CN111249431A

CN111249431A - 生姜泻心汤干预抗生素相关性腹泻的应用

Info

Publication number: CN111249431A
Application number: CN202010090504.2A
Authority: CN
Inventors: 黄璐琦; 杨洪军; 章从恩; 马致洁; 王焕君
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2020-02-13
Filing date: 2020-02-13
Publication date: 2020-06-09

Abstract

生姜泻心汤干预抗生素相关性腹泻的应用。本发明属于中医药领域。中医认为的抗生素往往是苦寒药性，久用会伤人正气，致脾阳虚，不能运化水湿，水浊内停则湿毒内生，水湿下迫肠道使小肠不能分清泌浊而导致腹泻，久病及肾，出现脾肾阳虚，寻找替代药物和治疗方案已成为当今热点。生姜泻心汤减轻燥热，化散水气，止泻且不致便秘，是预防和辅助治疗抗生素相关性腹泻的可行药物。

Description

生姜泻心汤干预抗生素相关性腹泻的应用

技术领域

本发明属于中医药领域，涉及生姜泻心汤干预抗生素相关性腹泻的应用，涉及生姜泻心汤在制备治疗或预防抗生素相关性腹泻的组合物上的应用。

背景技术

生姜泻心汤出自《伤寒论·辨太阳病脉证并治》157条，原文：“伤寒汗出，解之后，胃中不和，心下痞硬，干噫食臭，胁下有水气，腹中雷鸣，下利者，生姜泻心汤主之。”原方组成为：生姜12g，人参9克，炙甘草9克，黄芩9g，黄连3克，干姜3克，半夏(法半夏，经过文献分析现代多用法半夏)9克，大枣6g(擘)。

其方首主以生姜宣表和胃散水，反辅以半夏泻心汤开结除坚，是微寓解肌于散痞之中，治疗心下痞满、呕而肠鸣证的著名经方,有通阳涤饮、消痞止痢、扶正祛邪、标本同治之功。主要用于治疗心下痞、呕吐、泄泻等症，为历代医家公认的治疗脾胃病的良方之一。

近年来，生姜泻心汤在临床上应用广泛。生姜泻心汤治疗细菌性腹泻及胃肠炎疗效可靠，它具有广泛的药理和生物活性，包括抗炎和抗菌特性。临床研究证实，生姜泻心汤能有效预防伊立替康所致迟发性腹泻。生姜泻心汤对感染后肠易激综合征也具有治疗作用。

抗生素相关性腹泻(AAD)是指应用抗生素后导致肠道菌群失调而引起的最常见的医源性腹泻，中医认为抗生素相关性腹泻的病因是使用苦寒药性的抗生素，损伤人体正气，导致脾阳不足，脾阳虚则不能运化水湿，水浊内停，湿毒内生，水湿下迫肠道使小肠不能分清泌浊而导致泄泻，久病及肾，最后出现脾肾阳虚，而脾虚一直是各家比较一致的观点。

目前对于抗生素相关性腹泻的治疗首选甲硝唑和万古霉素，但是这两种药物治疗存在破坏肠道有益菌群，复发率较高等问题，寻找替代药物和治疗方案已成为当今研究的重要课题。

生姜泻心汤减轻了燥热之性，又化散水气之功，止泻同时又不致便秘，是预防和辅助治疗抗生素相关性腹泻的可行药物。

技术方案

本发明的生姜泻心汤在制备治疗或预防抗生素相关性腹泻的组合物的用途。

本发明的生姜泻心汤在制备调整肠道菌群的组合物的用途，所述肠道菌群为厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门。

本发明的生姜泻心汤在制备调整肠道菌群的组合物的用途，所述肠道菌群为：肠杆菌和拟杆菌属。

本发明的生姜泻心汤在制备调整肠道黏膜屏障的组合物的用途。

本发明的生姜泻心汤，其组成是：生姜5-60g,炙甘草5-45g,人参5-45g，干姜3- 15g，黄芩5-45g，半夏5-45g，黄连3-15g，大枣5-60g。

本发明的生姜泻心汤，其优选组成是：生姜5-60g,炙甘草5-45g,人参5-45g，干姜3- 15g，黄芩5-45g，法半夏5-45g，黄连3-15g，大枣5-60g。

本发明的生姜泻心汤，其较佳的组成是：生姜12g,炙甘草9g,人参9g，干姜3g，黄芩 9g，法半夏9g，黄连3g，大枣9g。

本发明所述生姜泻心汤可用本领域常规方法制备。药材也可采用本领域常规方法或经典文献记载的净制品或炮制品。

本发明的生姜泻心汤的制备方法，优选为：取生姜84g,炙甘草63g,人参63g，干姜 21g，黄芩27g，法半夏63g，黄连21g，大枣63g。加水3.2L，浸泡30min，加热煎煮 1h，过滤后加水2.5ml，再次煎煮1h，合并两次滤液，浓缩至800ml，含有绿原酸、甘草苷、黄连碱、盐酸小檗碱、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、6-姜辣素、姜黄素9个成分。

