料管和离心液管、带有叶片加速器法兰的先进核心及0.2”的间隙，其中包括Meissner过滤器和包含24”/18”C-flex的管组。进料量范围可能为每分钟0.1-4.0L。

图22为管组组件(例如，UniFuge管组组件)的一系列图像，其特点包括带有Meissner过滤器的4夹管阀和长24”、内径3/8”的C-flex连接管。管组组件使用a项至u项。a项为1/2”(内径)×3/4”(外径)的Pharmed 36.00”OAL管，零件编号可为P003。b项为1/2”WYE聚丙烯连接器，零件编号可为P006。c项为1/2”(内径)×3/4”(外径)的36.00”OAL铂金固化硅胶管，零件编号可为P002。d项为1/2”聚丙烯直式连接器，零件编号可为P005。e项为1/2”(内径)×3/4”(外径)的37C-flex 24.00”OAL管，零件编号可为P004。f项为1/2”聚丙烯管塞，零件编号可为P007。g项为大号聚丙烯管夹，零件编号可为P027。h项为黄色胶带，零件编号可为P076。i项为绿色胶带，零件编号可为P075。j项为1/2”(内径)×3/4”(外径)的6.00”OAL铂金固化硅胶管，零件编号可为P002。k项为1/2”聚碳酸酯压力传感器，零件编号可为P009。l项为3/16”(内径)×3/16”(外径)的18.00”OAL铂金固化硅胶管，零件编号可为P015。m项为3/16”(内径)Meissner HB 0.2Steridyne CFVMV 0.2-33A1过滤器，零件编号可为P016。n项为3/16”(内径)×5/16”(外径)的4.00”OAL铂金固化硅胶管，零件编号可为P0015。o项为最小号扎带，用于内径为1/4”-5/16”的管件，零件编号可为P063。p项为标准扎带，用于内径不小于3/8”的管件，零件编号可为P062。q项为蓝色胶带，零件编号可为P074。r项为白色胶带，零件编号可为P080。s项为1/2”×3/8”聚丙烯异径管，零件编号可为P052。t项为3/8”(内径)×5/6”(外径)的18.00”OAL 37C-flex管，零件编号可为P050。u项为3/8”聚丙烯管塞，零件编号可为P053。

图24为用于血液深层过滤(60μm和0.027m²/0.29ft²)的Millipore Clarisolve60HX或类似装置的图像。

图25为与血液深层过滤组件连接的Millipore Clarisolve 60HX或类似装置的图像。

图26为蛋白交联分布聚合步骤数据示例表。

图27为蛋白交联分布聚合步骤数据的一系列图表。显示了不同交联阶段的各种蛋白峰值。

图28为聚合步骤组件的图像。对不同的戊二醛/bHB比例和歧管类型进行了试验。为评价使用优化歧管时的再现性，在2天内进行了三次聚合反应。测试参数包括5月4日的1个批次和5月5日的2个批次，每次试验使用18g的材料，每克血红蛋白(bHB)使用29mg戊二醛。图28中的测试装置带有一个3/16”(外径)×4cm(长度)的静态混合器、一个T形连接器(而非Y形，可避免过剩回流)、用于封闭系统浓缩/渗滤和连续N2鼓泡的渗余液管阀门。

图29为聚合工艺设置另一实施例的示意图。

图30为C800 QEX(或等效)色谱梯度优化1的一系列图表和图像。梯度优化2可显著改善去除主要30KDa杂质的效果，收率为75％。可装入超过163mg bHB/ml树脂。

图31为C800 QEX(或等效)色谱梯度优化1的技术规格表。

图32为C800 QEX(或等效)色谱梯度优化2的一系列图表和图像。与优化1相比，梯度优化2的梯度下降，蛋白载量增加(图30和图3)。梯度优化2的FT中含有少量的bHB，收率为80％，CIP方法效果良好(1x)，分辨率良好，且236mg bHB/ml树脂时的回收率良好。

图33为C800 QEX(或等效)色谱梯度优化2的技术规格表。

图34为Q琼脂糖凝胶XL CIP C800 QEX(或等效)色谱优化的流程图。

图35为C800 QeX色谱(或等效)组件的图像。图像描述了一种组件和工艺，其中使用412ml的色谱柱(直径为5cm)，180-220mg bHB/ml树脂；为处理C500 1705A，共进行三次运行，第一次运行使用分液收集器；缓冲液进行连续N₂鼓泡；分液收集器包在一个充满氮气的气袋中。4月份，在直径为2.6cm的色谱柱中对梯度方法进行了优化。

图36为C500储存的一系列图像。产物可在4℃下储存长达4周。在3个真空N₂循环后，用小瓶密封产物，并放在充满N₂的气袋中。

图37A至图37E为10KDa渗滤的一系列图表和图像。图37A为10KDa渗滤数据表。图37B为描述C5001705A 10KDa渗滤的渗透液体积(L)及通量(LMH)的曲线图。图37C为C5001705A 10KDa渗滤的TMP及通量(LMH)的曲线图。图37D为10kDa渗滤工艺的示意图。图37E为10kDa渗滤装置的图像。尽管渗透液轻微发红，但血气分析仪并未检测到bHB。使用Sartopore 2无菌MidiCap 0.45μm+0.2μm过滤器过滤渗余液。

图38A至图38C为100KDa渗滤的一系列图表和图像。

图38A为100KDa渗滤的渗透液体积(L)及渗透液bHB浓度(g/dL)的曲线图。在渗滤后，使用血气分析仪在渗余液中测得bHB小于1％(1.7g/247g)。图38B为100KDa渗滤的渗透液体积(L)及渗余液总bHB(％)的曲线图。图38C为100KDa渗滤工艺数据表。

图39为100KDa渗滤工艺组件的一系列图像。

图40为100KDa渗滤工艺的示意图。渗滤工艺涉及以下方面：(1)渗余液、渗透液和渗滤缓冲液(H₂O)连续N₂鼓泡；(2)渗滤H₂O为＜0.005EUml的MilliQ H₂O，通过10KDa膜渗滤获得；(3)在不使用磁力搅拌器的情况下，使用静态混合器通过T型接头直接在渗余液管中加入渗滤缓冲液，以改善渗余液的均匀性。(4)使用蠕动泵控制渗透液流量，防止形成凝胶层及减少通量，并确保较大中试规模桥接。(5)使进料在进入膜前通过40℃换热器，促进瞬态二聚bHB型比例的增加，从而提高渗滤效率和收率。

