CN111269903A

CN111269903A - 木聚糖酶、基因及其应用

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Publication number: CN111269903A
Application number: CN202010237053.0A
Authority: CN
Inventors: 买文宁; 郜继红; 魏勇军; 丁文洪; 张利兵; 冯小军; 王娜; 孟鑫晨; 代吉华; 唐启; 印刘兵; 梁家伟
Original assignee: Henan Junhe Environmental Protection Technology Co ltd; JIAOZUO RUIFENG PAPER CO Ltd; Zhengzhou University
Current assignee: Henan Junhe Environmental Protection Technology Co ltd; JIAOZUO RUIFENG PAPER CO Ltd; Zhengzhou University
Priority date: 2020-03-30
Filing date: 2020-03-30
Publication date: 2020-06-12
Anticipated expiration: 2040-03-30
Also published as: CN111269903B

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种宏基因组来源的木聚糖酶，特别是指木聚糖酶、基因及其应用。本发明从造纸废水宏基因组文库中克隆到了一个木聚糖酶基因，经鉴定其编码的蛋白可良好地以内切的方式水解糖苷键，其可在大肠杆菌宿主中高效表达。本发明的木聚糖酶在高温、高pH条件下稳定性好、活性高，因此，可应用于造纸工业中。

Description

木聚糖酶、基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种宏基因组来源的木聚糖酶，特别是指木聚糖酶、基因及其应用。

背景技术

木聚糖酶 (endo-1,4-β-xylanases，EC3.2.1.8) 是一类重要的工业用酶，主要包括:内切β-1 ,4-木聚糖酶和β-木糖苷酶，可以将木聚糖降解成低聚糖和木糖。木聚糖酶主要以内切方式水解木聚糖或半纤维素中的 β-1,4-糖苷键，生成低聚木糖和木糖及少量的阿拉伯糖。木聚糖酶在自然界中存在广泛，多种细菌和真菌能够产生木聚糖酶，也已在多个以纤维素底物的微生物群落中发现木聚糖酶。木聚糖酶可分为不同的糖苷水解酶家族，木聚糖酶主要存在于第5、7、8、10、11和43家族。

木聚糖酶在许多工业中应用广泛，如造纸行业、饲料行业、食品行业、生物能源行业等，可用于造纸工业纸浆预漂白、木寡糖生产、降解木质纤维素生产生物燃料乙醇等。目前，大多木聚糖酶的最适温度为 40~55℃，最适pH为3~10，且这些木聚糖酶的热稳定性和pH稳定性均较差，但是在工业应用尤其是造纸工业应用中往往需要木聚糖酶具有良好的耐热性和耐碱性。如造纸过程中需要耐受高温蒸煮过程，所需pH值在8.0以上，所需温度在60℃以上。大部分已知的木聚糖酶由于耐热或耐碱能力较差，均不能应用于造纸工业，因此需要挖掘新的具有优良耐热和耐碱性能的木聚糖酶。随着分子生物学、微生物组学、基因工程和合成生物学技术的发展，木聚糖酶的研究工作越来越集中在基因克隆、重组表达和酶活性等研究上来。专利201810470802.7，公开一种木聚糖酶基因、重组表达质粒、重组表达菌株、木聚糖酶及其制备方法和应用，该发明制备的木聚糖酶laXynA在低温下具有高活性，且耐盐性良好，可有效地将木聚寡糖及山毛榉木聚糖水解为2~4个残基的木聚寡糖，可用于益生素木聚寡糖的制备以及食品加工；但该专利中并没有提及可用于水解木质纤维素的作用。

因此，本领域有待于利用微生物组学、分子生物学、基因工程和合成生物学技术，进一步鉴定新的、效果优良的木聚糖酶。

发明内容

本发明提出一种木聚糖酶蛋白质、基因及其应用，解决了水解含有β-1，4-木糖苷键的物质的问题。本发明的目的在于提供一种木聚糖酶(Xyl1)和它的编码基因(xyl1)在大肠杆菌中的高效表达和应用；本发明还涉及含有所述编码基因及其编码基因的表达载体和宿主细胞；本发明还涉及表达编码基因的重组菌，本发明还涉及利用所述木聚糖酶降解木聚糖的方法。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种蛋白质，上述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示或在SEQ ID No.2的N或C末端添加有标签序列，或在SEQ ID No.2的N末端连接有信号肽序列。