本发明的的生姜泻心汤的检测方法：优选为HPLC分析：

HPLC色谱条件

Inertsil ODS-SP C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，

流动相为0.1％甲酸水溶液(A)-0.1％甲酸甲醇溶液(B)，进行梯度洗脱。

洗脱梯度表

流速0.8mL·min-1，检测波长254nm，柱温40℃，进样量10μL。

供试品溶液的制备

准确称取生姜12g、人参9g、黄芩9g、炙甘草9g，法半夏9g，干姜3g，黄连3g、大枣9g，置于圆底烧瓶中，加8倍量水充分浸润，放置浸泡30min，电热套加热微沸回流提取1h，趁热用3层纱布过滤，滤渣加6倍量水微沸回流提取30min，3层纱布过滤，合并两次的滤液，浓缩至50mL，得生药浓度为1.26g/mL，4℃冷藏备用。

取生姜泻心汤药液，加适量超纯水稀释至0.1g·mL–1，涡旋1min，4℃12000rpm 离心10min，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，得供试品溶液。

附图说明

图1：试验流程图

图2：大鼠的一般指标

图3：大鼠腹泻状况指标分析结果

图4：HE染色大鼠结肠组织代表性视野图(200X,n＝10)

图5：生姜泻心汤对AAD大鼠肠道屏障的影响

图6：生姜泻心汤治疗对AAD大鼠肠道菌群的影响

图7：混合对照品HPLC图

图8：10批生姜泻心汤指纹图谱附图2-3、5-6的详细解释

图2：大鼠的一般指标。(A)各组大鼠的体重变化曲线。(B)各组大鼠饮水量的变化曲线。(C)各组大鼠饮食量的变化曲线

图3：大鼠腹泻状况指标分析结果。A为粪便评分依据，褐、成形、硬粪便记1分；黄或褐、成形、软粪便记2分；黄或褐、稀烂、不成形粪便记3分。B为粪便的评分结果分析(n＝10)。C为120min粪便重量的结果分析(n＝10)。D为粪便含水量的结果分析 (n＝10)。

图5：生姜泻心汤对AAD大鼠肠道屏障的影响。A大鼠结肠组织杯状细胞代表性视野图，(200X,n＝10)。B大鼠结肠组织中muc2免疫组化代表性视野图，(200X,n＝10)。C大鼠结肠组织中紧密连接蛋白ZO-1免疫荧光代表性视野图，(200X,n＝10)。

图6：生姜泻心汤治疗对AAD大鼠肠道菌群的影响。(A)Shannon指数的箱型图；基于Chao1指数的微生物丰度。(B)各组肠道微生物群门水平(左)和属水平(右)OTUs相对丰富度，包括正常对照组(Con)和AAD模型组(Mod)、生姜泻心汤治疗组(SJT)。(C)LEfSe分析LDA柱形图，正常对照组(Con)与AAD模型组(Mod)、生姜治疗组(SJT)的细菌丰度差异。 (D)经生姜泻心汤治疗之后，肠杆菌和拟杆菌属OTUs的相对丰度显著改变。

图7混合对照品HPLC图的解释：10.绿原酸；17.甘草苷；20.黄连碱；24.盐酸小檗碱；27.黄芩苷；33.黄芩素；34.6-姜辣素；38.汉黄芩素；39.姜黄素实验例一：本发明的药效学实验

本实验通过建立AAD大鼠模型，观察大鼠的一般指标和腹泻状况来研究不同剂量生姜泻心汤对AAD大鼠的干预作用，并通过观察大鼠结肠肠道屏障的完整性、检测大鼠肠道菌群的变化来初步探讨生姜泻心汤干预AAD大鼠的作用机制。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物

SPF级5周龄SD大鼠40只，雌雄各半，购自首都医科大学附属北京友谊医院实验动物中心。

动物饲养于清洁级实验动物房中，温度20-22摄氏度，12小时黑暗/光照循环。动物饲养使用标准鼠饲料和水，所有动物实验按照首都医科大学附属北京友谊医院动物伦理委员会相关规定进行。

1.1.2药物

生姜泻心汤由北京友谊医院中药房提供，水煎，浓缩至2g/ml.

