CN111254078B - 体外培养肝细胞用蜂窝载板及人工肝用生物反应器 - Google Patents

Abstract

本申请实施例公开了一种体外培养肝细胞用蜂窝载板及人工肝用生物反应器，用于解决生物人工肝中体外肝细胞成团生长空间不足以及物质交换效率低的问题。本申请实施例提供的体外培养肝细胞用蜂窝载板，蜂窝载板上的蜂窝孔分为第一蜂窝孔和第二蜂窝孔，第一蜂窝孔顶端开口，底端封闭，用于容置肝细胞，第二蜂窝孔顶端封闭或开口，底端开口，每个蜂窝孔的各个蜂窝壁上均设有孔径小于肝细胞直径的第一通孔，第一蜂窝孔和第二蜂窝孔的封闭端上均设有孔径小于肝细胞直径的第二通孔，每个第二蜂窝孔均与相邻的六个第一蜂窝孔共边设置，每个第一蜂窝孔均与相邻且交替分布的三个第一蜂窝孔和三个第二蜂窝孔共边设置。通过逐层纵向叠加蜂窝载板及透气中空纤维膜管，构成生物反应器内部结构。

Description

体外培养肝细胞用蜂窝载板及人工肝用生物反应器

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种体外培养肝细胞用蜂窝载板及人工肝用生物反应器。

背景技术

人工肝支持系统是肝衰竭患者的有效治疗手段，目前分为非生物型人工肝和生物型人工肝两大类。非生物型人工肝是目前临床广泛应用的人工肝类型，它能暂时代偿肝脏的解毒作用，但不能完全替代肝脏的合成、代谢功能以及生物转化功能，而基于体外肝细胞源和生物反应器的生物型人工肝理论上更接近人体肝脏生理功能，是目前主要的国际发展方向。生物反应器是生物型人工肝治疗的核心装置，既为外源性肝细胞和患者血液或血浆提供物质交换的场所，又为肝细胞提供适宜的生长环境。理想的生物人工肝反应器应当符合以下要求：1、能为体外肝细胞生长提供充足空间，在有限的空间内至少容纳正常肝脏10%的细胞数（约10¹⁰-10¹¹个）；2、良好的生物相容性，能保证肝细胞的活性和功能；3、能保证细胞和培养介质间物质双向传输。

迄今生物反应器主要有四种类型:中空纤维型、平板单层培养型、灌流床式/支架型和细胞包裹/悬浮型。其中，平板单层培养型效率低下目前已极少使用。中空纤维生物反应器是研究最多生物反应器，它兼具免疫隔离和氧合的功效，细胞受剪切力小，但其存在细胞分布不均匀，细胞粘附率低及活性差，半透膜阻塞等缺点。细胞包裹/悬浮型反应器在多型人工肝系统中均有采用，其使用海藻酸钠制备微囊或直接进行肝细胞3维培养，但包裹的肝细胞物质交换受影响，悬浮细胞的稳定性不佳，且细胞密度难以达到有效替代肝脏功能的所需细胞总量。灌流床式/支架型反应器，它具有能为肝细胞提供三维培养环境，容易放大，物质交换良好的优点，但因支架内部孔隙多是不规则不均匀的，易产生灌流不均，支架整体的中心及边缘地带易产生无效腔、死腔，且液体通过支架结构的阻力大，所需的灌流压力大，致细胞受剪切力大。

专利CN101549181公开了一种纳米纤维网片叠加式生物反应器，但因为纤维网片载体仅能展开为一个二维空间，肝细胞将沿网片表面贴壁生长，难以展开三维结构，此外，细胞易粘附于中空纤维网片上，而堵塞中空纤维孔，影响氧气交换，同时血浆由竖向分布的中空纤维进出，无跨膜压力差，培养液或血浆中各种物质仅能通过膜孔自由扩散至膜外与间隙中纳米纤维网片上的肝细胞进行物质交换，受大分子物资自由扩散速度慢影响，系统的交换效率较低。

