CN111214659B - Cbx4抑制剂在制备食管鳞癌放射增敏剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体是提供一种靶向CBX4的肿瘤放射增敏剂，具体涉及CBX4抑制剂在制备食管鳞癌放射增敏剂中的应用。本发明所述的增敏剂使用后再放疗，具有协同性的效果，同时还具有较低的放射线剂量、潜在的靶向专一性和临床上可接受的毒性的特点。其中放射性剂量可下降，而放疗效果不变甚至更好，降低了对周围正常组织的影响，从而减少因放射毒作用而引起的并发症。

Description

CBX4抑制剂在制备食管鳞癌放射增敏剂中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地说，是CBX4抑制剂在制备食管鳞癌放射增敏剂中的应用。

背景技术

放射治疗作为局部治疗恶性肿瘤的方法，可以使正常器官和组织得以保留，所以通过该方法治疗的患者数量迅速增长。据估计，大约有三分之二的癌症患者接受放疗，放疗涉及应用电离辐射作为治疗的一部分来控制或杀伤恶性细胞。电离辐射使暴露组织的DNA损伤而导致细胞死亡。放疗可治疗许多类型的癌症，也可用作辅助疗法的一部分，用以防止肿瘤手术后复发。

不同的癌症对放疗的响应不同。高度放射敏感的癌细胞可被中等放射剂量迅速杀伤如白血病、大多数淋巴瘤和生殖细胞肿瘤等。但一些类型的癌症(例如乳腺癌和黑色素瘤)是高度耐放射的并且无法通过在临床实践中安全的放射剂量治愈。肿瘤对放疗的响应还与它的尺寸和状况有关，很大的肿瘤对放射的响应不及较小的肿瘤或微观疾病。此外，一些肿瘤还容易对放射性治疗产生抵抗，从而使采用放射性治疗这种肿瘤的时候具有很小的效果。

食管癌在中国属于高发且恶性度较高的肿瘤，我国的食管癌发病占全球接近一半。与欧美不同的是，我国食管癌95％的病理类型为鳞状细胞癌。虽然化疗和分子靶向治疗已经高速发展，但放疗在手术和非手术的食管癌患者中仍然作为一种重要的治疗手段。食管癌死亡率高的原因主要是因为转移和对放化疗的抵抗，所以迫切需要提高现有治疗技术的疗效和延长病人的生存期的新的治疗手段。

此外，特别高的放射剂量会引起不同的副作用，包括在治疗后数月内发生的急性副作用、在治疗后数年内的长期副作用以及再治疗后的累加副作用。副作用的性质、严重程度和持续时间取决于接受放射的器官、治疗本身(放射的类型、剂量、分次、同步化疗)以及患者。急性副作用包括疲劳和皮肤刺激、恶心和呕吐、上皮表面损伤、口腔、咽喉和胃生疮疡、肠道不适、肿胀(水肿)和不育。在临床肿瘤学中，已试图使用低放射剂量以减少毒副作用，例如，通过使用放射增敏剂来增强治疗功效。

尽管已经将多种化疗剂与放疗组合，但几乎全部都是有毒的。化疗剂通常引起明显的并且通常是危险的副作用。研究人员一直希望开发出能够增加癌症放射疗法疗效的放射增敏剂，且这样的治疗方法具有较低的放射线剂量、潜在的靶向专一性和临床上可接受的毒性。

CBX蛋白是多梳蛋白家族的重要成员，多梳蛋白家族是一种表观遗传调控复合物，以聚合转录抑制复合体PRCs的形式存在。CBX4(Chromobox 4，多梳蛋白4)可以通过修饰染色质对靶基因进行转录抑制，在调控细胞分化、衰老、死亡和肿瘤发生、转移中发挥若重要作用。

但是关于CBX4抑制剂在制备食管鳞癌放射增敏剂中的应用目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供CBX4抑制剂在制备食管鳞癌放射增敏剂中的应用。

本发明的第一方面，提供CBX4抑制剂在制备食管鳞癌放射增敏剂中的应用。

进一步的，所述的CBX4抑制剂为任何能够降低CBX4的活性、降低CBX4的稳定性、抑制CBX4的表达、减少CBX4的有效作用时间、或抑制CBX4的转录活加工的物质。