盐酸克林霉素胶囊(山东方明药业)

氨苄西林胶囊(湖南康尔佳生物医药科技有限公司)

注射用硫酸链霉素(山东鲁抗医药股份有限公司)

生理盐水

1.1.3试剂与仪器

AL204电子天平(METTLER TOLEDO)；

电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；

脱水机(武汉俊杰电子有限公司JJ-12J)

包埋机(武汉俊杰电子有限公司JB-P5)

病理切片机(上海徕卡仪器有限公司RM2016)

正置光学显微镜(日本尼康Nikon Eclipse CI)

PCR仪(ABI

9700型)

E.Z.N.A.

soil试剂盒

苏木素-伊红染液(武汉谷歌生物科技G1005)

1.2方法

1.2.1分组与模型制备

大鼠适应性饲养1周后，按照数字表法随机分为4组，每组10只，分别为空白对照组 (Con)，AAD模型组(Mod)，生姜泻心汤低剂量治疗组(SJT1，6.3g生药/kg，相当于临床等效剂量)和生姜泻心汤高剂量治疗组(SJT2，12.6g生药/kg，相当于2倍临床等效剂量)。各组大鼠给予正常饮食饮水，正常饲养条件，空白对照组每天灌胃2mL的生理盐水，其他组每天灌胃给药2mL的抗生素混合溶液(克林霉素50mg/mL+氨苄西林55.5mg/mL+链霉素 27.75mg/mL)，连续给药一周。

1.2.2给药方法

造模结束，开始治疗，空白对照组和模型组给予蒸馏水，生姜泻心汤低、高剂量治疗组分别给予生姜泻心汤6.3g/kg、12.6g/kg，连续给药7天。之后停药，正常饮食饮水观察7天。实验结束。实验流程如图1。

1.2.3检测指标

外观指标实验过程中每天每天观察大鼠精神反应、体毛、饮食、、饮水、活动度、体重、粪便状况及尾部肛口干净程度等。其中重点观察小鼠粪便及体重的变化。每两日测量一次体重，早晨9：00测量。

腹泻指标于实验过程中每个阶段的中期和结束对大鼠的粪便进行评估。

(1)腹泻评分：褐、成形、硬粪便记1分；黄或褐、成形、软粪便记2分；黄或褐、稀烂、不成形粪便记3分。

(2)粪便含水量：采集一定数量的粪便进行称重，然后在烤箱里完全烘干(完全烘干指在95℃烘干半小时样品质量的变化小于1％)，再进行称重，计算粪便的含水量。

(3)120min粪便重量：每天同一时间将老鼠均置于独立的笼子里，收集其接下来2 小时的粪便，称重。

病理学检查连续给药一周，给药结束后，各组一半大鼠无菌条件下麻醉解剖，腹主动脉取血，并取大鼠结肠组织，置于甲醛中固定，待行石蜡切片常规作苏木精-伊红染色行病理学检查。停药观察一周后，剩余大鼠相同方法处理。

肠道屏障大鼠结肠组织按常规包埋、切片。

(1)杯状细胞：阿利新蓝染色结肠组织切片。

(2)蛋白：采用免疫组化染色的方法检测大鼠结肠组织中MUC2的表达。免疫荧光的方法检测大鼠结肠组织中紧密连接蛋白ZO-1的表达。

菌群分析连续给药一周，给药结束后，各组一半大鼠无菌采集粪便，保存于液氮中，然后转移至-80℃保存。按照说明书，用DNA抽提试剂盒进行DNA提取，DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，然后用338F (5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)引物对V3-V4 可变区进行PCR扩增，使用2％琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)进行纯化，Tris-HCl洗脱，2％琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluor^TM-ST(Promega,USA)进行检测定量。根据 Illumina MiSeq平台(Illumina,San Diego,USA)标准操作规程将纯化后的扩增片段构建 PE 2*300的文库。利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序。

1.2.4统计学方法。采用SPSS 23.0软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差

表示，采用单因素方差分析以P<0.05表示有差异。

1.3结果

1.3.1大鼠精神活动状况及体重变化

造模结束后，正常组大鼠精神反应佳，饮食、饮水正常，行动活跃，毛发光泽，粪便正常。而相比较正常组小鼠，模型组大鼠出现精神萎靡，反应差，懒动，行动迟缓无力，毛发不荣、枯黄，缺乏光泽，腹泻，肛门红，但是各组大鼠体重的变化没有出现明显差异。经生姜泻心汤的干预，大鼠精神状态均有一定程度的改善。

图2大鼠的一般指标。(A)各组大鼠的体重变化曲线。(B)各组大鼠饮水量的变化曲线。(C)各组大鼠饮食量的变化曲线。

体重变化如图2A，各组大鼠的体重没有明显的差异。记录各组大鼠的饮食量、饮水量，如图2B结果显示，各组大鼠饮食量没有明显的差距，如图2，模型组大鼠饮水量高于正常组，但是经生姜泻心汤治疗之后，饮水量逐渐趋近正常组。与模型组相比，生姜泻心汤的治疗能够明显降低AAD大鼠的饮水量。

1.3.2大鼠腹泻状况：抗生素混合溶液造模后，各组大鼠均出现腹泻，经生姜泻心汤干预之后，腹泻状况得到改善。实验过程中中没和阶段的中间和结束对大鼠的粪便进行一次评估，AAD大鼠腹泻明显，粪便粘形态、粪便含水量、120min粪便重量均有明显变化，如图3所示。从造模开始，除空白组外，其余各组大鼠均出现腹泻症状，从第4天开始出现明显稀便，第7天腹泻症状最明显，从第14天开始，模型组腹泻症状略恢复，一直持续至实验结束。经生姜泻心汤治疗之后，在治疗第10天出现成形软粪便，实验第14天出现出现固体粪便，与模型组相比，粪便形态评分显著下降，粪便含水量下降，120min粪便总重量下降。而模型组的粪便评分，粪便含水量和120min粪便重量均没有显著的恢复现象。与模型组相比，生姜泻心汤的治疗，能够明显改善AAD大鼠的腹泻状况，生姜泻心汤高剂量和低剂量组效果没有明显的差距。

