CN111254107A - 一种hiPSCs来源的类自闭症模型的建立方法 - Google Patents

一种hiPSCs来源的类自闭症模型的建立方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种hiPSCs来源的类自闭症模型的建立方法，该方法主要步骤为(1)微柱阵列芯片的制备；(2)在芯片上诱导类脑；(3)在诱导阶段初期VPA处理3D类脑。该方法主要将干细胞与组织工程相结合，产生了3D类脑组织，通过施加符合生理浓度的VPA(丙戊酸钠)，模拟有双向情感障碍或癫痫的孕妇服用VPA之后对胎儿脑发育的影响，以此来探究自闭症发生的病理机制。该模型是一种新型的自闭症的体外模型，在可以观察到VPA对胎儿脑发育的形态学变化的同时，可以借助分子生物学等多种手段来探究VPA增加胎儿自闭症风险的致病机制。这样可以消除动物实验带来的种属差异以及细胞实验的简单以及2D条件的不足，为探究自闭症的发生提供了一种新的模型与思路。

Description

一种hiPSCs来源的类自闭症模型的建立方法
技术领域
本发明属于器官芯片技术，具体涉及一种hiPSCs来源的类自闭症模型的建立方法。
背景技术
自闭症是广泛性发育障碍的一种亚型，起病于婴幼儿期，主要表现为不同程度的言语发育障碍、人际交往障碍、兴趣狭窄和行为方式刻板。孕期服用VPA会增加胎儿患自闭症的风险。目前对自闭症的研究大都集中在动物模型或二维细胞体外模型。由于小鼠与人之间的种属差异，以及2D培养的简单性，亟待需要一种3D的人源模型。近几年来包括神经干细胞、肠干细胞、胚胎干细胞以及iPSCs来源的类器官得到了有效发展。类器官的特点在于：通过重塑成人干细胞的器官再生或多能干细胞的器官发育，可以准确地代表器官的组织学和生理学。其中体外hiPSCs来源的3D脑基本复制了胎儿早期脑发育的过程，并且这一技术已经广泛的用于构建疾病模型，包括小头症，以及寨卡病毒感染等等。
目前看来，类器官技术还有其不足以及需要改进的地方。由于类器官是3D的细胞团结构使得内部组织容易缺乏氧气和营养，出现细胞死亡，因此限制体外器官的发育。基于此，需要结合其他技术来解决这一问题。此外，使用现有的传统细胞培养技术培养类器官操作复杂，消耗时间长，可控性差。通过微流控技术制备的微柱阵列芯片有利于类脑组织的气体交换与营养交换，除此之外微流控技术还可以提供更加符合生理的因素，例如流体等。
基于此，我们利用高通量的微柱芯片在施加流体的情况下，产生了3D脑类器官，并在特定的时期施加VPA以此来探究VPA增加自闭症的致病机制。
发明内容
本发明的目的是建立一种生命早期类自闭症体外模型，该方法使用微流控芯片产生3D类脑器官，不仅可以提供流体，而且小柱的结构有利于类脑器官之间的气体与营养交换，我们可以实时动态监测，类脑器官的发育，同时探究VPA对类脑器官的形态学、分子以及细胞水平的影响，以此探究VPA增加自闭症风险的致病机制。
本发明提供了一种hiPSCs来源的类自闭症模型的建立方法，其步骤主要分为三部分：
(1)高通量微柱芯片的制备；
(2)在芯片上产生脑类器官；
(3)在诱导阶段初期VPA处理3D类脑；
所述的微柱阵列芯片是由芯片外围坝结构包围微柱结构形成；可用于类器官的生长,微柱结构的直径为500-1000微米，高度为500-100微米，微柱间距为50-100微米，四个微柱结构围成的区域为类脑的形成区域。
步骤(1)高通量微柱阵列芯片的制备，具体为：
(1)使用软蚀刻技术制备SU-8模板，此模板为高通量凹陷小坑，之后对模板进行低粘附修饰，保证SU-8模板与PDMS聚合物容易分离；
(2)制作高通量阵列微柱结构的PDMS聚合物芯片：将PDMS与引发剂184按照体积比10～14：1混成均匀相，之后浇注到SU-8模板上，抽真空去除泡沫，置于80℃烘箱固化20-120分钟，常温将带有结构的PDMS芯片与SU-8模板分离，得到高通量的微柱阵列PDMS芯片；
(3)在PDMS芯片周边用相当大小的石英环将结构封闭，放于80℃烘箱内加热至凝固，得到微阵列芯片。