另一方面，本发明提供一种编码上述的蛋白质的基因，它包含如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：(1)编码上述蛋白质的多核苷酸序列；(2)与多核苷酸(1)互补的多核苷酸序列。

本专利的发明目的还在于：一种表达载体，所述表达载体含有上述的核苷酸；

以及一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有上述的重组表达载体，或宿主细胞基因组中整合有上述的任一种核苷酸序列。

所述的宿主细胞为原核细胞。

优选的，所述原核细胞为大肠杆菌、链霉菌属、鼠伤寒沙门氏菌中的任一种。

上述的蛋白质的制备方法，步骤如下：

(i) 培养上述的宿主细胞；

(ii) 收集含有上述的多肽的培养物；

(iii) 从培养物中分离出上述的多肽。

上述的蛋白质或宿主细胞的培养物的用途，作为水解糖苷键或用于形成木寡糖、低聚木糖或木糖。

优选的，所述糖苷键为β-1，4-木糖苷键。

一种组合物，所述组合物含有上述的蛋白质或上述的宿主细胞的培养物，以及造纸工业、医学、食品学、饲料学或工业上可接受的载体。

优选的，所述的蛋白质的用途，所述蛋白质作为水解含有糖苷键的物质的生物酶。

优选的，所述水解反应的条件为：pH值3.5~9.5、温度40~80℃。

优选的，水解反应条件为：pH值8~9，更优选的pH值8.5；温度55~75℃，更优选的温度60~70℃。

优选的，所述糖苷键为β-1，4-D-糖苷键；含有糖苷键的物质为多糖、木质纤维素。

优选的，所述的蛋白质的用途，所述蛋白质作为饲料添加剂或食品添加剂。

本发明具有以下有益效果：

1、本申请的木聚糖酶Xyl1对木聚糖最适pH8.5，65℃下的比活力为3245 U/mg；且在pH5.5~9.5之间均具有50%以上的活力，说明Xyl1的反应pH范围较宽，能够适应的酸碱范围较广；Xyl1在50~75℃的温度范围内可保持最高活力50%以上的活力，说明Xyl1的反应温度范围较宽；Xyl1在70℃下保存15min时，活力下降到最大活力的50%以下；在60℃、65℃下保持时酶活力下降较慢，保持45min时酶活力才下降到最大酶活力的50% 以下。

2、本申请的木聚糖酶Xyl1具有较广的pH耐受性：在pH8的缓冲液中保持60min，在pH8.5的缓冲液中保持45min，在pH9的缓冲液中保持30min后，均能够保持最高活力(以Xyl1在pH6 .0中保存30min，在60℃反应10min的比活力为100%)的50%以上。因此该木聚糖酶Xyl1还可应用于高温强碱条件下水解含有木糖苷键的木质纤维素；水解带有木糖苷键的色素、细化饲料或作为添加剂使用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为重组大肠杆菌基因组用验证引物PCR后的电泳图。图中泳道M为Marker为Takara的DL2000的电泳结果(片段由上到下依次是2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)，泳道1-3为3个大肠杆菌Xyl1阳性克隆DNA为模板扩增xyl1基因后的电泳图,另两个泳道为空白。

图2为xyl1基因的表达、表达产物的纯化SDS-PAGE图。其中，泳道1为大肠杆菌菌液超声后的裂解液；泳道2为超声后的裂解液沉淀；泳道3为裂解液上清；泳道4为40mM咪唑洗脱液；泳道5为100mM咪唑洗脱液；泳道M为蛋白Marker的电泳结果(由上到下的条带依次代表97 .2、66 .4、44 .3、29 .0、20 .1kDa)。

图3为Xyl1纯化蛋白在不同温度下的酶活力曲线，65℃为Xyl1纯化蛋白最适反应温度。

图4为Xyl1纯化蛋白在不同pH下的酶活力曲线，pH3～6 .0测定缓冲液为终浓度为100mM的NaAc，pH6 .0～8 .0测定缓冲液为终浓度100mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄；pH8 .0～pH10测定缓冲液为终浓度100mM Tris-HCl，其中最适pH为8.5，且在pH5 .5～9之间均具有50%以上的活力，说明Xyl1纯化蛋白反应pH范围较宽，能够适应的酸碱范围较广。