图3大鼠腹泻状况指标分析结果。A为粪便评分依据，褐、成形、硬粪便记1分；黄或褐、成形、软粪便记2分；黄或褐、稀烂、不成形粪便记3分。B为粪便的评分结果分析(n＝10)。C为120min粪便重量的结果分析(n＝10)。D为粪便含水量的结果分析 (n＝10)。

1.3.3病理结果通过HE染色大鼠结肠组织，分析结肠组织病理切片(图3)得出，空白组大鼠结肠组织黏膜上皮结构完整，肠腺数量丰富，排列紧密，形态正常；固有层少量炎性细胞浸润(红色箭头)，未见其它明显异常。模型组大鼠治疗期结束后，结肠组织中有大量炎症细胞浸润；恢复期结束后，仍见组织局部黏膜上皮细胞脱落(黑色箭头)；肠腺排列疏松，肠腺间质结缔组织增生，间隙增宽(绿色箭头)，并可见少量中性粒细胞浸润(黄色箭头)，局部粘膜下层水肿，结缔组织疏松(蓝色箭头)。经低剂量生姜泻心汤治疗一周之后，可见组织局部少量黏膜上皮细胞脱落(黑色箭头)，肠腺数量丰富，排列紧密，偶见有间隙增宽(绿色箭头)，固有层内偶见少量炎性细胞浸润(红色箭头)；恢复一周之后，组织黏膜上皮结构完整，肠腺数量丰富，排列紧密，形态正常，仅固有层内偶见炎性细胞浸润(红色箭头)。经高剂量生姜水煎液治疗一周之后，组织黏膜上皮结构完整，肠腺数量丰富，排列紧密，形态正常，肠腔内可见少量坏死细胞碎片(黑色箭头)，固有层内偶见炎性细胞浸润(红色箭头)；恢复一周之后，组织黏膜上皮结构完整，肠腺数量丰富，排列紧密，形态正常，仅固有层内偶见炎性细胞浸润(黑色箭头)，与空白组几乎相同。证明，生姜泻心汤的治疗可明显改善AAD大鼠结肠组织的病理状况，高剂量和低剂量生姜泻心汤的治疗效果没有明显的差距。

1.3.4肠道屏障完整性

肠上皮是肠道微生物群与宿主组织的界面，是防止腔内病原体进入血液的重要物理屏障。我们通过检测不同组大鼠结肠组织中分泌粘液的杯状细胞数量，参与杯状细胞合成和分泌的分泌型黏蛋白MUC2，紧密连接蛋白ZO-1的表达来分析上皮细胞的完整性，以确定与可能与腹泻相关的细胞和分子变化。杯状细胞是混在粘膜上皮中的粘液分泌细胞，肥大细胞圆或卵圆形，细胞核常呈三角形，常成群聚集在小血管旁，胞质内充满粗大的嗜碱性颗粒，颗粒中含有黏蛋白，黏蛋白分泌后，与水结合形成黏液，有润滑和饱和作用。杯状细胞是分散孤立的细胞，具有显著的分泌机能。

图4 HE染色大鼠结肠组织代表性视野图(200X,n＝10)。AAD组大鼠相对于空白组大鼠，治疗期结束后和恢复期结束后，结肠中充满粘液的杯状细胞数量均明显减少，表明 AAD大鼠结肠中杯状细胞分泌粘液的量可能减少。用不同剂量生姜泻心汤治疗之后，与AAD 组相比，治疗期结束后和恢复期结束后结肠杯状细胞数量均明显增加，与空白组接近。

黏蛋白(Mucin)是由体内多种上皮细胞分泌的大分子量糖蛋白。根据其结构的不同可分为分泌型和膜结合型。在正常情况下，黏蛋白除了对上皮细胞组织起保护作用外,还参与上皮细胞的分类和更新,细胞黏附和细胞信号传导通路的调节等。MUC2属于分泌型黏蛋白，在结肠、小肠及呼吸道上皮细胞中均有表达。该蛋白质在肠道的表面形成一层粘液层发挥润滑和拮抗致病菌的肠道黏附和侵装的作用。在正常情况下，MUC2 100％表达于肠道粘膜上皮，目前已在多种上皮来源的肿瘤及肠道疾病中发现黏蛋白的结构及功能发生改变，出现黏蛋白的异常表达，其异常表达与临床预后相关。各种抗生素的广泛长期应用，一方面使耐药菌株增加，耐药因子迅速扩散，另一方面引起肠道菌群絮乱，造成肠道功能失调。如图4所示，治疗期结束和恢复期结束后，MUC2在AAD大鼠结肠中的表达均明显低于对照组，然而，不同剂量生姜泻心汤组大鼠结肠中MUC2的表达在治疗期和恢复期结束后均明显增加增加，恢复期结束后与空白组接近。

