CN111217939A - 生物素与环糊精的偶联物及其应用 - Google Patents

生物素与环糊精的偶联物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生物素与环糊精的偶联物，属于医药化工技术领域。本发明提供了一类生物素与环糊精的偶联物，将环糊精上的‑OH与生物素的‑COOH酯化偶联，或者将环糊精上的‑OH转化成‑NH2，由氨基化的环糊精与生物素的‑COOH酰化偶联，或者采用NH2‑R1‑COOH、HO‑R1‑COOH(R1＝(CH2)n，n＝1～20)的连接子将环糊精和生物素连接；所得偶联物有益于生物素与肿瘤细胞表面的生物素受体结合，提高了环糊精对于肿瘤细胞的靶向性，提高其生物利用度，同时提高了环糊精的水溶性，能够用于药物传递，医药卫生等领域，用作药物载体，包载生物活性成分，具生物相容性好，肿瘤靶向等特征。

Description

生物素与环糊精的偶联物及其应用
技术领域
本发明属于医药化工技术领域，具体涉及一种生物素与环糊精的偶联物及其应用。
背景技术
环糊精是由D-型吡喃葡萄糖通过α-1,4糖苷键首尾相连而成的环状低聚糖，它主要包括α-，β-，γ-环糊精三种，它的分子它的分子呈锥桶状的立体结构，其分子具有亲水的外壁和疏水的内空腔(韩彬，环糊精对天然分子的包合行为研究及叶酸修饰环糊精的合成优化，昆明理工大学，2014)。环糊精可广泛应用于药品、食品、化妆品制造业等，在制药业中，主要用于增加药物的溶解度、稳定性和生物利用度。但实际上未经修饰的天然环糊精依然存在一些不能被忽视的缺点，例如键合能力有限、在有机溶剂中溶解性较差、催化活性低等，在一定程度上限制了环糊精的使用(王小凤，β-环糊精及其衍生物在靶向药物传递系统的研究进展[J]，北方药学，2017)。因此将环糊精进行修饰对克服环糊精水溶性具有重要的意义，而将修饰以后的环糊精的与生物素偶联，有望进一步的提高环糊精的水溶性。
环糊精还可以应用于靶向治疗，由于传统化疗药物对肿瘤细胞缺乏特异性，具有很大的毒副作用，限制了在临床治疗的应用范围。现代研究表明，有一些受体在正常的细胞表面不表达或很少表达，但在肿瘤细胞表面高度表达，如叶酸受体、整合素受体和去唾液酸糖蛋白受体等(安莲效，李慧，顾月清.RGD肽作为药物靶向配体的研究进展[J].中国生化药物杂志，2010，31：66-69)。因此可以将与受体特异性识别的靶向配体分子通过化学键连接在环糊精的表面，形成具有主动靶向性质的输送载体，包载化疗药物分子，构成主动靶向药物输送系统，使药物定向运送至肿瘤组织并发挥药效。因此本发明提出了一种环糊精与生物素相连的偶联物。
发明内容
基于上述发现，本发明提供了一种生物素与环糊精的偶联物，所述偶联物由环糊精上的-OH直接与生物素上的-COOH酯化偶联获得，或者先将环糊精上的-OH转化成-NH2，由氨基化的环糊精直接与生物素上的-COOH酰化偶联获得。
进一步的，在上述生物素与环糊精的偶联物基础上，本发明提供了另一种生物素与环糊精的偶联物，其在环糊精和生物素之间还含有连接子，所述连接子为NH2-R1-COOH或HO-R1-COOH，R1为(CH2)n，n＝1～20；所述偶联物由连接子上的-COOH与环糊精上的-OH酯化，或者先将环糊精上的-OH转化成-NH2，由氨基化的环糊精与连接子上的-COOH酰化，然后连接子上的-OH或-NH2再与生物素上的-COOH偶联获得。
上述生物素与环糊精的偶联物中，所述环糊精上的-OH的位点为2位、3位或6位。
上述生物素与环糊精的偶联物中，所述环糊精包括但不限于α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精，其结构式如下：
Figure BDA0002391451900000021
n＝1、2或3(依次对应α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精)。
上述生物素与环糊精的偶联物中，当环糊精6位上的-OH直接与生物素上的-COOH酯化偶联时，所述偶联物的制备方法包括以下步骤：
A、将环糊精C溶于水中，滴加NaOH，再向混合溶液中滴加对甲苯磺酰氯-乙腈溶液，用HCl调节pH，得化合物C1；
Figure BDA0002391451900000022
B、将化合物C1与生物素偶联，得生物素与环糊精的偶联物C4。
Figure BDA0002391451900000023
优选的，上述生物素与环糊精的偶联物中，步骤B中制备C4时，反应条件为：所述C1与生物素的摩尔用量比为1:100-100：1；反应溶液为30～90℃的热水，反应时间为1～72h。
上述生物素与环糊精的偶联物中，当先将环糊精6位上的-OH转化成-NH2，由氨基化的环糊精直接与生物素上的-COOH酰化偶联时，所述偶联物的制备方法包括以下步骤：
a、将环糊精C溶于水中，滴加NaOH，再向混合溶液中滴加对甲苯磺酰氯-乙腈溶液，用HCl调节pH，得化合物C1；
Figure BDA0002391451900000024
b、将化合物C1与叠氮化钠反应，得化合物C2；
Figure BDA0002391451900000031
c、将化合物C2与三苯基膦混合反应，得化合物C3；
Figure BDA0002391451900000032
d、将生物素与催化剂、NHS混合加热反应，得生物素-NHS；
e、将化合物C3和生物素-NHS偶联，得生物素与环糊精的偶联物C5。
Figure BDA0002391451900000033
优选的，上述生物素与环糊精的偶联物中，步骤d中制备生物素-NHS时，反应条件为：所述催化剂包括但不限于DCC(二环己基碳二亚胺)、NHS(N-羟基丁二酰亚胺)、EDCI(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)、DMAP(4-二甲氨基吡啶)或HOBT(1-羟基苯并三唑)；所述加热反应的温度为20～80℃。
优选的，上述生物素与环糊精的偶联物中，步骤e中制备C5时，反应条件为：C3与生物素-NHS的摩尔用量比为1:100-100：1；反应温度为5～80℃，反应时间为1～72h。
上述生物素与环糊精的偶联物中，当环糊精2位上的-OH直接与生物素上的-COOH酯化偶联时，所述偶联物的制备方法包括以下步骤：
A、将环糊精C溶于NaOH溶液(浓度为0.01～2mol/L)中，再向混合溶液中滴加对甲苯磺酰氯-乙腈溶液，同时滴加NaOH(浓度为0.01～3mol/L)溶液，使pH始终保持碱性(8-14或更高)，搅拌反应，得化合物C6；
Figure BDA0002391451900000034
B、将化合物C6和生物素偶联，得生物素与环糊精的偶联物C9。
Figure BDA0002391451900000041
优选的，上述生物素与环糊精的偶联物中，步骤B中制备C9时，反应条件为：所述C6与生物素的摩尔用量比为1:100-100：1；反应溶液为30～90℃的热水，反应时间为1～72h。
上述生物素与环糊精的偶联物中，当先将环糊精2位上的-OH转化成-NH2，由氨基化的环糊精直接与生物素上的-COOH酰化偶联时，所述偶联物的制备方法包括以下步骤：
a、将环糊精C溶于NaOH溶液(浓度为0.01～2mol/L)中，再向混合溶液中滴加对甲苯磺酰氯-乙腈溶液，同时滴加NaOH溶液(浓度为0.01～3mol/L)，使pH始终保持碱性(8-14或更高)，搅拌反应，得化合物C6；
Figure BDA0002391451900000042
b、将化合物C6与叠氮化钠反应，得化合物C7；
Figure BDA0002391451900000043
c、将化合物C7与三苯基膦混合反应，得化合物C8；
Figure BDA0002391451900000044
d、将生物素与催化剂、NHS混合加热反应，得生物素-NHS；
e、将化合物C8和生物素-NHS偶联，得生物素与环糊精的偶联物C10。
Figure BDA0002391451900000045
优选的，上述生物素与环糊精的偶联物中，步骤d中制备生物素-NHS时，反应条件为：所述催化剂包括但不限于DCC(二环己基碳二亚胺)、NHS(N-羟基丁二酰亚胺)、EDCI(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)、DMAP(4-二甲氨基吡啶)或HOBT(1-羟基苯并三唑)；所述加热反应的温度为20～80℃。
优选的，上述生物素与环糊精的偶联物中，步骤e中制备C10时，反应条件为：C8与生物素-NHS的摩尔用量比为1:100-100：1；反应温度为5～80℃，反应时间为1～72h。
上述生物素与环糊精的偶联物中，当环糊精3位上的-OH直接与生物素上的-COOH酯化偶联时，所述偶联物的制备方法包括以下步骤：
A、将环糊精C溶于吡啶中，再向混合溶液中滴加对甲苯磺酰氯-吡啶溶液，减压蒸馏，加入丙酮沉淀，重结晶固体，得化合物C11；
Figure BDA0002391451900000051
B、将化合物C11和生物素偶联，得生物素与环糊精的偶联物C14。
Figure BDA0002391451900000052
优选的，上述生物素与环糊精的偶联物中，步骤A中制备C11时，反应条件为：所述环糊精与吡啶的质量比为1:0.1～100；所述对甲苯磺酰氯-吡啶溶液对甲苯黄酰氯的浓度为0.01％～100％(质量体积比)。
优选的，上述生物素与环糊精的偶联物中，步骤B中制备C14时，反应条件为：C11与生物素的摩尔用量比为1:100-100：1；反应溶液为30～90℃的热水，反应时间为1～72h。
上述生物素与环糊精的偶联物中，当先将环糊精3位上的-OH转化成-NH2，由氨基化的环糊精直接与生物素上的-COOH酰化偶联时，所述偶联物的制备方法包括以下步骤：
a、将环糊精C溶于吡啶中(环糊精与吡啶的质量比为1:0.1～100)，再向混合溶液中滴加对甲苯磺酰氯-吡啶溶液(所述对甲苯磺酰氯-吡啶溶液对甲苯黄酰氯的浓度为0.01％～100％(质量体积比))，减压蒸馏，加入丙酮沉淀，重结晶固体，得化合物C11；
Figure BDA0002391451900000053
b、将化合物C11与叠氮化钠反应，得化合物C12；
Figure BDA0002391451900000054
c、将化合物C12与三苯基膦反应，得到化合物C13；
Figure BDA0002391451900000061
d、将生物素与催化剂、NHS混合加热反应，得生物素-NHS；
e、将化合物C13和生物素-NHS偶联，得生物素与环糊精的偶联物C15。
Figure BDA0002391451900000062
优选的，上述生物素与环糊精的偶联物中，步骤d中制备生物素-NHS时，反应条件为：所述催化剂包括但不限于DCC(二环己基碳二亚胺)、NHS(N-羟基丁二酰亚胺)、EDCI(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)、DMAP(4-二甲氨基吡啶)或HOBT(1-羟基苯并三唑)；所述加热反应的温度为20～80℃。
优选的，上述生物素与环糊精的偶联物中，步骤e中制备C15时，反应条件为：C13与生物素-NHS的摩尔用量比为1:100-100：1；反应温度为5～80℃，反应时间为1～72h。
上述生物素与环糊精的偶联物中，采用连接子偶联生物素和环糊精，当连接子上的-COOH与环糊精上的-OH酯化，然后连接子上的-OH或-NH2再与生物素上的-COOH偶联时，所述偶联物的制备方法包括以下步骤：
先将连接子的-NH2、-OH进行保护，再将连接子的-COOH与化合物C1、C6或C11酯化偶联，然后将连接子上被保护的基团脱保护，再与生物素-NHS偶联，得生物素与环糊精间接偶联的偶联物C28～C33，结构式如下：
Figure BDA0002391451900000063
Figure BDA0002391451900000071
具体的，制备C28～C33时，反应步骤为：
a、将环糊精-OH磺酰化；
