CN111249465B - Topk作为宫颈癌顺铂耐药治疗靶点的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于抗宫颈癌药物领域，具体涉及TOPK作为宫颈癌顺铂耐药防治靶点的应用。现有技术中针对TOPK与宫颈癌增殖及顺铂耐药的关系尚未见研究。为了明确宫颈癌患者顺铂耐药的机制，为宫颈癌患者提供更好的治疗药物，本发明针对TOPK对宫颈癌增殖及顺铂耐药的影响进行一系列研究。结果表明TOPK在宫颈癌患者组织中高表达；TOPK促进宫颈癌细胞增殖；TOPK过表达促进宫颈癌细胞对顺铂耐药。进一步研究表明TOPK特异性抑制剂OTS514在体内外明显抑制宫颈癌细胞增殖，本发明采用TOPK抑制剂OTS514与顺铂联合应用于宫颈癌治疗，治疗效果优于单独的顺铂治疗效果。

Description

TOPK作为宫颈癌顺铂耐药治疗靶点的应用

技术领域

本发明属于宫颈癌治疗靶点技术领域，具体涉及TOPK作为宫颈癌顺铂耐药治疗靶点，以及TOPK抑制剂与顺铂联合用于宫颈癌治疗的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

宫颈癌(cervical cancer)发病率在全球女性患者中高居第四位。美国癌症协会的年度统计报告表明，2019年全美将新增61880例宫颈癌患者，死亡12160例。中国每年新发宫颈癌病例达13.15万，宫颈癌死亡人数每年约5.3万，约占全部女性恶性肿瘤死亡人数的18.4％。包括上皮内癌在内的早期宫颈癌的一线治疗方式是手术切除，而放疗和以铂类为基础的化疗多用于治疗晚期宫颈癌患者。目前，晚期宫颈癌患者的中位生存时间仅为16.8个月，所有宫颈癌患者的5年生存率仅为68％。宫颈癌治疗效果不尽如人意的重要原因之一是患者对以顺铂为代表的化疗药物耐药。因此，迫切需要开发新的宫颈癌治疗靶点和治疗方法，克服化疗耐药，提高治疗效果。

TOPK(T-LAK细胞来源的蛋白激酶，T-LAK Cell-Originated Protein Kinase)是属于MAPKK家族的蛋白激酶，除睾丸和胎儿组织以外，TOPK在正常组织中几乎不表达，但是在肺癌、胃癌、胰腺癌、宫颈癌、结直肠癌、口腔癌等癌症中高表达并且发挥癌基因的作用，与肿瘤的发生发展、转移以及耐药密切相关。然而TOPK与宫颈癌恶性进展以及顺铂耐药的关系尚未见研究。

发明内容

现有研究中，TOPK在宫颈癌组织和细胞中的表达和功能尚不明确，与宫颈癌顺铂耐药是否存在相关性尚不可知。本发明针对TOPK在宫颈癌中的表达和作用展开了研究，发现TOPK在宫颈癌组织中高表达并且促进宫颈癌细胞增殖；TOPK抑制剂OTS514在体内外有效抑制宫颈癌细胞增殖；进一步证实了TOPK与宫颈癌顺铂耐药具有相关性。采用TOPK抑制剂与顺铂共同应用于宫颈癌治疗可以有效抑制宫颈癌细胞的增殖，降低宫颈癌对于顺铂的耐药性，为宫颈癌的治疗提供了新的用药依据和治疗前景。

基于上述研究成果，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供TOPK抑制剂作为宫颈癌预防/治疗药物的应用。

本发明通过RT-qPCR和Western Blot方法检测了正常组织及宫颈癌组织中TOPKmRNA和蛋白质水平，显示宫颈癌组织中TOPK含量显著高于正常组织。进一步的，本发明采用TOPK抑制剂应用于宫颈癌细胞及荷瘤小鼠模型，实验结果表明，该抑制剂能够显著抑制宫颈癌细胞的生长，降低荷瘤小鼠的肿瘤体积，证实了TOPK抑制剂可以作为宫颈癌防治药物加以开发和应用。