紧密连接(tight junction，TJ)是维持粘膜上皮机械屏障和通透性的重要结构。紧密连接蛋白ZO-1是其重要组成蛋白之一，不但参与调节细胞物质转运和维持上皮极性，而且还与细胞增殖分化、肿瘤细胞转移、基因转录等过程的信息传递和调控有关。我们通过免疫荧光法评估了紧密连接蛋白ZO-1在结肠中的表达。与对照组相比，AAD大鼠紧密连接蛋白ZO-1染色强度降低，生姜泻心汤治疗组，第治疗期结束和恢复期结束结肠中ZO-1染色较AAD大鼠增强，与空白组接近。

综上所述，这些结果表明AAD大鼠上皮排列和组织受损，表现为充满粘液的杯状细胞数量减少，参与杯状细胞合成和分泌的分泌性黏蛋白MUC2减少，紧密连接蛋白ZO-1表达减少，所有这些都是AAD大鼠粘膜屏障受损的原因。生姜泻心汤的治疗对大鼠肠上皮细胞的增殖和功能有调节作用，维持肠屏障的完整性，从而减轻AAD的症状。

1.3.4菌群结果

(1)物种多样性分析

Shannon是计算菌群多样性的指数，用来估算样品中微生物的多样性，常用于反映 alpha多样性指数。Shannon指数值越大，说明群落多样性越高。如图4Shannon指数显示，抗生素造模之后，大鼠肠道菌群的多样性明显降低，经过生姜泻心汤治疗之后，肠道菌群的多样性明显提高。Chao1是估计样品中所含OTU数目的指数，Chao1在生态学中常用来估计物种总数。如图4Chao1结果显示，经过抗生素混合溶液灌胃造模后，大鼠肠道菌群的物种总数降低，经生姜泻心汤治疗之后，肠道的物种总数并没有明显的恢复。

(2)物种组成分析

基于OTU的绝对丰度及注释信息，对每个样品在门水平和属水平上的序列数目占总序列数的比例进行统计分析，确定了空白组、AAD模型组和生姜泻心汤治疗组间在门和属水平上的物种组成差异(图5B)。在门水平上(5B左)，空白组大鼠厚壁菌门所占比例为 39.49％，而AAD模型组厚壁菌门所占比例为23.68％，经生姜泻心汤治疗之后，厚壁菌门的比例为34.13％，接近空白组；空白组、AAD模型组、生姜泻心汤组变形菌门的比例分别为 28.67％、65.57％、30.01％；空白组、AAD模型组、生姜泻心汤组拟杆菌门的比例分别为 21.57％、10.4％、35.70％；空白组疣微菌门的比例为8.64％，而模型组和生姜泻心汤组疣微菌门的比例均为0。

总的来说，在门水平上，AAD大鼠后壁菌门、拟杆菌门比例降低，变形菌门比例升高，经生姜泻心汤治疗之后，菌群恢复与空白组接近。这些数据表明抗生素混合溶液造模改变了肠道微生物群，生姜泻心汤的治疗在门水平上恢复了大鼠肠道菌群的失调。尤其是厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门的所占的比例恢复的几乎和空白组接近。

在属水平上(5B右)，空白组大鼠的肠杆菌、S24-7菌、乳酸菌、阿克曼菌所占比例最高。与空白组相比，AAD模型组肠杆菌属物种丰富度明显增加，S24-7菌、乳酸菌、阿克曼菌所占比例明显降低，但是肠杆菌属布、劳特氏菌(Blautia)、多尔氏菌属(Dorea)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、假单胞菌(Pseudomonas)所占比例明显增加。在生姜泻心汤组大鼠中，肠杆菌属(Enterobacteriaceae)所占比例相对模型组大幅降低，与空白组接近，但拟杆菌属(Bacteroides)大量增加。

LEfSe方法是非参数检验和线性判别分析的结合，适合菌群丰度差异检验，LEfSe寻找每一个分组的特征微生物(LDA>4的微生物)，也就是相对于其他分组，在这个组中丰度较高的微生物。LEfSe分析LDA柱形图(图4)更直观的看出，在属水平上，空白组显著性较高的是阿克曼菌属(Akkermansia)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、丁酸弧菌 (Anaerostipes)、颤螺菌属(Oscillospira)。AAD模型组显著性较高的是布劳特氏菌属(Blautia)、肠杆菌属(Enterobacteriaceae)、假单胞菌(Pseudomonas)。而生姜泻心汤治疗组显著性最高的是拟杆菌属(Bacteroides)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、梭菌属(Clostridium)、萨特菌属(Sutterella)、变形杆菌属(Proteus)。