b、将连接子NH2-R1-COOH和HO-R1-COOH用保护基保护；NH2-R1-COOH的保护基包括但不限于Boc(叔丁氧羰基)、Fmoc保护基(如芴甲氧羰羰基)、Cbz(苄氧羰基)、Alloc(烯丙氧羰基)或Teoc(三甲基硅乙氧羰基)；HO-R1-COOH的保护基包括但不限于氯甲酸三氯乙酯、三乙基氯硅烷、三甲基氯硅烷或叔丁基二甲基氯硅烷；
c、将磺酰化的环糊精与保护后的连接子在热水(温度30～90℃)中反应5～72h，减压浓缩，丙酮沉淀，得环糊精与连接子(含保护基)的连接物；
d、将生物素用NHS活化，得生物素-NHS。
e、含保护基的NH2-R1-COOH与环糊精-OH的连接物加入三氟乙酸(TFA)，DMF，搅拌0.5～10h，脱保护，加入生物素-NHS，控制温度5～80℃，反应1～96h，丙酮沉淀得生物素与环糊精通过NH2-R1-COOH连接的偶联物；
或将含保护基的HO-R1-COOH与环糊精-OH的连接物溶于乙腈和吡啶的混合液中(混合比例：乙腈：吡啶体积比＝1:100～100:1)，加入氢氟酸，在0-15℃下反应1-30h，室温反应1～40h，脱保护，萃取，有机相除吡啶后减压浓缩，干燥得固体；脱保护后溶于DMF中，加入生物素，1～20个当量的DCC，0.2～10个当量的DMAP，控制温度5～80℃，反应反应1～96h，丙酮沉淀，柱层析，减压浓缩，得生物素与环糊精通过HO-R1-COOH连接的偶联物；
所用的连接子与磺酰化环糊精或环糊精(包括但不限于C1、C6或C11)的摩尔用量比为1:100-100：1；生物素与连接子修饰的环糊精的摩尔用量比为1:100-100：1。
上述生物素与环糊精的偶联物中，当先将环糊精上的-OH转化成-NH2，由氨基化的环糊精与连接子上的-COOH酰化，然后连接子上的-OH或-NH2再与生物素上的-COOH偶联时，所述偶联物的制备方法包括以下步骤：
先将连接子的-NH2、-OH进行保护，再将连接子的-COOH与化合物C3、C8或C13酰化偶联，然后将连接子上被保护的基团脱保护，再与生物素-NHS偶联，得生物素与环糊精间接偶联的偶联物C34～C39，结构式如下：
Figure BDA0002391451900000072
Figure BDA0002391451900000081
。
具体的，制备C34～C39时，反应步骤为：
a、将环糊精磺酰化，叠氮化，氨基化得氨基化环糊精；
b、将连接子NH2-R1-COOH和HO-R1-COOH用保护基保护；NH2-R1-COOH的保护基包括但不限于Boc(叔丁氧羰基)、Fmoc保护基(如芴甲氧羰羰基)、Cbz(苄氧羰基)、Alloc(烯丙氧羰基)或Teoc(三甲基硅乙氧羰基)；HO-R1-COOH的保护基包括但不限于氯甲酸三氯乙酯、三乙基氯硅烷、三甲基氯硅烷或叔丁基二甲基氯硅烷；
c、将保护后的连接子与氨基化环糊精溶于DMF，加入NHS，DCC，控制温度10～70℃，反应2～72h，丙酮或乙醚沉淀，干燥得含保护基的连接子与氨基化环糊精的连接物；
d、将生物素用NHS活化，得生物素-NHS；
e、含保护基的NH2-R1-COOH与氨基化环糊精的连接物加入三氟乙酸(TFA)，DMF，搅拌0.5～10h，脱保护，加入生物素-NHS，控制温度5～70℃，反应1～96h，丙酮沉淀得生物素与环糊精通过NH2-R1-COOH连接的偶联物；
或将含保护基的HO-R1-COOH与氨基化环糊精的连接物溶于乙腈和吡啶的混合液中(混合比例：乙腈/吡啶＝1:100～100:1)，加入三氟乙酸，在0-15℃下反应2-30h，室温反应2～40h，脱保护，萃取，有机相除吡啶后减压浓缩，干燥得固体；脱保护后溶于DMF中，加入生物素，加入生物素，1～20个当量的DCC，0.2～10个当量的DMAP，控制温度5～80℃，反应反应1～96h，丙酮沉淀，柱层析，减压浓缩，得生物素与环糊精通过HO-R1-COOH连接的偶联物；
所用的连接子与磺酰化环糊精或环糊精(包括但不限于C1、C6或C11)的摩尔用量比为1:100-100：1；生物素与连接子修饰的环糊精的摩尔用量比为1:100-100：1。
进一步的，本发明还提供了以上述生物素与环糊精的偶联物为主要成分的药物载体，用于包载生物活性成分，如抗肿瘤药物紫杉醇，喜树碱，鬼臼毒素，甲氨蝶呤等。
更进一步的，本发明还提供了上述生物素与环糊精的偶联物及以其为药物载体包载抗肿瘤药物，在抗肿瘤中的应用；其具有肿瘤靶向，高溶解性等特征。
术语说明：
C1：单-6-对甲苯磺酰基-6-脱氧-α-环糊精(C1a)、单-6-对甲苯磺酰基-6-脱氧-β-环糊精(C1b)、单-6-对甲苯磺酰基-6-脱氧-γ-环糊精(C1c)。
C2：单-6-N3-6-脱氧-α-环糊精(C2a)、单-6-N3-6-脱氧-β-环糊精(C2b)、单-6-N3-6-脱氧-γ-环糊精(C2c)。
C3：单-6-氨基-6-脱氧α-环糊精(C3a)、单-6-氨基-6-脱氧-β-环糊精(C3b)、单-6-氨基-6-脱氧-γ-环糊精(C3c)。
C4：单-6-生物素-α-环糊精酯键接物(C4a)、单-6-生物素-β-环糊精酯键接物(C4b)、单-6-生物素-γ-环糊精酯键接物(C4c)。
C5：单-6-生物素-α-环糊精酰胺键接物(C5a)、单-6-生物素-β-环糊精酰胺键接物(C5b)、单-6-生物素-γ-环糊精酰胺键接物(C5c)。
C6：单-2-脱氧-对甲苯磺酰基-α-环糊精(C6a)、单-2-脱氧-对甲苯磺酰基-β-环糊精(C6b)、单-2-脱氧-对甲苯磺酰基-γ-环糊精(C6c)。
C7：单-2-脱氧-N3-α-环糊精(C7a)、单-2-脱氧-N3-β-环糊精(C7b)、单-2-脱氧-N3-γ-环糊精(C7c)。
C8：单-2-脱氧-氨基-α-环糊精(C8a)、单-2-脱氧-氨基-β-环糊精(C8b)、单-2-脱氧-氨基-γ-环糊精(C8c)。
C9：单-2-生物素-α-环糊精酯键接物(C9a)、单-2-生物素-β-环糊精酯键接物(C9b)、单-2-生物素-γ-环糊精酯键接物(C9c)。
C10：单-2-生物素-α-环糊精酰胺键接物(C10a)、单-2-生物素-β-环糊精酰胺键接物(C10b)、单-2-生物素-γ-环糊精酰胺键接物(C10c)。
C11：单-3-脱氧-对甲苯磺酰基-α-环糊精(C11a)、单-3-脱氧-对甲苯磺酰基-β-环糊精(C11b)、单-3-脱氧-对甲苯磺酰基-γ-环糊精(C11c)。
C12：单-3-脱氧-N3-α-环糊精(C12a)、单-3-脱氧-N3-β-环糊精(C12b)、单-3-脱氧-N3-γ-环糊精(C12c)。
C13：单-3-脱氧-氨基-α-环糊精(C13a)、单-3-脱氧-氨基-β-环糊精(C13b)、单-3-脱氧-氨基-γ-环糊精(C13c)。
C14：单-3-生物素-α-环糊精酯键接物(C14a)、单-3-生物素-β-环糊精酯键接物(C14b)、单-3-生物素-γ-环糊精酯键接物(C14c)。
C15：单-3-生物素-α-环糊精酰胺键接物(C15a)、单-3-生物素-β-环糊精酰胺键接物(C15b)、单-3-生物素-γ-环糊精酰胺键接物(C15c)。
C16：单-6-生物素-氨基丁酸-α-环糊精酯键接物(C16a)、单-6-生物素-氨基丁酸-β-环糊精酯键接物(C16b)、单-6-生物素-氨基丁酸-γ-环糊精酯键接物(C16c)。
C17：单-6-生物素-羟基丁酸-α-环糊精酯键接物(C17a)、单-6-生物素-羟基丁酸-β-环糊精酯键接物(C17b)、单-6-生物素-羟基丁酸-γ-环糊精酯键接物(C17c)。
C18：单-2-生物素-氨基丁酸-α-环糊精酯键接物(C18a)、单-2-生物素-氨基丁酸-β-环糊精酯键接物(C18b)、单-2-生物素-氨基丁酸-γ-环糊精酯键接物(C18c)。
C19：单-2-生物素-羟基丁酸-α-环糊精酯键接物(C19a)、单-2-生物素-羟基丁酸-β-环糊精酯键接物(C19b)、单-2-生物素-羟基丁酸-γ-环糊精酯键接物(C19c)。
C20：单-3-生物素-氨基丁酸-α-环糊精酯键接物(C20a)、单-3-生物素-氨基丁酸-β-环糊精酯键接物(C20b)、单-3-生物素-氨基丁酸-γ-环糊精酯键接物(C20c)。
C21：单-3-生物素-羟基丁酸-α-环糊精酯键接物(C21a)、单-3-生物素-羟基丁酸-β-环糊精酯键接物(C21b)、单-3-生物素-羟基丁酸-γ-环糊精酯键接物(C21c)。
C22：单-6-生物素-氨基丁酸-α-环糊精酰胺键接物(C22a)、单-6-生物素-氨基丁酸-β-环糊精酰胺键接物(C22b)、单-6-生物素-氨基丁酸-γ-环糊精酰胺键接物(C22c)。
C23：单-6-生物素-羟基丁酸-α-环糊精酰胺键接物(C23a)、单-6-生物素-羟基丁酸-β-环糊精酰胺键接物(C23b)、单-6-生物素-羟基丁酸-γ-环糊精酰胺键接物(C23c)。
C24：单-2-生物素-氨基丁酸-α-环糊精酰胺键接物(C24a)、单-2-生物素-氨基丁酸-β-环糊精酰胺键接物(C24b)、单-2-生物素-氨基丁酸-γ-环糊精酰胺键接物(C24c)。
C25：单-2-生物素-羟基丁酸-α-环糊精酰胺键接物(C25a)、单-2-生物素-羟基丁酸-β-环糊精酰胺键接物(C25b)、单-2-生物素-羟基丁酸-γ-环糊精酰胺键接物(C25c)
C26：单-3-生物素-氨基丁酸-α-环糊精酰胺键接物(C26a)、单-3-生物素-氨基丁酸-β-环糊精酰胺键接物(C26b)、单-3-生物素-氨基丁酸-γ-环糊精酰胺键接物(C26c)。
C27：单-3-生物素-羟基丁酸-α-环糊精酰胺键接物(C27a)、单-3-生物素-羟基丁酸-β-环糊精酰胺键接物(C27b)、单-3-生物素-羟基丁酸-γ-环糊精酰胺键接物(C27c)。
本发明的有益效果：
本发明所述一种生物素与环糊精的偶联物，将环糊精上的-OH与生物素的-COOH酯化偶联，或者将环糊精上的-OH转化成-NH2，由氨基化的环糊精与生物素的-COOH酰化偶联，或者采用连接子(连接子为NH2-R1-COOH、HO-R1-COOH，R1＝(CH2)n，n＝1～20)，将环糊精和生物素连接，所得偶联物有益于生物素与肿瘤细胞表面的生物素受体结合提高环糊精对于肿瘤细胞的靶向性，增强其抗肿瘤效果，同时提高了环糊精的水溶性。
附图说明
图1为HepG2分别用C5b-R，C26b-R和C27b-R孵育1h后的荧光显微镜图；其中，A为罗丹明B，B为C5b-R；C为C26b-R；D为C27b-RB-CD-R。
图2为HepG2细胞孵育1h后的流式图。
图3为鬼臼毒素和B-CD-PPT对细胞毒性的影响
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但并不因此将本发明保护范围限制在所述的实施例范围之中。
实施例1
一种生物素与环糊精(所述环糊精为α-、β-、γ-环糊精)6位-OH酯化偶联或者环糊精将6位-OH转化成-NH2酰化偶联的偶联物，包括步骤：
A、室温下，将环糊精5-7g溶于30-50mL水中，加入氢氧化钠(1-1.5mL，8mol/L)，将对甲苯磺酰氯(0.5-1g)溶于2.5-4mL乙腈中，将该溶液滴加到环糊精混合溶液中，产生大量白色沉淀，调节pH到中性或者酸性，再在室温下搅拌，抽滤，收集固体干燥，得到化合物C1；
B、将1-1.2mmol化合物C1溶解在加热的10-15mL水中，加入生物素1-1.2mmol，持续反应24-48h，用丙酮沉淀，过滤，收集固体干燥，得生物素与环糊精6位-OH直接酯化的偶联物C4，所得偶联物参数如下：
单-6-生物素-α-环糊精酯键接物(C4a)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.85-5.54(m,14H),4.95-4.75(m,7H),4.56-4.06(m,7H),3.57-3.47(m,14H),3.41-3.19(m,28H),3.02-2.87(m,3H),2.32-1.25(m,8H).MS(ES),m/z:1221.39[M+Na]+.