进一步的，所述的CBX4抑制剂包括但不限于：

特异性结合CBX4的蛋白；

特异性干扰CBX4基因表达、加工的小干扰分子，如shRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、反义核苷酸等；

CBX4的拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。

所述的CBX4抑制剂，包括：UNC3866等。

优选特异性干扰CBX4基因表达的小干扰RNA分子、短发夹RNA或反义核苷酸，更优选结构简单的短发夹RNA。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的CBX4抑制剂为针对CBX4的特异性shRNA，其靶点序列为GATGAAGATAGTCAAGAACAA(SEQ ID NO.1)；所述的shRNA的核苷酸序列如SEQID NO.2或SEQ ID NO.3所示：

CcggGATGAAGATAGTCAAGAACAATTCAAGAGATTGTTCTTGACTAT CTTCATCTTTTTg(SEQ IDNO.2)；

aattcaaaaaGATGAAGATAGTCAAGAACAATCTCTTGAATTGTTCTTGAC TATCTTCATC(SEQ IDNO.3)。

本发明的第二方面，提供CBX4抑制剂重组载体在制备食管鳞癌放射增敏剂中的应用。

进一步的，所述的CBX4抑制剂重组载体包括表达载体以及插入设置在该表达载体上的CBX4 siRNA、CBX4 shRNA或CBX4反义核苷酸的编码DNA序列。所述的载体包括病毒载体和非病毒载体。

本发明的第三方面，提供一种食管鳞癌放射增敏剂，所述的食管鳞癌放射增敏剂以CBX4抑制剂或CBX4抑制剂重组载体作为活性成分。

进一步的，所述的食管鳞癌放射增敏剂中还包括其他药学上可接受的成分。

进一步的，所述食管鳞癌放射增敏剂为注射剂。

本发明的第四方面，提供CBX4抑制剂在制备Beclin1抑制剂中的应用。

本发明的第五方面，提供CBX4抑制剂在制备细胞自噬促进剂中的应用。

本发明研究中构建CBX4低表达的食管鳞癌细胞。RT-PCR和Western blot检测显示敲低组中CBX4表达显著低于对照组。同时，敲低CBX4之后，食管鳞癌细胞辐射后细胞凋亡增加、克隆形成能力降低、辐照后DNA断裂均增加。我们将CBX4敲低后食管鳞癌细胞与对照组细胞做表达谱芯片，相关蛋白进行生物芯片，将下游分子进行通路分析，发现自噬通路在其中发挥重要作用。进一步实验发现敲低CBX4之后，食管鳞癌细胞LC3蛋白表达降低。免疫荧光显示在接受8Gy的照射后，CBX4敲低组与对照组细胞比较，自噬明显减少。CBX4敲低后食管鳞癌细胞接受放射线照射后自噬水平下调。

本发明优点在于：

本发明所述的CBX4抑制剂作为食管鳞癌放射增敏剂使用后再放疗，具有协同性的效果，同时还具有较低的放射线剂量、潜在的靶向专一性和临床上可接受的毒性的特点。其中放射性剂量可下降，而放疗效果不变甚至更好，降低了对周围正常组织的影响，从而减少因放射毒作用而引起的并发症。而其潜在的靶向专一性，机理如下：

CBX4可以诱导许多生物过程，例如，蛋白质合成、细胞周期和诱导癌细胞的自噬和凋亡等。肿瘤的生长需要的不是一个单一的过程，包括增加蛋白质的合成、血管生成、周围组织的侵犯和转移及逃避凋亡。快速增长的肿瘤一方面在细胞层面出现凋亡减少，细胞周期紊乱，自噬增加。另一方面肿瘤微环境出现营养匮乏、能量不足。CBX4的活性增加进而促进细胞保护性自噬，让肿瘤细胞在缺氧、缺营养的肿瘤微环境中生存，进而让肿瘤细胞得以存活。因此，在肿瘤细胞的自噬过程中CBX4起了一个关键的调节作用，CBX4的活性在食管鳞癌细胞中是增加的，而非增殖的肿瘤或正常细胞中活性降低，通过多种手段抑制CBX4活性而使其靶向性的作用于增殖的肿瘤细胞，其联合放射性疗法用于肿瘤的放疗增敏具有巨大的临床价值。