专利CN 101549179公开了一种人工肝用多孔砖式填充支架型反应器，其能为肝细胞生长提供疏松多孔的三维环境，但其存在如下缺陷：1.多孔砖设计空隙分布不均匀，空间利用率低；2.反应器中需设置固定床以提供支撑，进一步浪费空间；3.细胞生长孔内肝细胞因被较厚的砖体包裹，与周围液体接触面少，难以有效保证物质交换效率；4.反应器氧合器置于血浆入口处，而血浆溶氧能力差，很难保证远端肝细胞氧供充足，故难以放大。

专利CN2016106077862公开了一种毛绒线式生物人工肝反应器，显著增加了肝细胞在反应器内的可贴壁面积。但该专利本质上是一种中空纤维型生物反应器，虽在中空纤维的腔外增加了毛绒线式结构，以显著增加细胞附着空间，但该设计仍不能避免细胞生贴附于中空纤维管壁生长而堵塞其膜孔，影响通过膜孔的物质交换。另外该反应器仍是为肝细胞贴壁生长而设计，目前认为肝细胞呈微球或成小团三维生长功能上更强大。最后该反应器同样存在培养液或血浆由中空纤维进出，无跨膜流动的压力驱动，仅靠自由扩散导致物质交换效率较低的缺陷。

专利CN201620815043X在毛绒线式生物人工肝反应器基础上设计了一种三合一毛绒线式人工肝生物反应器，其血液经血浆分离器后分离出血浆再依次进入氧合器和反应器的设计，同样存在因血浆本身液体溶氧能力差，很难保证反应器远端肝细胞氧供充足，反应器难以放大的缺点。

综上，现有人工肝用肝细胞载体不能为微球样成团生长的肝细胞或海藻酸-壳聚糖包裹的肝细胞球提供合适的三维生长空间，同时物质交换效率不高。

发明内容

本申请实施例提供一种体外培养肝细胞用蜂窝载板及人工肝用生物反应器，用于解决生物人工肝中体外肝细胞成团生长空间不足以及物质交换效率低的问题。

为此，本申请实施例一方面提供一种体外培养肝细胞用蜂窝载板，所述蜂窝载板上的蜂窝孔分为第一蜂窝孔和第二蜂窝孔；其中，

所述第一蜂窝孔顶端开口，底端封闭，用于容置肝细胞；

所述第二蜂窝孔顶端封闭，底端开口，用于液体通过，且为第一蜂窝孔内的肝细胞提供物质交换的场所；

每个蜂窝孔的各个蜂窝壁上均设有第一通孔；

所述第一蜂窝孔和第二蜂窝孔的封闭端上均设有第二通孔；

所述第一通孔和第二通孔的孔径均小于所述肝细胞的直径；

每个所述第二蜂窝孔均与相邻的六个所述第一蜂窝孔共边设置；

每个所述第一蜂窝孔均与相邻且交替分布的三个所述第一蜂窝孔和三个所述第二蜂窝孔共边设置。

当然在实际应用中，所述第二蜂窝孔也可以两端直接敞开设置。

在本申请实施例中，在细胞悬液灌流时，肝细胞从两层肝细胞蜂窝载板中间流过，肝细胞向下沉降至开口朝上的第一蜂窝孔内，而落在反向开口的第二蜂窝孔上的肝细胞因不能受到腔体的保护，在液体流动过程中会继续向前，直至落入下一个开口朝上的第一蜂窝孔内（对于两端直接敞开设计的第二蜂窝孔，肝细胞也可以穿过该孔，落至下一层的第一蜂窝孔内），最终上开口的第一蜂窝孔填充满肝细胞，而反向开口的第二蜂窝孔内无肝细胞填充，用以方便液体通过，且为第一蜂窝孔内的肝细胞提供物质交换的场所。

在本申请实施例中，因蜂窝结构具有生物表面积大，空间利用率高的特点，因此能为微球样肝细胞团提供充足的生长空间，更能促进肝细胞的生长和繁殖，同时每个第一蜂窝孔的六个侧壁有三面与第二蜂窝孔共边，使得第一蜂窝孔内的肝细胞一直浸泡于培养液或血浆之中，既有利于恢复肝细胞极性，又为物质交换提供便利。

在一些实施方式中，所述蜂窝壁的壁厚控制在50um-100um，所述第一通孔和第二通孔的孔径大于等于300nm，这是因为上述尺寸的微孔血浆中蛋白成分能自由通过，但肝细胞大小是数十微米级的，都难以通过第一、第二通孔，只会陷在蜂巢开口朝上的蜂窝孔里，也即第一蜂窝孔中。