图5为Xyl1纯化蛋白在不同温度下的耐受性检测结果，●表示60℃下的酶活力，◆表示65℃下的酶活力，▲表示70℃下的酶活力。

图6为Xyl1纯化蛋白在不同pH缓冲液下的耐受性检测结果，纯化蛋白Xyl1在相应的pH缓冲液中在70℃的温度下，pH8、8.5、9时分别保温15、30、45、60、90分钟后测定酶活力，pH8保温缓冲液为终浓度100mM Tris-HCl。◆表示pH 8下的酶活力，■表示pH 8.5的酶活力，▲表示pH 9下的酶活力。

图7为用重组Xyl1蛋白或酸处理1-4底物，观察其对底物的作用。其中，1：1µL的1%葡萄糖；2：1µL的1%木糖；3：2µL的酸处理1%木聚糖；4：2µL的酶处理1%木聚糖；5：2µL 1%木聚糖。

图8为宏基因组序列拼接与注释方法。

图9为基因的扩增与表达。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明人从造纸废水处理反应器中克隆到了一个木聚糖酶基因，经鉴定其可良好地水解糖苷键，特别是β-1，4-木糖苷键。本发明人还在大肠杆菌中高效表达了该基因。本发明的木聚糖酶在中性偏碱性条件下稳定性好、活性高，可良好地应用于工业生产。

如本文所用，术语“本发明的多肽”、“本发明的蛋白”、“本发明的木聚糖酶”、“Xyl1蛋白”、“Xyl1多肽”、或木聚糖酶Xyl1”可互换使用，都指具有木聚糖酶Xyl1氨基酸序列(SEQID NO.2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的β-葡萄糖苷酶Xyl1。

如本文所用，术语“本发明的基因”、“xyl1基因”、“xyl1”、指具有木聚糖酶编码基因序列(SEQ ID NO.1)的多核苷酸。

如本文所用，术语“本发明的大肠杆菌阳性克隆”、“本发明的大肠杆菌重组子”、“本发明的大肠杆菌转化子”、“Xyl1大肠杆菌阳性克隆”、“Xyl1大肠杆菌重组子”或“Xyl1大肠杆菌转化子”可互换使用，都指以大肠杆菌为宿主，异源表达了木聚糖酶Xyl1氨基酸序列(SEQ ID NO.3)。

如本文所用，所述的“木糖”指一种含有五个碳原子的单糖。分子式C₅H₁₀O₅。所述的“木聚糖”是“以直线状(1-4)-连结的木糖”的聚合体。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括Xyl1蛋白的片段。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然Xyl1蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“Xyl1多肽”指具有Xyl1蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与Xyl1蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，更佳地1-10个，最佳地1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能；又比如，仅表达该蛋白的催化结构域，而不表达碳水化合物结合结构域也能获得和完整蛋白同样的催化功能。因此该术语还包括Xyl1蛋白的活性片段和活性衍生物。例如，变异可以发生在SEQ ID NO.2的保守功能域(第41-386位)之外。变异可以是1-3个氨基酸缺失、取代和插入。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与xyl1DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗Xyl1多肽的抗体获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含Xyl1多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了Xyl1多肽的片段。通常，该片段具有Xyl1多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供Xyl1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然Xyl1多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明的Xyl1蛋白的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。表2列出了其中的一些标签及其序列。

表2、标签的序列

标签	残基数	序列	SEQ ID NO.
				Poly-Arg	5-6个(通常5个)	RRRRR	5
Poly-His	2-10个(通常6个)	HHHHHH	6
				FLAG	8个	DYKDDDDK	7
Strep-TagII	8个	WSHPQFEK	8
				C-myc	10个	WQKLISEEDL	9

为了使翻译的蛋白分泌表达(如分泌到细胞外)，还可在所述Xyl1的氨基酸氨基末端用pelB等信号肽替换本身信号肽序列。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO.3的蛋白质，但与SEQID NO.1、SEQ ID NO.2所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO.3的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严谨条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0 .2×SSC，0 .1%SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ IDNO.2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码Xyl1蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的xyl1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或Xyl1蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的Xyl1多肽。一般来说有以下步骤：