生姜泻心汤治疗之后，与AAD模型组对比变化最大的细菌就是肠杆菌的减少和拟杆菌的增多，如图(4)所示。这些结果表明，肠杆菌属、布劳特氏菌(Blautia)、多尔氏菌属 (Dorea)、克雷伯氏菌和肠杆菌的急剧过度生长，以及S24-7菌、乳酸菌、阿克曼菌类的丧失，可能在AAD发病中发挥作用。结果也证实，生姜泻心汤的治疗可以调节AAD大鼠菌群的组成，加快菌群的恢复，重建了与空白组组小鼠相似的微生物环境，表明生姜泻心汤可以调节肠道菌群的组成和多样性，从而减轻腹泻症状。

讨论

目前医学上对AAD的主要认识，是抗生素的应用导致的菌群失调引起的腹泻，临床上应用的治疗方案主要是抗生素治疗、微生物制剂治疗，也有用粪便移植的方法来治疗的，但是这些方法都有一定的局限性。中医认为，AAD的病因是使用苦寒药性的抗生素，损伤人体正气，导致脾阳不足，脾阳虚则不能运化水湿，水浊内停，湿毒内生，水湿下迫肠道使小肠不能分清泌浊而导致泄泻，久病及肾，最后出现脾肾阳虚，而脾虚一直是各家比较一致的观点。中医在辨证治疗中，多数医家使用参苓白术散、七味白术散加减健脾祛湿为主，也有使用四君子汤、理中汤、附子理中汤、四神加味丸以健脾温肾治疗。生姜泻心汤以苦治热，以甘补虚，以辛散痞，寒热并用，破滞宣阳。其中人参和半夏的配伍使脾气升、胃气降，脾胃调和；人参、干姜、炙甘草和大枣配伍能够温运脾阳。在对于AAD的治疗中起着重要的作用。

给药剂量：生姜泻心汤提取，浓缩至1g/mL，以生药量计6.3g/kg/day(低剂量), 12.6g/kg/day(高剂量)，灌胃给药。每只大鼠按250g的体重，灌胃给药1.58mL(低剂量)，3.15mL(高剂量)。

按照大鼠和人的给药剂量换算，成人(60kg)给药剂量为121.94mL/day。

目前并没有对于生姜泻心汤治疗AAD的相关报道，本研究表明，生姜泻心汤对于AAD 有一定的疗效，生姜泻心汤高剂量和低剂量没有明显的差距，故选择生姜泻心汤低剂量。其作用机制主要是保护了大鼠的肠道屏障，并调整了肠道菌群。该研究为临床治疗AAD提供参考。

通过HPLC技术手段建立生姜泻心汤指纹图谱方法，为生姜泻心汤的质量控制提供科学参考。

1实验材料

1.1实验仪器

液相色谱串联离子阱飞行时间质谱(LC-IT-TOF-MS)，配置自动进样器、柱温箱、UV检测器(日本岛津公司)；LC-MS solution工作站；Eppendorf 5424R小型台式高速冷冻离心机(德国)；0.22μm微孔滤膜；98-Ⅰ-B电子调温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司)；BSA224S-CW电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；XS205型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；Inertsil ODS-SP C18色谱柱(4.6mm×250 mm，5μm)，(日本岛津公司)；KQ3200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；RE-52A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；循环水真空泵(上海知信实验仪器技术有限公司)；移液器(德国Eppendorf公司)。

1.2实验试剂

1.2.1药材

实验所用药材法半夏、炙甘草、黄芩、干姜、黄连、大枣购于首都医科大学附属北京友谊医院中药房，人参购于盛实百草药业有限公司，生姜购于北京人卫中药饮片厂。经首都医科大学附属北京友谊医院赵奎君教授鉴定，法半夏为天南星科植物半夏Pinellia ternata(Thunb.)Breit.的干燥块茎的炮制加工品；炙甘草豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根茎的炮制品；黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根；生姜为姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的新鲜根茎；干姜为姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根茎；黄连为毛茛科植物黄连 Coptis chinensis Franch.的干燥根茎；人参为参为五加科植物人参Panax ginseng C.A. Mey的干燥根和根茎；大枣为鼠李科植物枣Ziziphus jujuba Mill.的干燥成熟果实。各药材具体来源和批号见表1-1。

表1-1 8味药材产地与批号

1.2.2试剂及药品

水为屈臣氏蒸馏水；甲醇、甲酸为色谱纯(Fisher Scientific公司)；对照品：绿原酸(批号140730，含量≥98％，成都克洛玛生物科技有限公司)；甘草苷(批号： 111610-201607，含量以93.1％计，中国食品药品检定研究院)；姜黄素(批号：0823- 9802，中国食品药品检定研究院)；6-姜辣素(批号：111833-201806，含量≥99.9％，中国食品药品检定研究院)；黄芩素(批号：491-67-8，含量≥98％，中国药品生物制品检验所)；汉黄芩素(批号：153-18-4，含量≥98％，中国药品生物制品检验所)；黄芩苷(批号：110715-201016，含量以94.0％计，中国药品生物制品检验所)；盐酸小檗碱(批号： 110713-201814，中国食品药品检定研究院)；黄连碱(批号：B20560，上海源叶生物科技有限公司)