图41为中空纤维下一批次血液洗涤的示意图。下一批次使用0.65μm的中空纤维。设置包括渗透液流量控制。

图42A至图42C为血液洗涤和溶解的一系列图像和图表。图42A为血液洗涤和溶解工艺数据表。图42B为血液洗涤和溶解装置的图像。图42C为血液洗涤和溶解工艺装置更完整的图像。为进行洗涤，不使用中空纤维柱。通过离心洗涤红细胞。在柠檬酸盐(CSB)中1∶1稀释血液，并将血液离心。将细胞团块重悬于CSB中，并离心三次(共离心四次)。为进行溶解，在H₂O中通过静态混合进行1∶1稀释。离心14000x g，去除细胞碎片。

具体实施方式

99％以上的血细胞均为红细胞。红细胞的主要功能为运输血红蛋白，从而将氧气从肺部输送至各组织，并将CO₂从各组织输送至肺部。每100ml的正常红细胞中含有约34克血红蛋白。每克血红蛋白能够与约1.33ml的氧气结合。在牛血中，血红蛋白(bHB)的浓度(单位：g/dL)为10.1，在2.96L的血液中，相当于299g的bHB。因此，牛血对于大量的血红蛋白回收来说是一种可行的选择。

蛋白纯化用公离系统

例如，在一些实施例中，蛋白纯化用分离系统为Pneumatic Scale Angelus的CARRCentritech UniFuge系统(或等效系统)。UniFuge系统利用一次性γ射线辐照模块，无需CIP和SIP。所有工艺接触面均易于安装，且在每次运行后100％可更换。对于哺乳动物和昆虫细胞，可实现低剪切收获，最低限度地降低回收细胞的存活率。由于细胞未溶解，离心机中细胞碎片的产生量最低，这使UniFuge成为细胞回收或离心液澄清的最佳选择。通过管可轻松将UniFuge模块焊接至您的一次性生物反应器连接件上。UniFuge可全自动化输入灵活的循环参数。将进料悬浮液轻轻泵入模块中，细胞沉降至外半径，同时连续排出上清液。在模块充满细胞后，控制器停止转头，排出细胞。在处理量达到生物反应器体积前，重复此循环。

为了向本领域的普通技术人员完整公开和说明如何进行和使用本发明的测定、筛选和治疗方法，提出了以下实施例，这些实施例并不会限制发明人所认为的发明范围。

实施例

实施例1：2.3.S.2.2.小批次OxyPly原料药生产工艺及工艺控制说明

血液采集

从蒙特利尔大学兽医学院的附属农场获得牛血。通过学院的书面健康计划对动物进行了持续观察。

通过尾静脉穿刺分别从每只动物身上获得最多一(1)升血液。使用500毫升(mL)双血包采集系统(图1，Fenwal，零件编号：4R3429(伊利诺伊州苏黎世湖))进行采集。袋中含有CPD抗凝剂，并配备随体容器和无菌针头/管采样系统。抬起牛的尾巴，将16号针头插入垂直于尾巴、下侧和中线且距尾巴根部三到六英寸的位置，插入深度约为1/2英寸。在重力作用下，将血液采集到袋子中，共获得450-500mL血液。采集后，立即将袋子放在冰上并运至处理机构(例如，Biodextris)。

细胞洗涤

根据图2所示的工艺对采集到的血液进行洗涤。使用蠕动泵将过去24小时内通过多次采集获得的3-5升(L)血液转移到一个Mobius 5L软袋(T100)中。在无菌混合罐中制备50L柠檬酸钠溶液(含有7.9g/L氯化钠和6.0g/L二水柠檬酸钠的纯净水溶液)，使溶液通过10kDa膜滤器进入50L软袋(T101)中，进行脱氧。将柠檬酸盐血(以200mL-min^-1的流速)和柠檬酸钠溶液(以280mL-min^-1的流速)同时泵入静态在线混合器中。使混合液连续直接通过0.6μM和0.4μM的深层过滤膜，进入20L软袋(T102)中。当T102袋中含有5L过滤血液时，以1L-min^-1的流速通过0.2μM中空纤维膜再循环，开始洗涤工艺。将跨膜压力调为15psi，使平均渗透液流速达300mL-min^-1。以300mL-min^-1的流速将柠檬酸钠溶液泵入T102袋中，开始通过渗滤进行细胞洗涤，直至用7倍体积洗涤细胞。渗滤渗透液直接进入50L废液软袋(T103)中。继续渗滤，直至收集到的渗透液等于血量的7倍。用于细胞洗涤工艺的零件示例见以下表1。

表1

此工艺的一个替代方法为使用大型设备进行这一步或安装离心机并使用25L进行c500步骤。此设置的目的是将罐(袋子尺寸)限制为50L，以便可以将袋子放在可移动架上。

细胞溶解

当通过快速降低渗透压使细胞溶解时，牛红细胞释放血红蛋白。如图3所示，进行细胞溶解并连续通过100kDa和30kDa膜进行渗滤。以250mL-min^-1的流速将柠檬酸盐全血泵入静态在线混合器中，同时以250mL-min^-1的流速将注射用水泵入10L软袋(T105)中。当T105装有2.0-2.5L稀释后的全血时，以1000mL-min^-1的流速通过100000kDa的中空纤维膜柱(F103)开始再循环。渗透液直接进入5L软袋(T106)中。当T106中累积1.0-1.5L渗透液时，以1000mL-min^-1的流速通过30000kDa膜(F104)开始再循环。F104渗透液直接进入废液袋中。当全血量(T102)小于250mL时，泵104和105停止。然后，通过以一定的流速(例如，250mL-min^-1)将WFI直接泵入T105开始渗滤，直至100000kDa渗透液中的血红蛋白浓度小于0.2mg-mL^-1，相当于约25-30L的渗滤体积。用于细胞溶解工艺的零件示例见以下表2。

表2

血红蛋白溶液脱氧

通过脱除氧气来稳定血红蛋白溶液，并使用图4所示的工艺进行过滤，从而以中间体的形式进行储存。首先，以500ml-min^-1的流速泵送血红蛋白溶液连续通过两个对齐的Liquicell膜，氮气在75psi下逆流。继续脱氧，直至溶解氧读数低于0.02mg-mL^-1。在充分脱氧后，泵送血红蛋白溶液通过一个0.3μM深层过滤器和两个0.22μM深层过滤器进入5L软袋中，对其进行过滤。在进一步处理前，过滤后的血红蛋白可储存长达2周。用于血红蛋白过滤脱氧工艺的零件示例见以下表3。

表3

色谱法

使用色谱法进一步纯化血红蛋白溶液，减少非特异性血细胞成分(图5所示的工艺)。使用GE Akta Biopilot色谱系统进行操作，GE Akta Biopilot色谱系统配备装有快流速Q琼脂糖凝胶(GE Healthcare))的GE Healthcare XK硼硅酸盐柱(5cm(内径)x100cm(长度)，床高70±5cm。使用注射用水制备缓冲液，并使用10kDa膜过滤缓冲液，进一步减少热原含量。缓冲液为：(1)缓冲液A(2.42g-L^-1 Tris碱，使用乙酸调至pH 9.0±0.1)；(2)缓冲液B(6.05g-L^-1 Tris碱，使用乙酸调至pH 7.0±0.1)和(3)缓冲液C(2.42g-L^-1 Tris碱和58.38g-L^-1 NaCl，使用乙酸调至pH 8.9±0.1)。