单-6-生物素-β-环糊精酯键接物(C4b)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.75-5.40(m,14H),4.91-4.69(m,7H),4.60-4.12(m,8H),3.87-3.49(m,14H),3.42-3.17(m,28H),2.98-2.85(m,3H),2.62-1.45(m,8H).MS(ES),m/z:1383.45[M+Na]+.
单-6-生物素-γ-环糊精酯键接物(C4c)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.63-5.32(m,14H),4.87-4.67(m,7H),4.54-4.26(m,9H),3.86-3.45(m,14H),3.34-3.12(m,28H),2.91-2.75(m,3H),2.59-1.32(m,8H).MS(ES),m/z:1523.5[M+H]+.
C、将化合物C1(1-1.3g)溶于15-20ml的热水中，加入1.5-2g叠氮化钠，持续反应一段时间，冷却到室温，用丙酮沉淀，抽滤，固体干燥得到化合物C2；
D、将化合物C2(1-1.2g)和三苯基膦(0.3-0.5g)混合溶于10-15mL N-N二甲基甲酰胺溶液中，室温下搅拌2-4小时，加入2-5mL水，加热到80-90℃，持续反应一段时间，用丙酮沉淀，抽滤，收集固体干燥得到化合物C3；
E、将生物素(97.6-100mg)、NHS(48-60mg)，和DCC(130-150mg)混合加入到3-6mLDMF中，密封，加热到一定温度，搅拌下反应3-5h，冷却至室温，抽滤收集滤液，在冰浴中边搅拌边滴加乙醚，产生大量白色沉淀，继续搅拌一段时间，抽滤，收集固体在干燥，得到产物生物素-NHS；
F、将1-1.2mmol生物素-NHS与1-1.2mmol化合物C3溶解在5-8mLDMF中，在室温下反应24-48h，用丙酮沉淀，抽滤，收集固体干燥，得生物素和6位氨基化环糊精直接偶联的偶联物C5，所得偶联物参数如下：
单-6-生物素-α-环糊精酰胺键接物(C5a)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.79-5.63(m,14H),4.97-4.87(m,7H),4.45-4.36(m,7H),3.74-3.68(m,14H),3.60-3.47(m,28H),3.18-2.74(m,3H),2.33-1.98(m,8H).MS(ES),m/z:1220.41[M+Na]+.
单-6-生物素-β-环糊精酰胺键接物(C5b)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.81-5.66(m,14H),4.92-4.81(m,7H),4.46-4.34(m,8H),3.71-3.62(m,14H),3.58-3.39(m,28H),3.21-2.71(m,3H),2.25-1.92(m,8H).MS(ES),m/z:1360.46[M+H]+.
单-6-生物素-γ-环糊精酰胺键接物(C5ac)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.85-5.67(m,14H),4.93-4.83(m,7H),4.43-4.35(m,9H),3.72-3.57(m,14H),3.57-3.49(m,28H),3.25-2.77(m,3H),2.35-1.89(m,8H).MS(ES),m/z:1544.52[M+Na]+.
实施例2
一种生物素与环糊精(所述环糊精为α-、β-、γ-环糊精)2位-OH酯化偶联，或者将2位-OH转化成-NH2酰化偶联的偶联物，包括步骤：
A、将8.0-10g环糊精溶于320-350mL NaOH(0.15mol/L)溶液中，再把8.0-10g对甲苯磺酰氯溶于乙腈中，将所得的溶液溶于在室温下充分搅拌的上述环糊精溶液中，滴加过程中，不断加入NaOH(1mol/L)水溶液，使pH始终大于11-12.5，滴加完后再搅拌2-4h，然后向反应液中加入盐酸(1mol/L)水溶液和过量的碱中和，抽滤，除去未溶的对甲苯磺酰氯，减压蒸除部分水，再加入400-500mL甲醇，再次抽滤，减压蒸干溶液，把所得的固体溶于少量的热水，放入5℃冰浴中，滤去白色沉淀，收集滤液蒸干，得到白色粉末，将白色粉末进一步柱层析，最后得到化合物C6；
B、将1-1.2mmol化合物C6溶解在10-15mL热水中，加入生物素1-1.2mmol，持续反应24-48h，用丙酮沉淀，过滤，收集固体干燥，得生物素与2位-OH环糊精直接酯化的偶联物C9，所得偶联物参数如下：
单-2-生物素-α-环糊精酯键接物(C9a)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.96-5.45(m,13H),4.93-4.65(m,7H),4.60-4.49(m,8H),3.81-3.57(m,14H),3.42-3.13(m,28H),2.85-2.57(m,3H),2.35-1.85(m,8H).MS(ES),m/z:1199.35[M+H]+.
单-2-生物素-β-环糊精酯键接物(C9b)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.95-4.74(m,13H),4.91-4.62(m,7H),4.61-4.41(m,9H),3.80-3.55(m,14H),3.45-3.21(m,28H),2.83-2.56(m,3H),2.25-1.68(m,8H).MS(ES),m/z:1383.41[M+Na]+.
单-2-生物素-γ-环糊精酯键接物(C9c)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.97-4.71(m,13H),4.99-4.72(m,7H),4.63-4.47(m,9H),3.89-3.56(m,14H),3.49-3.25(m,28H),2.82-2.55(m,3H),2.36-1.78(m,8H).MS(ES),m/z:1523.52[M+H]+.
C、将化合物C6(1-1.3g)溶于15-20ml热水中，加入1.32-1.5g叠氮化钠，持续反应一段时间，冷却到室温，用丙酮沉淀，抽滤，固体干燥得到化合物C7；
D、将化合物C7(1-1.2g)和三苯基膦(0.3-0.5g，1.1mmol)混合溶于10-15mL N-N二甲基甲酰胺溶液中，室温下搅拌2-4小时，加入2-5mL水，加热到80-90℃，持续反应一段时间，用丙酮沉淀，抽滤，收集固体干燥得到化合物C8；
E、将生物素(97.6-100mg)、NHS(48-60mg)和DCC(130-150mg)混合加入到3-6mLN-N二甲基甲酰胺溶液中，密封，加热，搅拌下反应3-5h，冷却至室温，抽滤收集滤液，在冰浴中边搅拌边滴加乙醚，产生大量白色沉淀，继续搅拌一段时间，抽滤，收集固体在干燥，得到产物生物素-NHS；
F、将1-1.2mmol生物素-NHS与1-1.2mmol化合物C8在5-8mL DMF中室温下反应24-48h，用丙酮沉淀，抽滤，收集固体干燥，得到一种生物素和3位-氨基化环糊精直接偶联的偶联物C10，所得偶联物参数如下：
单-2-生物素-α-环糊精酰胺键接物(C10a)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.74-4.73(m,13H),4.68-4.52(m,7H),4.49-4.32(m,8H),3.56-3.36(m,14H),3.28-3.10(m,28H),2.84-2.69(m,3H),2.35-1.57(m,8H).MS(ES),m/z:1220.45[M+Na]+.
单-2-生物素-β-环糊精酰胺键接物(C10b)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.73-4.71(m,13H),4.63-4.50(m,7H),4.41-4.28(m,9H),3.51-3.37(m,14H),3.30-3.13(m,28H),2.95-2.87(m,3H),2.44-1.69(m,8H).MS(ES),m/z:1360.42[M+H]+.
单-2-生物素-γ-环糊精酰胺键接物(C10c)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.75-4.75(m,13H),4.73-4.55(m,7H),4.50-4.34(m,10H),3.61-3.47(m,14H),3.32-3.11(m,28H),2.85-2.77(m,3H),2.51-1.71(m,8H).MS(ES),m/z:1544.55[M+Na]+.
实施例3
一种生物素与环糊精(所述环糊精为α-、β-、γ-环糊精)3位-OH酯化，或者将3位-OH转化成-NH2酰化偶联的偶联物，包括步骤：
A、室温下，将环糊精(25-30g)溶于400-500mL吡啶中，吡啶用氧化钙干燥，再将对甲苯磺酰氯(4.0-4.5g)溶于30-50mL吡啶中，将对甲苯磺酰氯-吡啶溶液滴加到环糊精混合溶液中，滴加时温度控制在0-5℃以下，然后在室温下搅拌24-48h，减压蒸馏除去吡啶，加入600-700mL丙酮，搅拌30-45min，抽滤，用丙酮洗涤，再用热水重结晶，收集固体，在50-60℃真空干燥，得到化合物C11；
B、将1-1.2mmol化合物C11溶解在10-15mL热水中，加入生物素1-1.2mmol，持续反应24-48h，用丙酮沉淀，过滤，收集固体干燥，得到一种生物素与环糊精3位-OH直接酯化的偶联物C14，所得偶联物参数如下：
单-3-生物素-α-环糊精酯键接物(C14a)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.76-4.95(m,13H),4.93-4.65(m,7H),4.61-4.50(m,8H),3.57-3.46(m,14H),3.33-2.99(m,28H),2.85-2.67(m,3H),2.32-1.37(m,8H).MS(ES),m/z:1199.32[M+H]+.
单-3-生物素-β-环糊精酯键接物(C14b)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.85-4.89(m,13H),4.83-4.64(m,7H),4.60-4.49(m,9H),3.59-3.47(m,14H),3.38-3.03(m,28H),2.85-2.57(m,3H),2.42-1.60(m,8H).MS(ES),m/z:1361.48[M+H]+.