(1) .用本发明的编码Xyl1多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2) .在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3) .从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，xyl1多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含Xyl1编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子和其他一些已知的可控制基因在原核中表达的启动子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞是原核细胞，代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞。本发明的Xyl1在大肠杆菌的成功表达，说明该GH10家族木聚糖酶基因xyl1可直接或经过优化后在原核宿主中表达，有着广泛的工业应用潜力。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的Xyl1的用途包括(但不限于)：水解木质纤维素，将半纤维素中的木聚糖水解为低聚木糖和木糖，促进木质纤维素的水解；木聚糖酶和木糖可广泛应用于造纸、食品、医疗、饲料、纺织、石油等工业领域。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从沼液元基因组文库筛选获得的阳性克隆并通过测序获得序列，继而通过PCR分离出的。其序列如SEQ ID NO.1所示，它包含的多核苷酸序列全长为1017个碱基，编码全长为338个氨基酸的Xyl1蛋白(SEQ ID NO.3)。所述的Xyl1蛋白(SEQ ID NO.3)序列中，自氨基端的第14-317位氨基酸为糖基水解酶第5家族氨基端保守功能域

实验证明本发明的β-甘露聚糖酶具有很高的β-甘露聚糖酶活性，在宿主中能高效的分泌表达，最适pH和最适温度和纤维素酶工业菌株里氏木霉酶系基本一致，因而具有巨大的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J .萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、β-甘露聚糖酶Xyl1及其编码基因的获得

Illumina高通量测序技术获得造纸厂废水微生物群落短序列的获得和拼接

取2ml造纸厂废水，离心后取沉淀并用2ml PBS缓冲液(137mmol l^-1NaCl，2 .7mmol l^{- 1}KCl，1 .5mmol l^-1KH₂PO₄，8 .1mmol l^-1Na₂HPO₄，pH7 .4)洗3次。利用DNeasy PowerSoilPro Kit (Qiagen, Germany)试剂盒进行DNA提取。之后，利用Illumina高通量技术对提取的造纸厂废水DNA进行高通量测序，共获得53886441条宏基因组短序列，平均长度148.14bp。宏基因组测序数据分析基本分析流程包括：原始数据质量评估、质量控制、去除宿主序列（需提供明确宿主信息）、短读长 (short reads) 的种群结构分析以及功能结构分析、序列拼装、基因预测、构建基因集合以及功能注释，基因组重构等。具体步骤见图8。最终共得到172595条大于1kb的contigs，并对他们的基因进行了注释。其中一个含有完整的GH10基因xy1，该基因长1170bp。利用该基因设计引物：SEQ ID NO.3：ATGATTAAATTAGGATGTATCAAAGGTC和SEQ IDNO.4：TCATTTATTCATAAGGTCTATCACAC，目的片段xy1的1170bp的DNA片段。利用这对引物对造纸厂废水DNA进行扩增，扩增的DNA聚合酶为VazymePhanta® Max Super-Fidelity DNA Polymerase，以50µL的PCR体系进行扩增反应：：包括一对引物各0 .4μM，每个样品取50ng造纸厂废水DNA为模板,25µL Vazyme公司的2*phanta Max master缓冲液，加水至50µL。扩增基因片段的反应条件，参考其说明书设定PCR程序：95℃，30s ；95℃，15s，55℃，15s ，72℃，1min，共35个循环；72℃，5min；4℃保温。最终得到xyl基因。

实施例2、xyl1在大肠杆菌中的表达

1、宿主大肠杆菌中重组表达载体的构建

通过PCR以造纸厂废水DNA为模板克隆甘露聚糖酶基因xyl1的ORF编码基因 (SEQ IDNO.1，编码SEQ ID No. 2所示的氨基酸)，所用正向引物为：5 ’ GCCTGGTGCCGCGCGGCAGCATGATTAAATTAGGATGTATCAAAGGTC3’(SEQ ID NO.5)，其5’端添加与pET28载体的重组序列：GCCTGGTGCCGCGCGGCAGC；反向引物为5’TCATTTATTCATAAGGTCTATCACACTTTATTCATAAGGTCTATCACAC3’(SEQ ID NO.6) ，其5’端添与pET28载体的重组序列：TCATTTATTCATAAGGTCTATCACAC。