在一些实施方式中，所述蜂窝载板采用生物相容性好的聚丙烯或聚乙烯乙烯醇制作。具体的，上述蜂窝载板可通过3D打印模型框架后使用具有一定弹性的聚丙烯膜或聚乙烯进行制备，载板上的第一通孔和第二通孔可以在蜂窝载板成型后采用激光打孔制备，当然，也可以预先在化学制造工艺上进行设计，使得聚丙烯或聚乙烯乙烯醇成膜状并于膜上形成疏松孔，这样就省去了后续激光开孔的步骤，制作也相对简单。

优选的，在实际应用中，聚丙烯膜或聚乙烯多孔膜的微孔直径可以做1um级或更大。这是因为，一般人体血液中最大的蛋白成分300nm的孔径就能完全通过，而肝细胞直径一般20-30um，这样的孔径设置工艺难度不大，而且对液体流动阻力更小，层层叠加也不至于液体流动压力过高。

在一些实施方式中，所述第一通孔在所述蜂窝壁上均匀分布；所述第二通孔在所述封闭端上均匀分布。

具体的，为满足仿生结构设计的要求，所述蜂窝孔的孔径大小控制在0.8-1.2mm，高度控制在1-2mm，这是因为上述尺寸的蜂窝孔与正常肝脏肝小叶大小相近。

本申请实施例另一方面提供一种人工肝用人工肝用生物反应器，包括反应器外壳和上述实施例的蜂窝载板；

若干所述蜂窝载板纵向间隔叠加设置在所述反应器外壳中；

任意相邻的两所述蜂窝载板之间均形成有细胞悬液灌流通道；

所述细胞悬液灌流通道中设有透气中空纤维膜管；

所述反应器外壳的顶端和底端分别设有与其内腔连通的液体入口和液体出口；

所述反应器外壳的侧壁对向设有气体入口和气体出口，所述透气中空纤维膜管的两端分别与所述气体入口和气体出口连通；

所述反应器外壳的侧壁上还设有与所述细胞悬液灌流通道连通的细胞悬液入口和细胞悬液出口。

在本申请实施例中，蜂窝载板能为微球样肝细胞团提供充足的生长空间，而且蜂窝载板蜂窝孔能为内部的肝细胞提供保护，减轻流体剪切力对细胞的冲击及损害，促进肝细胞球形体的生成，更有利于高密度、高活性肝细胞的获得和长久培养。此外，因每个第一蜂窝孔的六个侧壁有三面贴近第二蜂窝孔内的培养液或血浆，既有利于恢复肝细胞极性，有为物质交换提供便利。透气中空纤维膜管置于蜂窝载板底面，具有氧气交换功能，保证了反应器中组织液或血浆中溶氧充足，为其上方蜂窝孔内的肝细胞提供充分的氧气供应。

在一些实施方式中，所述液体入口与最顶端的所述蜂窝载板之间以及所述液体出口与所述最底端的蜂窝载板之间均设有细胞滤网。

在一些实施方式中，所述蜂窝载板通过水平并排间隔设置的多根所述透气中空纤维膜管支撑设置于所述反应器外壳中。

在本申请实施例中，透气中空纤维膜管置于蜂窝载板底面，既为蜂窝载板提供三维支撑，又因其兼具氧气交换功能，保证了反应器中组织液或血浆中溶氧充足。此外，蜂窝载板与透气中空纤维膜管层层叠加交替设置，空间利用率高，液体冲击压力逐层分散，机械强度大，反应器兼具氧合、三维立体培养、高效率物质交换等功能。

在一些实施方式中，所述细胞悬液入口与细胞悬液出口在所述反应器外壳上相对设置，且所述细胞悬液入口靠近所述反应器外壳的顶部设置，所述细胞悬液出口靠近所述反应器外壳的底部设置。这样的设计能保证在细胞悬液灌流时细胞从上至下逐层填充蜂窝载板。

在一些实施方式中，反应器外壳采用生物相容性较好的透明的聚碳酸酯树脂或聚丙烯或聚乙烯制成，其生物相容性好，并且可以方便的观察反应器内情况。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的蜂窝载板主视图；