单-3-生物素-γ-环糊精酯键接物(C14c)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.94-5.11(m,13H),4.93-4.71(m,7H),4.65-4.52(m,10H),3.51-3.39(m,14H),3.31-2.93(m,28H),2.84-2.59(m,3H),2.41-1.41(m,8H).MS(ES),m/z:1545.55[M+Na]+.
C、将化合物C11(1-1.3g)溶于15-20ml热水中，加入1.32-1.5g叠氮化钠，持续反应一段时间，冷却到室温，用丙酮沉淀，抽滤，收集固体干燥得到化合物C12；
D、将化合物C12(1-1.3g)和三苯基膦(0.3-0.5g)混合溶于10-15mL N-N二甲基甲酰胺溶液中，室温下搅拌2-4小时，加入2-5mL水，加热到80-90℃，持续反应一段时间，用丙酮沉淀，抽滤，收集固体干燥得到化合物C13；
E、将生物素(97.6-100mg)、NHS(48-60mg)和DCC(130-150mg)混合加入到3-6mLN-N二甲基甲酰胺溶液中，密封，加热，搅拌下反应3-5h，冷却至室温，抽滤收集滤液，在冰浴中边搅拌边滴加乙醚，产生大量白色沉淀，继续搅拌一段时间，抽滤，收集固体在干燥，得到产物生物素-NHS；
F、将1-1.2mmol生物素-NHS与1-1.2mmol化合物C13在5-8mL DMF中室温下反应24-48h，用丙酮沉淀，抽滤，收集固体干燥，得到一种生物素和3位氨基化的环糊精直接偶联的偶联物C15，所得偶联物参数如下：
单-3-生物素-α-环糊精酰胺键接物(C15a)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.78-4.91(m,13H),4.83-4.65(m,7H),4.62-4.22(m,8H),3.71-3.57(m,14H),3.47-3.21(m,28H),3.15-2.87(m,3H),2.35-1.45(m,8H).MS(ES),m/z:1220.43[M+Na]+.
单-3-生物素-β-环糊精酰胺键接物(C15b)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.79-4.99(m,13H),4.87-4.62(m,7H),4.59-4.29(m,9H),3.69-3.51(m,14H),3.48-3.30(m,28H),3.25-2.86(m,3H),2.31-1.56(m,8H).MS(ES),m/z:1382.44[M+Na]+.
单-3-生物素-γ-环糊精酰胺键接物(C15c)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.78-4.95(m,13H),4.93-4.65(m,7H),4.58-4.21(m,9H),3.61-3.47(m,14H),3.41-3.23(m,28H),3.19-2.85(m,3H),2.38-1.49(m,8H).MS(ES),m/z:1544.53[M+Na]+.
实施例4
一种生物素与环糊精间接偶联的偶联物，由环糊精6位-OH与连接子(所述连接子为NH2-R1-COOH、HO-R1-COOH(R1＝(-CH2)n(n＝1～20))的-COOH酯化，再与生物素偶联的偶联物，包括步骤：
当连接子为NH2-R1-COOH(R1＝(-CH2)n(n＝1～20))：
A、室温下，将环糊精(5-7g)溶于30-50mL水中，加入氢氧化钠(1-1.5mL，8mol/L)，将对甲苯磺酰氯(0.5-1g)溶于2.5-4mL乙腈中，将该溶液滴加到环糊精混合溶液中，产生大量白色沉淀，调节pH到中性或者酸性，再在室温下搅拌，抽滤，收集固体干燥，得到化合物C1；
B、将1-1.2mmol NH2-R1-COOH(R1＝(-CH2)n(n＝1～20))溶于10-15mL水中，加入1-1.3g氢氧化钠，搅拌冷却下，加入0.01-0.05mL相转移催化剂，然后慢慢滴加1.2-1.4mmol(Boc)2O，室温下搅拌8-10h，然后调节pH至酸性，抽滤，干燥,得到Boc-NH-R1-COOH；
C、将1-1.2mmol化合物C1溶解在10-15mL热水中，加入1-1.2mmol Boc-NH-R1-COOH，持续反应24-48h，反应完成后减压蒸馏，然后用蒸馏水溶解析出的产物，并缓慢滴入100-200mL丙酮沉淀，过滤收集固体，真空干燥箱烘干，得到[6-Boc-NH-R1-COO]-CD；
D、将生物素(97.6-100mg)、NHS(48-60mg)和DCC(130-150mg)混合加入到3-6mLN-N二甲基甲酰胺溶液中，密封，加热，搅拌下反应3-5h，冷却至室温，抽滤收集滤液，在冰浴中边搅拌边滴加乙醚，产生大量白色沉淀，继续搅拌一段时间，抽滤，收集固体在干燥，得到产物生物素-NHS；
E、将1-1.2mmol[6-Boc-NH-R1-COO]-CD溶于5-8mL DMF中，加入TFA，脱保护，减压浓缩，得[6-NH2-R1-COO]-CD。加入生物素-NHS，室温下搅拌反应24-48h,用TLC监测反应进程，反应完成后，加入丙酮沉淀并多次洗涤，抽滤，干燥，得到一种生物素和环糊精间接偶联的偶联物C28。
以化合物C16为例，提供部分偶联物参数：
Figure BDA0002391451900000151
单-6-生物素-氨基丁酸-α-环糊精酯键接物(C16a)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.40-5.11(m,6H),4.77-4.71(m,12H),4.60-4.47(m,5H),4.24-3.90(m,17H),3.80-3.27(m,24H),3.10-2.85(m,2H),2.47-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1306.45[M+Na]+.
单-6-生物素-氨基丁酸-β-环糊精酯键接物(C16b)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.39-5.11(m,7H),4.79-4.71(m,14H),4.61-4.45(m,5H),4.34-3.90(m,20H),3.80-3.27(m,28H),3.10-2.85(m,2H),2.47-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1445.5[M+H]+.
单-6-生物素-氨基丁酸-γ-环糊精酯键接物(C16c)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.40-5.11(m,8H),4.77-4.71(m,16H),4.60-4.41(m,5H),4.28-3.90(m,23H),3.80-3.27(m,32H),3.10-2.85(m,2H),2.47-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1612.55[M+H]+.
当连接子为HO-R1-COOH(R1＝(-CH2)n(n＝1～20))：
A、室温下，将环糊精(5-7g)溶于30-50mL水中，加入氢氧化钠(1-1.5mL，8mol/L)，将对甲苯磺酰氯(0.5-1g)溶于2.5-4mL乙腈中，将该溶液滴加到环糊精混合溶液中，产生大量白色沉淀，调节pH到中性或者酸性，再在室温下搅拌，抽滤，收集固体干燥，得到化合物C1；
B、将1-1.2mmol HO-R1-COOH(R1＝(-CH2)n(n＝1～20))溶解在5-8ml DMF中,加入5-8ml干燥后的吡啶,加入2.5-4ml三乙基氯硅烷,加入,室温下反应24-48h,反应完成后蒸干溶液,得到(CH3CH2)3Si-O-R1-COOH；
C、将1mmol化合物C1溶解在10-15ml热水中，加入1-1.2mmol(CH3CH2)3Si-O-R1-COOH的产物，持续反应24-48h，反应完成后减压蒸馏，然后用蒸馏水溶解析出的产物，并缓慢滴入100-200ml丙酮沉淀，过滤收集固体，真空干燥箱烘干，得到产物[6-(CH3CH2)3Si-O-R1-COO]-CD；
D、将1-1.2mmol[6-(CH3CH2)3Si-O-R1-COO]-CD溶于乙腈和吡啶的混合液，加入氢氟酸2.5-3mL，在0-5℃下反应8-10h，再在室温下反应10-14h，萃取保留有机相，用CuSO4水溶液洗涤有机相，除去吡啶，将溶液旋转蒸发收集固体，真空干燥箱烘干,得到产物[6-HO-R1-COO]-CD；
E、将1-1.2mmol[6-HO-R1-COO]-CD溶于5-8mL DMF中，加入1-1.2mmol生物素，1-4mmolDCC，0.5-3mmolDMAP，室温下搅拌反应24-48h，用丙酮沉淀，抽滤，柱层析，减压浓缩，收集固体干燥，制得一种生物素与环糊精间接偶联的偶联物C29。
以化合物C17为例，提供部分偶联物参数：
Figure BDA0002391451900000161
单-6-生物素-羟基丁酸-α-环糊精酯键接物(C17a)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.40-5.09(m,6H),4.73-4.71(m,12H),4.60-4.37(m,7H),4.24-3.90(m,17H),3.80-3.27(m,22H),3.10-2.85(m,2H),2.32-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1307.43[M+Na]+.
单-6-生物素-羟基丁酸-β-环糊精酯键接物(C17b)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.45-5.11(m,7H),4.77-4.71(m,14H),4.60-4.48(m,7H),4.29-3.90(m,20H),3.80-3.27(m,26H),3.10-2.85(m,2H),2.32-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1469.48[M+Na]+.
单-6-生物素-羟基丁酸-γ-环糊精酯键接物(C17c)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.40-5.11(m,8H),4.77-4.71(m,16H),4.60-4.49(m,7H),4.27-3.90(m,23H),3.80-3.27(m,30H),3.10-2.85(m,2H),2.32-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1631.54[M+Na]+.
实施例5
一种生物素与环糊精间接偶联的偶联物，由环糊精2位-OH与连接子(所述连接子为NH2-R1-COOH、HO-R1-COOH(R1＝(CH2)n(n＝1～20))的-COOH酯化，再与生物素偶联的偶联物，包括步骤：
当连接子为NH2-R1-COOH(R1＝(CH2)n(n＝1～20))：
A、将8.0-10g环糊精溶于320-350mL NaOH(0.15mol/L)溶液中，再把8.0-10g对甲苯磺酰氯溶于乙腈中，将所得的溶液溶于在室温下充分搅拌的上述环糊精溶液中，滴加过程中，不断加入NaOH(1mol/L)水溶液，使pH始终大于11-12.5，滴加完后再搅拌2-4h，然后向反应液中加入盐酸(1mol/L)水溶液和过量的碱中和，抽滤，除去未溶的对甲苯磺酰氯，减压蒸除部分水，再加入400-500mL甲醇，再次抽滤，减压蒸干溶液，把所得的固体溶于少量的热水，放入5℃冰浴中，滤去白色沉淀，收集滤液蒸干，得到白色粉末，将白色粉末进一步柱层析，最后得到化合物C6；
B、将1-1.2mmol NH2-R1-COOH(R1＝(CH2)n(n＝1～20))溶于10-15ml水中，加入1-1.3g氢氧化钠，搅拌冷却下，加入0.01-0.05ml相转移催化剂，然后慢慢滴加1.2-1.4mmol(Boc)2O，室温下搅拌8-10h，然后调节pH至酸性，抽滤，干燥,得到Boc-NH-R1-COOH。
C、将1-1.2mmol化合物C6溶解在10-15ml热水中，加入1-1.2mmol Boc-NH-R1-COOH，持续反应24-48h，反应完成后减压蒸馏，然后用蒸馏水溶解析出的产物，并缓慢滴入100ml丙酮沉淀,过滤收集固体,真空干燥箱烘干,得到[2-Boc-NH-R1-COO]-CD。
D、将生物素(97.6-100mg)，NHS(48-60mg)，DCC(130-150mg)混合加入到3-6mlN-N二甲基甲酰胺溶液中，密封，加热，搅拌下反应3-5h，冷却至室温，抽滤收集滤液，在冰浴中边搅拌边滴加乙醚，产生大量白色沉淀，继续搅拌一段时间，抽滤，收集固体在干燥，得到产物生物素-NHS。
E、将1-1.2mmol[2-Boc-NH-R1-COO]-CD溶于5-8ml DMF中，加入TFA，脱保护，减压浓缩得2-NH-R1-COO]-CD；加入生物素-NHS，室温下搅拌反应24-48h，用TLC监测反应进程，反应完成后，加入丙酮沉淀并多次洗涤，抽滤，干燥，得到一种生物素和环糊精间接偶联的偶联物C30。
以化合物C18为例，提供部分偶联物参数：
Figure BDA0002391451900000171
单-2-生物素-氨基丁酸-α-环糊精酯键接物(C18a)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.99-5.40(m,6H),4.97-4.71(m,12H),4.60-4.49(m,3H),4.14-3.90(m,16H),3.80-3.30(m,26H),3.27-2.85(m,3H),2.35-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1284.41[M+H]+.
