KR100942807B1

KR100942807B1 - 폐암의 예방 또는 치료용 유전자 치료제 및 약제 조성물

Info

Publication number: KR100942807B1
Application number: KR1020070137115A
Authority: KR
Inventors: 조명행; 조종수
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2007-12-26
Filing date: 2007-12-26
Publication date: 2010-02-18
Also published as: KR20090069448A; US20090169485A1

Abstract

본 발명은 폐암의 예방 또는 치료용 유전자 치료제 및 약제 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 폴리에스테르 아민을 합성하여 유전자전달체로 사용하였으며, 상기 유전자전달체의 효율 및 Akt관련 신호와 세포주기조절에 관한 Akt1 siRNA의 잠재적 효력을 평가한 결과, 폴리에스테르 아민/Akt1 siRNA복합체의 에어로졸은 코로만 흡입되는 시스템에 의하여 K-ras 제거된 폐암 마우스에 전달되었고, 전달된 Akt1 siRNA는 폐종양전개를 상당히 억제하였을 뿐만 아니라, 폴리에스테르 아민 매개의 Akt1 siRNA에 의한 에어로졸 전달은 비침습성(invasive) 생체내 유전자치료와 혼용하여 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

폐암, 폴리에스테르 아민, Akt, siRNA

Description

폐암의 예방 또는 치료용 유전자 치료제 및 약제 조성물 {Gene Therapy and Pharmaceutical Composition for Preventing or Treating Lung Cancer}

본 발명은 폐암의 예방 또는 치료용 유전자 치료제 및 약제 조성물에 관한 것이다.

폐는 아주 접근하기 쉬운 장기이고, 그러므로 유전자 전달 시스템의 국소적용을 받을 수 있다. 폐질환 의약의 분야는 암을 포함하는 다양한 폐질환에 실현 가능한 비침습성 치료의 접근을 찾아내는 희망에 많은 노력을 투자하고 있다 (Dailey et al., 2004; Ferrari et al., 2002; Merdan et al., 2002).

정맥 주사와 코의 또는 내부도관의 주입과 같은 폐에 유전자 전달을 위한 다른 접근이 각종 동물 모델에서 보고되었다 (Gautam et al., 2001; Goula et al., 2000). 그러나, 이러한 전략은 침습적이거나 또는 그 방법이 폐 조직을 통한 관심있는 유전자의 효율적인 전달에 적합하지 않을지도 모른다.

바이러스성과 비바이러스성 벡터 또한 유전자 치료를 위해 이용되고 있다. 바이러스성 벡터는 세포에 들어가고 관심있는 유전자의 표현을 촉진시키는 본질적 인 능력 때문에 주로 사용된다. 그러나, 반복된 투여에 대한 면역 반응 및 대규모 생산의 어려움과 같은 많은 요인은 바이러스성 벡터의 실제적인 사용을 제한한다 (Densmore, 2006).

다른 한편으로, 비바이러스성 벡터는 쉬운 조작, 저렴한 비용, 안전 및 상대적으로 비면역원성 (nonimmunogenicity)의 용이함과 같은 몇몇 이점 때문에 많은 관심사를 끄는 것을 계속한다. 다양한 비바이러스성 벡터는 각종 기관에 유전자 전달을 위해 개발되었다.

이에 에어로졸 전달은 관심있는 유전자에 효과적으로 전달할 수 있고,폐에 유전자 표적에 대한 비침습성 대안을 대표한다 (Merlin et al., 2001). 이와 관련하여, 본 발명자들은 이미 용해성 (degradability), DNA와 복합체를 형성하는 능력, 및 적은 독성과 강화된 유전자 전달효율을 갖는 유전자 전달에 적합한 물리화학적 성질 때문에 이미 폴리에스테르 아민이 효과적인 전달 수단이 된다는 것을 확인한 바 있다 (Park et al., 2005).