图2是本发明实施例提供的蜂窝载板蜂窝孔示意图；

图3是本发明实施例提供的蜂窝载板俯视图；

图4是本发明实施例提供的人工肝用生物反应器的结构示意图；

图5是本发明实施例提供的生物反应器中蜂窝载板与透气中空纤维膜管布置示意图；

图6为本发明实施例提供的生物型人工肝支持系统结构示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本申请实施例提供一种体外培养肝细胞用蜂窝载板及人工肝用生物反应器，用于解决肝细胞成团生长空间不足以及物质交换效率低的问题。

参见图1-图3，本申请实施例提供的体外培养肝细胞用蜂窝载板，该蜂窝载板1上的蜂窝孔依据开口的情况分为两类，为方便说明取名为第一蜂窝孔101和第二蜂窝孔102。其中，第一蜂窝孔101为顶端开口，底端封闭的蜂窝孔，用于容置肝细胞；第二蜂窝孔102为顶端封闭，底端开口的蜂窝孔，用于液体通过，且为第一蜂窝孔101内的肝细胞提供物质交换的场所。这里需要解释说明的是，上述肝细胞可以为微球样成团生长的肝细胞或海藻酸-壳聚糖包裹的肝细胞球，当然，也可以为其他结构形态的肝细胞。

参见图2和图3，具体的，每个蜂窝孔的各个蜂窝壁上均设有孔径小于肝细胞直径的第一通孔（图中未示出），第一蜂窝孔101和第二蜂窝孔102的封闭端上均设有孔径小于肝细胞直径的第二通孔（图中未示出），每个第二蜂窝孔102均与相邻的六个第一蜂窝孔101共边设置，每个第一蜂窝孔101均与相邻且交替分布的三个第一蜂窝孔101和三个第二蜂窝孔102共边设置。第一蜂窝孔101内的肝细胞通过第一通孔与周围6个第二蜂窝孔102内的液体进行物质交换。需要解释的，第二蜂窝孔102顶端也可以直接敞开设置。

在本申请实施例中，在细胞悬液灌流时，肝细胞从两层肝细胞蜂窝载板中间流过，肝细胞向下沉降至开口朝上的第一蜂窝孔101内，而落在反向开口的第二蜂窝孔102上的肝细胞因不能受到腔体的保护，在液体流动过程中会继续向前，直至落入下一个开口朝上的第一蜂窝孔101内。最终上开口的第一蜂窝孔101填充满肝细胞，而反向开口的第二蜂窝孔102内无肝细胞填充，用以方便液体通过，且为第一蜂窝孔101内的肝细胞提供物质交换的场所。当然在实际应用中，第二蜂窝孔102也可以两端直接敞开设置，此外，上下两层蜂窝载板上的第二蜂窝孔102优先错开设置。

在本申请实施例中，蜂窝载板具有受力分散，机械强度高，抗压性强，不易被破坏的优点，同时因蜂窝结构具有生物表面积大，空间利用率高的特点，因此能为微球样肝细胞团提供充足的生长空间，更能促进肝细胞的生长和繁殖，此外每个第一蜂窝孔101的六个侧壁有三面与第二蜂窝孔102共边，使得第一蜂窝孔101内的肝细胞一直浸泡于组织液或血浆之中，既有利于恢复肝细胞极性，又为物质交换提供便利。

参见图1和图2，在一些实施例中，本申请实施例蜂窝载板上的第一通孔和第二通孔的孔径大于等于300nm，所述蜂窝壁的壁厚控制在50um-100um，这是因为上述尺寸的微型通孔和血浆分离器18的膜孔差不多，血浆都能自由通过，但肝细胞大小是10几个um级的，都穿不过去，只会陷在蜂巢开口朝上的蜂窝孔里，也即第一蜂窝孔101中。此外，为保障物质传输的均匀性，第一通孔在蜂窝壁上均匀分布，第二通孔在封闭端上均匀分布。