优选的，所述TOPK抑制剂包括化学抑制剂、通过基因工程手段抑制TOPK表达的试剂、TOPK上游靶点调节剂等。

进一步优选的，所述化学抑制剂包括OTS514。

本发明第二方面，提供TOPK检测试剂作为宫颈癌顺铂耐药状况检测试剂的应用。

优选的，所述TOPK检测试剂包括通过免疫印迹方法、免疫组化方法、RT-qPCR检测方法、免疫荧光检测等常用检测方法检测TOPK含量所需要的试剂。

本发明第三方面，提供一种宫颈癌顺铂耐药检测试剂盒，所述试剂盒中包括TOPK检测试剂。

本发明第四方面，提供TOPK抑制剂与顺铂的组合作为抗宫颈癌治疗药物的应用。

本发明第五方面，提供一种宫颈癌防治药物，所述药物采用TOPK抑制剂作为活性成分。

优选的，所述药物采用TOPK抑制剂及顺铂作为活性成分。

本发明第六方面，提供一种宫颈癌治疗方法，所述治疗方法包括采用TOPK抑制剂与顺铂联合应用于宫颈癌的治疗。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.TOPK在多种肿瘤组织中的表达含量呈现增加趋势，现有研究也表明TOPK在宫颈癌组织中的表达含量高于正常组织。本发明采用细胞及动物模型实验更加确切的证实了TOPK抑制剂单独即可发挥良好的抑制宫颈癌组织的效果，提供了TOPK抑制剂作为宫颈癌防治药物的应用，为宫颈癌治疗药物的开发提供了新的研究方向。

2.宫颈癌患者对顺铂耐药是宫颈癌治疗效果不佳的重要原因之一。本发明对宫颈癌药物耐药机制进行了研究，发现了TOPK与顺铂耐药之间的关系，提供了TOPK抑制剂与顺铂联合治疗宫颈癌的治疗方法，推动了宫颈癌耐药机制及联合用药的研究。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为TOPK在宫颈癌患者样本中高表达；

其中，图1A为RT-qPCR检测正常组织与宫颈癌组织中TOPK mRNA含量水平图；

图1B为Western Blot方法检测TOPK蛋白水平条带图。

图2为TOPK促进宫颈癌细胞增殖；

其中，图2A为敲低与过表达TOPK的Hela细胞增殖曲线；

图2B为敲低与过表达TOPK的Siha细胞增殖曲线；

图2C为敲低与过表达TOPK对Hela和Siha细胞成克隆能力的影响；

图2D为体内荷瘤模型中敲低TOPK后小鼠肿瘤照片图；

图2E为体内荷瘤模型中敲低TOPK后肿瘤体积统计散点图。

图3为TOPK促进宫颈癌细胞对顺铂耐药结果图；

其中，图3A为Western Blot检测不同浓度顺铂处理后细胞中TOPK蛋白含量条带图；

图3B为RT-qPCR检测不同浓度顺铂处理后细胞中TOPK mRNA水平图；

图3C为MTT检测顺铂处理后细胞存活率；

图3D为Western Blot检测顺铂处理条件下敲低TOPK对细胞凋亡的影响；

图3E为流式细胞术检测TOPK对细胞凋亡的影响。

图4为TOPK特异性抑制剂OTS514显著抑制宫颈癌细胞增殖；

其中，图4A为抑制剂处理Hela细胞24h和48h组细胞存活率直方图；

图4B为抑制剂处理Siha细胞24h和48h组细胞存活率直方图；

图4C为抑制剂处理Hela和Siha细胞24h后TOPK蛋白水平条带图。

图5为在裸鼠体内荷瘤模型中，腹腔注射OTS514显著减少肿瘤体积；

其中，图5A为荷瘤模型中小鼠肿瘤照片图；

图5B为肿瘤体积统计散点图。

图6为OTS514与顺铂联合应用抑制宫颈癌细胞增殖；

其中，图6A为MTT检测Hela细胞存活率直方图；

图6B为MTT检测Siha细胞存活率直方图；

图6C为Western Blot检测凋亡蛋白PARP和caspase 3的表达水平。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，针对现有技术中存在的不足，本发明提出了TOPK作为宫颈癌顺铂耐药治疗靶点的应用。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。本发明涉及的动物实验研究均获得山东大学齐鲁医院动物护理机构和使用委员会的批准。

实施例1

1.检测TOPK mRNA和蛋白质在正常宫颈和宫颈癌组织中的表达水平

分别使用TRIzol(15596018,Invitrogen)和Western及IP细胞裂解液(P0013，碧云天)提取正常宫颈和宫颈癌组织的mRNA和蛋白质，利用RT-qPCR和Western Blot方法检测TOPK mRNA和蛋白质水平。

检测结果如图1A所示，宫颈癌组织中TOPK mRNA含量为正常组织中的4～5倍。Western检测结果(图1B)证实，与对照组正常宫颈组织相比，TOPK蛋白质在宫颈癌组织中显著提高。