在进行色谱操作前，通过新装Q琼脂糖凝胶柱进行五个完整的缓冲循环。色谱法以125mL-min^-1的流速进行。先将血红蛋白溶液(1L含有130±10mg-mL^-1的血红蛋白)装入色谱柱中，然后通过加入等量的缓冲液A和缓冲液B形成pH梯度。通过280nm处的UV吸光度测量柱中洗脱出的蛋白量。当洗脱液的吸光度低于0.05AU时，通过100％缓冲液B洗脱会增加柱pH。在色谱运行的这一部分中，会洗脱出血红蛋白。当吸光度达到0.43AU时，将血红蛋白部分收集到20L软袋(T111)中，当吸光度低于0.05AU时，停止收集。在血红蛋白洗脱后，泵送3L缓冲液C通过色谱柱，以洗脱紧密结合的成分。

在两次色谱运行之间，使用0.2N磷酸并通过两个完整的缓冲循环清洗色谱柱。如果在24小时内不会开始另一次运行，则将色谱柱储存在0.2N磷酸中。用于色谱工艺的零件示例见以下表4。

表4

脱氧

如图6A至图6B所示，对纯化血红蛋白进行脱氧，以增加稳定性。通过30000Da的中空纤维膜(F110)过滤将阳离子交换色谱法步骤中的纯化部分浓缩至11.0±1mg-mL^-1。当达到所需血红蛋白浓度时，以500ml-min^-1的流速泵送血红蛋白溶液连续通过两个对齐的Liquicell膜(F108、F109)，氮气在75psi下逆流。继续脱氧，直至溶解氧读数低于0.02mg-mL^-1。

然后，泵送所述脱氧纯化血红蛋白通过30000Da的中空纤维膜(F110)，并使用六倍储存缓冲液进行渗滤；储存缓冲液由2.63g-L^-1磷酸三钠十二水合物、7.0g-L^-1磷酸氢二钠七水合物和2.0g-L^-1乙酰半胱氨酸组成。在完成缓冲液更换后，泵送溶液通过一个0.5μM深层过滤器和两个0.22μM深层过滤器进入5L软袋(T113)中，对其进行过滤。在进一步处理前，可在室温(17-23℃)下将纯化血红蛋白储存在氮气手套箱中长达60天。用于脱氧工艺的零件示例见以下表5。

表5

聚合

使用图7所示的工艺，通过与戊二醛交联聚合纯化血红蛋白。在氮气压力下，将纯化血红蛋白(4-5L，110g/L)从储存罐(T113)向20L Wave温控袋(T603)中转移。泵送注射用水通过纯化血红蛋白转移线进入T603，以将血红蛋白浓度降至40g/L。然后，稀释后的血红蛋白溶液的温度升至42±2℃。在Wave温控袋(T602)中以6.2g/L的浓度制备戊二醛溶液，并将溶液加热至42±2℃。以10mL/min的流速将戊二醛溶液泵入T603中，直至戊二醛与血红蛋白的比率约为0.029∶1。通过静态混合器(M601)向再循环回路中加入戊二醛，以确保与血红蛋白溶液快速均匀混合。加入戊二醛后，将反应混合液的温度冷却至22±2℃，通过30000Da的中空纤维膜(F601)渗滤浓缩溶液，使血红蛋白浓度达80±5g/L。

如图8所示，通过硼氢化钠还原来稳定戊二醛-血红蛋白键。硼氢化钠在中性pH的水溶液中分解，形成分子氢和硼酸钠。使用硼酸钠缓冲液对聚合血红蛋白进行渗滤，以稳定硼氢化钠并限制氢气形成。硼酸盐缓冲液为含有4.58g/L十水硼酸钠和0.91g/L氢氧化钠的注射用水溶液。

通过10000Da膜过滤缓冲液来减少热原含量，并将缓冲液储存在20L软袋(T605)中。首先，以250mL/min的流速通过再循环回路将硼酸盐缓冲液泵入T603中。同时，以1000mL/min的流速泵送聚合血红蛋白溶液通过30000Da的中空纤维膜进行渗滤。将硼酸盐加入流速调为与渗滤渗透液流速相等，即约250mL/min。继续使用硼酸盐缓冲液进行渗滤，直至加入量相当于3倍聚合血红蛋白溶液。

硼氢化钠溶液为含有9.45g/L硼氢化钠、4.58g/L十水硼酸钠和0.91g/L氢氧化钠的注射用水溶液。通过10000Da膜过滤溶液来减少热原含量，并将溶液储存在2L软袋(T606)中。首先，通过再循环回路以7mL/min的流速将硼氢化钠溶液(0.6L)泵入T603中，并将T603的温度控制在20±2℃。在加入所有溶液之后，硼氢化反应持续60分钟，期间聚合血红蛋白溶液连续再循环。

通过30kD的超滤膜(F601)对稳定聚合血红蛋白溶液进行浓缩，使血红蛋白浓度达到100±5g/L。去除含硼的成分(硼酸钠/硼氢化钠)，使用渗滤溶液A(6.67g/L氯化钠，0.30g/L氯化钾，0.20g/L二水氯化钙，0.445g/L氢氧化钠，2.02g/L N-乙酰-L-半胱氨酸，3.07g/L乳酸钠，pH＝4.9-5.1)通过30kD的超滤膜渗滤聚合血红蛋白，将pH降至8.0-8.4。用于聚合工艺的零件示例见以下表6。

表6

无菌过滤

使最终聚合血红蛋白溶液通过一个0.5μm深层过滤器、一个除菌级0.2μm膜滤器及一个除菌级为2级的0.2μm膜滤器滤入一个275升的蒸汽消毒移动式散装储存罐中。在使用前，将散装储存罐在氮气中储存。

实施例2：OxyPly原料药批量生产的生产工艺和工艺控制说明

概述

OxyPly原料药生产涉及以下主要步骤：

1.血液采集-用柠檬酸钠抗凝剂采集牛血

血液采集

通过尾静脉穿刺分别从每只动物身上获得最多一(1)升血液。使用500mL双血包采集系统进行采集(Fenwal，零件编号：4R3429(伊利诺伊州苏黎世湖))。袋中含有CPD抗凝剂，并配备随体容器和无菌针头/管采样系统。抬起牛的尾巴，将16号针头插入垂直于尾巴、下侧和中线且距尾巴根部三到六英寸的位置，插入深度约为1/2英寸。在重力作用下，将血液采集到袋子中，共获得450-500mL血液。采集后，立即将袋子放在冰上并运至处理机构。