附图说明

图1：CBX4表达与食管鳞癌组织和细胞株的放射抵抗相关。A)放射敏感和放射抵抗肿瘤组织中CBX4的相对表达；B)CBX4在放射抵抗和放射敏感肿瘤组织中的典型免疫组化；C)RT-PCR显示食管鳞癌细胞系接受不同剂量辐照后CBX4 mRNA相对表达量；D)Westernblot显示食管鳞癌细胞系接受不同剂量辐照后CBX4蛋白表达变化。*P<0.05，**P<0.01vsNC。

图2：CBX4促进食管鳞癌细胞模型放射抵抗。A和B)利用针对CBX4的特异性shRNA成功地构建了TE-13和KYSE-150细胞的稳定CBX4敲低细胞系。C)CCK-8检测显示CBX4敲低组食管鳞癌细胞株细胞增殖能力显著高于对照组；D和E)克隆形成实验表明，CBX4敲低组在各放疗剂量点的克隆形成能力均低于对照细胞。*P<0.05，**P<0.01vs NC。

图3：CBX4促进食管鳞癌动物模型放射抵抗。将Balb/c裸鼠随机分为4组(n＝6/组)：NC:TE-13正常对照组；CBX4敲低组：稳定转染CBX4-shRNA的TE-13细胞；IR-NC:TE-13正常对照组，6Gy照射。IR-CBX4敲低组：经6Gy照射稳定转染CBX4-shRNA的TE-13细胞。通过皮下注射0.1毫升TE13细胞(1×10⁷细胞/ml)进入右侧近端后肢建立异种移植物。细胞接种后第15天处死动物，取出肿瘤。A)每3天测定肿瘤体积，CBX4敲低组接受放射线后肿瘤重量明显低于对照组组。B)裸鼠的图像。C)肿瘤图像。D)实验结束时的肿瘤重量，CBX4敲低组接受放射线后肿瘤重量明显低于对照组组。E和F)CBX4敲低组TE13荷瘤裸鼠肿瘤切片进行免疫组化分析CBX4敲低组CBX4和Ki67低于对照组。数据显示为平均值±标准差(n＝6/组)。*P<0.05，**P<0.01与正常对照。

图4：CBX4调节辐射诱导的DNA损伤、细胞周期阻滞和凋亡。A)免疫荧光检测CBX4敲低组和对照组食管鳞癌细胞株照射12h后γH2AX表达的典型图像；B)免疫荧光检测CBX4敲低组和对照组食管鳞癌细胞株照射12h后γH2AX表达的定量结果；C)Western blot检测CBX4敲低组和对照组食管鳞癌细胞株C-PARP和γH2AX蛋白表达；D)流式细胞分析CBX4敲低组和对照组食管鳞癌细胞株照射后细胞周期分布情况；E)流式细胞分析CBX4敲低组和对照组食管鳞癌细胞株照射后凋亡情况；F)Western blot检测CBX4敲低组和对照组食管鳞癌细胞株照射后相关凋亡蛋白表达情况。*P<0.05，**P<0.01vs NC。

图5：CBX4通过抑制自噬体的形成促进辐射诱导的细胞死亡。A)GSEA生物信息分析提示CBX4通过自噬途径影响细胞功能；B)免疫荧光法检测检测CBX4敲低组和对照组食管鳞癌细胞株照射后照射前后自噬变化的定量统计；C)免疫荧光法检测检测CBX4敲低组和对照组食管鳞癌细胞株照射后照射前后自噬变化的典型图片；D)透射电镜观察CBX4敲低组和对照组食管鳞癌细胞株自噬体的代表性电子显微照片；E)Western blot检测CBX4敲低组和对照组食管鳞癌细胞株照射后相关自噬蛋白表达情况。*P<0.05，**P<0.01vs NC。

图6：CBX4通过靶向BECLIN1调节食管鳞癌细胞照射后的适应性自噬。A)Westernblot检测CBX4敲低组和对照组食管鳞癌细胞株照射后BECLIN1和p62蛋白的表达情况；B)CBX4敲低组和对照组食管鳞癌细胞株照射后克隆形成能力变化；C)Western Blot检测CBX4敲低组和对照组食管鳞癌细胞株加或者不加CQ情况下照射后LC3蛋白表达变化；D)免疫荧光检测CBX4敲低组和对照组食管鳞癌细胞株照射自噬变化；E)CBX4敲低组和对照组食管鳞癌细胞株有无Beclin1干扰情况下照射后自噬体形成的定量结果。*P<0.05，**P<0.01vsNC。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例：