将PCR产物纯化后的DNA片段和经Cla I和Xba I双酶切双酶切后回收的载体pET28，用上海翊圣公司的一步法同源重组酶Hieff CloneTM Plus Multi One StepCloning试剂盒，得到重组表达载体pET28-ecoxyl1。表达产物的N和C末端带有表达载体提供的His标签(6×His-Tag) ，便于后续纯化。

2、xyl1基因在大肠杆菌中的转化和验证

将上述构建好的质粒pET28a-ecoxyl1转化入大肠杆菌BL21(Invitrogen，CA，USA)菌株中，将在含有卡那霉素的 LB 平板上长出的菌落，用正向引物SEQ ID NO.3：ATGATTAAATTAGGATGTATCAAAGGTC和b反向引物为反向引物为SEQ IDNO.4：TCATTTATTCATAAGGTCTATCACAC5’菌落PCR鉴定阳性克隆，经测序后，验证是正确的。

结果如图1所示，3个阳性克隆菌株P1, P2和P3中均有目的片段扩出。

3、xyl1基因在大肠杆菌中的表达和表达产物的纯化

(1)xyl1基因的表达

接种大肠杆菌P1克隆至5mL含有100μg/ml氨苄青霉素的的LB培养基中，37℃，200rpm培养过夜。取1ml培养液到100ml LB培养液中，37℃，200rpm培养至OD600为0 .6-0.8。冷却后加入IPTG至终浓度为25μM，于16℃，200rpm继续培养16个小时，离心收集菌体。用裂解液(lysis buffer：NaH₂PO₄50mmol/L，NaCl300mmol/L，pH7 .4)悬浮收集的菌体，超声波破碎细胞后的裂解液即为粗酶液。粗酶液在12000×g离心10分钟，收集裂解液上清，即为所需的粗酶液。

用购自Qiagen公司的Ni柱(Ni-NTA Column)纯化裂解液上清，纯化时所用洗涤液(wash bufer) ：NaH₂PO₄50mmol/L，NaCI300mmol/L，pH7.0；不同咪唑浓度(20、40、60、100、200、500)的洗脱液(elution bufer) ：NaH₂PO₄50mmol/L，NaCl300mmol/L，咪唑20-500mmol/L，pH7 .0，其中以40mM咪唑洗脱时的纯化效果最好。用5µL洗脱液进行蛋白SDS-PAGE电泳检测，如图2所示。其中，泳道1为大肠杆菌菌液超声后的裂解液；泳道2为超声后的裂解液沉淀；泳道3为裂解液上清；泳道4为40mM咪唑洗脱液；泳道5为100mM咪唑洗脱液；泳道M为蛋白Marker的电泳结果(由上到下的条带依次代表97 .2、66 .4、44 .3、29 .0、20 .1kDa)。40mM咪唑洗脱时目的蛋白大量洗脱，电泳后可以看到单条带，说明此时已经得到高纯度的Xyl1目的蛋白，将所有含有目的蛋白的洗脱液合并，用GE公司10Kd 截留的vivaspin6超滤管浓缩透析，同时用20mM pH7 .4NaH₂PO₄的置换缓冲液，以去除咪唑。

实施例3、重组Xyl1蛋白酶学性质的分析

木聚糖酶的酶活的测定采用DNS法，具体操作如下：

(1)DNS配制

称取10克NaOH ，溶解于大约400ml ddH₂O中，再称取10g二硝基水杨酸、2g苯酚、0 .5g无水亚硫酸钠、200g四水酒石酸钾钠，将其溶解于大约300ml ddH₂O中，两种溶液混合，定容到1升，避光保存。

(2)标准曲线制备

取9支薄壁离心管，按表3加入溶液。

表 3

标样编号	1	2	3	4
					木糖总量(μg)	0	10	20	30
木糖体积(µL)	0	1	2	3
					补充纯水(µL)	100	99	98	97