单-2-生物素-氨基丁酸-β-环糊精酯键接物(C18b)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.98-5.40(m,7H),4.95-4.71(m,14H),4.60-4.47(m,3H),4.12-3.90(m,19H),3.80-3.30(m,30H),3.27-2.85(m,3H),2.35-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1446.52[M+H]+.
单-2-生物素-氨基丁酸-γ-环糊精酯键接物(C18c)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.94-5.40(m,8H),4.97-4.71(m,16H),4.60-4.44(m,3H),4.18-3.90(m,22H),3.81-3.30(m,34H),3.27-2.85(m,3H),2.35-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1612.53[M+H]+.
当连接子为HO-R1-COOH(R1＝(CH2)n(n＝1～20))：
A、将8.0-10g环糊精溶于320-350mL NaOH(0.15mol/L)溶液中，再把8.0-10g对甲苯磺酰氯溶于乙腈中，将所得的溶液溶于在室温下充分搅拌的上述环糊精溶液中，滴加过程中，不断加入NaOH(1mol/L)水溶液，使pH始终大于11-12.5，滴加完后再搅拌2-4h，然后向反应液中加入盐酸(1mol/L)水溶液和过量的碱中和，抽滤，除去未溶的对甲苯磺酰氯，减压蒸除部分水，再加入400-500mL甲醇，再次抽滤，减压蒸干溶液，把所得的固体溶于少量的热水，放入0-5℃冰浴中，滤去白色沉淀，收集滤液蒸干，得到白色粉末，将白色粉末进一步柱层析，最后得到化合物C6。
B、将1-1.2mmol HO-R1-COOH(R1＝(CH2)n(n＝1～20))溶解在5-8ml DMF中，加入5-8ml干燥后的吡啶,加入2.5-4ml三乙基氯硅烷，加入,室温下反应24h，反应完成后蒸干溶液,得到(CH3CH2)3Si-O-R1-COOH。
C、将1-1.2mmol化合物C6溶解在10-15ml热水中，加入1-1.2mmol(CH3CH2)3Si-O-R1-COOH的产物，持续反应24-48h，反应完成后减压蒸馏，然后用蒸馏水溶解析出的产物，并缓慢滴入100-200ml丙酮沉淀，过滤收集固体，真空干燥箱烘干，得到产物[2-(CH3CH2)3Si-O-R1-COO]-CD。
D、将1-1.2mmol[2-(CH3CH2)3Si-O-R1-COO]-CD溶于乙腈和吡啶的混合液，加入氢氟酸2.5-4ml，在0-5℃下反应8-10h，再在室温下反应10-14h，萃取保留有机相，用CuSO4水溶液洗涤有机相，除去吡啶，将溶液旋转蒸发收集固体，真空干燥箱烘干，得到产物[2-HO-R1-COO-]-CD。
E、将1-1.2mmol[2-HO-R1-COO]-CD溶于5-8ml DMF中，加入1-1.2mmol生物素，1-4mmolDCC，0.5-3mmolDMAP，室温下搅拌反应24-48h，用丙酮沉淀，抽滤，柱层析，减压浓缩，收集固体干燥，制得一种生物素与环糊精间接偶联的偶联物C31。
以C19为例，提供部分偶联物参数：
Figure BDA0002391451900000181
单-2-生物素-羟基丁酸-α-环糊精酯键接物(C19a)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.92-5.40(m,6H),4.96-4.71(m,12H),4.60-4.13(m,5H),4.12-3.90(m,16H),3.83-3.30(m,24H),3.27-2.85(m,3H),2.35-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1307.41[M+Na]+.
单-2-生物素-羟基丁酸-β-环糊精酯键接物(C19b)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.97-5.40(m,7H),4.97-4.71(m,14H),4.63-4.13(m,5H),4.09-3.90(m,19H),3.80-3.30(m,28H),3.27-2.85(m,3H),2.35-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1469.46[M+Na]+.
单-2-生物素-羟基丁酸-γ-环糊精酯键接物(C19c)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.99-5.41(m,8H),4.97-4.71(m,16H),4.60-4.13(m,5H),4.10-3.87(m,22H),3.83-3.31(m,32H),3.27-2.85(m,3H),2.35-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1631.52[M+Na]+.
实施例6
一种生物素与环糊精间接偶联的偶联物，由环糊精3位-OH与连接子(所述连接子为NH2-R1-COOH、HO-R1-COOH(R1＝(CH2)n(n＝1～20))的-COOH酯化，再与生物素偶联的偶联物，包括步骤：
当连接子为NH2-R1-COOH(R1＝(CH2)n(n＝1～20))：
A、室温下，将环糊精(25-30g)溶于400-500ml吡啶中，吡啶用氧化钙干燥，再将对甲苯磺酰氯(4.0-4.5g)溶于30-50ml吡啶中，将对甲苯磺酰氯-吡啶溶液滴加到环糊精混合溶液中，滴加时温度控制在0-5℃以下，然后在室温下搅拌24-48h，减压蒸馏除去吡啶，加入600-700ml丙酮，搅拌30-45min，抽滤，用丙酮洗涤，再用热水重结晶，收集固体，在50-60℃真空干燥，得到化合物C11。
B、将1-1.2mmol NH2-R1-COOH(R1＝(CH2)n(n＝1～20))溶于10-15ml水中，加入1-1.3g氢氧化钠，搅拌冷却下，加入0.01-0.05ml相转移催化剂，然后慢慢滴加1.2-1.4mmol(Boc)2O，室温下搅拌8-10h，然后调节pH至酸性，抽滤，干燥,得到Boc-NH-R1-COOH。
C、将1-1.2mmol化合物C11溶解在10-15ml热水中，加入1-1.2mmol Boc-NH-R1-COOH，持续反应24-48h，反应完成后减压蒸馏，然后用蒸馏水溶解析出的产物，并缓慢滴入100-200ml丙酮沉淀,过滤收集固体,真空干燥箱烘干,得到[3-Boc-NH-R1-COO]-CD。
D、将生物素(97.6-100mg)，NHS(48-60mg)，DCC(130-150mg)混合加入到3-6mlN-N二甲基甲酰胺溶液中，密封，加热，搅拌下反应3-5h，冷却至室温，抽滤收集滤液，在冰浴中边搅拌边滴加乙醚，产生大量白色沉淀，继续搅拌一段时间，抽滤，收集固体在干燥，得到产物生物素-NHS。
E、将1-1.2mmol[3-Boc-NH-R1-COO]-CD溶于5-8ml DMF中，加入TFA，脱保护，减压浓缩得[3-NH2-R1-COO]-CD；加入生物素-NHS，室温下搅拌反应24-48h，用TLC监测反应进程，反应完成后，加入丙酮沉淀并多次洗涤，抽滤，干燥，得到一种生物素和环糊精间接偶联的偶联物C32。
以化合物C20为例，提供部分偶联物参数：
Figure BDA0002391451900000201
单-3-生物素-氨基丁酸-α-环糊精酯键接物(C20a)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.41-5.09(m,6H),4.97-4.71(m,12H),4.60-4.49(m,3H),4.48-3.90(m,16H),3.89-3.30(m,26H),3.27-2.85(m,3H),2.35-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1284.42[M+H]+.
单-3-生物素-氨基丁酸-β-环糊精酯键接物(C20b)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.40-5.08(m,7H),4.97-4.71(m,14H),4.62-4.49(m,3H),4.47-3.90(m,19H),3.89-3.30(m,30H),3.27-2.85(m,3H),2.35-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1468.54[M+Na]+.
单-3-生物素-氨基丁酸-γ-环糊精酯键接物(C20c)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.43-5.07(m,8H),4.97-4.71(m,16H),4.60-4.489(m,3H),4.45-3.90(m,22H),3.89-3.33(m,34H),3.27-2.85(m,3H),2.35-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1634.56[M+Na]+.
当连接子为HO-R1-COOH(R1＝(CH2)n(n＝1～20))：
A、室温下，将环糊精(25-30g)溶于400-500ml吡啶中，吡啶用氧化钙干燥，再将对甲苯磺酰氯(4.0-4.5g)溶于30-50ml吡啶中，将对甲苯磺酰氯-吡啶溶液滴加到环糊精混合溶液中，滴加时温度控制在0-5℃以下，然后在室温下搅拌24-48h，减压蒸馏除去吡啶，加入600-700ml丙酮，搅拌30-45min，抽滤，用丙酮洗涤，再用热水重结晶，收集固体，在50-60℃真空干燥，得到化合物C11。
B、将1-1.2mmol HO-R1-COOH(R1＝(CH2)n(n＝1～20))溶解在5-8ml DMF中,加入5-8ml干燥后的吡啶,加入2.5-4ml三乙基氯硅烷,室温下反应24-48h,反应完成后蒸干溶液,得到(CH3CH2)3Si-O-R1-COOH。
C、将1-1.2mmol化合物C11溶解在10-15ml热水中，加入1-1.2mmol(CH3CH2)3Si-O-R1-COOH的产物，持续反应24-48h，反应完成后减压蒸馏，然后用蒸馏水溶解析出的产物，并缓慢滴入100-200ml丙酮沉淀，过滤收集固体，真空干燥箱烘干，得到产物[3-(CH3CH2)3Si-O-R1-COO]-CD。
D、将1-1.2mmol[3-(CH3CH2)3Si-O-R1-COO]-CD溶于乙腈和吡啶的混合液，加入氢氟酸2.5-4ml，在0-5℃下反应8-10h，再在室温下反应10-14h,萃取保留有机相,用CuSO4水溶液洗涤有机相，除去吡啶，将溶液旋转蒸发收集固体，真空干燥箱烘干,得到产物[3-HO-R1-COO]-CD。
E、将1-1.2mmol[3-HO-R1-COO]-CD溶于5-8ml DMF中，加入1-1.2mmol生物素，1-4mmolDCC，0.5-3mmolDMAP，室温下搅拌反应24-48h，用丙酮沉淀，抽滤，柱层析，收集，减压浓缩，干燥，制得一种生物素与环糊精间接偶联的偶联物C33。
以化合物C21为例，提供部分偶联物参数：
Figure BDA0002391451900000211
单-3-生物素-羟基丁酸-α-环糊精酯键接物(C21a)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.43-5.09(m,6H),4.97-4.71(m,12H),4.60-4.49(m,5H),4.44-3.90(m,16H),3.89-3.30(m,24H),3.27-2.85(m,3H),2.35-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1307.4[M+Na]+.
单-3-生物素-羟基丁酸-β-环糊精酯键接物(C21b)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.42-5.09(m,7H),4.97-4.71(m,14H),4.60-4.43(m,5H),4.41-3.90(m,19H),3.89-3.30(m,28H),3.27-2.85(m,3H),2.35-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1447.45[M+H]+.