步骤(2)在芯片上诱导3D类脑；具体为：
(1)使用高通量的小坑芯片产生拟胚体：坑状结构置于24孔板中，小坑芯片结构直径为600-800微米，深度为100-300微米，用于制备拟胚体的形成；
(2)制备拟胚体阶段，将融合度为70％-80％的hiPSCs消化成单细胞，一个六孔板里面加1.5ml含有ROCK inhibitor Y27632的mTeSR1培养基，之后置于24孔板中用于拟胚体的形成；
所述含有ROCK inhibitor Y27632的mTeSR1培养基中：ROCK inhibitor Y27632的母液与mTeSR1培养基的体积比为1：5000；
所述的ROCK inhibitor Y27632在母液中的浓度为30mM；
所述的mTeSR1培养基由400ml mTeSR1TM Basal medium以及100ml 5XSupplement以及1ml 500X Getamicin/Amphotericin B以及1ml 10X Plasmocin TMprophylactic构成；
(3)将形成的拟胚体转移至高通量微柱芯片，并加含有ROCK inhibitor Y27632以及Dorsomorphine、A83-01的KSR培养基培养3天，3天之后加入含有bFGF以及Dorsomorphine、A83-01的KSR培养基；
所述含有ROCK inhibitor Y27632以及Dorsomorphine、A83-01的KSR培养基培中：ROCK inhibitor Y27632的母液与KSR培养基的体积比为1:2000；Dorsomorphine的母液与KSR的体积比为1:4000。A83-01的母液与KSR的体积比为1:4000；
所述含有bFGF以及Dorsomorphine、A83-01的KSR培养基中：bFGF的母液与KSR培养基的体积比为1:25000，Dorsomorphine的母液与KSR的体积比为1:4000；A83-01的母液与KSR的体积比为1:4000；
所述ROCK inhibitor Y27632在母液中的浓度为30mM；
所述Dorsomorphine在母液中的浓度为10mM；
所述A83-01在母液中的浓度为10mM；
所述bFGF在母液中的浓度为100ug/ml；
所述KSR培养基的基础成分为DMEM/F12，另外需添加占总体积20％的KnockOutReplacement(KSR)，占总体积1％NEAA(Non Essential Amino Acid，100×)，占总体积1％GlutaMax(100×)，占总体积1％penicillin-streptomROCK inhibitorycin(100×)，以及0.1mM beta-mercaptoethanol，4ng/ml bFGF。
所述的Dorsomorphine为是一种MAPK信号通路抑制剂，可以抑制BMP4激活的SMAD信号通路。
所述的A83-01有效地抑制TGF-β诱导的生长抑制作用，抑制SMAD信号通路；
所述bFGF为一种生长因子，
(4)到第6天时换成含有bFGF的NIM培养基，3天后换成不含bFGF的NIM培养基，加两天；
所述含有bFGF的NIM培养基中：bFGF的母液的体积与NIM培养基的体积比为：1:25000；
所述bFGF在母液中的浓度为100ug/ml。
所述NIM培养基的基础成分为DMEM/F12，另外需添加占总体积1％N2(100×)，占总体积1％GlutaMAX(100×)，占总体积1％NEAA(Non EssentialAmino Acid，100×)，1μg/mlheparin，占总体积1％penicillin-streptomycin(100×)。
步骤(3)VPA处理3D类脑，具体为：
(1)第11天，对照组使用NDM培养基培养3D脑，实验组加入含VPA的NDM培养基，所用的培养基最好是现配现用。
(3)在第16天收集样品，进行VPA对脑发育影响的鉴定；
