CN111304215A - 一种Bet V1重组蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

一种Bet V1重组蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111304215A
CN111304215A CN202010169695.1A CN202010169695A CN111304215A CN 111304215 A CN111304215 A CN 111304215A CN 202010169695 A CN202010169695 A CN 202010169695A CN 111304215 A CN111304215 A CN 111304215A
Authority
CN
China
Prior art keywords
prokaryotic
bet
recombinant protein
vector
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010169695.1A
Other languages
English (en)
Inventor
李子樵
周延庆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Ailex Pharmaceutical Co ltd
Ailex Technology Group Co ltd
Original Assignee
Zhejiang Ailex Pharmaceutical Co ltd
Ailex Technology Group Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Ailex Pharmaceutical Co ltd, Ailex Technology Group Co ltd filed Critical Zhejiang Ailex Pharmaceutical Co ltd
Priority to CN202010169695.1A priority Critical patent/CN111304215A/zh
Publication of CN111304215A publication Critical patent/CN111304215A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种Bet V1重组蛋白及其制备方法和应用，所述Bet V1重组蛋白的编码基因包括如SEQ ID NO:1所示的核酸序列。所述Bet V1重组蛋白的编码基因经过密码子优化，经人工合成后亚克隆至原核载体得到重组载体，采用原核表达系统表达制备，有利于实现BetV1重组蛋白在原核表达系统中的高效表达。

Description

一种Bet V1重组蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种Bet V1重组蛋白及其制备方法和应用，尤其涉及一种白桦树主要组分过敏原Bet V1重组蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，过敏性疾病的发病率不断升高，成为重要的公共健康问题。过敏性疾病在各个年龄阶段均有可能发生，其中由血清IgE介导的I型超敏反应是产生过敏性疾病的重要途径，具有明显的遗传倾向性。过敏性疾病主要包括皮肤过敏反应、呼吸道过敏反应、消化道过敏反应甚至过敏性休克等。
白桦树是一种造成I型过敏反应的重要过敏原，可以引起过敏性鼻结膜炎、支气管哮喘等症状，主要含有Bet V1、Bet V2、Bet V4和Bet V6等四种致敏组分过敏原，其中，BetV1为最主要的组分过敏原。多种与Bet V1具有较高同源性且有交叉反应的蛋白也是重要的组分过敏原，如壳斗目中的恺木、榛子，水果中的苹果、樱桃、梨，以及蔬菜中的胡萝卜和芹菜等。因此，Bet V1在过敏诊断和脱敏治疗中具有广泛的应用前景。
因此，研究一种经济、有效的制备Bet V1组分过敏原的方法在过敏性疾病诊断和治疗领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种Bet V1重组蛋白及其制备方法和应用，所述Bet V1重组蛋白的编码基因经过密码子优化，采用原核表达系统表达制备，产量高、成本低，具有广阔的应用前景。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种编码Bet V1重组蛋白的核酸分子，所述核酸分子包括如SEQ ID NO:1所示的核酸序列；
SEQ ID NO:1：
ATGGGCGTGTTTAACTATGAAACCGAAACCACCAGCGTGATTCCGGCGGCGCGCCTGTTTAAAGCGTTTATTCTGGATGGCGATAACCTGTTTCCGAAAGTGGCGCCGCAGGCGATTAGCAGCGTGGAAAACATTGAAGGCAACGGCGGCCCGGGCACCATTAAAAAAATTAGCTTTCCGGAAGGCTTTCCGTTTAAATATGTGAAAGATCGCGTGGATGAAGTGGATCATACCAACTTTAAATATAACTATAGCGTGATTGAAGGCGGCCCGATTGGCGATACCCTGGAAAAAATTAGCAACGAAATTAAAATTGTGGCGACCCCGGATGGCGGCAGCATTCTGAAAATTAGCAACAAATATCATACCAAAGGCGATCATGAAGTGAAAGCGGAACAGGTGAAAGCGAGCAAAGAAATGGGCGAAACCCTGCTGCGCGCGGTGGAAAGCTATCTGCTGGCGCATAGCGATGCGTATAAC。