2.试验方法

1.1色谱条件

Inertsil ODS-SP C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为0.1％甲酸水溶液 (A)-0.1％甲酸甲醇溶液(B)，按照下表梯度进行洗脱。

表1-2洗脱梯度表

流速0.8mL·min-1，检测波长254nm，柱温40℃，进样量10μL。

2.2供试品溶液的制备

将处方中的8种药材按不同产地和批号进行排列组合，投药制备得到10批生姜泻心汤复方，具体药材来源组成见表1-2。10批生姜泻心汤复方(S1～S10)分别按照上述方法制备供试品溶液。

表1-3 10批生姜泻心汤药材来源批号随机分组表

2.3对照品溶液的制备

取各对照品适量，精密称定，加甲醇配制成对照品溶液(绿原酸100μg·mL–1、甘草苷 70μg·mL–1、黄连碱100μg·mL–1，盐酸小檗碱25μg·mL–1，黄芩苷200μg·mL –1、黄芩素25μg·mL–1、汉黄芩素90μg·mL–1、6-姜辣素30μg·mL–1、姜黄素 30μg·mL–1)，过0.22μm微孔滤膜，4℃冷藏备用。

1.2方法学考察

2.5.1精密度实验

取同一供试品溶液(S1)，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录图谱。

2.5.2重复性实验

按“2.3”项下供试品溶液制备的方法平行制备S1生姜泻心汤供试品溶液6份(S1-1～S1- 6)，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录图谱。

2.5.3稳定性实验

将供试品溶液S1，分别在0、2、4、8、12、24h按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。

1.3指纹图谱的建立及相似度评价

将混合对照品溶液按照“2.1”项下的色谱条件进行测定，记录色谱图。取14批生姜泻心汤汤复方(S1～S14)按照“2.1”项下的方法进行测定，记录色谱图。按照《中药色谱指纹图谱》要求将10批生姜泻心汤供试品溶液的图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)》进行分析，将峰面积较大、分离度较好的色谱峰进行标定。

2.实验结果

2.1方法学考察结果

2.1.1参照峰的选择

在生姜泻心汤汤剂的指纹图谱中，选择峰面积较大而且稳定，分离度较好的5个峰(1 号、6号、18号、27号、31号峰)作为参照峰。在以下的方法学考察研究中，均以各供试品溶液色谱图中的1号、6号、18号、27号、31号色谱峰为参照峰，计算其相对保留时间(RRT)的RSD值和相对峰面积(RPA)的RSD值。

2.1.2精密度考察结果

记录六次进样的色谱图，并将数据采用A版指纹图谱相似度评价软件进行处理，进行色谱峰匹配，6次进样图谱与对照图谱相似度均大于0.998。计算各参照峰相对保留时间 (RRT)的RSD值，均小于0.38％；计算其相对峰面积(RPA)的RSD值，均小于2.95％；表明该方法精密度良好，符合特征图谱相关要求。精密度考察结果如表1-4和表1-5所示。

表1-4精密度试验结果(相对保留时间)(n＝6)

表1-5精密度试验结果(相对峰面积)(n＝6)

2.1.3重复性考察结果

记录六次进样的色谱图，并将数据采用A版指纹图谱相似度评价软件进行处理，进行色谱峰匹配，6次进样图谱与对照图谱相似度均大于0.995。计算各参照峰相对保留时间 (RRT)的RSD值，均小于1.30％；计算其相对峰面积(RPA)的RSD值，均小于4.81％；表明该方法的重复性好，符合特征图谱相关要求。精密度考察结果如表1-6和表1-7所示。

表1-6重复性试验结果(相对保留时间)(n＝6)

表1-7重复性试验结果(相对峰面积)(n＝6)

2.1.4稳定性考察结果

记录六次进样的色谱图，并将数据采用A版指纹图谱相似度评价软件进行处理，进行色谱峰匹配，6次进样图谱与对照图谱相似度均大于0.997。计算各参照峰相对保留时间 (RRT)的RSD值，均小于0.55％；计算其相对峰面积(RPA)的RSD值，均小于4.37％；表明供试品溶液在24h内稳定，符合特征图谱相关要求。稳定性考察结果如表1-8和表1-9 所示。

表1-8稳定性试验结果(相对保留时间)(n＝6)

表1-9稳定性试验结果(相对峰面积)(n＝6)

2.2指纹图谱的构建

将10批药材的供试品溶液在上述色谱条件下进行分析,导入A版指纹图谱相似度评价软件进行处理，以S1为参照谱，采用平均数法，时间窗宽度设定为0.1，多点校正，色谱峰自动匹配，生成对照指纹图谱，并计算相似度。生姜泻心汤HPLC指纹图谱，如图8所示，共标定出41个共有峰。编号S1-S10为10批样本的液相色谱，R为对照指纹图谱。