(4)在第21天收集样品，进行VPA对脑发育影响的鉴定。
使用的VPA浓度为0.5mM和1.0m M。
所述的NDM培养的基础成分为体积比为DMEM/F12和Neuralbasal medium其体积比为1：1，另外需添加占总体积1％B27(50×)，占总体积0.5％N2(100×)，占总体积0.5％NEAA(100×)，占总体积1％GlutaMAX(100×)，占总体积1％penicillin-streptomycin(100×)，0.05mM beta-mercaptoethanol。
本发明一种hiPSCs来源的类自闭症模型的建立方法，其后续检测方法为：
(1)在显微镜下实时检测VPA对类脑器官的生长速度以及发育状态的影响；
(2)使用实时荧光定量PCR检测VPA处理类脑器官发育的影响；
(3)使用冷冻切片技术，将3D脑类器官经过固定，脱水、包埋之后，切成10-20um薄片的厚度，进行免疫荧光染色，在蛋白水平上检测，VPA对脑发育的影响。
(4)VPA对脑发育的长期影响。
本发明中的高通量微柱芯片不仅可以用于诱导类脑器官，还可用于诱导肝、肠等来器官。
本发明提供了一种hiPSCs来源的类自闭症模型的建立方法，还可以用于研究VPA对其他器官影响。该模型作为创新性的体外类器官发育模型，不仅有利于直接观察VPA对脑发育的影响，而且可以借助其他方法，例如实时荧光定量PCR以及免疫组化来探究VPA导致自闭症的致病机理。消除了使用动物模型的种属差异，以及2D细胞培养过于简化的缺点。
附图说明
图1高通量拟胚体形成的阵列微柱结构的PDMS聚合物芯片的俯视图和剖面图；
其中1是微柱结构，2是微柱间距，3是芯片外围坝结构，4是有四个微柱结构围成的脑组织形成区域；
图2为明场条件下对照组与处理组3D类脑器官发育情况的实时监测；
图3为免疫组化以及冷冻切片方法检测对照组与处理组3D脑发育在蛋白水平的变化；
图4用qRT-PCR方法在基因水平检测VPA对类脑神经元分化的影响。
图5用免疫荧光方法检测，去除药物之后，对照组与实验组神经元的生长情况。
具体实施方式
下面的实施案例是对本发明的进一步说明，但并不因此限制本发明。本发明所涉及的试剂均为市场购买。
实施例1
本发明提供了一种hiPSCs来源的类自闭症模型的建立方法，其步骤主要分为三部分：
(1)高通量微柱芯片的制备；
(2)在芯片上产生脑类器官；
(3)在诱导阶段初期VPA处理3D类脑；
微柱阵列芯片是由芯片外围坝结构和包围微柱结构形成可用于类器官的生长,微柱结构的直径为1000微米，高度为500微米，微柱间距为50微米，四个微柱结构围成的区域为类脑的形成区域。其具体结构示意图为图1。图1是具体实施例1中高通量拟胚体形成的阵列微柱结构的PDMS聚合物芯片的俯视图和剖面图；其中1是微柱结构，2是微柱间距，3是芯片外围坝结构，4是有四个微柱结构围成的脑组织形成区域；
步骤(1)高通量微柱阵列芯片的制备，具体为：
(1)使用软蚀刻技术制备SU-8模板，此模板为高通量凹陷小坑，之后对模板进行低粘附修饰，保证SU-8模板与PDMS聚合物容易分离；
(2)制作高通量阵列微柱结构的PDMS聚合物芯片：将PDMS与引发剂184按照体积比10～14：1混成均匀相，之后浇注到SU-8模板上，抽真空去除泡沫，置于80℃烘箱固化20-120分钟，常温将带有结构的PDMS芯片与SU-8模板分离，得到高通量的微柱阵列PDMS芯片；
(3)在PDMS芯片周边用相当大小的石英环将结构封闭，放于80℃烘箱内加热至凝固，得到微阵列芯片。
步骤(2)在芯片上诱导3D类脑；具体为：
(1)使用高通量的小坑芯片产生拟胚体：坑状结构置于24孔板中，小坑芯片结构直径为600-800微米，深度为100-300微米，用于制备拟胚体的形成；
(2)制备拟胚体阶段，将融合度为70％-80％的hiPSCs消化成单细胞，一个六孔板里面加1.5ml含有ROCK inhibitor Y27632的mTeSR1培养基，之后置于24孔板中用于拟胚体的形成；