本发明中，根据白桦树主要组分过敏原Bet V1的mRNA序列，进行原核表达系统密码子优化，密码子优化主要通过调整GC含量、mRNA二级结构等，利用在线密码子优化工具(https://www.vectorbuilder.cn/tool/codon-optimization.html)，得到适用于大肠杆菌表达系统的编码Bet V1重组蛋白的核酸分子，所述核酸分子经人工合成后亚克隆至原核载体得到重组载体，有利于实现Bet V1重组蛋白在大肠杆菌表达系统中的高效表达。
第二方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体包括如第一方面所述的核酸分子。
本发明中，重组载体具有多克隆位点，是一种可以调控外源基因表达的分子生物学载体。
优选地，所述重组载体的空载体包括原核载体。
优选地，所述原核载体包括pET-21a(+)。
第三方面，本发明提供了一种原核表达系统，所述原核表达系统转染有如第一方面所述的核酸分子和/或如第二方面所述的重组载体。
优选地，所述原核表达系统包括可以表达外源基因的原核细胞。
优选地，所述原核细胞包括原核细菌。
优选地，所述原核细菌包括大肠杆菌Rosetta(DE3)。
第四方面，本发明提供了一种Bet V1重组蛋白，所述Bet V1重组蛋白采用如第三方面所述的原核表达系统进行表达。
优选地，所述Bet V1重组蛋白包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:2：
mgvfnyetettsvipaarlfkafildgdnlfpkvapqaissveniegnggpgtikkisfpegfpfkyvkdrvdevdhtnfkynysvieggpigdtlekisneikivatpdggsilkisnkyhtkgdhevkaeqvkaskemgetllravesyllahsdayn。
第五方面，本发明提供了一种如第四方面所述的Bet V1重组蛋白的制备方法，所述方法包括：
(1)将编码Bet V1重组蛋白的核酸分子插入原核载体，得到重组载体；
(2)将所述重组载体转化入原核表达系统，诱导培养；
(3)收集所述原核表达系统的培养上清，纯化后得到所述Bet V1重组蛋白。
优选地，步骤(1)所述核酸分子如SEQ ID NO:1所示。
优选地，步骤(1)所述原核载体包括pET-21a(+)。
优选地，步骤(1)所述核酸分子插入原核载体的BamH I和Xho I限制性酶切位点。
优选地，步骤(2)所述原核表达系统包括原核细胞。
优选地，所述原核细胞包括原核细菌。
优选地，所述原核细菌包括大肠杆菌Rosetta(DE3)。
优选地，步骤(2)所述转化的方法包括化学转染和/或物理转染。
优选地，步骤(3)所述纯化的方法包括亲和层析。
优选地，所述亲和层析采用镍柱进行。
作为优选技术方案，本发明提供了一种如第四方面所述的Bet V1重组蛋白的制备方法，所述方法包括：
(1)将编码Bet V1重组蛋白的核酸分子SEQ ID NO:1插入原核载体pET-21a(+)的BamH I和Xho I限制性酶切位点，得到重组载体；
(2)将所述重组载体转化入大肠杆菌，诱导培养；
(3)收集大肠杆菌的培养上清，采用镍柱亲和层析后得到所述Bet V1重组蛋白。
第六方面，本发明提供了一种如第一方面所述的核酸分子、如第二方面所述的重组载体、如第三方面所述的原核表达系统或如第四方面所述的Bet V1重组蛋白在制备过敏性疾病诊断试剂和/或治疗药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明将Bet V1基因进行原核表达系统密码子优化，密码子优化主要通过调整GC含量、mRNA二级结构等，利用在线密码子优化工具(https://www.vectorbuilder.cn/tool/codon-optimization.html)，得到适用于大肠杆菌表达系统的编码Bet V1重组蛋白的核酸分子；
(2)本发明将所述核酸分子经人工合成后亚克隆至原核载体得到重组载体，转染至原核表达系统中，实现了Bet V1重组蛋白的高效表达，1L诱导表达量可获得8.12mg白桦树Bet V1重组蛋白，并且白桦树Bet V1重组蛋白的纯度高达90％以上；
(3)本发明的制备方法操作简单、成本低、产量高，在过敏性疾病诊断和治疗领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为Bet V1重组蛋白的SDS-PAGE图，其中，泳道1为蛋白Marker，泳道2为诱导后且纯化前样品，泳道3为洗涤收集液，泳道4为洗脱收集液；
图2为Bet V1重组蛋白的Western Blot分析图，其中，泳道1～3表示纯化后的BetV1检测UniCAP白桦树阳性血清，泳道4表示纯化后的Bet V1检测UniCAP白桦树阴性血清。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
细胞和载体：大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司；pET-21a(+)载体购自优宝生物。
培养基：LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH＝7.0)。