细胞洗涤

根据图9所示的工艺对采集到的血液进行洗涤。使用蠕动泵将过去24小时内通过多次采集获得的15-20L血液转移到一个20L GE Ready Circuit软袋(T100)中。在无菌混合罐中制备200L柠檬酸钠溶液(含有7.9g/L氯化钠和6.0g/L二水柠檬酸钠的纯净水溶液)，使溶液通过10000Da膜滤器进入200L超低密度聚乙烯(ULDP)一次性袋(T101)中，进行脱氧。将柠檬酸盐血(以500mL-min^-1的流速)和柠檬酸钠溶液(以700mL-min^-1的流速)同时泵入静态在线混合器中。使混合液连续直接通过0.6μM和0.4μM的深层过滤膜，进入50L ULDP一次性袋(T102)中。当T102袋中含有10L过滤血液时，以2L-min^-1的流速通过0.2μM中空纤维膜再循环，开始洗涤工艺。将跨膜压力调为15psi，使平均渗透液流速达500mL-min^-1。以500mL-min^-1的流速将柠檬酸钠溶液泵入T102袋中，开始通过渗滤进行细胞洗涤，直至用7倍渗滤体积洗涤细胞。渗滤渗透液直接进入200LULDP一次性袋(T103)中。继续渗滤，直至收集到的渗透液等于血量的7倍。

用于细胞洗涤工艺的零件示例见以下表7，用于细胞洗涤中间检测的零件示例见以下表8。

表7

表8

细胞溶解

通过离心将红细胞与白细胞和血小板分离，如图10所示，当通过快速降低渗透压使细胞溶解时，红细胞释放血红蛋白。将洗涤后的血细胞泵入以13500x g运行的管状转筒离心机(C201)中。重相中包含的红细胞直接通过静态混合器(M201)(在此处，用注射用水稀释两倍)，进入20L GE Ready Circuit软袋(T202)中。当T202装有至少10L稀释后的全血时，以1000mL-min^-1的流速通过100000kDa的中空纤维膜柱(F201)开始再循环。渗透液直接进入20LGE Ready Circuit软袋(T203)中。当T203中累积15L渗透液时，以1000mL-min^-1的流速通过30000kDa膜(F202)开始再循环。F202渗透液直接进入废液袋中。继续通过100000Da膜(F201)进行渗滤，直至渗透液中的血红蛋白浓度小于0.2mg/mL，表明已提取释放的大部分血红蛋白。这相当于约15-20倍的渗滤体积。通过30000kDa膜过滤浓缩通过100000Da过滤从细胞碎片中分离的血红蛋白。连续进行100000Da和30000Da步骤。当血红蛋白浓度在90-110g/L之间时，30000Da过滤停止。

用于细胞溶解工艺的零件示例见以下表9，用于细胞溶解中间检测的零件示例见以下表10。

表9

表10

血红蛋白溶液脱氧

通过脱除氧气来稳定血红蛋白溶液，并使用图11所示的工艺进行过滤，从而以中间体的形式进行储存。首先，以500ml-min^-1的流速泵送血红蛋白溶液连续通过两个对齐的Liquicell膜，氮气在75psi下逆流。继续脱氧，直至溶解氧读数低于0.02mg/mL。在充分脱氧后，泵送血红蛋白溶液通过一个0.3μM深层过滤器和两个0.22μM深层过滤器进入20L GEReady Circuit软袋(T301)中，对其进行过滤。在进一步处理前，过滤后的血红蛋白可储存长达2周。

用于血红蛋白过滤脱氧工艺的零件示例见以下表11，用于血红蛋白过滤脱氧中间检测的零件示例见以下表12。

表11

表12

色谱法

使用色谱法进一步纯化血红蛋白溶液，减少非特异性血细胞成分(图12所示的工艺)。使用GE Akta Biopilot色谱系统进行操作，GE Akta Biopilot色谱系统配备装有快流速Q琼脂糖凝胶(GE Healthcare))的GE Healthcare XK硼硅酸盐柱(5cm(内径)x100cm(长度)，床高70±5cm。使用注射用水制备缓冲液，并使用10kDa膜过滤缓冲液，进一步减少热原含量。缓冲液为：(1)缓冲液A(2.42g-L^-1 Tris碱，使用乙酸调至pH 9.0±0.1)；(2)缓冲液B(6.05g-L^-1 Tris碱，使用乙酸调至pH 7.0±0.1)和(3)缓冲液C(2.42g-L^-1 Tris碱和58.38g-L^-1 NaCl，使用乙酸调至pH 8.9±0.1)。

在进行色谱操作前，通过新装Q琼脂糖凝胶柱进行五个完整的缓冲循环。色谱法以125mL-min^-1的流速进行。首先，将血红蛋白溶液(1L含有130±10mg-mL^-1的血红蛋白)装入色谱柱中，然后通过加入等量的缓冲液A和缓冲液B形成pH梯度。通过280nm处的UV吸光度测量柱中洗脱出的蛋白量。当洗脱液的吸光度低于0.05AU时，通过100％缓冲液B洗脱会增加柱pH。在色谱运行的这一部分中，会洗脱出血红蛋白。当吸光度达到0.43AU时，将血红蛋白部分收集到20L GE Ready Circuit一次性袋(T405)中，当吸光度低于0.05AU时，停止收集。在血红蛋白洗脱后，泵送3L缓冲液C通过色谱柱，以洗脱紧密结合的成分。

在两次色谱运行之间，使用0.2N磷酸并通过两个完整的缓冲循环清洗色谱柱。如果在24小时内不会开始另一次运行，则将色谱柱储存在0.2N磷酸中。

用于色谱工艺的零件示例见以下表13，用于色谱中间检测的零件示例见以下表14。

表13

表14

脱氧

如图13A至图13B所示，对纯化血红蛋白进行脱氧，以增加稳定性。通过30000Da的中空纤维膜(F503)过滤将阳离子交换色谱法步骤中的纯化部分浓缩至11.0±1mg-mL^-1。当达到所需血红蛋白浓度时，以500ml-min-1的流速泵送血红蛋白溶液连续通过两个对齐的Liquicell膜(F501、F502)，氮气在75psi下逆流。继续脱氧，直至溶解氧读数低于0.02mg/mL。

然后，泵送所述脱氧纯化血红蛋白通过30000Da的中空纤维膜(F110)，并使用六倍储存缓冲液进行渗滤；储存缓冲液由2.63g-L^-1磷酸三钠十二水合物、7.0g-L^-1磷酸氢二钠七水合物和2.0g-L^-1乙酰半胱氨酸组成。在完成缓冲液更换后，泵送溶液通过一个0.5μM深层过滤器和两个0.22μM深层过滤器进入20L GE Ready Circuit一次性袋(T501)中，对其进行过滤。在进一步处理前，可在室温(17-23℃)下将纯化血红蛋白储存在氮气手套箱中长达60天。