单-3-生物素-羟基丁酸-γ-环糊精酯键接物(C21c)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.40-5.09(m,8H),4.97-4.71(m,16H),4.60-4.39(m,5H),4.38-3.90(m,22H),3.85-3.30(m,32H),3.27-2.85(m,3H),2.35-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1631.55[M+Na]+.
实施例7
一种生物素与环糊精间接偶联的偶联物，由环糊精的6位-OH先转化成-NH2再与连接子(所述连接子为NH2-R1-COOH、HO-R1-COOH(R1＝(CH2)n(n＝1～20))的-COOH酰化，然后与生物素偶联的偶联物发明，包括步骤：
当连接子为NH2-R1-COOH(R1＝(CH2)n(n＝1～20))：
A、室温下，将环糊精(5-7g)溶于30-50ml水中，加入氢氧化钠(1-1.5ml,8mol/L)，将对甲苯磺酰氯(0.5-1g)溶于2.5-4ml乙腈中，将该溶液滴加到环糊精混合溶液中，产生大量白色沉淀，调节pH到中性或者酸性，再在室温下搅拌，抽滤，收集固体干燥，得到化合物C1。
B、将化合物C1(1-1.3g)溶于15-20ml热水中，加入1.5-2g叠氮化钠，持续反应一段时间，冷却到室温，用丙酮沉淀，抽滤，收集固体干燥得到化合物C2。
C、将化合物C2(1-1.3g)和三苯基膦(0.3-0.5g)混合溶于10-15ml N-N二甲基甲酰胺溶液中，室温下搅拌2-4小时，加入2-5ml水，加热到80-90℃，持续反应一段时间，用丙酮沉淀，抽滤，收集固体干燥得到化合物C3。
D、将1-1.2mmol NH2-R1-COOH(R1＝(CH2)n(n＝1～20))溶于10-15ml水中，加入1-1.3g氢氧化钠，搅拌冷却下，加入0.01-0.05ml相转移催化剂，然后慢慢滴加1.2-1.4mmol(Boc)2O，室温下搅拌8-10h，然后调节pH至酸性，抽滤，干燥,得到Boc-NH-R1-COOH。
E、将1-1.2mmol化合物C3溶解在10-15ml DMF中，加入1mmol Boc-NH-R1-COOH，1-2mmol NHS，1-4mmol DCC，室温下反应24-48h，加入丙酮沉淀,过滤收集固体,真空干燥箱烘干,得到[6-Boc-NH-R1-CO-NH]-CD。
F、将生物素(97.6-100mg)，NHS(48-60mg)，DCC(130-150mg)混合加入到3-6mlN-N二甲基甲酰胺溶液中，密封，加热，搅拌下反应3-5h，冷却至室温，抽滤收集滤液，在冰浴中边搅拌边滴加乙醚，产生大量白色沉淀，继续搅拌一段时间，抽滤，收集固体在干燥，得到产物生物素-NHS。
G、将1-1.2mmol[6-Boc-NH-R1-CO-NH]-CD溶于5-8ml DMF中，加入TFA，脱保护，减压浓缩得6-NH2-R1-CO-NH]-CD；加入生物素-NHS，室温下搅拌反应24-48h，用TLC监测反应进程，反应完成后，加入丙酮沉淀并多次洗涤，抽滤，干燥，得到一种生物素和环糊精间接偶联的偶联物C34。
以化合物C22为例，提供部分偶联物参数：
Figure BDA0002391451900000221
单-6-生物素-氨基丁酸-α-环糊精酰胺键接物(C22a)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.43-5.11(m,6H),4.91-4.71(m,11H),4.60-4.42(m,4H),4.14-3.90(m,17H),3.80-3.27(m,26H),3.10-2.85(m,2H),2.34-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1305.45[M+Na]+.
单-6-生物素-氨基丁酸-β-环糊精酰胺键接物(C22b)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.40-5.15(m,7H),4.89-4.71(m,13H),4.60-4.42(m,4H),4.13-3.90(m,20H),3.80-3.27(m,30H),3.10-2.85(m,2H),2.34-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1467.52[M+Na]+.
单-6-生物素-氨基丁酸-γ-环糊精酰胺键接物(C22c)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.40-5.12(m,8H),4.87-4.71(m,15H),4.60-4.42(m,4H),4.12-3.90(m,23H),3.80-3.27(m,34H),3.10-2.85(m,2H),2.34-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1607.57[M+H]+.
当连接子为HO-R1-COOH(R1＝(CH2)n(n＝1～20))：
A、室温下，将环糊精(5-7g)溶于30-50ml水中，加入氢氧化钠(1-1.5ml,8mol/L)，将对甲苯磺酰氯(0.5-1g)溶于2.5-4ml乙腈中，将该溶液滴加到环糊精混合溶液中，产生大量白色沉淀，调节pH到中性或者酸性，再在室温下搅拌，抽滤，收集固体干燥，得到化合物C1。
B、将化合物C1(1-1.3g)溶于15-20ml热水中，加入1.5-2g叠氮化钠，持续反应一段时间，冷却到室温，用丙酮沉淀，抽滤，收集固体干燥得到化合物C2。
C、将化合物C2(1-1.3g)和三苯基膦(0.3-0.5g)混合溶于10-15ml N-N二甲基甲酰胺溶液中，室温下搅拌2-4小时，加入2-5ml水，加热到80-90℃，持续反应一段时间，用丙酮沉淀，抽滤，收集固体干燥得到化合物C3。
D、将1-1.2mmol HO-R1-COOH(R1＝(CH2)n(n＝1～20))溶解在5-8ml DMF中,加入5-8ml干燥后的吡啶,加入2.5-4ml三乙基氯硅烷,加入,室温下反应24-48h,反应完成后蒸干溶液,得到(CH3CH2)3Si-O-R1-COOH。
E、将1-1.2mmol化合物C3溶解在10-15ml DMF中，加入1-1.2mmol(CH3CH2)3Si-O-R1-COOH，1-2mmol NHS，1-4mmol DCC，室温下搅拌反应24-48h，反应完成后加入丙酮沉淀，过滤收集固体，真空干燥箱烘干，得到产物[6-(CH3CH2)3Si-O-R1-CO-NH]-CD。
F、将1-1.2mmol[6-(CH3CH2)3Si-O-R1-CO-NH]-CD溶于乙腈和吡啶的混合液，加入氢氟酸2.5-4ml，在0-5℃下反应8-10h，再在室温下反应10-14h,萃取保留有机相,用CuSO4水溶液洗涤有机相，除去吡啶，将溶液旋转蒸发收集固体，真空干燥箱烘干,得到产物[6-HO-R1-CO-NH]-CD。
G、将1-1.2mmol[6-HO-R1-COO]-CD溶于5-8ml DMF中，加入1-1.2mmol生物素，1-4mmolDCC，0.5-3mmolDMAP，室温下搅拌反应24-48h，用丙酮沉淀，抽滤，柱层析，减压浓缩，收集固体干燥，制得一种生物素与环糊精间接偶联的偶联物C35。
以化合物C23为例，提供部分偶联物参数：
Figure BDA0002391451900000231
单-6-生物素-羟基丁酸-α-环糊精酰胺键接物(C23a)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.36-5.11(m,6H),4.77-4.71(m,12H),4.60-4.07(m,7H),4.04-3.90(m,17H),3.80-3.27(m,24H),3.10-2.85(m,2H),2.34-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1306.45[M+Na]+.
单-6-生物素-羟基丁酸-β-环糊精酰胺键接物(C23b)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.40-5.11(m,7H),4.77-4.71(m,14H),4.60-4.07(m,7H),4.01-3.90(m,20H),3.80-3.27(m,28H),3.10-2.85(m,2H),2.34-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1446.51[M+H]+.
单-6-生物素-羟基丁酸-γ-环糊精酰胺键接物(C23c)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.39-5.11(m,8H),4.77-4.71(m,16H),4.60-4.07(m,7H),4.02-3.90(m,23H),3.80-3.27(m,32H),3.10-2.85(m,2H),2.34-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1630.55[M+Na]+.
实施例8
一种生物素与环糊精间接偶联的偶联物，由环糊精的2位-OH先转化成-NH2再与连接子(所述连接子为NH2-R1-COOH、HO-R1-COOH(R1＝(CH2)n(n＝1～20))的-COOH酰化，然后与生物素偶联的偶联物发明，包括步骤：
当连接子为NH2-R1-COOH(R1＝(CH2)n(n＝1～20))：
A、将8.0-10g环糊精溶于320-350mL NaOH(0.15mol/L)溶液中，再把8.0-10g对甲苯磺酰氯溶于乙腈中，将所得的溶液溶于在室温下充分搅拌的上述环糊精溶液中，滴加过程中，不断加入NaOH(1mol/L)水溶液，使pH始终大于11-12.5，滴加完后再搅拌2-5h，然后向反应液中加入盐酸(1mol/L)水溶液和过量的碱中和，抽滤，除去未溶的对甲苯磺酰氯，减压蒸除部分水，再加入400-500mL甲醇，再次抽滤，减压蒸干溶液，把所得的固体溶于少量的热水，放入0-5℃冰浴中，滤去白色沉淀，收集滤液蒸干，得到白色粉末，将白色粉末进一步柱层析，最后得到化合物C6。
B、将化合物C6(1-1.3g)溶于15ml热水中，加入1.32-1.5g叠氮化钠，持续反应一段时间，冷却到室温，用丙酮沉淀，抽滤，收集固体干燥得到化合物C7。
C、将化合物C7(1-1.3g)和三苯基膦(0.3-0.5g)混合溶于10-15ml N-N二甲基甲酰胺溶液中，室温下搅拌2-5小时，加入2-5ml水，加热到80-90℃，持续反应一段时间，用丙酮沉淀，抽滤，收集固体干燥得到化合物C8。
D、将1-1.2mmol NH2-R1-COOH(R1＝(CH2)n(n＝1～20))溶于10-15ml水中，加入1-1.3g氢氧化钠，搅拌冷却下，加入0.01-0.05ml相转移催化剂，然后慢慢滴加1.2-1.4mmol(Boc)2O，室温下搅拌8-10h，然后调节pH至酸性，抽滤，干燥,得到Boc-NH-R1-COOH。
E、将1-1.2mmol化合物C8溶解在10-15ml DMF中，加入1-1.2mmol Boc-NH-R1-COOH，1-2mmol NHS，1-4mmol DCC，室温下反应24h，加入丙酮沉淀,过滤收集固体,真空干燥箱烘干,得到[2-Boc-NH-R1-CO-NH]-CD。
F、将生物素(97.6-100mg)，NHS(48-60mg)，DCC(130-150mg)混合加入到3-6mlN-N二甲基甲酰胺溶液中，密封，加热，搅拌下反应3-5h，冷却至室温，抽滤收集滤液，在冰浴中边搅拌边滴加乙醚，产生大量白色沉淀，继续搅拌一段时间，抽滤，收集固体在干燥，得到产物生物素-NHS。
G、将1-1.2mmol[2-Boc-NH-R1-CO-NH]-CD溶于5-8ml DMF中，加入TFA，脱保护，减压浓缩得2-NH2-R1-CO-NH]-CD。加入生物素-NHS，室温下搅拌反应24-48h，用TLC监测反应进程，反应完成后，加入丙酮沉淀并多次洗涤，抽滤，干燥，得到一种生物素和环糊精间接偶联的偶联物C36。
以化合物C24为例，提供部分偶联物参数：
Figure BDA0002391451900000241
单-2-生物素-氨基丁酸-α-环糊精酰胺键接物(C24a)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ6.02-5.41(m,6H),4.87-4.71(m,10H),4.60-4.37(m,4H),3.99-3.90(m,17H),3.80-3.30(m,26H),3.27-2.85(m,3H),2.35-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1283.46[M+H]+.