生化试剂：PierceTM Coomassie(Bradford)Protein Assay Kit、Ni-NTA琼脂糖、IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)、FastDigest BamH I、FastDigest Xho I购自Thermo Fisher公司；His标签蛋白纯化试剂盒(耐变性剂型)、TMB显色液购自碧云天生物技术有限公司；4×Loading buffer、4-20％TEO梯度预制胶购自上海天能科技有限公司。
实施例1 Bet V1重组蛋白编码基因的设计与合成
以GenBank已公开的白桦树主要组分过敏原Bet V1的mRNA序列(GenBank序列登录号：X15877.1，SEQ ID NO:3)作为优化对象，按照原核表达系统密码子偏好性，选择使用频率最高的密码子，重新设计编码序列，获得如SEQ ID NO:1所示的Bet V1重组蛋白的编码基因，并进行人工合成。
SEQ ID NO:3：
ATGGGTGTTTTCAATTACGAAACTGAGACCACCTCTGTTATCCCAGCAGCTCGACTGTTCAAGGCCTTTATCCTTGATGGCGATAATCTCTTTCCAAAGGTTGCACCCCAAGCCATTAGCAGTGTTGAAAACATTGAAGGAAATGGAGGGCCTGGAACCATTAAGAAGATCAGCTTTCCCGAAGGCTTCCCTTTCAAGTACGTGAAGGACAGAGTTGATGAGGTGGACCACACAAACTTCAAATACAATTACAGCGTGATCGAGGGCGGTCCCATAGGCGACACATTGGAGAAGATCTCCAACGAGATAAAGATAGTGGCAACCCCTGATGGAGGATCCATCTTGAAGATCAGCAACAAGTACCACACCAAAGGTGACCATGAGGTGAAGGCAGAGCAGGTTAAGGCAAGTAAAGAAATGGGCGAGACACTTTTGAGGGCCGTTGAGAGCTACCTCTTGGCACACTCCGATGCCTACAACTAA。
实施例2 Bet V1重组蛋白的表达
(1)使用限制性内切酶BamH I和Xho I酶切Bet V1重组蛋白的编码基因(SEQ IDNO:1)后，用TaKaRa Fragment Purification Kit纯化回收；将回收的编码基因插入同样经限制性内切酶BamH I和Xho I酶切的pET-21a(+)中，构建重组载体；
(2)取50μL大肠杆菌感受态细胞Rosetta(DE3)，冰浴至融化，加入4μL重组质粒pET21a(+)-Bet V1，冰浴30min，将离心管置于42℃水浴中，热激90s，马上放回冰上，冰浴2min，每管加入500μL LB培养基，在37℃摇床温育45min；
(3)取50μL重组质粒转化产物，均匀涂布于含有100μg/mL Amp(氨苄西林)的LB平板上，倒置培养皿，于37℃过夜培养，得到转化子；
(4)挑取单菌落至10mL含有100μg/mL Amp的LB培养基中，37℃、200rpm过夜培养；取10mL菌液加入1L含有100μg/mL Amp的LB培养基中，37℃、250rpm培养至OD600＝0.8，加入终浓度为0.1mM IPTG，于18℃、180rpm继续培养诱导16h，10000rpm离心5min，收集菌体，菌体表达Bet V1重组蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
实施例3 Bet V1重组蛋白的纯化
蛋白纯化按照碧云天生物技术有限公司的His标签蛋白纯化试剂盒(耐变性剂型)说明书进行，具体步骤如下：
(1)每1L表达菌加入80mL变性裂解液，充分重悬菌体；
(2)重悬后的菌液于冰上用超声破碎仪超声裂解表达菌(功率300W，超声时间2秒、间隙时间2秒、工作次数30次)；
(3)4℃10000rpm离心30min，收集细菌裂解液上清并置于冰水浴上待纯化；
(4)取10mL混合均匀的50％BeyoGoldTM His-tag Purification Resin(耐变性剂型)，4℃离心(1000g×10s)弃去储存液，向凝胶中加入一个柱体积的变性裂解液，混匀以平衡凝胶，4℃离心(1000g×10s)弃去液体，再重复平衡1-2次，弃去液体；
(5)混合BeyoGoldTM His-tag PurificationResin(耐变性剂型)和细菌裂解液上清，4℃在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动60min；
(6)将裂解液和BeyoGoldTM His-tag Purification Resin(耐变性剂型)的混合物装入适当的空柱管中，将纯化柱底部的盖子打开，在重力作用下使柱内液体流出；
(7)洗柱5次，每次加入5mL裂解液；
(8)再次洗柱5次，每次加入5mL变性洗涤液；
(9)洗脱目的蛋白3次，每次用5mL非变性洗脱液，得到纯化的Bet V1重组蛋白。
实施例4 Bet V1重组蛋白的SDS-PAGE和蛋白浓度测定
分别取30μL上述收集的样品，与10μL上海天能4×Loading buffer混匀，于金属浴中99℃煮沸10min；10000rpm离心5min后，取10μL上清用4-20％TEO梯度预制胶进行SDS-PAGE，180V运行30min，结果见图1，其中，泳道1为蛋白Marker，泳道2为诱导后且纯化前样品，泳道3为洗涤收集液，泳道4为洗脱收集液。
可以看出，纯化的表达产物在20KDa处有明显的条带，与预计的Bet V1分子量大小(20KDa)相符，目的蛋白的纯度>90％。
采用PierceTM Coomassie(Bradford)Protein Assay Kit测定纯化后蛋白的浓度，为0.54mg/mL，1L细胞表达量可获得近8.12mg较高纯度的Bet V1重组蛋白。
实施例5 Bet V1重组蛋白的Western Blot分析