所述的mTeSR1培养基由400ml mTeSR1TM Basal medium以及100ml5XSupplement以及1ml 500X Getamicin/Amphotericin B以及1ml 10X Plasmocin TMprophylactic构成；
所述的ROCK inhibitor Y27632的母液浓度为30mM。
所述的ROCK inhibitor Y27632的母液与mTeSR1培养基的体积比为1：5000；
(3)将形成的拟胚体转移至高通量微柱芯片，并加含有ROCK inhibitor Y27632以及Dorsomorphine、A83-01的KSR培养基培养3天，3天之后加入含有bFGF以及Dorsomorphine、A83-01的KSR培养基；
所述KSR培养基的基础成分为DMEM/F12，另外需添加占总体积20％的KnockOutReplacement(KSR)，占总体积1％NEAA(Non Essential Amino Acid，100×)，占总体积1％GlutaMax(100×)，占总体积1％penicillin-streptomROCK inhibitorycin(100×)，以及0.1mM beta-mercaptoethanol，4ng/ml bFGF。
所述的Dorsomorphine为是一种MAPK信号通路抑制剂，可以抑制BMP4激活的SMAD信号通路。使用将其配置成浓度为10mM的母液；
所述的A83-01有效地抑制TGF-β诱导的生长抑制作用，抑制SMAD信号通路。将其配置成浓度为10mM的母液。
所述ROCK inhibitor Y27632的母液与KSR培养基的体积比为1:2000。
所述的Dorsomorphine的母液：A83-01的母液与KSR的体积比为1：1:4000。
所述bFGF为一种生长因子，将其配置成浓度100ug/ml的母液：
所述含有bFGF的KSR培养基中bFGF的母液的体积与KSR培养基的体积比为：1:25000。
(4)到第6天时换成含有bFGF的NIM培养基，3天后换成不含bFGF的NIM培养基，加两天；
所述NIM培养基的基础成分为DMEM/F12，另外需添加占总体积1％N2(100×)，占总体积1％GlutaMAX(100×)，占总体积1％NEAA(Non EssentialAmino Acid，100×)，1μg/mlheparin，占总体积1％penicillin-streptomycin(100×)。
所述bFGF为一种生长因子，将其配置成浓度100ug/ml的母液：
所述含有bFGF的NIM培养基中bFGF的母液的体积与NIM培养基的体积比为：1:25000。
步骤(3)VPA处理3D类脑，具体为：
(1)第11天，对照组使用NDM培养基培养3D脑，对照组加入含VPA浓度的NDM培养基，所用的培养基最好是现配现用。
(3)在第16天收集样品，进行VPA对脑发育影响的鉴定；
(4)在第21天收集样品，进行VPA对脑发育影响的鉴定。
使用的VPA浓度为0.5mM和1.0m M。
所述的NDM培养的基础成分为体积比为DMEM/F12和Neuralbasal medium其体积比为1：1，另外需添加占总体积1％B27(50×)，占总体积0.5％N2(100×)，占总体积0.5％NEAA(100×)，占总体积1％GlutaMAX(100×)，占总体积1％penicillin-streptomycin(100×)，0.05mM beta-mercaptoethanol。
明场跟踪样品组和对照组3D类脑器官的发育状况，结果如图2所示。
实施例2
本发明提供了一种hiPSCs来源的类自闭症模型的建立方法，其步骤主要分为三部分：
(2)高通量微柱芯片的制备；
(2)在芯片上产生脑类器官；
(3)在诱导阶段初期VPA处理3D类脑；
微柱阵列芯片是由芯片外围坝结构和包围微柱结构形成可用于类器官的生长,微柱结构的直径为1000微米，高度为800微米，微柱间距为50微米，四个微柱结构围成的区域为类脑的形成区域。