单-2-生物素-氨基丁酸-β-环糊精酰胺键接物(C24b)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ6.02-5.43(m,7H),4.89-4.71(m,12H),4.61-4.37(m,4H),3.98-3.90(m,20H),3.80-3.30(m,30H),3.27-2.85(m,3H),2.35-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1467.53[M+Na]+.
单-2-生物素-氨基丁酸-γ-环糊精酰胺键接物(C24c)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ6.02-5.40(m,8H),4.77-4.65(m,14H),4.62-4.37(m,4H),3.97-3.87(m,23H),3.80-3.30(m,34H),3.27-2.85(m,3H),2.35-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1629.55[M+Na]+.
当连接子为HO-R1-COOH(R1＝(CH2)n(n＝1～20))
A、将8.0-10g环糊精溶于320-350mL NaOH(0.15mol/L)溶液中，再把8.0-10g对甲苯磺酰氯溶于乙腈中，将所得的溶液溶于在室温下充分搅拌的上述环糊精溶液中，滴加过程中，不断加入NaOH(1mol/L)水溶液，使pH始终大于11-12.5，滴加完后再搅拌2-5h，然后向反应液中加入盐酸(1mol/L)水溶液和过量的碱中和，抽滤，除去未溶的对甲苯磺酰氯，减压蒸除部分水，再加入400-500mL甲醇，再次抽滤，减压蒸干溶液，把所得的固体溶于少量的热水，放入0-5℃冰浴中，滤去白色沉淀，收集滤液蒸干，得到白色粉末，将白色粉末进一步柱层析，最后得到化合物C6。
B、将化合物C6(1-1.3g)溶于15-20ml热水中，加入1.32-1.5g叠氮化钠，持续反应一段时间，冷却到室温，用丙酮沉淀，抽滤，收集固体干燥得到化合物C7。
C、将化合物C7(1-1.3g)和三苯基膦(0.3-0.5g)混合溶于10-15ml N-N二甲基甲酰胺溶液中，室温下搅拌2-5小时，加入2-5ml水，加热到80-90℃，持续反应一段时间，用丙酮沉淀，抽滤，收集固体干燥得到化合物C8。
D、将1-1.2mmol HO-R1-COOH(R1＝(CH2)n(n＝1～20))溶解在5-8ml DMF中,加入5-8ml干燥后的吡啶,加入2.5-4ml三乙基氯硅烷,加入,室温下反应24-48h,反应完成后蒸干溶液,得到(CH3CH2)3Si-O-R1-COOH。
E、将1-1.2mmol化合物C8溶解在10-15ml DMF中，加入1-1.2mmol(CH3CH2)3Si-O-R1-COOH，1-2mmol NHS，1-4mmol DCC，室温下搅拌反应24-48h，反应完成后加入丙酮沉淀，过滤收集固体，真空干燥箱烘干，得到产物[2-(CH3CH2)3Si-O-R1-CO-NH]-CD。
F、将1-1.2mmol[2-(CH3CH2)3Si-O-R1-CO-NH]-CD溶于乙腈和吡啶的混合液，加入氢氟酸2.5-4ml，在0-5℃下反应8-10h，再在室温下反应10-14h,萃取保留有机相，用CuSO4水溶液洗涤有机相，除去吡啶，将溶液旋转蒸发收集固体，真空干燥箱烘干，得到产物[2-HO-R1-CO-NH]-CD。
G、将1-1.2mmol[2-HO-R1-COO]-CD溶于5-8ml DMF中，加入1-1.2mmol生物素，1-4mmolDCC，0.5-3mmolDMAP，室温下搅拌反应24-48h，用丙酮沉淀，抽滤，柱层析，减压浓缩，收集固体干燥，制得一种生物素与环糊精间接偶联的偶联物C37。
以化合物C25为例，提供部分偶联物参数：
Figure BDA0002391451900000261
单-2-生物素-羟基丁酸-α-环糊精酰胺键接物(C25a)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ6.02-5.40(m,6H),4.77-4.64(m,10H),4.60-4.13(m,6H),3.98-3.86(m,17H),3.80-3.30(m,24H),3.27-2.85(m,3H),2.35-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1306.46[M+Na]+.
单-2-生物素-羟基丁酸-β-环糊精酰胺键接物(C25b)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ6.02-5.40(m,7H),4.77-4.63(m,12H),4.61-4.13(m,6H),3.97-3.85(m,20H),3.80-3.30(m,28H),3.27-2.85(m,3H),2.35-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1446.53[M+H]+.
单-2-生物素-羟基丁酸-γ-环糊精酰胺键接物(C25c)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ6.02-5.40(m,8H),4.77-4.61(m,14H),4.59-4.13(m,6H),4.04-3.90(m,23H),3.80-3.30(m,32H),3.27-2.85(m,3H),2.35-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1608.56[M+H]+.
实施例9
一种生物素与环糊精间接偶联的偶联物，由环糊精的3位-OH先转化成-NH2再与连接子(所述连接子为NH2-R1-COOH、HO-R1-COOH(R1＝(CH2)n(n＝1～20))的-COOH酰化，然后与生物素偶联的偶联物发明，包括步骤：
当连接子为NH2-R1-COOH(R1＝(CH2)n(n＝1～20))：
A、室温下，将环糊精(25-30g)溶于400-500ml吡啶中，吡啶用氧化钙干燥，再将对甲苯磺酰氯(4.0-4.5g)溶于30-50ml吡啶中，将对甲苯磺酰氯-吡啶溶液滴加到环糊精混合溶液中，滴加时温度控制在0-5℃以下，然后在室温下搅拌24-48h，减压蒸馏除去吡啶，加入600-700ml丙酮，搅拌30-45min，抽滤，用丙酮洗涤，再用热水重结晶，收集固体，在50-60℃真空干燥，得到化合物C11。
B、将化合物C11(1-1.2g)溶于15-20ml热水中，加入1.32-1.5g叠氮化钠，持续反应一段时间，冷却到室温，用丙酮沉淀，抽滤，收集固体干燥得到化合物C12。
C、将化合物C12(1-1.3g)和三苯基膦(0.3-0.5g)混合溶于10-15ml N-N二甲基甲酰胺溶液中，室温下搅拌2-4小时，加入2-5ml水，加热到80-90℃，持续反应一段时间，用丙酮沉淀，抽滤，收集固体干燥得到化合物C13。
D、将1-1.2mmol NH2-R1-COOH(R1＝(CH2)n(n＝1～20))溶于10-15ml水中，加入1-1.3g氢氧化钠，搅拌冷却下，加入0.01-0.05ml相转移催化剂，然后慢慢滴加1.2-1.4mmol(Boc)2O，室温下搅拌8-10h，然后调节pH至酸性，抽滤，干燥,得到Boc-NH-R1-COOH。
E、将1-1.2mmol化合物C13溶解在10-15ml DMF中，1-2mmol NHS，1-4mmol DCC，加入1-1.2mmol Boc-NH-R1-COOH，室温下反应24-48h，加入丙酮沉淀,过滤收集固体,真空干燥箱烘干,得到[3-Boc-NH-R1-CO-NH]-CD。
F、将生物素(97.6-100mg,0.4mmol)，NHS(48-60mg,0.42mmol)，DCC(130-150mg)混合加入到3-6ml DMF中，密封，加热，搅拌下反应3-5h，冷却至室温，抽滤收集滤液，在冰浴中边搅拌边滴加乙醚，产生大量白色沉淀，继续搅拌一段时间，抽滤，收集固体在干燥，得到产物生物素-NHS。
G、将1-1.2mmol[3-Boc-NH-R1-CO-NH]-CD溶于5-8ml DMF中，加入TFA，脱保护，减压浓缩得[3-NH2-R1-CO-NH]-CD。加入生物素-NHS，室温下搅拌反应24-48h，用TLC监测反应进程，反应完成后，加入丙酮沉淀并多次洗涤，抽滤，干燥，得到一种生物素和环糊精间接偶联的偶联物C38。
以化合物C26为例，提供部分偶联物参数：
Figure BDA0002391451900000271
单-3-生物素-氨基丁酸-α-环糊精酰胺键接物(C26a)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.40-5.12(m,6H),4.79-4.71(m,11H),4.60-4.50(m,3H),4.04-3.90(m,18H),3.80-3.30(m,25H),3.27-2.85(m,3H),2.13-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1305.44[M+Na]+.
单-3-生物素-氨基丁酸-β-环糊精酰胺键接物(C26b)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.40-5.12(m,7H),4.81-4.71(m,13H),4.60-4.50(m,3H),4.03-3.90(m,20H),3.80-3.30(m,29H),3.27-2.85(m,3H),2.13-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1467.55[M+Na]+.
单-3-生物素-氨基丁酸-γ-环糊精酰胺键接物(C26c)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.41-5.12(m,8H),4.77-4.68(m,15H),4.60-4.50(m,3H),4.01-3.90(m,22H),3.82-3.30(m,33H),3.27-2.85(m,3H),2.13-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1629.58[M+Na]+.
当连接子为HO-R1-COOH(R1＝(CH2)n(n＝1～20))：
A、室温下，将环糊精(25-30g)溶于400-500ml吡啶中，吡啶用氧化钙干燥，再将对甲苯磺酰氯(4.0-4.5g)溶于30-50ml吡啶中，将对甲苯磺酰氯-吡啶溶液滴加到环糊精混合溶液中，滴加时温度控制在0-5℃以下，然后在室温下搅拌24-48h，减压蒸馏除去吡啶，加入600-700ml丙酮，搅拌30-45min，抽滤，用丙酮洗涤，再用热水重结晶，收集固体，在50-60℃真空干燥，得到化合物C11。
B、将化合物C11(1-1.3g)溶于15-20ml热水中，加入1.32-1.5g叠氮化钠，持续反应一段时间，冷却到室温，用丙酮沉淀，抽滤，收集固体干燥得到化合物C12。
C、将化合物C12(1-1.3g)和三苯基膦(0.3-0.5g)混合溶于10-15ml N-N二甲基甲酰胺溶液中，室温下搅拌2-5小时，加入2-5ml水，加热到80-90℃，持续反应一段时间，用丙酮沉淀，抽滤，收集固体干燥得到化合物C13。
D、将1-1.2mmol HO-R1-COOH(R1＝(CH2)n(n＝1～20))溶解在5-8ml DMF中,加入5-8ml干燥后的吡啶，加入2.5-4ml三乙基氯硅烷，加入室温下反应24-48h,反应完成后蒸干溶液,得到(CH3CH2)3Si-O-R1-COOH。
E、将1-1.2mmol化合物C13溶解在10-15ml DMF中，加入1-1.2mmol(CH3CH2)3Si-O-R1-COOH，1-2mmol NHS，1-4mmol DCC，室温下搅拌反应24-48h，反应完成后加入丙酮沉淀，过滤收集固体，真空干燥箱烘干，得到产物[3-(CH3CH2)3Si-O-R1-CO-NH]-CD。
F、将1-1.2mmol[3-(CH3CH2)3Si-O-R1-CO-NH]-CD溶于乙腈和吡啶的混合液，加入氢氟酸2.5-4ml，在0-5℃下反应8-10h，再在室温下反应10-14h，萃取保留有机相，用CuSO4水溶液洗涤有机相，除去吡啶，将溶液旋转蒸发收集固体，真空干燥箱烘干，得到产物[3-HO-R1-CO-NH]-CD。
G、将1-1.2mmol[3-HO-R1-COO]-CD溶于5-8ml DMF中，加入1-1.2mmol生物素，1-4mmolDCC，0.5-3mmolDMAP，室温下搅拌反应24-48h，用丙酮沉淀，抽滤，柱层析，减压浓缩，收集固体干燥，制得一种生物素与环糊精间接偶联的偶联物C39。
以化合物C27为例，提供部分偶联物参数：
Figure BDA0002391451900000281
单-3-生物素-羟基丁酸-α-环糊精酰胺键接物(C27a)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.45-5.12(m,6H),4.88-4.71(m,11H),4.64-4.33(m,5H),4.23-3.90(m,18H),3.80-3.30(m,23H),3.27-2.85(m,3H),2.13-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1306.43[M+Na]+.