取纯化后的10μg Bet V1重组蛋白进行SDS-PAGE电泳并电转移至PVDF膜，3％BSA室温封闭1h后，分别取白桦树过敏原阳性血清和阴性血清室温孵育1h，TBST清洗3次，每次5min；随后用HRP偶联的鼠抗人IgE二抗孵育1h，TBST清洗3次，每次5min，用TMB显色液进行显色，检测Bet V1重组蛋白的表达情况。
结果如图2所示，其中，泳道1～3表示纯化后的Bet V1检测UniCAP白桦树阳性血清，泳道4表示纯化后的Bet V1检测UniCAP白桦树阴性血清，可以看出，Bet V1重组蛋白与3例UniCAP白桦树阳性血清全部具有反应性，而与阴性血清不反应，说明Bet V1重组蛋白在大肠杆菌中成功表达。
综上所述，本发明将Bet V1基因进行密码子优化，得到适用于原核表达系统的编码Bet V1重组蛋白的核酸分子，所述核酸分子经人工合成后亚克隆至原核载体得到重组载体，转染至原核表达系统中，实现了Bet V1重组蛋白的高效表达，制备方法操作简单、成本低、产量高，在在过敏性疾病诊断和治疗领域具有广阔的应用前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
、 SEQUENCE LISTING
<110> 蓝怡科技集团股份有限公司；浙江蓝怡医药有限公司
<120> 一种Bet V1重组蛋白及其制备方法和应用
<130> 20200309
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 480
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atgggcgtgt ttaactatga aaccgaaacc accagcgtga ttccggcggc gcgcctgttt 60
aaagcgttta ttctggatgg cgataacctg tttccgaaag tggcgccgca ggcgattagc 120
agcgtggaaa acattgaagg caacggcggc ccgggcacca ttaaaaaaat tagctttccg 180
gaaggctttc cgtttaaata tgtgaaagat cgcgtggatg aagtggatca taccaacttt 240
aaatataact atagcgtgat tgaaggcggc ccgattggcg ataccctgga aaaaattagc 300
aacgaaatta aaattgtggc gaccccggat ggcggcagca ttctgaaaat tagcaacaaa 360
tatcatacca aaggcgatca tgaagtgaaa gcggaacagg tgaaagcgag caaagaaatg 420
ggcgaaaccc tgctgcgcgc ggtggaaagc tatctgctgg cgcatagcga tgcgtataac 480
<210> 2
<211> 160
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Met Gly Val Phe Asn Tyr Glu Thr Glu Thr Thr Ser Val Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ala Arg Leu Phe Lys Ala Phe Ile Leu Asp Gly Asp Asn Leu Phe Pro
20 25 30
Lys Val Ala Pro Gln Ala Ile Ser Ser Val Glu Asn Ile Glu Gly Asn
35 40 45
Gly Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Ser Phe Pro Glu Gly Phe Pro
50 55 60
Phe Lys Tyr Val Lys Asp Arg Val Asp Glu Val Asp His Thr Asn Phe
65 70 75 80
Lys Tyr Asn Tyr Ser Val Ile Glu Gly Gly Pro Ile Gly Asp Thr Leu
85 90 95
Glu Lys Ile Ser Asn Glu Ile Lys Ile Val Ala Thr Pro Asp Gly Gly
100 105 110
Ser Ile Leu Lys Ile Ser Asn Lys Tyr His Thr Lys Gly Asp His Glu
115 120 125
Val Lys Ala Glu Gln Val Lys Ala Ser Lys Glu Met Gly Glu Thr Leu
130 135 140
Leu Arg Ala Val Glu Ser Tyr Leu Leu Ala His Ser Asp Ala Tyr Asn
145 150 155 160
<210> 3
<211> 483
<212> DNA
<213> 人工
<400> 3
atgggtgttt tcaattacga aactgagacc acctctgtta tcccagcagc tcgactgttc 60
aaggccttta tccttgatgg cgataatctc tttccaaagg ttgcacccca agccattagc 120
agtgttgaaa acattgaagg aaatggaggg cctggaacca ttaagaagat cagctttccc 180
gaaggcttcc ctttcaagta cgtgaaggac agagttgatg aggtggacca cacaaacttc 240