用于脱氧工艺的零件示例见以下表15，用于脱氧中间检测的零件示例见以下表16。

表15

表16

聚合

使用图14所示的工艺，通过与戊二醛交联聚合纯化血红蛋白。在氮气压力下，将纯化血红蛋白(4-5L，110g/L)从储存罐(T501)向20L Wave温控袋(T603)中转移。泵送注射用水通过纯化血红蛋白转移线进入T603，以将血红蛋白浓度降至40g/L。然后，稀释后的血红蛋白溶液的温度升至42±2℃。在Wave温控袋(T602)中以6.2g/L的浓度制备戊二醛溶液，并将溶液加热至42±2℃。以10mL/min的流速将戊二醛溶液泵入T603中，直至戊二醛与血红蛋白的比率约为0.029∶1。通过静态混合器(M601)向再循环回路中加入戊二醛，以确保与血红蛋白溶液快速均匀混合。加入戊二醛后，将反应混合液的温度冷却至22±2℃，通过30000Da的中空纤维膜(F601)渗滤浓缩溶液，使血红蛋白浓度达80±5g/L。

如图8所示，通过硼氢化钠还原来稳定戊二醛-血红蛋白键。硼氢化钠在中性pH的水溶液中分解，形成分子氢和硼酸钠。使用硼酸钠缓冲液对聚合血红蛋白进行渗滤，以稳定硼氢化钠并限制氢气形成。硼酸盐缓冲液为含有4.58g/L十水硼酸钠和0.91g/L氢氧化钠的注射用水溶液。通过10000Da膜过滤缓冲液来减少热原含量，并将缓冲液储存在20L软袋(T605)中。首先，以250mL/min的流速通过再循环回路将硼酸盐缓冲液泵入T603中。同时，以1000mL/min的流速泵送聚合血红蛋白溶液通过30000Da的中空纤维膜进行渗滤。将硼酸盐加入流速调为与渗滤渗透液流速相等，即约250mL/min。继续使用硼酸盐缓冲液进行渗滤，直至加入量相当于3倍聚合血红蛋白溶液。

通过30kDa的超滤膜(F601)对稳定聚合血红蛋白溶液进行浓缩，使血红蛋白浓度达到100±5g/L。去除含硼的成分(硼酸钠/硼氢化钠)，使用渗滤溶液A(6.67g/L氯化钠，0.30g/L氯化钾，0.20g/L二水氯化钙，0.445g/L氢氧化钠，2.02g/L N-乙酰-L-半胱氨酸，3.07g/L乳酸钠，pH＝4.9-5.1)通过30kD的超滤膜(F601)渗滤聚合血红蛋白，将pH降至8.0-8.4。

用于聚合工艺的零件示例见以下表17，用于聚合中间检测的零件示例见以下表18。

表17

表18

无菌过滤

使最终聚合血红蛋白溶液通过一个0.5μm深层过滤器(F701)、一个除菌级0.2μm膜滤器(F702)及一个除菌级为2级的0.2μm膜滤器(F703)滤入一个20L GE Ready Circuit软袋(T701)中。在使用前，将散装储存罐在氮气中储存。图16为无菌过滤工艺示意图。用于无菌过滤工艺的零件示例见以下表19。

表19

实施例3：生产和纯化工艺的装置和组件

蛋白(例如，血红蛋白)纯化工艺会使用分离系统(图18)。分离系统包括分离室(图19A至图19B)和管组组件(图22)，其可组装在一起(图21)并安装在模块系统(图20)中，用于从溶液(例如，血液)中提取蛋白(例如，血红蛋白)。分离系统中可包括一个附加装置(图23)，用于蛋白纯化。

可使用Millipore Clarisolve 60HX或类似装置(图24)进行血液深层过滤。Millipore Clarisolve 60HX或类似装置可与组件(图25)连接，用于血液深层过滤。

以示意图(图29)和图像(图28)的形式显示了聚合组件示例。在组件中，对不同的戊二醛/bHB比例和歧管类型进行了试验。为评价使用优化歧管时的再现性，在2天内进行了三次聚合反应。测试参数包括5月4日的1个批次和5月5日的2个批次，每次试验使用18g的材料，每克血红蛋白(bHB)使用29mg戊二醛。图28中的测试装置带有一个3/16”(外径)×4.625cm(长度)的静态混合器、一个T形连接器(而非Y形，可避免过剩回流)、用于封闭系统浓缩/渗滤和连续N2鼓泡的渗余液管阀门。获得了包含蛋白(血红蛋白)聚合处理后蛋白交联分布数据的图表(图27和图26)。

用于蛋白纯化的色谱系统组件示例见图35。对C800 QEX(或等效)色谱系统进行了两次不同的梯度优化。图30至图31为包含色谱优化1数据的图表和图像。图32至图33为包含色谱优化2数据的图表和图像。图34为C800 QEX(或等效)色谱系统的Q琼脂糖凝胶XL CIP优化流程图。在某些色谱处理的情况下，将180-220mg血红蛋白(bHB)/ml树脂装入412ml色谱柱(直径：5cm)中。为处理C500 1705A，完成三次运行。第一次运行使用分液收集器，缓冲液进行连续N₂鼓泡。分液收集器包在一个充满氮气的气袋中。在某些情况下，在直径为2.6cm的色谱柱中对梯度方法进行了优化。

图37A至图37E为用于蛋白纯化的10KDa渗滤工艺的图表和图像。图38A至图38C为用于蛋白纯化的100KDa渗滤工艺的一系列图表。以图像(图39)和示意图(图40)的形式显示了100KDa渗滤工艺组件示例。100KDa渗滤工艺涉及以下方面：渗余液、渗透液和渗滤缓冲液(H2O)连续N₂鼓泡；使用通过10KDa膜渗滤获得的渗滤H2O(MilliQ H₂O)(＜0.005EUml)；在不使用磁力搅拌器的情况下，使用静态混合器通过T型接头直接在渗余液管中加入渗滤缓冲液，以改善渗余液的均匀性；使用蠕动泵控制渗透液流量，防止形成凝胶层及减少通量，并确保较大中试规模桥接；使进料在进入膜前通过40℃换热器，促进瞬态二聚bHB型比例的增加，从而提高渗滤效率和收率。

图41为中空纤维洗涤工艺示意图。在溶解前对抗凝血细胞采用中空纤维洗涤工艺。可通过多种方式来保持红细胞的完整性，确保血红蛋白不会接触内毒素和其他脂质。图42A至图42C为血液洗涤和溶解工艺的一系列图像和图表。