单-3-生物素-羟基丁酸-β-环糊精酰胺键接物(C27b)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.40-5.11(m,7H),4.86-4.71(m,13H),4.63-4.31(m,5H),4.24-3.90(m,20H),3.80-3.30(m,27H),3.27-2.85(m,3H),2.13-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1468.57[M+Na]+.
单-3-生物素-羟基丁酸-γ-环糊精酰胺键接物(C27c)：1H NMR(400MHz,DMSO-D6,300K,TMS,δppm)：δ5.43-5.12(m,8H),4.89-4.71(m,15H),4.60-4.34(m,5H),4.26-3.91(m,22H),3.80-3.30(m,31H),3.27-2.85(m,3H),2.13-1.25(m,12H).MS(ES),m/z:1608.54[M+H]+.
HepG2细胞中罗丹明B的定性摄取实验
(1)分别用单-6-生物素-β-环糊精酰胺键接物(C5b)、单-3-生物素-氨基丁酸-β-环糊精酰胺键接物(C26b)和单-3-生物素-羟基丁酸-β-环糊精酰胺键接物(C27b)包合罗丹明B(Rodamine B,R)，分别得到C5b-R，C26b-R和C27b-R。
(2)HepG2细胞，用DMEM培养基培养后，胰酶消化后铺6孔板，每孔30万个细胞，37℃孵育过夜，加入罗丹明B(R，10μg/ml)，C5b-R，C26b-R和C27b-R(10μg/ml，以罗丹明B计)，培养1-2h，然后用冷PBS清洗2-3次，4％多聚甲醛固定10-15min，吸去多聚甲醛，用PBS洗涤1-2次，置于荧光显微镜下观察。
(3)从图1中可以看出，在同等时间条件下，图A的荧光强度明显弱于图B，C和D，因此，HepG2细胞对C5b-R，C26b-R和C27b-R的吸收均明显强于对罗丹明B的吸收。由此可见，用C5b-R，C26b-R和C27b-R包合后可以增强细胞对罗丹明B的吸收，C5b-R，C26b-R和C27b-R均可以增强药物对肿瘤细胞的靶向性。值得注意的是，HepG2细胞对C5b-R，C26b-R和C27b-R的吸收后荧光强度没有明显差异，说明C5b-R，C26b-R和C27b-R在增强药物靶向性方面没有显著的差异。
流式细胞术实验
在6孔板上接种3×105个HepG2细胞，并使其附着和生长。分别用含有罗丹明B和含有C5b-R，C26b-R和C27b-R的2ml培养基孵育细胞1-2h。在孵育结束时，用PBS冲洗2-3次，胰蛋白酶处理消化细胞，PBS洗涤2-3次离心收集细胞，流式细胞仪检测细胞的荧光强度。流式的结果显示(图2)，孵育1-2h后，HepG2细胞对C5b-R，C26b-R和C27b-R的吸收明显强于对罗丹明B的吸收，说明HepG2细胞对C5b-R，C26b-R和C27b-R的摄取明显强于罗丹明B的摄取。在流式图中，C5b-R，C26b-R和C27b-R三组荧光强度均强于罗丹明B组，但三组之间荧光强度相当，说明C5b-R，C26b-R和C27b-R在增强药物靶向性方面没有明显的差异，这与荧光显微镜的观察结果一致。
细胞毒性实验
HepG2细胞在96孔板中培养，接种密度为0.5×104个细胞，孵育24h。用DMEM培养基将鬼臼毒素和单-6-生物素-β-环糊精酰胺键接物包合的鬼臼毒素(B-CD-PPT)稀释到不同浓度，每孔加入100μl，每个浓度设3个复孔，并设对照组，对照组加入不含药的培养基，在37℃的CO2孵化器中孵育48h后，每孔加入20-25μl MTT(5mg/ml)，在37℃下再孵育4-6h，去除培养基，加入150-200μl DMSO，然后在562nm处测定吸光度计算细胞活力。
从图3中可以看出，在浓度0.5μM-16μM范围内，B-CD-PPT的细胞毒性强于鬼臼毒素。由前面的流式结果和荧光显微镜的观察结果可知，用单-6-生物素-β-环糊精酰胺键接物包合罗丹明B后可增强药物的摄取，提高肿瘤细胞对药物的靶向性。因此，单-6-生物素-β-环糊精酰胺键接物增强鬼臼毒素的抗肿瘤作用可能与其增强药物对肿瘤细胞的靶向性有关。

Claims (10)

1.生物素与环糊精的偶联物，其特征在于：所述偶联物由环糊精上的-OH直接与生物素上的-COOH酯化偶联获得，或者先将环糊精上的-OH转化成-NH2，由氨基化的环糊精直接与生物素上的-COOH酰化偶联获得。
2.根据权利要求1所述的生物素与环糊精的偶联物，其特征在于：环糊精和生物素之间还含有连接子，所述连接子为NH2-R1-COOH或HO-R1-COOH，R1为(CH2)n，n＝1～20；所述偶联物由连接子上的-COOH与环糊精上的-OH酯化，或者先将环糊精上的-OH转化成-NH2，由氨基化的环糊精与连接子上的-COOH酰化，然后连接子上的-OH或-NH2再与生物素上的-COOH偶联获得。
3.根据权利要求1或2所述的生物素与环糊精的偶联物，其特征在于：所述环糊精上的-OH的位点为2位、3位或6位。
4.根据权利要求3所述的生物素与环糊精的偶联物，其特征在于：所述环糊精包括但不限于α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精。
5.根据权利要求4所述的生物素与环糊精的偶联物，其特征在于：
当环糊精6位上的-OH直接与生物素上的-COOH酯化偶联时，所述偶联物的制备方法包括以下步骤：
A、将环糊精C溶于水中，滴加NaOH，再向混合溶液中滴加对甲苯磺酰氯-乙腈溶液，用HCl调节pH，得化合物C1；
Figure FDA0002391451890000011
B、将化合物C1和生物素偶联，得生物素与环糊精的偶联物C4；
Figure FDA0002391451890000012
当先将环糊精6位上的-OH转化成-NH2，由氨基化的环糊精直接与生物素上的-COOH酰化偶联时，所述偶联物的制备方法包括以下步骤：
a、将环糊精C溶于水中，滴加NaOH，再向混合溶液中滴加对甲苯磺酰氯-乙腈溶液，用HCl调节pH，得化合物C1；
Figure FDA0002391451890000021
b、将化合物C1与叠氮化钠反应，得化合物C2；
Figure FDA0002391451890000022
c、将化合物C2与三苯基膦混合反应，得化合物C3；
Figure FDA0002391451890000023
d、将生物素与催化剂、NHS混合加热反应，得生物素-NHS；
e、将化合物C3和生物素-NHS偶联，得生物素与环糊精的偶联物C5；
Figure FDA0002391451890000024
。
6.根据权利要求4所述的生物素与环糊精的偶联物，其特征在于：
当环糊精2位上的-OH直接与生物素上的-COOH酯化偶联时，所述偶联物的制备方法包括以下步骤：
A、将环糊精C溶于NaOH溶液中，再向混合溶液中滴加对甲苯磺酰氯-乙腈溶液，同时滴加NaOH溶液，使pH始终保持碱性，搅拌反应，得化合物C6；
Figure FDA0002391451890000031
B、将化合物C6和生物素偶联，得生物素与环糊精的偶联物C9；
Figure FDA0002391451890000032
当先将环糊精2位上的-OH转化成-NH2，由氨基化的环糊精直接与生物素上的-COOH酰化偶联时，所述偶联物的制备方法包括以下步骤：
a、将环糊精C溶于NaOH溶液中，再向混合溶液中滴加对甲苯磺酰氯-乙腈溶液，同时滴加NaOH溶液，使pH始终保持碱性，搅拌反应，得化合物C6；
Figure FDA0002391451890000033
b、将化合物C6与叠氮化钠反应，得化合物C7；
Figure FDA0002391451890000034
c、将化合物C7与三苯基膦混合反应，得化合物C8；
Figure FDA0002391451890000035
d、将生物素与催化剂、NHS混合加热反应，得生物素-NHS；
e、将化合物C8和生物素-NHS偶联，得生物素与环糊精的偶联物C10；
Figure FDA0002391451890000036
Figure FDA0002391451890000041
。
7.根据权利要求4所述的生物素与环糊精的偶联物，其特征在于：
当环糊精3位上的-OH直接与生物素上的-COOH酯化偶联时，所述偶联物的制备方法包括以下步骤：
A、将环糊精C溶于吡啶中，再向混合溶液中滴加对甲苯磺酰氯-吡啶溶液，减压蒸馏，加入丙酮沉淀，重结晶固体，得化合物C11；
Figure FDA0002391451890000042
B、将化合物C11和生物素偶联，得生物素与环糊精的偶联物C14；
Figure FDA0002391451890000043
当先将环糊精3位上的-OH转化成-NH2，由氨基化的环糊精直接与生物素上的-COOH酰化偶联时，所述偶联物的制备方法包括以下步骤：
a、将环糊精C溶于吡啶中，再向混合溶液中滴加对甲苯磺酰氯-吡啶溶液，减压蒸馏，加入丙酮沉淀，重结晶固体，得化合物C11；
Figure FDA0002391451890000044
b、将化合物C11与叠氮化钠反应，得化合物C12；
Figure FDA0002391451890000045
c、将化合物C12与三苯基膦反应，得化合物C13；
Figure FDA0002391451890000051
d、将生物素与催化剂、NHS混合加热反应，得生物素-NHS；
e、将化合物C13和生物素-NHS偶联，得生物素与环糊精的偶联物C15；
Figure FDA0002391451890000052
。
8.根据权利要求4所述的生物素与环糊精的偶联物，其特征在于：当连接子上的-COOH先与与环糊精上的-OH酯化，然后连接子上的-OH或-NH2再与生物素的-COOH偶联时，所述偶联物的制备方法包括以下步骤：
先将连接子的-NH2、-OH进行保护，再将连接子的-COOH与化合物C1、C6或C11酯化偶联，然后将连接子上被保护的基团脱保护，再与生物素-NHS偶联，得生物素与环糊精间接偶联的偶联物C28～C33，结构式如下：
Figure FDA0002391451890000053
；
当先将环糊精上的-OH转化成-NH2，由氨基化的环糊精与连接子上的-COOH酰化，然后连接子上的-OH或-NH2再与生物素上的-COOH偶联时，所述偶联物的制备方法包括以下步骤：
先将连接子的-NH2、-OH进行保护，再将连接子的-COOH与化合物C3、C8或C13酰化偶联，然后将连接子上被保护的基团脱保护，再与生物素-NHS偶联，得生物素与环糊精间接偶联的偶联物C34～C39，结构式如下：
Figure FDA0002391451890000062
。
9.以权利要求1～8任一项中所述的生物素与环糊精的偶联物为主要成分的药物载体。
10.权利要求1～8任一项中所述的生物素与环糊精的偶联物及权利要求9所述的药物载体包载抗肿瘤药物，在抗肿瘤中的应用。
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