한편, 세린 트레오닌 키니아제 Akt (단백질 키니아제 B)는 세포 생존, 및 세포 증식의 중요한 조절제이다 (Vivano and Sawyers, 2002). 상기 Akt는 세포 증식을 자극하고 세포자살을 억제하는 것에 의하여 암에 핵심 역할을 한다 (Lawlor and Alessi, 2001). Akt 동류형(isoforms)을 인코딩하는 유전자의 증폭은 많은 종양에서 발견되었다 (Vivano and Sawyers, 2002).

Akt의 지배적인 음성 대립 유전자는 세포 생존을 차단하고, 세포자살반응을 유도하는 것으로 보고되었다 (Li et al., 1998). 왜냐하면 Akt가 세포의 생존과 증식 모두를 촉진시키기 때문에, 예를 들면 Akt 활성을 바꾸는 것에 의한 그 하류 신호전달 경로의 특정 억제는 Akt 유전자의 증폭과 함께 종양을 위한 합리적인 치료 전략일 수 있다.

인간 종양의 대략 30% 는 ras 유전자 돌연변이를 수행한다. K-ras, N-ras 및 H-ras의 Ras-family 3종 중, K-ras는 폐 선암 (25- 50%)을 포함하는 인간 종양에 있어 가장 빈번하게 돌연변이되는 것으로 확인되었다 (Pellegata et al., 1996). 이같은 돌연변이를 수행하는 쥐는 일정 범위의 종양 타입에 아주 걸리기 쉽고, 짧은 잠복기 및 높은 발현성을 보여준다 (Johnson et al., 2001). 이에 이하 실시예에서는, 비소세포성 폐암 (NSLC, non-small lung cancer)인 실험실용 동물 모델로서 K-ras 제거 마우스의 폐에 종양을 발생시킨 다음 에어로졸 전달된 Akt1 siRNA에 대하여 생체내 평가를 수행하였다.

한편, siRNA는 표적 유전자의 서열에 상응하는 이중가닥 RNA에 의해 유도된 전사 후 유전자 침묵 메커니즘 (gene-silencing mechanism)을 갖는다(Hu et al., 2002; Cogoni and Macino, 2000).

화학적으로 합성된 siRNAs의 도입은 포유류 세포에서 유전자 침묵을 유도할 수 있다. 포유류 세포에서 short 21-nt RNA 두가닥의 감염은 유전자 표현을 방해하 고 불특정의 항바이러스 반응을 유도하지 않는다(Elbashir et al., 2001).

화학적으로 합성된 siRNA는 보통 내인성으로 표현된 표적 mRNA의 단지 일시적인 감소를 유도한다. 상술한 siRNA 기술의 출현은 생체 외 및 생체 내 모두에서 효과적인 유전 조작의 가능성을 열었다.

그러나 siRNA의 성공적인 생체내 적용 여부는 적합한 운반체 및 siRNA 의 표적이 되는 전달체에 달려있다.

전통적인 치료는 대부분의 폐암에 적합하지 않다. 그렇기 때문에 새로운 기술이 폐암치료에 필요하다. 이에 본 발명자들은 Akt1 siRNA의 비침습성 타겟전달의 중요성에 착안하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

최근 몇년간 암을 포함한 다양한 폐 질환의 치료를 위한 에어로졸 유전자 전달 기술의 발달에 많은 노력이 집중되었다. 이러한 노력은 대부분 분무치료 (nebulization)의 sheering force에 저항하고 폐에서 최적으로 기능하는 적절한 비바이러스성 DNA 전달 운반체를 찾아내는 것에 관련되어 있다 (Tehrani et al., 2007).

몇몇 비바이러스성 벡터 중 PEI-PEG 공중합체와 같은 PEI 유도체는 생체적합성을 강화하기 위하여 합성되었고(Ahn et al., 2002), 비록 공중합체가 분해 가능하고 덜 유독하더라도 공중합체의 감염 효율성이 PEI 25K에 비교하여 낮다는 것을 발견하였다.

이에 본 발명자들은 이미 PEI 유도체의 합성을 위한 많은 노력 끝에 PEI-PEG와 같은 경우 높은 감염 효율성 및 낮은 독성을 가지고, 새로운 분해가능한 폴리에스테르 아민을 생산하는 새로운 유전자전달체로서 새로운 중합체를 합성하도록 촉진한다는 것을 확인할 수 있었다(Park et al., 2005).