图36为描述可在4℃下储存长达4周的蛋白产物C500储存的图像。此产物为中间材料，未经化学处理，但已进行脱氧，可确保氧化活性较低或无氧化活性。无菌过滤有助于延长使用寿命，确保可以从料仓中取出可用材料。

实施例4改性血红蛋白类氧载体

根据标准试验方法对根据本发明生产的几批改性血红蛋白类氧载体进行了分析。批次结果见以下表20至表23。

表20

检定试验日期：2018年6月25日

表21

检定试验日期：2018年7月2日

表22

检定试验日期：2018年7月16日

表23

检定试验日期：2018年7月23日

实施例5：生产改性血红蛋白类氧载体

图43显示了商业规模生产设施。主生产套件室127应符合C级/ISO8规范。主生产套件室为主处理室，在此处，根据本发明通过专用离子交换色谱法进一步纯化血红蛋白溶液(即，用水稀释的原料)。将洗脱液收集在适当容器中，以限制和防止接触氧气和微粒。通过管焊机和适当的密闭容器进行处理和连接，从而减轻所有室内环境暴露风险。通过30kDTFF膜对材料进行浓缩。向高度纯化的血红蛋白溶液中加入大剂量NaCl缓冲液，以便通过疏水气体交换膜进行脱氧。

将血红蛋白溶液滤入含有除氧剂的储存缓冲液中，并进行浓缩，以达到目标血红蛋白浓度。然后，在进一步处理(无开放系统转移)前，将血红蛋白溶液(0.2微米)滤入预灭菌袋中储存。主生产套件室还配备用于聚合血红蛋白、猝灭反应以及使用30kD膜交换缓冲液的工艺设备。聚合系统中的每个容器也通过密闭系统疏水气体交换膜进行再循环，以脱除在向工艺中加入化学品和缓冲液时引入系统中的任何氧气。最终聚合血红蛋白产品滤入(0.22微米)预灭菌容器。将最终产品储存在安全区域的仓库中，放行后，将向合同灌装机构装运最终产品。

进一步参考图43，生产辅助套件室130应符合D级/ISO9规范。生产辅助套件室用于配制工艺中使用的缓冲液，为主处理区提供支持。将在防护罩中称量缓冲液制备时所使用的化学品，以控制颗粒。使用穿过墙上端口且使用虹膜阀密封的管件向工艺供应缓冲液。这些端口还用于向废液转移总管转移工艺废液，最后，废液流至地下废液累积罐中。

根据定义的制药SOP，将在每个工作日根据定义的SOP使用季铵盐“消毒液”对房间进行清洁。每月将使用杀孢子剂或根据环境监测计划中的使用情况对房间进行清洁。使用预灭菌一次性封闭系统进行这一过程。对容器进行采样，容器的管件焊接到系统上，保持封闭系统的状态。

如图43所示，部件准备室128应符合C级规范。准备室用于准备灭菌过程中使用的组件，配备用于冲洗材料的USP纯净水以及用于最终冲洗部件的WFI(按需)。准备室还配备完整性试验机，用于在使用前后进行完整性测试。

如图43所示，杂用室123中配备用于支持设施功能的实用设备。其中包括装置蒸汽锅炉、空气压缩机、氮气/氩气系统、真空系统、USP水系统、带有WFI冷凝器的纯蒸汽发生器、WFI系统和废水中和系统。也可以从此处进入高压灭菌器的机械侧。为确保符合pH排放限值以及为准确测量提供良好的流量，使用批量排放式废水中和系统。

如图43所示，仓库119用于安全储存生产过程中使用的材料，其中包括一个用于储存最终散装产品的附加安全储存室(房间120)以及一个用于储存血红蛋白溶液来料的冷藏室(房间122)。购买化学品及代表性样本，以供QC测试使用。

质量控制实验室118用于测试样本，以支持正在进行的操作。将大部分测试工作外包给尚未确定的适当合同测试实验室。

原料来源

工艺的起始物料为从受控供体畜群中采集的大量牛血红蛋白。通过切向流动过滤系统渗滤或通过一次性离心机离心对采集的红细胞进行洗涤。然后，通过渗透压使红细胞溶解，并通过100kD TFF膜过滤血红蛋白。通过30kD TFF膜收集并浓缩渗透液。在血红蛋白达到目标浓度后，将血红蛋白溶液滤入(0.22微米)袋中并储存在2-8℃下。

原产国

所有动物均来自美国。根据欧盟文件“科学指导委员会关于疯牛病地域性风险(GBR)的意见更新(2002年1月11日采用)”的定义，美国为GBR II级国家。GBR II级表示，“该国家的家牛不太可能感染BSE致病因子，但不能排除感染的可能性。”

交叉污染风险的避免规程

在专用采集室中采集用于处理的牛全血，专用采集室与采集室的剩余处理区分开，或位于受控空间内的屠宰场。由经批准的供应商提供的动物从畜棚进入血液采集区。根据畜群管理计划，接受血液采集的所有动物均有完整的文件，其中包括产地和饲养状态。在出血或放血后，将动物移出血液采集室，送回畜群管理区或在屠宰场设施中进行进一步处理。

动物隔离

到达采集站或屠宰场的经单独标识的牛独立于管理畜群进行控制。首先，根据标准畜群管理计划，在它们进入专用血液采集区前，作为一批进行控制。牛通过滑槽进入，滑槽将它们直接送往采集区或屠宰场的致昏平台。血液采集设施独立于指定设施处的主要放血(如果是屠宰场)或采集设施。

血液采集

在每次采集前，确认每只动物的配套文件和标识的准确性和完整性，并检查动物是否存在任何疾病迹象。使用封闭系统进行血液采集。可固定动物(如已放血)，如果一次性收获，则可使用非气动弩枪法致昏。从未在屠宰场采集血液，也不会使用“脑脊髓刺毁法”规程。如果在屠宰场，则致昏后立即将链条卸扣套在后蹄上，将动物吊至头部朝下的位置。高架输送机系统沿线路将动物尸体移动至采集平台。如果是屠宰场捐赠，则从下颌角至胸腔入口切开兽皮；然后通过颈部后侧缠着的松紧绳从外露的颈沟中收回兽皮。

使用插入颈静脉(靠近腔静脉)的不锈钢套管针以封闭的形式采集血液。消毒管将消毒的套管针与消毒的不锈钢容器或塑料袋连接，这些容器中已装入柠檬酸钠抗凝剂。在约30-60秒的时间内，采集到约10-15升血液。采集血液后，拔出套管针，密封容器。然后，从专用监督采集设施中移出套管针，并移动到主屠宰场处理层，不能将套管针移回设施中。如果在动物管理设施中，动物的出血量控制在2-5升，则在捐赠期间，动物将受到限制，且将血液采集到装有抗凝剂的无菌采集袋中。