一、实验方法

1)细胞水平

①细胞株及细胞培养条件：食管鳞癌细胞株：TE-13、KYSE150。培养条件：10％胎牛血清及含青、链霉素的DMEM培养基，5％CO₂孵箱37℃孵育，2～3d传代1次。

②过表达细胞株模型构建：按慢病毒转染操作说明书，以CBX4过表达慢病毒颗粒(pHBLV-CMVIE-IRES-ZsGreen-CBX4)和对照慢病毒颗粒(pHBLV-CMVIE-IRES-ZsGreen)分别感染食管鳞癌细胞株，作为实验组和阴性对照组，空白对照组细胞不做任何处理，三组常规培养。稳定表达CBX4通过0.5mg/mL嘌呤霉素处理10天筛选获得。

③敲低细胞株模型构建：以CBX4有效干扰靶点序列的RNAi以及阴性对照组的Scramble序列的病毒液转让至食管鳞癌细胞株，制备稳定的pHBLV-CMVIE-IRES-ZsGreen-RNAi细胞株，同时选取同期未转染的作为对照。转染效率由绿色荧光蛋白表达鉴定，由IX71荧光显微镜检测。同时采用免疫印迹以及实时定量PCR检测CBX4 mRNA及蛋白的表达。稳定表达CBX4shRNA通过0.5mg/mL嘌呤霉素处理10天筛选获得。

④照射条件：采用Varian Triology直线加速器。照射条件：6MV X线，剂量率300cGy/min，源皮距100cm，照射野20cm×20cm，加1cm厚蜡块作表面剂量补偿。

⑤克隆形成抑制实验：平板克隆形成实验单层培养的细胞培养至对数生长期，之后给予6MV X线的直线加速器照射肿瘤细胞，分别予2Gy、4Gy、6Gy、8Gy的剂量进行辐照，辐照后继续培养10-14天，让肿瘤细胞生长成肉眼可见的克隆。乙醇固定，结晶紫染色晾干，计数每孔内形成的细胞克隆数。

⑥放射生物学参数计算：计算克隆形成率(PE)以及细胞存活率(SF)，PE＝(空白对照组克隆数/空白对照组细胞种植数)×100％，SF＝某剂量下辐照实验组细胞克隆数/(该组细胞种植数×PE)，根据单击多靶模型SF＝1-(1-e-D/D0)^N拟合剂量生存曲线，计算得出D0(平均致死剂量)，Dq(细胞受损所需总阈量)，SF2(2Gy照射剂量下细胞存活分数)等。使用GraphPad Prism7.0软件，通过单击多靶模型，模拟出剂量生存曲线。

⑦RT-PCR：提取RNA后，进行反应体系配置。反应体系：cDNA5.0μl、Primers 1.0μl、SYBR Green荧光染料10μl、无菌蒸馏水8.0μl；反应条件：95℃变性10min；95℃15s、65℃30s、72℃30s，共40个循环；循环结束后72℃延伸10min，每个标本均作复管PCR反应。

⑧Western blot：将对数生长期的细胞提取总蛋白，经BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白含量。等量的总蛋白上样(50μg)，经10％SDSPAGE电泳分离后，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。5％脱脂奶粉封闭1.5h，加入一抗4℃过夜，PBST缓冲液漂洗3次，二抗孵育，室温轻摇1h，PBST缓冲液漂洗3次，ECL方法显色、压片。

⑨细胞凋亡率测定：在25cm²培养瓶中培养细胞，当细胞处于对数生长期时，分别接受辐照或药物处理照射，24h后消化收取细胞。流式细胞仪检测根据Annexin V/PI双标记试剂盒说明操作，流式细胞仪分析检测结果用Cellquest软件分析。

⑩细胞免疫荧光：当细胞处于对数生长期时，分别接受辐照或药物处理照射，制作单细胞悬液。经过固定、洗涤、一抗稀释、二抗孵育、DAPI染核、震荡等步骤，于激光扫描共聚焦显微镜下观察并拍照。