木糖浓度为10mg/ml。上表每份标样加DNS100µL ，沸水浴5min显色，酶标仪测

540nm光吸收，标样1为空白对照。各样品值减空白后制备标线。

(3)标准酶活测定

在100µL反应体系中，加入终浓度为1%(w/w)的不溶性木聚糖（杭州昊鑫生物，货号：HT1063-10G），终浓度为100mM的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液，然后加入用该缓冲液稀释至一定稀释度的适量酶液在合适温度下反应10分钟，再加入100µL DNS终止反应(对照为在上述反应体系中先加入100µL DNS后再加酶液) ，PCR仪中95℃反应5分钟显色，用酶标仪测540nm光吸收值，样品测定值减去对照后利用标准曲线计算酶活单位(U)。

酶活单位(U)定义：1U为每分钟催化水解木聚糖产生1μmol还原糖(简单糖)所需的酶量。

比活力单位的定义：每毫克蛋白质所含的酶活力(U/mg)。

结果表明，Xyl1对木聚糖最适pH8.5，65℃下的比活力为3245 U/mg。

(4)Xyl1最适pH测定

pH范围为3～9.5，每0.5个单位为一个梯度，不同pH值的缓冲液配制为：pH3～6 .0用终浓度为100mM的NaAc；pH6 .0～8 .0用终浓度为100mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄；pH8.0～pH9 .5用终浓度为100mM Tris-HCl。将酶液加入各pH缓冲液的体系中，按如前所述标准酶活测定步骤测定酶活。在65℃反应条件下，Xyl1在pH8.5的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液中的比活力最高，以此为100%，换算各pH值下的相对酶活力。

结果如图5所示，Xyl1最适pH为8.5，且在pH5.5～9.5之间均具有50%以上的活力，说明Xyl1的反应pH范围较宽，能够适应的酸碱范围较广。

(5)Xyl1最适温度测定

在最适pH8.5条件下，在温度范围为40-80℃之间，按如前所述标准酶活测定方法步骤测定。

结果如图4所示，Xyl1的最适温度为65℃，故以此温度下的酶活力为100%，换算各个温度下的相对酶活力。Xyl1在50-75℃的温度范围内可保持最高活力50%以上的活力，说明Xyl1的反应温度范围较宽。

(6)Xyl1温度耐受性测定

将Xyl1酶液保存于最适pH缓冲液中，在不同温度(60℃、65℃、70℃)保持不同时间(15min、30min、45min、60min、90min)后，在pH8.5，65℃下测定酶活力。其对照是未热处理的酶液在pH8.5，65℃下所测定的活力，以此为100%，换算在不同温度下保温不同时间后的剩余相对活力。

结果如图6所示，Xyl1在70℃下保存15min时，活力下降到最大活力的50%以下；在60℃、65℃下保持时酶活力下降较慢，保持45min时酶活力才下降到最大酶活力的50% 以下。

(7)Xyl1的pH耐受性测定

于最适温度(65℃)下将酶液在不同pH(8, 8.5, 9)的缓冲液中，分别保持不同时间后，在相应pH下，65℃测定酶活力。以Xyl1在pH8.5中保存30min，在65℃反应10min的比活力为100%，换算Xyl1在各pH值缓冲液中保存不同时间后的相对酶活力。

结果如图7所示，Xyl1具有较广的pH耐受性：在pH8的缓冲液中保持60min，在pH8.5的缓冲液中保持45min，在pH9的缓冲液中保持30min后，均能够保持最高活力(以Xyl1在pH6.0中保存30min，在60℃反应10min的比活力为100%)的50%以上。

实施例4、重组Xyl1蛋白对木聚糖的水解

将1%(w/w) 不溶性木聚糖（杭州昊鑫生物，货号：HT1063-10G）与20U的Xyl1蛋白在pH8.5、65℃下作用30min获得水解产物。将2µL上述产物用TLC进行鉴定，其中标准样品为葡萄糖和木糖，另有浓盐酸20℃酸解1%木聚糖1µL作为参考。展开剂为：乙酸乙酯：正丙酮：水=6:1:3(V/V/V) ；显色剂为甲醇：浓硫酸=4:1。

用重组Xyl1蛋白或酸处理底物。用重组Xyl1蛋白或酸处理1-4底物，观察其对底物的作用。其中，1：1µL的1%葡萄糖；2：1µL的1%木糖；3：2µL的酸处理1%木聚糖；4：2µL的酶处理1%木聚糖；5：2µL 1%木聚糖。结果如图7，可获得低聚木糖和木糖。