Akt는, 비록 몇몇 동류형-특정 특징이 있더라도 일반적으로 넓게 표현되는 3개의 동류형인 Akt1, 2 및 3으로 구성된다 (Vivance and Sawyer, 2002). 실제로 Akt1은 특정 암세포 죽음에 대한 중요 요소로 Akt 억제를 제시하는, NSLC의 치료 저항성에 관련된다 (Brognard et al., 2001).

Akt1 활성화가 상향조절된 (upregulated) 세포 증식과 관련되어 있다고 하더라도, 세포증식과 mTOR, p70S6K 및 4E-BP1와 같은 중요한 하방 작동체의 측면을 감아해볼 때 Akt1의 생체내 효과는 대부분 불명확하게 남아있다.

이를 명확히 해결하기 위하여, 본 발명자들은 Akt1 siRNA에 기초하여 폐암 진행중인 Akt1의 기능에 착수하게 된 것이다.

본 발명의 목적은 폐암 환자의 장기생존에 수행하는 전통적인 치료의 낮은 효을 대체할 수 있는 에어로졸 유전자 전달을 이용한 새로운 유전자 치료제를 제공하려는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 Akt1 활성을 감소시키는 작용제를 이용하여 암 세포에서 아폽토시스를 유도하는 약학 조성물을 제공하려는데 있다.

본 발명의 제1 견지에 의하면,

폐 종양세포를 Akt1 활성을 감소시키는 작용제 및 유전자 운반체와 접촉시켜 폐암을 예방 또는 치료하는 유전자 치료제에 있어서,

상기 작용제로는 siRNA, 안티센스 분자, 길항제, 리보자임, 억제제, 펩티드 및 소형 분자로 구성된 군으로부터 선택하고,

상기 유전자 운반체로는 폴리에스테르 아민을 이용하며,

상기 접촉은 리포좀, 나노리포좀, 세라마이드-함유 나노리포좀, 프로테오리포좀, 나노미립자, 칼슘 인-실리케이트 나노미립자, 인산칼슘 나노미립자, 이산화규소 나노미립자, 나노결정질 미립자, 반도체 나노미립자, 폴리(D-아르기닌), 나노덴드리머, 바이러스, 인산칼슘 뉴클레오티드-매개된 뉴클레오티드 전달, 일렉트로포레이션, 미세주사의 이용 및 에어로졸 전달을 포함하는 것을 특징으로 하는 폐암 의 예방 또는 치료용 유전자 치료제를 제공한다.

본 발명의 제2 견지에 의하면,

상기 제1 견지에 의한 유전자 치료제, 및 담체를 포함하는 폐암을 예방 또는 치료하기 위한 약제 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에 의하여 폐 종양세포를 Akt1 활성을 감소시키는 작용제 및 유전자 운반체와 접촉시켜 폐암을 예방 또는 치료하는 유전자 치료제에 있어서, 상기 작용제로는 이에 한정하는 것은 아니나 siRNA, 안티센스 분자, 길항제, 리보자임, 억제제, 펩티드 및 소형 분자로 구성된 군으로부터 선택하는 것이 좋고, siRNA를 선택하는 것이 보다 바람직하다.

이때 유전자 운반체로는 폴리에스테르 아민을 이용하는 것이 높은 감염효율성 측면에서 볼 때 바람직하다.

또한, 상기 접촉은 리포좀, 나노리포좀, 세라마이드-함유 나노리포좀, 프로테오리포좀, 나노미립자, 칼슘 인-실리케이트 나노미립자, 인산칼슘 나노미립자, 이산화규소 나노미립자, 나노결정질 미립자, 반도체 나노미립자, 폴리(D-아르기닌 ), 나노덴드리머, 바이러스, 인산칼슘 뉴클레오티드-매개된 뉴클레오티드 전달, 일렉트로포레이션, 미세주사의 이용 및 에어로졸 전달 등 통상의 방법을 적용가능하며, 특히 에어로졸 전달에 의해 수행하는 것이 운반체로서 폴리에스테르 아민을 사용시 성공적인 전달과 관심있는 유전자의 효율적인 발현 측면에서 볼 때 바람직하다.