在实际设计中，蜂窝载板一般采用生物相容性好的聚丙烯或聚乙烯乙烯醇制作。具体的，上述蜂窝载板由亲水的聚丙烯膜或聚乙烯乙烯醇膜构成，所需蜂窝结构可通过3D打印模型框架后使用具有一定弹性的聚丙烯膜或聚乙烯制备，板上的第一通孔和第二通孔采用激光打孔制备。当然，也可以预先在化学制造工艺上进行设计，使得聚丙烯或聚乙烯乙烯醇成膜状并于膜上形成疏松孔，这样就省去了后续激光开孔的步骤，制作也相对简单些。

优选的，在实际应用中，第一、第二通孔的直径可以做成1um级或更大。这是因为，一般人体血液中最大的蛋白成分300nm的孔径就能完全通过，而肝细胞直径一般20-30um，这样的孔径设置工艺难度不大，而且对液体流动阻力更小，层层叠加也不至于液体流动压力过高。

具体的，为满足仿生结构设计的要求，所述蜂窝孔的孔径大小控制在0.8-1.2mm，高度控制在1-2mm，这是因为上述尺寸的蜂窝孔与正常肝脏肝小叶大小相近。

参见图4和图5，本申请实施例另一方面提供的人工肝用生物反应器，包括反应器外壳2和蜂窝载板1，若干蜂窝载板1纵向间隔叠加设置在该反应器外壳2中，任意相邻的两蜂窝载板1之间均形成有细胞悬液灌流通道3，在细胞悬液灌流通道3内设有透气中空纤维膜管4，反应器外壳2的顶端和底端分别设有与其内腔连通的液体入口5和液体出口6，反应器外壳2的侧壁对向设有气体入口7和气体出口8，透气中空纤维膜管4的两端分别与气体入口7和气体出口8连通，反应器外壳2的侧壁上还设有与细胞悬液灌流通道3连通的细胞悬液入口9和细胞悬液出口10。

具体的，该蜂窝载板1上的蜂窝孔依据开口的情况分为两类，为方面说明取名为第一蜂窝孔101和第二蜂窝孔102；其中，第一蜂窝孔101顶端开口，底端封闭，用于容置肝细胞；第二蜂窝孔102顶端封闭，底端开口，用于液体通过，且为第一蜂窝孔101内的肝细胞提供物质交换的场所。

每个蜂窝孔的各个蜂窝壁上均设有孔径小于肝细胞的第一通孔，第一蜂窝孔101和第二蜂窝孔102的封闭端上均设有孔径小于肝细胞的第二通孔，每个第二蜂窝孔102均与相邻的六个第一蜂窝孔101共边设置，每个第一蜂窝孔101均与相邻且交替分布的三个第一蜂窝孔101和三个第二蜂窝孔102共边设置。第一蜂窝孔101内的肝细胞通过第一通孔与第二蜂窝孔102内的液体进行物质交换。

在本申请实施例中，在细胞悬液灌流时，肝细胞从两层蜂窝载板中间的细胞悬液灌流通道3流过，肝细胞向下沉降至开口朝上的第一蜂窝孔101内，而落在反向开口的第二蜂窝孔102上的肝细胞因不能受到腔体的保护，在液体流动过程中会继续向前，直至落入下一个开口朝上的蜂窝孔内，最终上开口蜂窝孔填充满肝细胞，而反向开口的蜂窝孔内无肝细胞填充，用以方便液体通过，且为周围六面网格内的肝细胞提供物质交换的场所，使其一直浸泡于组织液或血浆之中。透气中空纤维膜管4是由透气但不透水的聚醚砜中空纤维或聚砜中空纤维制成，内部是气体通道，用以通过肝细胞生长所需的二氧化碳和氧气的混合气体，其叠层均匀的分布保证了反应器中组织液或血浆中溶氧稳定和充足，为其上方蜂窝孔内的肝细胞提供充分的氧气供应。

在本申请实施例中，蜂窝载板能为微球样肝细胞团提供充足的三维生长空间，而且蜂窝载板蜂窝孔能为内部的肝细胞提供保护，减轻流体剪切力对细胞的冲击及损害，促进肝细胞球形体的生成，更有利于高密度、高活性肝细胞的获得和长久培养。此外，因每个第一蜂窝孔101的六个侧壁有三面贴近第二蜂窝孔102内的培养液或血浆，既有利于恢复肝细胞极性，有为物质交换提供便利。透气中空纤维膜管4置于蜂窝载板底面，具有氧气交换功能，保证了反应器中组织液或血浆中溶氧充足，为其上方蜂窝孔内的肝细胞提供充分的氧气供应。当然在实际应用中，第二蜂窝孔102也可以两端直接敞开设置，此外，上下两层蜂窝载板上的第二蜂窝孔102优先错开设置。