本申请的木聚糖酶Xyl1主要是针对β-1，4-木糖苷键的，因此该木聚糖酶Xyl1还可应用于高温强碱条件下水解含有木糖苷键的木质纤维素；水解带有木糖苷键的色素、细化饲料或作为添加剂使用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 郑州大学、焦作瑞丰纸业有限公司、河南君和环保科技有限公司

<120> 木聚糖酶蛋白质、基因及其应用

<160> 6

<210> 1

<211> 1170

<212> DNA

<213> 造纸废水宏基因组文库

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(1170)

<400> 1

atgattaaat taggatgtat caaaggtctt aaacatataa tcctgtacat tagcccgctt 60

ttactttttc tctttttatc ctttaatccg aaacccatcg agggcaggga tatagagaaa 120

gggctgaagg actattattc taaaaacttt ttaatcggcg ctgcgatctt tcccgcgctc 180

tttgacaatc cggtttccgc agagctgata aaaactcatt tcaattctat tacccctgaa 240

aatgagatga agtggggctc cattcaccct acccctggtc aatacaggtt tgaaagggca 300

gataagattg cagaatttgc acaggcaaac aatattaaat tgataggcca tacactggtc 360

tggcatagcc agctcggaca gggggtattc acaaaagagg attcaaccga tcttagggca 420

ctggttgata aggataccct ctataaaagg ataaaagagc atatctttac tgttgcaggg 480

agatataagg ggaaggttca cggatgggat gttgttaatg aggcattaaa tgaagacggc 540

accatgcgtg aatctggttt ttacaaaata gcaggggatg aatttattga aaaggcattt 600

gagtatgccc acatagccga cccggatgca gagctctatt ataatgacta taacctggtt 660

atccctgaaa agcgtgccgg ggcagtcagt atagttaaaa gactaaagga aaagggttta 720

aggattgatg cagttggcgt acagggccac tgggatctga aattcccgga actgatcgag 780

attgaaaaca ctataaggga tttttcagaa ctgggtgtta aggttatgtt cacagagctg 840

gatgtatctg tgctgccaag cccctggaga aacagcccct cagccgatat cagtataagg 900

catgaaaata gtcaggagat gaatccatat aaggatggtc tgcctgaatc agtcgctgat 960

gaactggcaa agagatatgg tgatatcttc acaatcttta acaaacataa aggcaagata 1020

agcagggtta ccttctgggg gctgcatgac ggcatatcct ggaagaataa cttccctgtg 1080

ccaggcagga cagactatcc tttgcttttt gatcgtgaga tgaaacctaa aaaggcatat 1140

ttaagtgtga tagaccttat gaataaatga 1170

<210> 2

<211> 389

<212> PRT

<213> 造纸废水宏基因组文库

<400> 2

Met Ile Lys Leu Gly Cys Ile Lys Gly Leu Lys His Ile Ile Leu Tyr

1 5 10 15

Ile Ser Pro Leu Leu Leu Phe Leu Phe Leu Ser Phe Asn Pro Lys Pro

20 25 30

Ile Glu Gly Arg Asp Ile Glu Lys Gly Leu Lys Asp Tyr Tyr Ser Lys

35 40 45

Asn Phe Leu Ile Gly Ala Ala Ile Phe Pro Ala Leu Phe Asp Asn Pro

50 55 60

Val Ser Ala Glu Leu Ile Lys Thr His Phe Asn Ser Ile Thr Pro Glu

65 70 75 80

Asn Glu Met Lys Trp Gly Ser Ile His Pro Thr Pro Gly Gln Tyr Arg

85 90 95

Phe Glu Arg Ala Asp Lys Ile Ala Glu Phe Ala Gln Ala Asn Asn Ile

100 105 110

Lys Leu Ile Gly His Thr Leu Val Trp His Ser Gln Leu Gly Gln Gly

115 120 125

Val Phe Thr Lys Glu Asp Ser Thr Asp Leu Arg Ala Leu Val Asp Lys

130 135 140

Asp Thr Leu Tyr Lys Arg Ile Lys Glu His Ile Phe Thr Val Ala Gly

145 150 155 160

Arg Tyr Lys Gly Lys Val His Gly Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Leu