이때 상기 작용제와 유전자 운반체는 미리 복합체를 형성하는 것이 ? 측면에서 볼 때 바람직하다. 예를 들어 상기 복합제는 폴리에스테르 아민/siRNA 타입인 것을 특징으로 한다.

나아가, 본 발명은 상술한 유전자 치료제 및 담체를 포함하여 폐암을 예방 또는 치료하기 위한 약제 조성물을 제공한다. 상기 담체는 이에 한정하는 것은 아니나 리포좀, 나노리포좀, 세라마이드-함유 나노리포좀, 프로테오리포좀, 나노미립자, 칼슘-인 실리케이트 나노미립자, 인산칼슘 나노미립자, 이산화규소 나노미립자, 나노결정질 미립자, 반도체 나노미립자, 폴리(D-아르기닌), 나노덴드리머, 바이러스 및 인산칼슘 뉴클레오티드-매개된 뉴클레오티드 전달로 구성된 군으로부터 선택할 수 있다.

본 발명에 의한 폴리에스테르 아민/Akt1 siRNA 복합체의 에어로졸 전달을 수행한 결과, 하기 실시예에서 규명한 바와 같이, Akt 관련 신호와 세포 주기 조절을 변경하는 것을 통하여 K-ras 제거 마우스의 폐에서 폐 종양발생을 억제할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로는 Akt2,3이 아닌 Akt1 활동의 제거가 단백질 번역 (도 4 참조), 세포 주기 진행 (도 5 참조)에 중요한 Akt1-관련 신호를 억제하기에 충분하다는 것을 입증하였고, 이에 따라 폐 종양 진행을 억제하기에 충분함을 입증하였다 (도3 과 표 1 참조).

결과적으로, Akt1 제거가 종양 개시를 연기하고, K-ras 유전자 돌연변이에 의해 유도된 폐 종양에 대한 저항성을 깊이 제공하기에 충분했다는 것을 입증하였다. 최근 일련의 증거들은 또한 Akt1 결핍이 PTEN 결핍에 의해 유도된 종양 발달을 상당히 약하게 하기에 충분했다는 것을 입증하였다 (Chen et al., 2006).

또한 PTEN의 에어로졸 전달이 K-ras가 제거된 마우스의 폐에서 Akt 하방 경로를 억제하였다는 강력한 증거를 제공하였다 (Kim et al., 2004). 최근의 보고는 또한 직접적으로 Akt를 활성화시키지 않는 병변에 의해 유도된 종양발생을 억제하기 위한 일반적인 접근으로서 부분적인 Akt1 제거가 사용될 수 있다는 것을 보여주었다 (Skeen et al., 2006).

흥미롭게도 (Chen et al., 2006), Akt1 녹아웃 마우스가 그들의 수명에서 손상되지 않고, 야생형 마우스 (wild-type mice)보다 더 오래 사는 것이 가능할 수도 있다는 것이 보고되었다. Akt1이 전이를 억제했다는 것 또한 제시되었다 (Wyszomierski and Yu, 2005). 더불어, Akt1의 목표는 상당한 생리학적 문제를 야기함이 없이 암에 대한 치료적 접근으로서 사용될 수 있다는 것이다.

최근 십년간, 많은 연구가 세포 주기 통제와 폐 발암현상 사이의 상호 관계에 집중하였다. 아폽토시스가 높게 보존되어 있는 복잡한 일련의 절차에 의해 통제되는 것과 마찬가지로, 세포 주기는 또한 진핵 세포가 증식함에 의해 높게 보전된 메커니즘이다.

본 발명에서는 특히 K-ras가 제거된 마우스의 폐에서 세포 주기 통제에 에어로졸 전달된 Akt1 siRNA의 효과를 실험한 결과로서, 에어로졸 전달된 Akt1 siRNA는 cyclin D1과3, CDK4 및 PCNA와 같은 세포증식 단백질을 억제하는 것을 통하여 폐암 성장을 억제한다는 것을 확인할 수 있었다 (도 5 참조). 참고로, 세포외 신호를 통해서 세포 주기 통제의 개시는 cyclin D를 포함하는 몇몇 단백질의 전사를 유도하고, cyclin D는 CDK4와 결합할 때 다음 세포 주기로 이동한다 (Caputi et al., 2005).