2.3相似度评价

指纹图谱相似度越接近1，说明色谱图间相似度值越高。表1-10为10个样品的相似度评价结果，10个样品的相似度都高于0.95，表明不同批次生姜泻心汤之间相似度良好，质量稳定，说明用于后期药效实验的生姜泻心汤品具有较好的稳定性，同时该指纹图谱可为生姜泻心汤药理药效实验的重复性做参考。

表1-10：10批生姜泻心汤指纹图谱相似度

3.讨论

考察对比了不同的流动相系统，包括乙腈-水、甲醇-水、0.1％甲酸甲醇-0.1％甲酸水溶液，结果表明，以0.1％甲酸甲醇-0.1％甲酸水溶液体系为流动相，采用梯度洗脱，能够达到较好的洗脱效果，各色谱峰的峰形和分离度相对较好，故选用0.1％甲酸甲醇-0.1％甲酸水溶液作为流动相系统。柱温考察20℃、25℃、30℃、40℃，最终选择40℃作为分离柱温。流动相流速考察0.6mL·min–1，0.8mL·min–1和1mL·min–1，0.8mL·min–1 色谱峰分离度最好，保留时间适中，最终选择0.8mL·min–1流速。精密吸取柴生姜泻心汤供试液10μL，进样分析，利用DAD检测器进行紫外扫描检测，对235、254、275、300、350nm 5个波长下检测的色谱图进行比较，确定合适的检测波长，结果表明供试品在254nm检测波长下检出色谱峰信息较全，峰面积最大，且基线较为稳定，故选择254 nm作为检测波长。

应用高效液相色谱法，成功建立了生姜泻心汤指纹图谱，标定了41个共有峰，并通过对照品对比确认了绿原酸、甘草苷、黄连碱、盐酸小檗碱、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、 6-姜辣素、姜黄素9个共有峰；查阅文献可知，绿原酸、甘草苷来自于甘草，黄连碱、盐酸小檗碱来源于黄连，黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素来源于黄芩，6-姜辣素、姜黄素来源于生姜和干姜。并进行了精密度、重复性、稳定性等方法学考察，结果表明，所用色谱方法符合指纹图谱技术定性研究要求；计算了10批生姜泻心汤相似度大于0.95，结果表明不同批次的生姜泻心汤之间相似度良好，质量稳定，表明该方法可作为生姜泻心泻心汤水煎液的质量控制标准。该方法可以为生姜泻心汤质量控制提供参考，对生姜泻心汤的临床应用有重要意义。

具体实施例

实施例1

取生姜84g,炙甘草63g,人参63g，干姜21g，黄芩27g，法半夏63g，黄连21g，大枣 63g。加水3.2L，浸泡30min，加热煎煮1h，过滤后加水2.5ml，再次煎煮1h，合并两次滤液，浓缩至约800ml。

实施例2

称取生姜12g、人参9g、黄芩9g、炙甘草9g，法半夏9g，干姜3g，黄连3g、大枣 9g，置于圆底烧瓶中，加8倍量水充分浸润，放置浸泡30min，电热套加热微沸回流提取 1h，趁热用3层纱布过滤，滤渣加6倍量水微沸回流提取30min，3层纱布过滤，合并两次的滤液，浓缩至50mL，得生药浓度为1.26g/mL，4℃冷藏备用。

实施例3

实施例4

采用建立的生姜泻心汤HPLC检测方法进行分析，确认包括实施例1-3的样品中含有绿原酸、甘草苷、黄连碱、盐酸小檗碱、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、6-姜辣素、姜黄素9 个成分。经进一步的指纹图谱分析，结果显示本批次提取液与前期建立的对照指纹图谱的相似度为0.983>0.90。

Claims

1.生姜泻心汤在制备治疗或预防抗生素相关性腹泻的组合物的用途。

2.生姜泻心汤在制备调整肠道菌群的组合物的用途，所述肠道菌群为厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门。

3.生姜泻心汤在制备调整肠道菌群的组合物的用途，所述肠道菌群为：肠杆菌和拟杆菌属。

4.生姜泻心汤在制备保护肠道黏膜屏障的组合物的用途。

5.生姜泻心汤，其特征在于：组成是生姜,炙甘草,人参，干姜，黄芩，法半夏，黄连，大枣。

6.生姜泻心汤，其特征在于：生姜5-60g,炙甘草5-45g,人参5-45g，干姜3-15g，黄芩5-45g，半夏5-45g，黄连3-15g，大枣5-60g。

7.生姜泻心汤，其特征在于：生姜12g,炙甘草9g,人参9g，干姜3g，黄芩9g，法半夏9g，黄连3g，大枣9g。

8.根据权利要求1-5的生姜泻心汤的制备方法可用中药汤药制备的常规方法。药材也可采用常规的中药饮片。