aaatacaatt acagcgtgat cgagggcggt cccataggcg acacattgga gaagatctcc 300
aacgagataa agatagtggc aacccctgat ggaggatcca tcttgaagat cagcaacaag 360
taccacacca aaggtgacca tgaggtgaag gcagagcagg ttaaggcaag taaagaaatg 420
ggcgagacac ttttgagggc cgttgagagc tacctcttgg cacactccga tgcctacaac 480
taa 483

Claims (10)

1.一种编码Bet V1重组蛋白的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括如SEQ IDNO:1所示的核酸序列。
2.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括如权利要求1所述的核酸分子；
优选地，所述重组载体的空载体包括原核载体；
优选地，所述原核载体包括pET-21a(+)。
3.一种原核表达系统，其特征在于，所述原核表达系统转染有如权利要求1所述的核酸分子和/或如权利要求2所述的重组载体；
优选地，所述原核表达系统包括原核细胞；
优选地，所述原核细胞包括原核细菌；
优选地，所述原核细菌包括大肠杆菌。
4.一种Bet V1重组蛋白，其特征在于，所述Bet V1重组蛋白采用如权利要求3所述的原核表达系统进行表达；
优选地，所述Bet V1重组蛋白包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
5.一种如权利要求4所述的Bet V1重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)将编码Bet V1重组蛋白的核酸分子插入原核载体，得到重组载体；
(2)将所述重组载体转化入原核表达系统，诱导培养；
(3)收集所述原核表达系统的培养上清，纯化后得到所述Bet V1重组蛋白。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述核酸分子如SEQ ID NO:1所示；
优选地，步骤(1)所述原核载体包括pET-21a(+)；
优选地，步骤(1)所述核酸分子插入原核载体的BamH I和Xho I限制性酶切位点。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述原核表达系统包括原核细胞；
优选地，所述原核细胞包括原核细菌；
优选地，所述原核细菌包括大肠杆菌；
优选地，步骤(2)所述转化的方法包括化学转染和/或物理转染。
8.根据权利要求5-7任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述纯化的方法包括亲和层析；
优选地，所述亲和层析采用镍柱进行。
9.根据权利要求5-8任一项所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)将编码Bet V1重组蛋白的核酸分子SEQ ID NO:1插入原核载体pET-21a的BamH I和Xho I限制性酶切位点，得到重组载体；
(2)将所述重组载体转化入大肠杆菌，诱导培养；
(3)收集大肠杆菌的培养上清，采用镍柱亲和层析后得到所述Bet V1重组蛋白。
10.一种如权利要求1所述的核酸分子、如权利要求2所述的重组载体、如权利要求3所述的原核表达系统或如权利要求4所述的Bet V1重组蛋白在制备过敏性疾病诊断试剂和/或治疗药物中的应用。
CN202010169695.1A 2020-03-12 2020-03-12 一种Bet V1重组蛋白及其制备方法和应用 Pending CN111304215A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010169695.1A CN111304215A (zh) 2020-03-12 2020-03-12 一种Bet V1重组蛋白及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010169695.1A CN111304215A (zh) 2020-03-12 2020-03-12 一种Bet V1重组蛋白及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111304215A true CN111304215A (zh) 2020-06-19

Family

ID=71158628

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010169695.1A Pending CN111304215A (zh) 2020-03-12 2020-03-12 一种Bet V1重组蛋白及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111304215A (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATA168590A (de) * 1990-08-13 1995-11-15 Biomay Biotech Prod Für das baumpollenallergen p14 codierende rekombinante dna-moleküle, daraus hergestellte und abgeleitete polypeptide und deren verwendung