步骤(1)高通量微柱阵列芯片的制备，具体为：
(1)使用软蚀刻技术制备SU-8模板，此模板为高通量凹陷小坑，之后对模板进行低粘附修饰，保证SU-8模板与PDMS聚合物容易分离；
(2)制作高通量阵列微柱结构的PDMS聚合物芯片：将PDMS与引发剂184按照体积比10～14：1混成均匀相，之后浇注到SU-8模板上，抽真空去除泡沫，置于80℃烘箱固化20-120分钟，常温将带有结构的PDMS芯片与SU-8模板分离，得到高通量的微柱阵列PDMS芯片；
(3)在PDMS芯片周边用相当大小的石英环将结构封闭，放于80℃烘箱内加热至凝固，得到微阵列芯片。
步骤(2)在芯片上诱导3D类脑；具体为：
(1)使用高通量的小坑芯片产生拟胚体：坑状结构置于24孔板中，小坑芯片结构直径为600-800微米，深度为100-300微米，用于制备拟胚体的形成；
(2)制备拟胚体阶段，将融合度为70％-80％的hiPSCs消化成单细胞，一个六孔板里面加1.5ml含有ROCK inhibitor Y27632的mTeSR1培养基，之后置于24孔板中用于拟胚体的形成；
所述的mTeSR1培养基由400ml mTeSR1TM Basal medium以及100ml5XSupplement以及1ml 500X Getamicin/Amphotericin B以及1ml 10X Plasmocin TMprophylactic构成；
所述的ROCK inhibitor Y27632的母液浓度为30mM。
所述的ROCK inhibitor Y27632的母液与mTeSR1培养基的体积比为1：5000；
(3)将形成的拟胚体转移至高通量微柱芯片，并加含有ROCK inhibitor Y27632以及Dorsomorphine、A83-01的KSR培养基培养3天，3天之后加入含有bFGF以及Dorsomorphine、A83-01的KSR培养基；
所述KSR培养基的基础成分为DMEM/F12，另外需添加占总体积20％的KnockOutReplacement(KSR)，占总体积1％NEAA(Non Essential Amino Acid，100×)，占总体积1％GlutaMax(100×)，占总体积1％penicillin-streptomROCK inhibitor ycin(100×)，以及0.1mM beta-mercaptoethanol，4ng/ml bFGF。
所述的Dorsomorphine为是一种MAPK信号通路抑制剂，可以抑制BMP4激活的SMAD信号通路。使用将其配置成浓度为10mM的母液；
所述的A83-01有效地抑制TGF-β诱导的生长抑制作用，抑制SMAD信号通路。将其配置成浓度为10mM的母液。
所述ROCK inhibitor Y27632的母液与KSR培养基的体积比为1:2000；
所述的Dorsomorphine的母液：A83-01的母液与KSR的体积比为1：1:4000；
所述bFGF为一种生长因子，将其配置成浓度100ug/ml的母液：
所述含有bFGF的KSR培养基中bFGF的母液的体积与KSR培养基的体积比为：1:25000。
(4)到第6天时换成含有bFGF的NIM培养基，3天后换成不含bFGF的NIM培养基，加两天；
所述NIM培养基的基础成分为DMEM/F12，另外需添加占总体积1％N2(100×)，占总体积1％GlutaMAX(100×)，占总体积1％NEAA(Non EssentialAmino Acid，100×)，1μg/mlheparin，占总体积1％penicillin-streptomycin(100×)。
所述bFGF为一种生长因子，将其配置成浓度100ug/ml的母液：
所述含有bFGF的NIM培养基中bFGF的母液的体积与NIM培养基的体积比为：1:25000。
步骤(3)VPA处理3D类脑，具体为：
(1)第11天，对照组使用NDM培养基培养3D脑，对照组加入含VPA NDM培养基，所用的培养基最好是现配现用。
(3)在第16天收集样品，进行VPA对脑发育影响的鉴定；