2.检测TOPK对宫颈癌细胞增殖水平的影响

分别构建TOPK稳定敲低和过表达的宫颈癌Hela和Siha细胞系，利用Western Blot检测TOPK敲低和过表达效率(图2A和图2B)。将稳定敲低或过表达TOPK的宫颈癌细胞接种于96孔板中，每孔1000个细胞，每组6个复孔，使用MTT方法检测细胞在第1、2、3、4、5天增殖水平。将稳定敲低或过表达TOPK的宫颈癌细胞接种于6孔板中，每孔800个细胞，培养至肉眼可见细胞克隆，使用结晶紫染色检测宫颈癌细胞成克隆能力(图2C)。从南京大学模式动物中心订购4-6周大小雌性裸鼠，将1×10⁷个稳定敲低TOPK或对照组Hela细胞注射到裸鼠左侧腋窝皮下，20天后安乐法处死小鼠，取出肿瘤组织(图2D)，使用游标卡尺测量瘤体长度和宽度，使用如下公式计算肿瘤体积：长×宽²×0.5。

如图2所示，过表达TOPK组小鼠肿瘤体积明显大于敲除TOPK组，证明过表达TOPK促进宫颈癌细胞增殖和成克隆能力，而敲低TOPK抑制宫颈癌细胞增殖和成克隆能力。裸鼠荷瘤实验表明敲低TOPK抑制宫颈癌细胞体内成瘤能力。

3.检测TOPK对宫颈癌细胞顺铂耐药的影响。

在宫颈癌Hela和Siha细胞中，利用Western Blot(图3A)和RT-qPCR(图3B)检测0、3、6μg/ml(0、5、10μg/ml)顺铂(CDDP,PHR1624,Sigma)处理条件下TOPK、蛋白质和mRNA水平变化。将稳定敲低TOPK的宫颈癌细胞系接种于96孔板中，每孔3000个细胞，每组6个复孔，待细胞过夜贴壁后，使用3μg/ml或5μg/ml顺铂分别处理细胞24、48、72小时，使用MTT方法检测细胞存活率(图3C)。另外，在顺铂处理条件下，使用Western Blot(图3D)和流式细胞术(图3E)检测敲低TOPK对细胞凋亡的影响。

结果如图3所示，顺铂以浓度依赖的方式降低宫颈癌细胞中TOPK蛋白质和mRNA水平。敲低TOPK增强宫颈癌细胞对顺铂敏感性，敲低TOPK促进顺铂诱导的宫颈癌细胞凋亡。TOPK在细胞水平上促进宫颈癌细胞对顺铂耐药。

4.检测TOPK抑制剂OTS514对宫颈癌细胞增殖水平的影响。

将3000个Hela或Siha宫颈癌细胞接种于96孔板中，每组6个复孔，分别使用0、1、5、10、20、50、100、200nM OTS514(S7652,Selleck)处理细胞24或48h，使用MTT方法检测细胞增殖水平。分别使用0、10、20、50nM OTS514处理宫颈癌细胞24h，使用Western Blot检测TOPK蛋白水平。

如图4所示，OTS514能够明显抑制宫颈癌细胞增殖；OTS514能够剧烈降低TOPK蛋白水平。

5.检测体内荷瘤模型中OTS514对宫颈癌细胞增殖水平的影响。

将1×10⁷个Hela细胞注射到裸鼠皮下，待肿瘤体积生长至约100mm³后腹腔注射25或50mg/kg的OTS514，注射15天后安乐法处死小鼠，取出肿瘤组织，拍照测量(图5A)，计算肿瘤体积(图5B)。

如图5所示，在体内裸鼠荷瘤模型中，OTS514明显抑制宫颈癌细胞增殖。

6.检测TOPK抑制剂OTS514与顺铂联合应用于宫颈癌治疗的效果。

将宫颈癌细胞Hela或Siha接种于96孔板中，每组6个复孔。分别使用0、1、3、6μg/ml(1、5、10μg/ml)顺铂或/和0、10nM(20nM)OTS514处理细胞24或48h，使用MTT方法检测细胞存活率(图6A和图6B)。使用指定浓度OTS514或/和顺铂处理宫颈癌细胞24h，使用WesternBlot检测凋亡蛋白PARP和caspase 3的表达水平(图6C)。

如图6所示，OTS514联合顺铂处理杀伤效果明显优于顺铂单独处理。

以下为抗体信息：TOPK(Proteintech,16110-1-AP),β-actin(Sigma,A5441),PARP(CST,9542S),Caspase-3(Proteintech,19677-1-AP)。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.检测TOPK的试剂在制备宫颈癌顺铂耐药状况检测试剂中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测试剂包括通过免疫印迹方法、免疫组化方法、RT-qPCR检测方法、免疫荧光检测方法任一项中的检测TOPK含量所需要的试剂。

3.TOPK抑制剂与顺铂的组合在制备抗宫颈癌治疗药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述TOPK抑制剂为OTS514。

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