参见图5，在一些实施例中，蜂窝载板通过水平并排间隔设置的多根透气中空纤维膜管4支撑设置于反应器外壳2中，多根水平并排间隔设置透气中空纤维膜管4构成纤维膜管网。在本申请实施例中，两层纤维膜管网中间填充蜂窝载板这样的结构，类似于三合板结构，上下两面为板，中间为填充蜂窝网格，质地轻，用料省，重量小但抗压机械强度大，中间结构疏松，生物空间利用度高。

本申请实施例，透气中空纤维膜管4既为蜂窝载板提供三维支撑，又因其兼具氧气交换功能，保证了反应器中组织液或血浆中溶氧充足。此外，蜂窝载板与透气中空纤维膜管4层层叠加交替设置，空间利用率高，液体冲击压力逐层分散，机械强度大，反应器兼具氧合、三维立体培养、高效率物质交换等功能。

本申请实施例中，蜂窝载板的蜂窝孔能为内部的肝细胞提供保护，减轻流体剪切力对细胞的冲击及损害，促进肝细胞球形体的生成，更有利于高密度、高活性肝细胞的获得和长久培养；因肝细胞及微球均沉积于蜂窝孔内，而不会沿蜂窝孔下方的透气中空纤维膜管网表面生长，从而极大的减少了透气中空纤维膜管膜孔堵塞的风险，更能保证氧气供应充足。此外，细胞因反应器中整合了氧合功能，省去了一般生物人工肝系统中需配备独立的氧合器，且氧合效率大大提高。

需要解释说明的是，在具体的设计中，每根透气中空纤维膜管4内径可以设置为300um，膜厚为50um，孔隙率为>80%。两层透气中空纤维膜管4按1.8mm的间距粘合叠加，透气中空纤维膜管4所支撑的蜂窝载板厚度可以设置为1mm，其顶面距上一层透气中空纤维膜管4间距0.4mm，透气中空纤维膜管4厚约0.4mm。一般肝细胞大小孔径约20-30um，而成团的肝细胞直径亦不超过0.4mm，蜂窝载板顶面与透气中空纤维膜管4间0.4mm的间距能保证肝细胞能顺利从两层之间穿过。这样的设置能在提供支撑的同时，不影响上开口的蜂窝孔底部的细胞与透气中空纤维膜管4下的组织液进行物质交换，也不影响血浆或培养基在从上至下灌流时通过反向开口蜂窝孔再通过透气中空纤维膜管4，进入下一层蜂窝载板。需要说明的是，以上仅仅为具体的设计实例，本申请实施例中的生物反应器的两层蜂窝载板间距、蜂窝孔大小以及反应器规模可根据实际应用放大或缩小。

具体的，蜂窝载板1由亲水的聚丙烯膜或聚乙烯乙烯醇制成，其上分布大于等于300nm的第一通孔和第二通孔，以方便液体通过及物质交换。在体外肝细胞培养或血液净化的过程中，液体从上至下通过蜂窝载板，向上开口的蜂窝孔因填充满肝细胞，流体阻力大，而反向开口的蜂窝孔上存在的第二通孔能为液体提供流过的空间，这样的液体通道减少了流体阻力和对肝细胞的剪切损伤。

在实际应用中，在液体入口5与最顶端的蜂窝载板之间以及液体出口6与最底端的蜂窝载板之间均设有细胞滤网11。在本申请实施例中，因在反应器外壳2中设置细胞滤网11，可以防止肝细胞及微球从反应器流出。

可以理解的是，细胞悬液入口9与细胞悬液出口10在反应器外壳2上相对设置，且细胞悬液入口9靠近反应器外壳2的顶部设置，细胞悬液出口10靠近反应器外壳2的底部设置。

在另一些实施例中，反应器外壳2采用生物相容性较好的透明的聚碳酸酯树脂或聚丙烯或聚乙烯制成，其生物相容性好，并且可以方便的观察反应器内情况。生物反应器外壳2可以设置为方形，亦可改为圆柱形以进一步减少循环死腔。