(4)在第21天收集样品，进行VPA对脑发育影响的鉴定。
使用的VPA浓度为0.5mM和1.0m M。
所述的NDM培养的基础成分为体积比为DMEM/F12和Neuralbasal medium其体积比为1：1，另外需添加占总体积1％B27(50×)，占总体积0.5％N2(100×)，占总体积0.5％NEAA(100×)，占总体积1％GlutaMAX(100×)，占总体积1％penicillin-streptomycin(100×)，0.05mM beta-mercaptoethanol。
实施例3
本发明提供了一种hiPSCs来源的类自闭症模型的建立方法，其步骤主要分为三部分：
(3)高通量微柱芯片的制备；
(2)在芯片上产生脑类器官；
(3)在诱导阶段初期VPA处理3D类脑；
微柱阵列芯片是由芯片外围坝结构和包围微柱结构形成可用于类器官的生长,微柱结构的直径为1000微米，高度为800微米，微柱间距为50微米，四个微柱结构围成的区域为类脑的形成区域。
其制作步骤如下：
步骤(1)高通量微柱阵列芯片的制备，具体为：
(1)使用软蚀刻技术制备SU-8模板，此模板为高通量凹陷小坑，之后对模板进行低粘附修饰，保证SU-8模板与PDMS聚合物容易分离；
(2)制作高通量阵列微柱结构的PDMS聚合物芯片：将PDMS与引发剂184按照体积比10～14：1混成均匀相，之后浇注到SU-8模板上，抽真空去除泡沫，置于80℃烘箱固化20-120分钟，常温将带有结构的PDMS芯片与SU-8模板分离，得到高通量的微柱阵列PDMS芯片；
(3)在PDMS芯片周边用相当大小的石英环将结构封闭，放于80℃烘箱内加热至凝固，得到微阵列芯片。
步骤(2)在芯片上诱导3D类脑；具体为：
(1)使用高通量的小坑芯片产生拟胚体：坑状结构置于24孔板中，小坑芯片结构直径为600-800微米，深度为100-300微米，用于制备拟胚体的形成；
(2)制备拟胚体阶段，将融合度为70％-80％的hiPSCs消化成单细胞，一个六孔板里面加1.5ml含有ROCK inhibitor Y27632的mTeSR1培养基，之后置于24孔板中用于拟胚体的形成；
所述的mTeSR1培养基由400ml mTeSR1TM Basal medium以及100ml5XSupplement以及1ml 500X Getamicin/Amphotericin B以及1ml 10X Plasmocin TMprophylactic构成；
所述的ROCK inhibitor Y27632的母液浓度为30mM。
所述的ROCK inhibitor Y27632的母液与mTeSR1培养基的体积比为1：5000；
(3)将形成的拟胚体转移至高通量微柱芯片，并加含有ROCK inhibitor Y27632以及Dorsomorphine、A83-01的KSR培养基培养3天，3天之后加入含有bFGF以及Dorsomorphine、A83-01的KSR培养基；
所述KSR培养基的基础成分为DMEM/F12，另外需添加占总体积20％的KnockOutReplacement(KSR)，占总体积1％NEAA(Non Essential Amino Acid，100×)，占总体积1％GlutaMax(100×)，占总体积1％penicillin-streptomROCK inhibitor ycin(100×)，以及0.1mM beta-mercaptoethanol，4ng/ml bFGF。
所述的Dorsomorphine为是一种MAPK信号通路抑制剂，可以抑制BMP4激活的SMAD信号通路。使用将其配置成浓度为10mM的母液；
所述的A83-01有效地抑制TGF-β诱导的生长抑制作用，抑制SMAD信号通路。将其配置成浓度为10mM的母液。
所述ROCK inhibitor Y27632的母液与KSR培养基的体积比为1:2000.
所述的Dorsomorphine的母液：A83-01的母液与KSR的体积比为1：1:4000.