自噬体数量分析：单丹磺酰戊二胺(MDC)是一种嗜酸性染色剂，可以使自噬体发出荧光。细胞培养液中加入0.05mM MDC并在37℃条件下培养15分钟，弃培养液，用PBS溶液清洗，用4％多聚甲醛于室温下固定细胞5分钟，弃多聚甲醛，用PBS溶液清洗，在荧光显微镜下观察荧光亮点并拍照计数。

透射电镜观察自噬体状态：消化收集细胞后用PBS清洗2遍，2.5％戊二醛固定30分钟，4℃下固定1小时，用乙醇进行脱水，用丙酮和包埋剂进行标本渗透，接着包埋及聚合，切成60nM厚度的薄片，醋酸铀-柠檬酸铅复染，透射电镜下观察细胞中自噬体的出现情况。

2)动物水平

①裸鼠移植瘤构建：将裸鼠随机分为4组，分别为：CBX4敲低组、敲低对照组、IR+CBX4敲低组、IR+敲低对照组。取生长旺盛期的肿瘤细胞，在无菌的条件下，肿瘤细胞接种于裸鼠右侧腋窝皮下，肿瘤细胞的接种量为1×10⁶。待裸鼠长到一定体积时照射6MV X线，每只每天2Gy，把肿瘤暴露于照射野下，余部分挡铅连续照射5d。

②肿瘤质量抑制率检测；从放射治疗后的第二天开始观察各组荷瘤鼠及肿瘤的生长情况并分别予以记录和拍照，至治疗周期结束后，用脱臼法处死荷瘤鼠并剥离出肿瘤，用电子天平称瘤重，计算肿瘤质量抑制率。

③肿瘤体积抑制率检测；从放射治疗后的第二天开始观察各组荷瘤鼠及肿瘤的生长情况并分别予以记录和拍照，至治疗周期结束后，用脱臼法处死荷瘤鼠并剥离出肿瘤,游标卡尺测量肿瘤的长径及肿瘤的短径，根据公式计算瘤体积，及肿瘤体积抑制率。瘤体-80℃保存，4％福尔马林固定，石蜡包埋切片，免疫组织化学待用。

④生存分析：通过实时动态观察肿瘤的生长情况，记录肿瘤大小并统计每组裸鼠移植瘤的生存时间，绘制生长曲线，进一步评估在体内CBX4表达水平改变对放疗疗效和食管癌生物学进程的影响。

3)分子机制水平

①蛋白芯片制备：利用慢病毒载体(抑制组、过表达组及空载组)感染食管鳞癌细胞系，获得CBX4表达差异的细胞，裂解提取蛋白通过蛋白芯片试剂盒进一步制备蛋白芯片。

②通过蛋白芯片筛选差异基因，并运用生物信息学技术(GO-analysis、Pathway-analysis等)，对差异分子进行生物学归类分析，并运用RT-PCR技术、免疫组化和蛋白印记的方法对蛋白芯片结果进行mRNA及蛋白表达验证。

③针对差异分子及所在通路，运用抗体抑制剂、免疫蛋白酶体抑制剂、关键分子通路免疫共沉淀等方法，探索CBX4对下游关键分子的通路的影响。

二、结果

1、CBX4的表达与食管鳞癌患者肿瘤组织样本和细胞株的抗辐射性高度相关

为了探讨CBX4与食管鳞癌患者放射治疗疗效的相关性，根据放疗有效性将所有病例分为放射敏感组和放射抵抗组。免疫组织化学染色显示：与放射敏感患者相比，放射抵抗组的CBX4表达水平明显升高。典型IHC图像(图1A)。根据两个独立病理学评估提供的中值，CBX4表达升高(17.42±2.29vs27.00±3.43，P<0.05)与放射抵抗显著相关(图1B)。为了进一步研究CBX4在辐射反应中的调节作用，在不同剂量(0、2、4、6和8Gy)的照射下，对ESCC细胞中CBX4的表达进行了评估。TE-13和KYSE-150细胞中的CBX4在细胞接受照射后表达显著增高且剂量依赖性地上调(图1C和D)。上述数据表明，在ESCC患者和细胞系中，CBX4的表达与放射抵抗高度相关。