상기 결과는, Akt1이 cyclin D1 상향조절 (upregulation)과 관련되고, cyclin D1 상향조절 (upregulation)은 세포 주기의 G1/S 조절 포인트의 붕괴에 있어 도움을 주는 규정하는 관점의 붕괴에 있어 도움을 주어 발암 현상 동안의 비정상적 세포 증식으로 이끌어낸다는 발견에 의해 지지될 수 있다 (Parekh and Rao, 2007).

본 발명을 통하여, 에어로졸 전달된 폴리에스테르 아민/Akt1 siRNA 복합체는 Akt-관련 신호에 중요한 단백질을 조절함을 통한 폐암 진행, 그리고 세포주기 조절 을 효과적으로 억제하였으며, 에어로졸 유전자 전달은 유전자 전달의 효과적인 비침습성 모델을 제공할 수 있고, Akt1 siRNA는 폐암의 치료 뿐만 아니라 예방을 위한 단백질 번역과 세포 주기 조절을 목적으로 하는데 효과적일 수 있다.

규명한 내용을 정리하면 다음과 같다:

첫째, Akt1 siRNA의 에어로졸 전달은 특히 폐에서 Akt1 단백질을 감소시킨다.

둘째, Akt1 siRNA의 에어로졸 전달은 K-ras 제거된 마우스에서 특히 폐 종양발생을 억제한다.

셋째, Akt1 siRNA의 에어로졸 전달은 K- ras 제거 마우스의 폐에서 단백질 번역에 중요한 단백질을 억제한다.

넷째, Akt1 siRNA의 에어로졸 전달은 K- ras 제거 마우스의 폐에서 세포주기 조절에 중요한 단백질을 상당히 억제한다.

본 발명에 따르면, 폴리에스테르 아민/Akt1 siRNA복합체의 에어로졸은 코로만 흡입되는 시스템에 의하여 K-ras 제거된 폐암 마우스에 전달되었고, 전달된 Akt1 siRNA는 폐종양전개를 상당히 억제하였을 뿐만 아니라, 폴리에스테르 아민 매개의 Akt1 siRNA에 의한 에어로졸 전달은 비침습성(invasive) 생체내 유전자치료와 혼용하여 사용할 수 있는 것이다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한하는 것은 아니다.

< 실시예 1>

재료

폴리에틸렌이민 (Mn 423, 순도 97%)과 폴리(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트 (Mn 258, 순도 98%)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였고, pcDNA3.1-그린 형광 단백질 (GFP) (6.1 kb)는 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)사로부터 구입하였다. Thr308에서 Akt1 및 포스포-Akt에 대한 단일클론항체는 이 기술분야의 통상의 방법을 사용하여 제조하였다.

Ser473에서 항-포스포-Akt와 항-mTOR, Ser2448 항체에서 항-포스포-mTOR는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)사로부터 입수하였고, 웨스턴 블롯 및 IHC를 위한 다른 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)사로부터 입수하였다.

Akt1 siRNA 의 구성 및 폴리에스테르 아민/ siRNA 복합체의 제조

Akt1을 표적으로 하는 siRNA 구조체의 19-mer 머리핀형 서열을 인코딩하는 올리고뉴클레오티드는 Meng et al.(2006)에 의해 개시된 방법으로 설계되었다. siRNA이나 유전체에 대한 상당한 서열상동성이 결여되어 있는 siRNA로서 동일한 뉴클레오티드 조성을 갖는 scrambled siRNA를 설계하였다. 이러한 올리고뉴클레오티 드는 제조자 지시에 따라 siXpress^TM Human U6 PCR vector system (Mirus Bio, Madison, WI, USA)에 연결되었다.