每个采集容器均只储存一只动物的血液。记录每个采集容器的独特编号，编号与独特动物耳标中的动物编号相关。耳标编号进一步与独特屠宰场动物编号(用于追踪通过包装厂的牛)相关。随后，经USDA培训的检查人员将检查动物是否存在疾病或污染的迹象。检查人员接受经USDA培训的兽医的监督。如果USDA工作人员因任何原因而将某一只动物留作进一步检查，则将该动物的血液丢弃在屠宰场。可从设施中取出装满的采集容器，将其放在冰上，装入卡车，运至分离设施处。如果是管理供体畜群，则进行类似的编目，并收集和冷却袋子，然后运至最初的处理设施处。

采集到的血液受到其他组织污染的可能性

由于采用密闭方法采集血液，且由训练有素的操作人员进行受控书面规程，因此，受到其他组织污染的可能性极小。在屠宰场，将套管针的刀片朝向血管，可以避免切到气管和食管。

动物头骨上的致昏部位远离套管针插入位置(1米)。由于在采集血液时动物处于悬挂位置，因此，致昏部位的任何液体或骨碎片均不会接触采集部位。采集到的血液不会接触脑、脊髓、眼、回肠、淋巴结、近端结肠、脾脏、扁桃体、硬脑膜、松果体、胎盘、脑脊液、垂体、肾上腺、远端结肠、鼻粘膜、周围神经、骨髓、肝脏、肺脏或胰腺。此外，在生产厂的血液汇集工艺工程中，将去除任何可能的污染组织，其中，通过一个800μ网屏、50μ过滤器和一个60μ深层过滤器连续过滤血液。60μ深层过滤器的孔径分布广泛；最大的孔径为60μ或微米。

水系统

通过纯蒸汽冷凝进入2000L储存罐(保持在65℃以上)产生注射用水，其中，通过喷球进行再循环，以在运行过程中冲洗所有内表面。热回路没有任何直接使用点，但可供应冷回路，冷回路通过换热器进行再循环，将温度降至25℃度。一个使用点为缓冲液制备，另一个使用点为部件准备，即在高压灭菌器灭菌前进行最后冲洗。每晚在规定时间内用热水对冷回路进行消毒。

除了将纯化血红蛋白溶液储存在2-8℃下之外，其他原料均储存在受控室温下。使用标准一次性产品接触材料(如聚丙烯、聚碳酸酯、硅胶管、C-flex管和带有惰性内层(由超低密度聚乙烯或等效材料制成)的袋子)进行储存。在使用前冲洗系统，去除微粒，并在处理前进行泄漏试验。如果需要消毒，则在规定的时间内用0.5M NaOH冲洗系统，然后从系统冲出NaOH，确保在处理前中和残留物。将最终产品储存在受控室温下。

HVAC和空气处理

HVAC系统向洁净室提供HEPA过滤空气，为将湿度降至60％的相对湿度以下，此类洁净室已冷却，为使操作人员感到舒适，可重新加热至所需温度。根据设计，HVAC系统具有足够的换气速率，适用于压力级联为0.05”的等级，位于不同等级的房间之间，主处理区域压力最高。根据设计，处理套件配备气锁，可确保在人员和材料转换时对处理区的影响最小。根据标准操作规程，使用经批准的消毒剂对洁净室进行清洁。根据洁净室等级，定期进行活性和无活性微粒环境监测。将在标准操作规程中规定的位置进行表面监测。

其他实施例

尽管已经结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但前述描述旨在进行说明，而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附发明要求保护范围限定。其他方面、优势和修改在以下发明要求保护范围内。

本文中引用的专利和科学文献确定了本领域技术人员可获得的知识。本文所引用的所有美国专利及已发表或未发表的美国专利申请文件均通过引用结合到本文中。本文所引用的所有已发表国外专利和专利申请文件均通过引用结合到本文中。本文所引用的Genbank和NCBI提交文件(以登录号表示)均通过引用结合到本文中。本文所引用的所有其他已发表文献、文件、手稿或科学文献均通过引用结合到本文中。

尽管已经参照本发明的优选实施例具体显示和描述了本发明，但是本领域的技术人员应理解，在不脱离所附发明要求保护范围所涵盖的本发明范围的情况下，可以对其形式和细节进行各种修改。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种无内毒素血红蛋白类原料药的生产方法，包括：