2、体外实验证实CBX4在食管鳞癌中促进放射抵抗

为了确定CBX4在食管鳞癌抗辐射中的重要作用，利用针对CBX4的特异性shRNA成功地构建了TE-13和KYSE-150细胞的稳定CBX4敲低细胞系(图2A和B)。与对照shRNA的细胞相比，CBX4基因敲低组显著降低了TE-13和KYSE-150细胞的增殖率(图2C)。此外，CBX4基因敲除后，ESCC细胞对放射的敏感性显著增加。结晶紫染色后评估克隆存活率，并进一步将克隆形成数据提交至线性二次(LQ)模型分析(图2D和E)。CBX4基因敲除低后TE-13和KYSE-150细胞的SER值分别为1.13和1.22。这些数据表明CBX4敲低增强了食管鳞癌的放射敏感性。

3、体内实验证实CBX4敲低在食管鳞癌中增加放射敏感性

为了进一步在体内模型中验证CBX4基因敲低有助于增强食管鳞癌的放射敏感性，将CBX4基因敲低稳定的TE13细胞皮下注射于BALB/c裸鼠，然后在第18天暴露于6Gy X射线照射。结果显示，从CBX4敲低细胞生长的肿瘤比从对照细胞生长的肿瘤要小得多(图3A)。同样，照射后，CBX4基因敲低细胞生长的肿瘤比对照shRNA处理的细胞生长的肿瘤小。在处死后，CBX4基因敲低组的肿瘤大小/体积与对照组相比(图3B和C)减少。肿瘤的重量也得到了类似的结果(图3D)。此外，与对照组相比，从CBX4基因敲低组收集的肿瘤组织中Ki67阳性细胞更少(图3E和F)。上述结果表明，食管鳞癌CBX4的表达显著影响在体内的放射敏感性。

4、CBX4调节辐射相关DNA损伤、细胞周期分布和凋亡

为了探讨CBX4对食管鳞癌细胞放射敏感性的影响机制，我们检测了放射诱导的不同细胞反应，包括DNA损伤、细胞周期阻滞和细胞凋亡。首先，为了确定CBX4是否参与了双链DNA断裂修复，我们检测了照射前后CBX4基因敲低组和shRNA对照细胞中磷酸化H2AX(γH2AX)的表达模式。γH2AX免疫染色的典型图像(图4A)和相关定量分析(图4B)表明，在TE-13和KYSE-150细胞系中，γH2AX在照射后的短时间内显著增加，然后缓慢下降。在CBX4基因敲低组的γH2AX表达(图4B)在照射后不同时间点均高于对照shRNA组。同样地，通过Western blot检测的C-PARP(双链DNA断裂的另一个指标)的表达水平比对照的shRNA细胞在CBX4敲低细胞中更高(图4C)。除了双链DNA断裂外，细胞周期阻滞是评估细胞对辐射反应的另一个重要参数。我们检测了照射前后CBX4基因敲低组和对照组shRNA的细胞周期分布。如图4D，照射后两种细胞系的G2/M期细胞百分比显著增加；与shRNA对照组相比CBX4基因敲除组的G2/M期细胞百分比显著降低，S期细胞百分比增加。这表明CBX4沉默可能有助于细胞逃避放射诱导的G2/M阻滞。细胞凋亡是细胞对辐射的另一重要反应。我们发现在TE-13和KYSE-150细胞系中CBX4基因敲低在正常条件下不影响细胞凋亡，但照射后凋亡水平增加(图4E)。CBX4沉默增加了BAD和BAX的表达水平，降低了照射后BCL2的表达(图4F)。总的来说，CBX4基因敲除增加了照射后DNA双链损伤反应，减少了细胞周期阻滞，增强了细胞凋亡。