공지된 방법으로 폴리에스테르 아민을 합성하였다(Park et al., 2005). 45의 장입비에서 폴리에스테르 아민/siRNA 복합체는 이전 결과에 근거한 유전자전달에 가장 효율적인 조건으로 선택하였다(Park et al., 2005). 간략하면, self-assembled 폴리에스테르 아민/siRNA 복합체는 증류수내에서 폴리에스테르 아민에 플라스미드 DNA 1㎎을 조심스러운 교반하에 점적하 첨가함으로써 개시되었으며, 최종부피 50㎖가 되도록 조정하였다. 이어서 복합체를 사용 전에 실온에서 30분간 배양하였다.

< 실시예 2>

폴리에스테르 아민/ siRNA 복합체의 생체내 에어로졸 전달

실험은 5주령의 ICR 마우스와 K-ras 제거 마우스로 각각 수행하였다. ICR마우스는 중앙실험동물(서울, 한국)로부터 구입하였고, K-ras 제거 마우스는 Human Caner Consortium-National Cancer Institute (Frederick, MD, USA)로부터 입수하였으며, 온도 23±2℃ 및 상대습도 50±20%에서 12시간 밤/낮 주기를 유지하여 실험실 동물 시설에 보관되었다. 본 연구에 사용된 모든 방법은 the Animal Care and Use Committee at Seoul National University (SNU-061110-5)에 의해 승인되었다. 유전자 전달을 위해 마우스의 코에만 노출되는 챔버에 두었고 이전에 사용된 방법 에 근거하여 에어로졸에 노출시켰다(Tehrani et al., 2007; Kim et al., 2004).

폴리에스테르 아민의 유전자 전달 효율의 테스트를 위하여, ICR마우스는 한 그룹당 3마리가 포함되도록 하여 3그룹으로 나누었다. 2가지 처리그룹은 폴리에스테르 아민을 갖거나 갖지 않는 GFP 플라스미드 DNA를 포함하는 에어로졸에 노출시켰고, 남은 1가지 처리그룹은 대조군으로서 사용되었다.

노출 2일 후에, 마우스를 희생시키고 GFP의 녹색신호를 검사하기 위해 폐를 수집하였다. 폐암 발달에서 Akt1 siRNA의 효과를 위하여, K-ras 제거된 마우스를 그룹당 4마리가 포함되도록 하여 3가지 그룹으로 나누었다. 대조 그룹은 어떤 것도 처리하지 않았고, 다른 2가지 그룹 중 siAkt처리군은 Akt1 siRNA와 함께, scrambled 대조군은 scrambled RNA와 함께 폴리에스테르 아민을 포함하는 에어로졸에 각각 노출되었다. K-ras 제거된 마우스는 총 4주동안 일주일에 두 번 에어로졸에 노출되었다. 테스트 기간이 지난 후, K-ras 제거 마우스를 희생하고 폐를 수집하였다.

검시절차동안 병변은 조심스럽게 현미경하에서 폐의 표면을 세어보았다. 동시에 폐는 조직병리학 검사 및 IHC를 위하여 10% 중성 완충 포르말린에 관류되고 고정되었다. 4마리의 마우스로부터 얻은 폐는 조직병리학 및 면역조직화학 분석에 사용되었다. 또한 남아있는 폐는 장래 연구를 위해 -70℃에서 보관되었다.

< 실시예 3>

웨스턴 블롯 분석

웨스턴 블롯 분석을 위해서, 4마리로부터 3마리의 폐가 무작위 샘플링에 의해 사용되었다. Bradford 킷트 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 균질화된 용해체의 단백질 농도를 측정한 후, 30 ㎍ 단백질을 SDS-PAGE상에서 분리하여 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다.

그 후, 막을 5% 탈지유를 포함하는 TTBS 상에서 1시간 동안 블락 (Block) 하고, 막을 5% 탈지유 내에서 대응하는 1차 항체로 4℃에서 밤새 배양한 후, 양고추냉이 과산화 효소(HRP)와 결합된 2차 항체와 상온에서 3시간 또는 4℃에서 밤새 배양하는 면역 블로팅을 수행하였다.