在具体的应用中，生物反应器外壳2包括中间筒体201、顶盖202和底盖203，顶盖202和底盖203与中间筒体201的连接处采用可拆卸设计；液体入口5设置在顶盖202中间区域，液体出口6设置在底盖203中间区域，顶盖202及底盖203均内衬细胞滤网11，气体入口7和气体出口8对向设置在中间筒体201相对的两侧壁上。

本申请实施例另一方面提供的基于人工肝用生物反应器的生物型人工肝支持系统，包括血浆高速净化再生循环单元和分离回输循环单元。其中，血浆高速净化再生循环单元包括顺次连接的血浆储存袋12、加热器13、第二蠕动泵14、高通量血滤器15、中性树脂吸附器16和上述实施例生物反应器；血浆分离回输循环单元包括相连接的第一蠕动泵17和血浆分离器18。

其中，血浆储存袋12上下各存在2个开口。其上端一开口通过第三蠕动泵19与血浆分离器18的血浆出口连接，另一开口与生物反应器的出液口连接；其下端一开口通过第四蠕动泵20与血浆分离器18的血液返回管路连接，另一开口与加热器13连通。通过血浆储存袋储存血浆提供缓冲，可使血浆高速净化再生循环以数倍甚至成分血浆分离的速度运行。

上述实施例生物型人工肝支持系统的工作过程如下：使用专用生物人工肝治疗设备进行操作，采用第一蠕动泵17从肝衰竭人体或实验动物体内引出血液，全血经血浆分离器18分为细胞成份和血浆成份，血浆储均存于血浆储存袋12，收集300-500 ml肝衰竭血浆，并补充回等量新鲜血浆。因有储存袋中的储存300-500ml肝衰竭血浆提供缓冲，可以以10倍血浆分离速度开始进行高速血浆生物净化循环。该循环单元顺次连接有管路加温器、高通量血滤器15、中性树脂吸附器16和生物反应器。管路加温器能将管路中血浆温度加热到生物反应最适合的36-38℃，高通量血滤器15能有效清除中小分子量血浆毒素，而阴离子树脂能有效清除白蛋白结合毒素及大量的肝衰竭炎性介质等，这样使得在进行生物处理前血浆得到初步净化，从而减轻血浆对反应器内肝细胞的毒性，血浆从反应器顶部的液体入口自上而下的进入反应器内，通过蜂窝载板，与蜂窝孔中的肝细胞充分进行物质交换，再反复逐层通过透气中空纤维膜管网、蜂窝载板，交替完成氧合并充分与载板内肝细胞进行物质交换，完成生物合成及净化后，通过底层的细胞滤网11，从液体出口流出，返回血浆储存袋12。血浆储存袋12中经反复多次净化的血浆可经置换与细胞成分混合返回人体。

在本申请实施例中，血浆高速净化再生循环单元中，高通量血滤器15能有效清除中小分子量血浆毒素，而阴离子树脂能有效清除白蛋白结合毒素及大量的肝衰竭炎性介质等，这样使得在进行生物处理前血浆得到初步净化，从而减轻血浆对反应器内肝细胞的毒性，也使得整个系统净化效率大为提高。

另外，生物反应器的用于体外肝细胞三维培养过程如下：

（1）四部灌流法获取原代肝细胞，制备10⁶-10⁷ cells/mL细胞悬液，接种于T-75平板，平板置于摇臂平台，0.125HZ低频震荡3维培养，制备肝细胞，接种后24小时孔径小于400微米。或使用海藻酸-壳聚糖包裹原代肝细胞，制成肝细胞微球。

（2）关闭反应器液体出口6、细胞悬液出口10，从生物反应器的细胞悬液入口9将肝细胞悬液注入反应器内，直至有液体成分从反应器顶部液体入口溢出为止。打开细胞悬液出口10，关闭顶部液体入口，循环灌注肝细胞悬液，在液体流动过程中，肝细胞平行于透气中空纤维膜管4网平面进入两层蜂窝载板间的间隙，因流体冲击和细胞沉降，只有沉入第一蜂窝孔101内才能固定下来，其余细胞将跟随液体继续前进流动，直至悬液中肝细胞完全沉降至后续的第一蜂窝孔101内，填充满整个生物反应器；