所述bFGF为一种生长因子，将其配置成浓度100ug/ml的母液：
所述含有bFGF的KSR培养基中bFGF的母液的体积与KSR培养基的体积比为：1:25000。
(4)到第6天时换成含有bFGF的NIM培养基，3天后换成不含bFGF的NIM培养基，加两天；
所述NIM培养基的基础成分为DMEM/F12，另外需添加占总体积1％N2(100×)，占总体积1％GlutaMAX(100×)，占总体积1％NEAA(Non EssentialAmino Acid，100×)，1μg/mlheparin，占总体积1％penicillin-streptomycin(100×)。
所述bFGF为一种生长因子，将其配置成浓度100ug/ml的母液：
所述含有bFGF的NIM培养基中bFGF的母液的体积与NIM培养基的体积比为：1:25000。
步骤(3)VPA处理3D类脑，具体为：
(1)第11天，对照组使用NDM培养基培养3D脑，对照组加入含VPA的NDM培养基，所用的培养基最好是现配现用。
(3)在第16天收集样品，进行VPA对脑发育影响的鉴定；
(4)在第21天收集样品，进行VPA对脑发育影响的鉴定。
使用的VPA浓度为0.5mM和1.0m M。
所述的NDM培养的基础成分为体积比为DMEM/F12和Neuralbasal medium其体积比为1：1，另外需添加占总体积1％B27(50×)，占总体积0.5％N2(100×)，占总体积0.5％NEAA(100×)，占总体积1％GlutaMAX(100×)，占总体积1％penicillin-streptomycin(100×)，0.05mM beta-mercaptoethanol。
实施例4
RT-PCR方法检测对照组和样品组脑发育相关基因表达情况
收集实施例1中发育16、21天的3D类脑，PBS缓冲液清洗3次，并离心。使用Trizol法提取全RNA，方法如下：加入1ml Trizol重悬细胞，上下吹打直至无细胞块，整个溶液澄清；加入200μl氯仿，在涡旋器上震荡均匀，室温放置3min,待分层，4度离心12000g离心15min,溶液出现分层，取上层液体至新的EP管中，整个过程小心操作尽量避免接触中间层白色沉淀；在吸取液中加入等量异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃静置过夜，利于RNA析出；12000rpm离心10min；保留管底部的白色RNA沉淀，小心去上清；75％乙醇清洗白色沉淀，12000rpm离心5min；尽可能去除75％乙醇，室温让其挥发5min，以免乙醇污染样品，影响后续实验；DEPC水溶解RNA沉淀；测RNA浓度和纯度，并进行相应的稀释，终浓度为69ng/ul。
第二步，使用相应的反转录试剂盒，将mRNA反转录为cDNA，体系为25ul。
第三步，Real-time PCR，按照试剂盒要求配体溶液，终体系为5ul，退火温度Tm统一为58℃。
最后统计对照组和样品组脑发育相关基因的表达，结果如图3所示。TUB是神经元的标记基因。
实施例5
免疫组化方法检测对照组和样品组3D脑发育情况。
收集实施例1第16和21天的3D脑进行冷冻切片，方法如下：4％多聚甲醛进行4度过夜固定，PBS缓冲液冲洗三次，每次10min；30％蔗糖4℃过夜脱水；OCT包埋，室温存放30min，80℃凝固；冷冻切片，厚度为10-20μm，并将其贴附在静电吸附的载玻片上。然后进行免疫荧光染色，方法为：将带有切片的载玻片置于PBS缓冲液中浸泡5min；0.1％tritonX-100破膜5min，PBS缓冲液冲洗1次，5min；山羊封闭血清室温作用1h，一抗(TUJ1(1:300)，SOX2/NESTIN(1:400)1:400稀释，4℃过夜孵育，PBS缓冲液冲洗1次，5min；二抗(Fluorescence488/594标记的山羊抗兔或鼠IgG)1:100稀释，常温孵育1h，PBS缓冲液冲洗1次，5min；冲洗完毕后加入1:2000稀释的DAPI工作液，荧光显微镜下拍照，记录TUJ1和SOX2/NESTIN的表达情况，结果如图3所示。TUJ1神经元的标记蛋白，
结果如图4所示。样品组中神经元(TUJ1)显高于对照组，证明VPA处理促进3D脑的神经分化。
实施例6
使用免疫荧光的方法检测去除药物后，对照与样品组观察药物对神经元发育的长期影响。如图5，TUJ1是神经元的标记蛋白。

Claims (7)