세척 후, 관심 있는 밴드를 발광영상분석기 LAS-3000 (Fujifilm, Tokyo, Japan)으로 분석하였다. 웨스턴 블랏 분석의 정량은 Multi Gauge version 2.02 program (Fujifilm, Tokyo, Japan)을 사용하는 것에 의해 수행되었다.

< 실시예 4>

조직병리학 검사 및 면역조직화학( IHC )

10% 중성 완충 포르말린에 고정된 파라핀-포매된 폐 조직 섹션을 4 ㎛로 절단하였다. 조직학적 분석을 위해, 조직섹션은 해마톡실린과 에오신으로 염색하였 다. IHC를 위해 조직섹션은 자일렌 (xylene)에서 조직으로부터 파라핀을 제거하고 알코올 구배를 통하여 다시 수화시키고 나서, 세척하고 내인성 과산화 효소 활성을 억제하기 위해 3% 과산화수소 (AppliChem, Darmstadt, Germany) 내에서 30분간 배양하였다.

PBS에서 세척한 후, 비특이적 결합 부위를 차단하기 위해 조직 섹션을 PBS 내 5% BSA로 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 1차 항체들을 4℃에서 조직 섹션 상에 밤새 적용하였다. 다음날, 조직 섹션들을 세척하고 HRP-결합 2차 항체(1:50)와 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 조심스럽게 세척한 후, 조직 섹션들을 Mayer's Hematoxylin (DAKO, Caepinteria, CA, USA)으로 대조염색하고 자일렌으로 세척하였다. Permount (Fisher, Pittsburgh, PA, USA)을 사용하여 커버 슬라이드에 올리고, 광학 현미경 (Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA) 하에서 관찰하였다.

Ser473 과 Thr308 에서 p-Akt 염색의 평가는 Tang et al. (2006)에 의한 득점 시스템에 따라 수행되었고, PCNA 염색의 평가는 Zhang et al. (2000)에 설명된 방법으로 수행되었다.

결과 고찰

첫째, 폴리에스테르 아민은 에어로졸 유전자 전달의 효율적인 운반체이다.

녹색 형광성 단백질 (GFP)를 생산하는 유전자 구조를 이용하여 ICR 마우스의 폐에서 생체내 폴리에스테르 아민의 감염 효율성을 확인한 결과로서, 마우스를 폴리에스테르 아민을 함유하는 에어로졸에 노출시킨 경우, GFP의 형광성 신호는 폴리 에스테르 아민/GFP 복합체에 노출된 그룹에서 2개의 그룹에 대해 강하게 검출되었다 (도 1 참조). 상기 결과로부터 본 발명의 전달계가 효율적으로 기능한다는 것을 확인할 수 있었다.

둘째, Akt1 siRNA 의 에어로졸 전달은 특히 폐에서 Akt1 단백질을 감소시킨다.

에어로졸 전달된 Akt1 siRNA가 특히 Akt1를 표적으로 했는지를 확인하기 위하여 Akt 1,2 및 3의 단백질 표현은 에어로졸 siRNA에 노출된 마우스의 폐조직에서 웨스턴블랏에 의해 측정한 결과, 도 2a 및 2b에서 보듯이, 전달된 Akt1 siRNA는 Akt 2,3가 변하지 않고 남아있는 동안 특별히 Akt1의 단백질 발현을 억제한 것을 확인할 수 있었다.

Akt1의 최대활성을 위해서는 Thr308 및 Ser473의 인산화가 요구되는 점(Tehrani et al., 2007; West et al., 2003)을 감안하여, Akt1의 인산화 상태를 실험한 결과, Akt1 siRNA는 Thr308에서 뿐만 아니라 Ser473에서 Akt의 인산화를 억제한 것을 확인할 수 있었다 (도 2c 참조). 한편, 농도계 분석은 명확하게 Akt 인산화가 현저하게 억제되었다는 것을 설명하였다 (도 2d 참조).

억제된 Akt1 인산화는 도 2e에서 보이는 것과 같이 IHC에 의해서, 나아가 도 2f에서 보이는 바와 같이 면역양성 세포에 의하여 모두 확인할 수 있었다.