165 170 175

Asn Glu Asp Gly Thr Met Arg Glu Ser Gly Phe Tyr Lys Ile Ala Gly

180 185 190

Asp Glu Phe Ile Glu Lys Ala Phe Glu Tyr Ala His Ile Ala Asp Pro

195 200 205

Asp Ala Glu Leu Tyr Tyr Asn Asp Tyr Asn Leu Val Ile Pro Glu Lys

210 215 220

Arg Ala Gly Ala Val Ser Ile Val Lys Arg Leu Lys Glu Lys Gly Leu

225 230 235 240

Arg Ile Asp Ala Val Gly Val Gln Gly His Trp Asp Leu Lys Phe Pro

245 250 255

Glu Leu Ile Glu Ile Glu Asn Thr Ile Arg Asp Phe Ser Glu Leu Gly

260 265 270

Val Lys Val Met Phe Thr Glu Leu Asp Val Ser Val Leu Pro Ser Pro

275 280 285

Trp Arg Asn Ser Pro Ser Ala Asp Ile Ser Ile Arg His Glu Asn Ser

290 295 300

Gln Glu Met Asn Pro Tyr Lys Asp Gly Leu Pro Glu Ser Val Ala Asp

305 310 315 320

Glu Leu Ala Lys Arg Tyr Gly Asp Ile Phe Thr Ile Phe Asn Lys His

325 330 335

Lys Gly Lys Ile Ser Arg Val Thr Phe Trp Gly Leu His Asp Gly Ile

340 345 350

Ser Trp Lys Asn Asn Phe Pro Val Pro Gly Arg Thr Asp Tyr Pro Leu

355 360 365

Leu Phe Asp Arg Glu Met Lys Pro Lys Lys Ala Tyr Leu Ser Val Ile

370 375 380

Asp Leu Met Asn Lys

389

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_difference

<222> （1）…（28）

<400> 3

atgattaaat taggatgtat caaaggtc 28

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_difference

<222> （1）…（26）

<400> 4

tcatttattc ataaggtcta tcacac 26

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_difference

<222> （1）…（48）

<400> 5

gcctggtgcc gcgcggcagc atgattaaat taggatgtat caaaggtc 48

<210> 6

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_difference

<222> （1）…（49）

<400> 6

tcatttattc ataaggtcta tcacacttta ttcataaggt ctatcacac 49

Claims

1.一种蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示或在SEQ IDNo.2的N或C末端添加有标签序列，或在SEQ ID No.2的N末端连接有信号肽序列。

2.一种编码权利要求1所述的蛋白质的基因。

3.一种表达载体，其特征在于：所述表达载体含有权利要求2所述的核苷酸。

4.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞含有权利要求3所述的重组表达载体，或宿主细胞基因组中整合有权利要求2所述的任一种核苷酸序列。

5.根据权利要求1所述的宿主细胞，其特征在于：所述的宿主细胞为原核细胞。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于：所述原核细胞为大肠杆菌、链霉菌属、鼠伤寒沙门氏菌中的任一种。

7.权利要求1所述的蛋白质的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(i) 培养权利要求4或5或6所述的宿主细胞；

(ii) 收集含有权利要求1所述的多肽的培养物；

(iii) 从培养物中分离出权利要求1所述的多肽。

8.权利要求1所述的蛋白质或权利要求4或5或6所述的宿主细胞的培养物的用途，其特征在于：作为水解糖苷键或用于形成木寡糖、低聚木糖或木糖。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述糖苷键为β-1，4-木糖苷键。

10.一种组合物，其特征在于：所述组合物含有权利要求1所述的蛋白质或权利要求4或5或6所述的宿主细胞的培养物，以及造纸工业、医学、食品学、饲料学或工业上可接受的载体。

11.权利要求1所述的蛋白质的用途，其特征在于：所述蛋白质作为水解糖苷键的生物酶。

12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述水解反应的条件为：pH值3.5~9.5、温度40~80℃。

13.根据权利要求11所述的蛋白质的用途，其特征在于：所述糖苷键为β-1，4-D-糖苷键；含有糖苷键的物质为多糖、木质纤维素。

14.权利要求1所述的蛋白质的用途，其特征在于：所述蛋白质作为饲料添加剂或食品添加剂。