使用含有CPD抗凝剂的无菌容器收集牛血；

通过渗滤洗涤收集的血液；

使所述牛红细胞溶解，产生血红蛋白溶液；

通过脱除氧气来稳定所述血红蛋白溶液，产生脱氧血红蛋白溶液；

过滤所述脱氧血红蛋白溶液；

纯化所述脱氧血红蛋白溶液，从而减少非特异性血细胞成分，其中，通过色谱法实现所述纯化，产生纯化血红蛋白溶液；

通过约30000Da的中空纤维膜进行过滤脱氧，从而稳定所述纯化血红蛋白溶液，达到所需血红蛋白浓度，其中，使纯化血红蛋白溶液通过多个膜，进行脱氧。

用泵使所述脱氧纯化血红蛋白溶液通过30000Da的中空纤维膜，并使用储存缓冲液进行渗滤，从而过滤该溶液；

通过与戊二醛交联，使所述纯化脱氧血红蛋白聚合；

通过硼氢化钠还原稳定所述聚合纯化脱氧血红蛋白，其中，通过所述聚合血红蛋白渗滤，所述稳定聚合纯化脱氧血红蛋白产生最终聚合血红蛋白溶液；及

过滤所述聚合血红蛋白溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，通过一个0.5μm深层过滤器、一个除菌级0.2μm膜滤器及至少一个除菌级为2级的附加0.2μm膜滤器过滤所述最终聚合血红蛋白溶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，通过快速降低渗透压使牛红细胞进行所述溶解，从而使细胞溶解，并通过100kDa和30kDa膜进行连续渗滤。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述血红蛋白溶液的脱氧步骤进一步包括用泵使血红蛋白溶液以500ml-min^-1的流速连续通过两个对齐的Liquicell膜，氮气在75psi下逆流，直至溶解氧读数低于0.02mg-mL^-1。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述色谱系统利用GE Akta Biopilot色谱系统，该系统配备装有快流速Q琼脂糖凝胶(GE Healthcare))的GE Healthcare XK硼硅酸盐柱(5cm(内径)x 100cm(长度)，床高70±5cm。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，使用注射用水制备所述色谱系统的缓冲液，并通过10kDa膜过滤该缓冲液，进一步减少热原含量。从由(1)缓冲液A(2.42g-L^-1Tris碱，使用乙酸调至pH 9.0±0.1)；(2)缓冲液B(6.05g-L^-1Tris碱，使用乙酸调至pH 7.0±0.1)和(3)缓冲液C(2.42g-L^-1Tris碱和58.38g-L^-1NaCl，使用乙酸调至pH 8.9±0.1)组成的一组中选择所述缓冲液。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，通过将脱氧血红蛋白溶液加热至约42±2℃，使该溶液聚合。在Wave温控袋中制备浓度为6.2g/L的戊二醛，并将其加热至约42±2℃，然后以10mL/min的流速将所述戊二醛溶液泵入Wave温控袋中，直至戊二醛与血红蛋白的比率约为0.029∶1。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，通过再循环回路中的静态混合器加入戊二醛，确保其与血红蛋白快速均匀混合，将反应混合液冷却至约22±2℃。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，通过30000Da的中空纤维膜进行渗滤，浓缩该反应混合液，使血红蛋白的浓度达到约80±5g/L。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述硼氢化钠溶液是一种含有9.45g/L硼氢化钠、4.58g/L十水硼酸钠和0.91g/L氢氧化钠的注射用水溶液，通过10000Da膜过滤所述硼氢化钠溶液，以减少热原含量。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，通过以下步骤对收集的血液进行所述洗涤：用泵使柠檬酸盐血(以约200mL-min^-1的流速)和柠檬酸钠溶液(以约280mL-min^-1的流速)同时连续通过0.6uM和0.4uM的深层滤膜进入袋中，以约1L-min^-1的流速通过0.2uM的中空纤维膜再循环，并以约300ml-min^-1的流速将柠檬酸钠溶液泵入所述柔性袋中。

12.根据权利要求4所述的方法，其中，所述血红蛋白溶液的脱氧步骤进一步包括用泵使过滤后的血红蛋白溶液通过一个0.3uM深层过滤器以及至少一个0.22uM深层过滤器。

13.根据权利要求10所述的方法，其中，在约20±2℃的受控温度下，以7mL/min的流速通过再循环回路将所述硼氢化钠溶液泵入所述Wave温控袋中，在加入所有溶液并连续使聚合血红蛋白溶液再循环后，持续反应约60分钟。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，通过30kD的超滤膜进一步过滤所述纯化聚合血红蛋白溶液，使血红蛋白浓度达到100±5g/L。

15.一种无内毒素血红蛋白溶液的生产方法，包括：

使用含有CPD抗凝剂的无菌容器收集牛血；

通过渗滤洗涤收集的血液；

使所述牛红细胞溶解，产生血红蛋白溶液；

过滤所述脱氧血红蛋白溶液；

纯化所述脱氧血红蛋白溶液，产生纯化血红蛋白溶液；

通过过滤稳定所述纯化血红蛋白溶液，达到所需血红蛋白浓度；

使用储存缓冲液进行渗滤，从而过滤所述脱氧纯化血红蛋白溶液；

通过与戊二醛交联，使所述纯化脱氧血红蛋白聚合；

使用硼氢化钠稳定所述聚合纯化脱氧血红蛋白，产生最终聚合血红蛋白溶液；及

过滤所述聚合血红蛋白溶液。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，通过色谱法对脱氧血红蛋白溶液进行所述纯化。

17.根据权利要求15所述的方法，其中，纯化血红蛋白溶液的所述稳定步骤进一步包括通过一个约30000Da的中空纤维膜及至少一个Liquicell膜过滤脱氧。

18.根据权利要求15所述的方法，其中，用泵使所述脱氧纯化血红蛋白溶液通过30000Da的中空纤维膜，并使用储存缓冲液进行渗滤，从而过滤该溶液；

19.根据权利要求15所述的方法，其中，使用硼氢化钠稳定所述聚合纯化脱氧血红蛋白的步骤进一步包括所述聚合血红蛋白渗滤。

Claims

1.一种无内毒素血红蛋白类原料药的生产方法，包括：

使用含有CPD抗凝剂的无菌聚合袋收集牛血；

通过渗滤洗涤收集的血液；

使所述牛红细胞溶解，产生血红蛋白溶液；

过滤所述脱氧血红蛋白溶液；

通过约30000Da的中空纤维膜进行过滤脱氧，从而稳定所述纯化血红蛋白溶液，达到所需血红蛋白浓度，其中，使纯化血红蛋白溶液通过多个Liquicell膜，进行脱氧。

泵送所述脱氧纯化血红蛋白溶液通过30000Da的中空纤维膜，并使用储存缓冲液进行渗滤，从而过滤所述脱氧纯化血红蛋白溶液；

通过与戊二醛交联，使所述纯化脱氧血红蛋白聚合；

过滤所述聚合血红蛋白溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，通过一个0.5μm深层过滤器、一个除菌级0.2μm膜滤器及至少一个除菌级为2级的附加02μm膜滤器过滤所述最终聚合血红蛋白溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述血红蛋白溶液的脱氧步骤进一步包括以500ml-min^-1的流速泵送血红蛋白溶液连续通过两个对齐的Liquicell膜，氮气在75psi下逆流，直至溶解氧读数低于0.02mg-mL^-1。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述色谱系统利用GE Akta Biopilot色谱系统，系统配备装有快流速Q琼脂糖凝胶(GE Healthcare))的GE Healthcare XK硼硅酸盐柱(5cm(内径)×100cm(长度))，床高70±5cm。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，使用注射用水制备所述色谱系统的缓冲液，并通过10kDa膜过滤缓冲液，进一步减少热原含量。从由(1)缓冲液A(2.42g-L^-1Tris碱，使用乙酸调至pH 9.0±0.1)；(2)缓冲液B(6.05g-L^-1Tris碱，使用乙酸调至pH7.0±0.1)和(3)缓冲液C(2.42g-L^-1Tris碱和58.38g-L^-1NaCl，使用乙酸调至pH 8.9±0.1)组成的一组中选择所述缓冲液。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，通过将血红蛋白溶液加热至42±2℃，使溶液聚合。在Wave温控袋(T602)中制备浓度为6.2g/L的戊二醛，并加热至42±2℃，然后以10mL/min的流速将所述戊二醛溶液泵入T603中，直至戊二醛与血红蛋白的比率约为0.029∶1。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，通过再循环回路中的静态混合器加入戊二醛，确保其与血红蛋白快速均匀混合，将反应混合液冷却至22±2℃。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，通过30000Da的中空纤维膜(F601)进行渗滤，浓缩反应混合液，使血红蛋白的浓度达到80±5g/L。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述硼氢化钠溶液是一种含有9.45g/L硼氢化钠、4.58g/L十水硼酸钠和0.91g/L氢氧化钠的注射用水溶液，通过10000Da膜过滤所述硼氢化钠溶液来减少热原含量。