（3）将血浆储存袋12、加热器13、第二蠕动泵14以及生物反应器按图6生物净化部分所示串联，连成肝细胞培养循环通路；

（4）血浆储存袋12填充组织培养液，打开氧气入口和氧气出口，使用氧气和二氧化碳的混合气体开始为生物反应器供氧；

（5）新鲜的培养基从叠层蜂巢式生物反应器液体入口5流入，充分完成生物净化后从液体出口6流出；反应器运行过程中即便出现单层蜂窝载板蜂内肝细胞破碎或者蜂窝孔破裂，破碎成分也会被其下层蜂窝载板阻拦，

（6）培养合适时间后，待肝细胞增殖至所需细胞量，更换组织培养液为生理盐水进行预充后，可以按图6所示连接组合成生物人工肝支持系统。

上述实施例仅仅是清楚地说明本发明所作的举例，而非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里也无需也无法对所有的实施例予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (9)

1.体外培养肝细胞用蜂窝载板，其特征在于：所述蜂窝载板上的蜂窝孔分为第一蜂窝孔和第二蜂窝孔；其中，

所述第一蜂窝孔顶端开口，底端封闭，用于容置肝细胞；

所述第二蜂窝孔顶端封闭，底端开口；

每个蜂窝孔的各个蜂窝壁上均设有第一通孔；

所述第一蜂窝孔和第二蜂窝孔的封闭端上均设有第二通孔；

所述第一通孔和第二通孔的孔径均小于所述肝细胞的直径；

每个所述第二蜂窝孔均与相邻的六个所述第一蜂窝孔共边设置；

每个所述第一蜂窝孔均与相邻且交替分布的三个所述第一蜂窝孔和三个所述第二蜂窝孔共边设置。

2.根据权利要求1所述的体外培养肝细胞用蜂窝载板，其特征在于：

所述第一通孔和所述第二通孔的孔径大于等于300nm；

所述蜂窝壁的壁厚控制在50um-100um。

3.根据权利要求1所述的体外培养肝细胞用蜂窝载板，其特征在于：所述蜂窝载板的制作材质采用生物相容性好的聚丙烯或聚乙烯乙烯醇。

4.根据权利要求1所述的体外培养肝细胞用蜂窝载板，其特征在于：

所述第一通孔在所述蜂窝壁上均匀分布；

所述第二通孔在所述封闭端上均匀分布。

5.根据权利要求1所述的体外培养肝细胞用蜂窝载板，其特征在于：所述蜂窝孔的孔径大小为0.8-1.2mm，高度为1-2mm。

6.人工肝用生物反应器，其特征在于：包括反应器外壳和权利要求1-5任一项所述的蜂窝载板；

若干所述蜂窝载板纵向间隔叠加设置在所述反应器外壳中；

任意相邻的两所述蜂窝载板之间均形成有细胞悬液灌流通道；

所述细胞悬液灌流通道中设有透气中空纤维膜管；

所述反应器外壳的顶端和底端分别设有与其内腔连通的液体入口和液体出口；

所述反应器外壳的侧壁对向设有气体入口和气体出口，所述透气中空纤维膜管的两端分别与所述气体入口和气体出口连通；

所述反应器外壳的侧壁上还设有与所述细胞悬液灌流通道连通的细胞悬液入口和细胞悬液出口。

7.根据权利要求6所述的人工肝用生物反应器，其特征在于：所述液体入口与最顶端的所述蜂窝载板之间以及所述液体出口与所述最底端的蜂窝载板之间均设有细胞滤网。

8.根据权利要求6所述的人工肝用生物反应器，其特征在于：所述蜂窝载板通过水平并排间隔设置的多根所述透气中空纤维膜管支撑设置于所述反应器外壳中。

9.根据权利要求6-8任一项所述的人工肝用生物反应器，其特征在于：所述细胞悬液入口与细胞悬液出口在所述反应器外壳上相对设置，且所述细胞悬液入口靠近所述反应器外壳的顶部设置，所述细胞悬液出口靠近所述反应器外壳的底部设置。

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