5、靶向CBX4通过减少自噬体的形成促进放射相关的细胞死亡

为了进一步探讨CBX4调控食管鳞癌放射敏感性的机制，我们通过基因集富集分析(GSEA)来探究潜在的途径或生物过程。我们发现，低CBX4含量与自噬途径某些成分的表达水平降低相关(FDR-q值为0.195)，表明低CBX4表达可能对ESCC的自噬活性产生负面调节(图5A)。为了确定CBX4基因敲除是否影响自噬通量，将GFP-mRFP-LC3转染TE-13和KYSE-150细胞株。嘌呤霉素筛选后，与对照组细胞相比，CBX4敲低的TE-13和KYSE-150的自噬体数量显著减少。接受8Gy的照射后，敲低组的自噬提减少更明显(图5B)。透射电镜(TEM)检测自噬体形成进一步确认了这样的结果(图5C)。微管相关蛋白1轻链3(MAP1LC3/LC3)代表自噬标记。在自噬过程中，不溶于脂肪的LC3(LC3-I)与磷脂酰乙醇胺(PE)相互作用，发生转化，产生脂溶性LC3-II，这有助于自噬体的产生。LC3-II被溶酶体迅速降解；因此，通过LC3-II量的变化可以很容易地测量自噬通量。为了进一步研究CBX4在调节细胞自噬活性中的作用，我们用免疫印迹法检测了LC3Ⅰ型向Ⅱ型的转变。对照shRNA组的LC3-II蛋白含量显著高于CBX4基因敲除组(不论是否经过照射)或氯喹(CQ)给药后。与单用放射线或CQ治疗相比，联合放射线和CQ治疗在对照shRNA和CBX4基因敲低组的蛋白水平上导致LC3-II更明显的转变(图5D和E)。

6、CBX4通过Beclin 1调节照射后自噬活性

Beclin 1控制自噬体的形成和成熟。照射前后检测CBX4基因敲低和对照shRNA食管鳞癌细胞株mRNA和蛋白水平。数据显示，CBX4基因敲低后，Beclin 1的含量显著下降。同时，p62被认为是一种特殊的自噬体货物蛋白，在CBX4基因敲除后显著上调(图6A)。在CBX4沉默的异种移植瘤样本中也发现了类似的结果(图3E和F)。为了进一步确定Beclin 1在调节CBX4对ESCC的抗辐射和自噬抑制中的作用，beclin1在ESCC细胞系中过度表达。结果清楚地表明，Beclin 1过表达增加了照射后的菌落形成(图6B)，并根据LC3-II水平逆转了CBX4沉默诱导的自噬抑制(图6C)。因此，在食管鳞癌细胞系中Beclin 1过度表达后，自噬体的形成和成熟显著增强(图6D和E)。综上所述，上述结果表明，放射抗性可能部分归因于放射相关自噬激活。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学附属肿瘤医院

<120> CBX4抑制剂在制备食管鳞癌放射增敏剂中的应用

<130> /

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

gatgaagata gtcaagaaca a 21

<210> 2

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

ccgggatgaa gatagtcaag aacaattcaa gagattgttc ttgactatct tcatcttttt 60

g 61

<210> 3

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

aattcaaaaa gatgaagata gtcaagaaca atctcttgaa ttgttcttga ctatcttcat 60

c 61

Claims (5)

1.CBX4抑制剂在制备放射抗性食管鳞癌放射治疗增敏剂中的应用；所述的CBX4抑制剂为针对CBX4的特异性shRNA，其靶点序列如SEQ ID NO.1所示，所述的shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

2.CBX4抑制剂重组载体在制备放射抗性食管鳞癌放射治疗增敏剂中的应用；所述的CBX4抑制剂重组载体包括表达载体以及插入设置在该表达载体上的CBX4 shRNA，所述的shRNA的靶点序列如SEQ ID NO.1所示，所述的shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ IDNO.3所示。

3.一种放射抗性食管鳞癌放射治疗增敏剂，其特征在于，所述的放射抗性食管鳞癌放射治疗增敏剂以CBX4抑制剂或CBX4抑制剂重组载体作为活性成分；所述的CBX4抑制剂为针对CBX4的特异性shRNA，其靶点序列如SEQ ID NO.1所示；所述的CBX4抑制剂重组载体包括表达载体以及插入设置在该表达载体上的CBX4 shRNA，所述的shRNA的靶点序列如SEQ IDNO.1所示，所述的shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求3所述的增敏剂，其特征在于，所述的增敏剂中还包括其他药学上可接受的成分。

5.根据权利要求3所述的增敏剂，其特征在于，所述的增敏剂为注射剂。

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