1.一种hiPSCs来源的类自闭症模型的建立方法，其特征在于该方法主要步骤分为：
(1)微柱阵列芯片的制备；
(2)在芯片上诱导类脑；
(3)在诱导阶段初期VPA处理3D类脑。
2.按照权利要求1所述一种hiPSCs来源的类自闭症模型的建立方法，其特征在于：所述微柱阵列芯片是由芯片外围坝结构包围微柱结构形成；用于类器官的生长,微柱结构的直径为500-1000微米，高度为500-100微米，微柱间距为50-100微米，四个微柱结构围成的区域为类脑的形成区域。
3.按照权利要求1所述一种hiPSCs来源的类自闭症模型的建立方法，其特征在于：步骤(1)高通量微柱阵列芯片的制备，具体为步骤为：
(1)使用软蚀刻技术制备SU-8模板，此模板为高通量凹陷小坑，之后对模板进行低粘附修饰，保证SU-8模板与PDMS聚合物容易分离；
(2)制作高通量阵列微柱结构的PDMS聚合物芯片：将PDMS与引发剂184按照体积比10～14：1混成均匀相，之后浇注到SU-8模板上，抽真空去除泡沫，置于80℃烘箱固化20-120分钟，常温将带有结构的PDMS芯片与SU-8模板分离，得到高通量的微柱阵列PDMS芯片；
(3)在PDMS芯片周边用相当大小的石英环将结构封闭，放于80℃烘箱内加热至凝固，得到微阵列芯片。
4.按照权利要求1所述一种hiPSCs来源的类自闭症模型的建立方法，其特征在于：微柱阵列芯片必须无菌，需要将制备好的芯片放于高温灭菌锅灭菌待用。
5.按照权利要求1所述一种hiPSCs来源的类自闭症模型的建立方法，其特征在于：步骤(2)在芯片上诱导3D类脑，具体为：
(1)使用高通量的小坑芯片产生拟胚体：坑状结构置于24孔板中，小坑芯片结构直径为600-800微米，深度为100-300微米，用于制备拟胚体的形成；
(2)制备拟胚体阶段，将融合度为70％-80％的hiPSCs消化成单细胞，一个六孔板里面加1.5ml含有ROCK inhibitor Y27632的mTeSR1培养基，之后置于24孔板中用于拟胚体的形成；
所述含有ROCK inhibitor Y27632的mTeSR1培养基中：ROCK inhibitor Y27632的母液与mTeSR1培养基的体积比为1：5000；
所述的ROCK inhibitor Y27632在母液中的浓度为30mM；
(3)将形成的拟胚体转移至高通量微柱芯片，并加含有ROCK inhibitor Y27632以及Dorsomorphine、A83-01的KSR培养基培养3天，3天之后加入含有bFGF以及Dorsomorphine、A83-01的KSR培养基；
所述含有ROCK inhibitor Y27632以及Dorsomorphine、A83-01的KSR培养基培中：ROCKinhibitor Y27632的母液与KSR培养基的体积比为1:2000；Dorsomorphine的母液与KSR的体积比为1:4000；A83-01的母液与KSR的体积比为1:4000；
所述含有bFGF以及Dorsomorphine、A83-01的KSR培养基中：bFGF的母液与KSR培养基的体积比为1:25000，Dorsomorphine的母液与KSR的体积比为1:4000；A83-01的母液与KSR的体积比为1:4000；
所述ROCK inhibitor Y27632在母液中的浓度为30mM；
所述Dorsomorphine在母液中的浓度为10mM；
所述A83-01在母液中的浓度为10mM；
所述bFGF在母液中的浓度为100ug/ml；
(4)到第6天时换成含有bFGF的NIM培养基，3天后换成不含bFGF的NIM培养基，加两天；所述含有bFGF的NIM培养基中：bFGF的母液的体积与NIM培养基的体积比为：1:25000；
所述bFGF在母液中的浓度为100ug/ml。
6.按照权利要求1所述一种hiPSCs来源的类自闭症模型的建立方法，其特征在于步骤(3)VPA处理3D类脑，具体为：
(1)第11天，对照组使用NDM培养基培养3D脑，实验组加入含VPA的NDM培养基，所用的培养基最好是现配现用。
(3)在第16天收集样品，进行VPA对脑发育影响的鉴定；
(4)在第21天收集样品，进行VPA对脑发育影响的鉴定。
7.按照权利要求6所要求所述一种hiPSCs来源的类自闭症模型的建立方法，其特征在于使用的VPA浓度为0.5mM或1.0mM。
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