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATA168590A (de) * 1990-08-13 1995-11-15 Biomay Biotech Prod Für das baumpollenallergen p14 codierende rekombinante dna-moleküle, daraus hergestellte und abgeleitete polypeptide und deren verwendung

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ACCESSION P15494: "RecName: Full=Major pollen allergen Bet v 1-A; AltName: Full=Allergen Bet v I-A; AltName: Allergen=Bet v 1-A" *
H BREITENEDER等: "The gene coding for the major birch pollen allergen Betv1, is highly homologous to a pea disease resistance response gene", EMBO J, vol. 8, no. 7, XP000050673 *
I SWOBODA等: "Isoforms of Bet v 1, the major birch pollen allergen, analyzed by liquid chromatography, mass spectrometry, and cDNA cloning", J. BIOL. CHEM, vol. 270, no. 6, pages 2613 *
MICHAEL D. SPANGFORT等: "Dominating IgE-Binding Epitope of Bet v 1, the Major Allergen of Birch Pollen, Characterized by X-ray Crystallography and Site-Directed Mutagenesis", THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 171, no. 6, pages 3085 *
徐桂: "桦树花粉致敏原Bet v 1-F／I的表达鉴定及其过敏原性改良", pages 17 - 24 *
莫绪成;吴序栎;刘志刚;: "平榛主要过敏原Cor h 1的克隆表达、纯化及免疫学鉴定", no. 02, pages 187 - 190 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107245494B (zh) Aβ42在大肠杆菌中的高效可溶性表达及纯化方法
CN111269306B (zh) 一种Art V1重组蛋白及其制备方法和应用
CN111363029A (zh) 重组人源ⅲ型胶原蛋白、表达菌株及其构建方法
CN110229805B (zh) 一种通过序列一致性制备的谷氨酸脱羧酶突变体及其应用
WO2024087784A1 (zh) 酵母重组xvii型人源化胶原蛋白及其制备方法
CN110042092B (zh) 一类稳定性提高的木聚糖酶突变体及其编码基因和应用
CN113736763B (zh) 黑芥子酶Rmyr及其在制备萝卜硫素、莱菔素中的应用
CN109706137B (zh) 一种通过增加二硫键提高肝素酶i热稳定性的突变体及制备方法
WO2024046404A1 (zh) 一种重组肉毒杆菌毒素及其制备方法
CN112980865A (zh) 一种重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法
CN112358536A (zh) 拟穴青蟹致敏蛋白Scy p 1衍生物及其应用
CN117756926B (zh) 一种重组ⅩⅦ型胶原蛋白Pro.C17及其制备方法和应用
CN111304215A (zh) 一种Bet V1重组蛋白及其制备方法和应用
CN106995484B (zh) 一种利用定点突变和分子修饰技术改造的珍珠贝肉抗氧化肽及其构建和制备方法
CN112646837A (zh) 重组人脂联素表达载体、载体构建方法及表达方法
CN116789776A (zh) 一种芒果果实的抑制蛋白过敏原及其应用
CN110988361B (zh) 人血清白蛋白去除试剂盒
CN108753751B (zh) 一种人端粒酶逆转录酶抗原肽及其制备方法
CN113999299B (zh) 人肌红蛋白的高效表达方法
CN111235129A (zh) 一种PPK2蛋白及其在用作聚丙烯酰胺凝胶电泳30kd标准品中的应用
CN115466732B (zh) 用于制备Hispidin的重组蛋白及其应用
CN111233995B (zh) 一种来自猫的新过敏原npc2
CN109609539A (zh) 一种从重组毕赤酵母中制备elabela多肽的方法
EP2834354A1 (en) Improved galactose isomerases and use thereof in the production of tagatose
CN109111489B (zh) 一种基于动物半乳凝集素-3糖识别结构域富集糖蛋白的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200619