셋째, Akt1 siRNA 의 에어로졸 전달은 K- ras 제거된 마우스 에서 특히 폐 종양발생을 억제한다.

Akt1 단백질에서 감소가 폐암의 모델에서 종양발생을 바꾸었는지 결정하기 위하여, Akt1에 유도된 siRNA는 K-ras 제거 마우스의 폐로 에어로졸 폴리에스테르 아민에 의해 전달되었다. 이때 K-ras 제거 마우스는 총 4주동안 일주일에 2회씩 에어로졸에 노출시켰다.

그 결과 도 3a에서 보듯이, Akt1 siRNA에 의해 종양의 수는 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있었다 (화살표 및 원 표시 참조). 조직병리학적인 검사는 또한 폐종양 형성이 현저하게 억제되었다는 것을 나타내었다 (도 3b내 화살표 참조).

종양 억제의 범위를 하기표 1에 요약하였다.

그룹	No.^a	종양 No.^b	adenoma incidence^c	hyperplasia incidence
그룹	No.^a	종양 No.^b	adenoma incidence^c	+++^d	++^e
CON	4	18±0.3	3	2	0
SCR	4	18±0.5	2	1	1
siAkt1	4	11±0.5^{*, #}	1	0	2

^a: 실험된 마우스의 수

^b: 마우스중 종양 수

^c: 장애가 관찰된 마우스의 수

^d: 폐포 상피 이상증식 등급은 moderate함.

^e: 폐포 상피 이상증식 등급은 mild함.

^*: 유의성 p<0.05로서 대조군과 현저하게 차이가 있었다.

^#: 유의성 p<0.05로서 SCR 그룹과 현저하게 차이가 있었다.

상기 표에서 보듯이, Akt1 siRNA가 선종, 그리고 특히 (세포의)과다형성 발생뿐만 아니라 종양 수를 억제한다는 것을 확인할 수 있다.

넷째, Akt1 siRNA 의 에어로졸 전달은 K - ras 제거 마우스의 폐에서 단백질 번역에 중요한 단백질을 억제한다.

인산화에 의하여 활성화된 Akt는 종양발생에 있어 중추적인 역할을 한다. Akt/mTOR 경로는 p70S6K와 4E-BP1 인산화의 조절을 통해 세포의 단백질 번역, 그리고 암세포 성장과 밀접한 관계가 있는 단백질 번역을 통제한다 (Lawlor and Alessi, 2001). Akt1 siRNA가 폐 종양발생을 어떻게 억제하는지 기계적인 통찰을 얻기 위해 Akt 관련된 신호에 대해 중요했던 단백질을 분석한 결과, Akt1의 억제가 상당히 mTOR 및 phospho-mTOR 단백질 발현을 감소시켰음을 확인할 수 있었다.

또한 Akt1 siRNA의 에어로졸 전달은 p70S6K와 phospho-p70S6K의 단백질 발현을 억제하였다. 그러한 Akt1 siRNA는 K-ras 제거 마우스의 폐에서 4E-BP1의 Thr69 및 Ser65에서 인산화를 상당히 억제한 반면, 총 4E-BP1의 단백질 발현의 상당한 변화를 유도하지 않았다 (도 4a 및 4b 참조).

다섯째, Akt1 siRNA 의 에어로졸 전달은 K - ras 제거 마우스의 폐에서 세포주기 조절에 중요한 단백질을 상당히 억제한다.

Akt는 세포 주기 진행을 조절하는 것으로 알려져 있다 (Lawlor and Alessi, 2001). 이에 K-ras 제거 마우스의 폐에서 세포 주기에 대한 Akt1 siRNA의 효과를 평가한 결과, Akt1 siRNA의 에어로졸 전달이 cyclin D1, D3, CDK4, and PCNA와 같은 세포주기 조절에 중요한 단백질의 수를 억제한다는 것을 명백하게 입증하였다 (도 5a 및 5b 참조).

세포증식 표지 PCNA 발현의 수준을 추가로 분석하였으며, 그 결과는 IHC에 의하여(도 5c 참조) 그리고 면역양성세포 표시를 표지한 PCNA 표지의 득점에 의하여 (도 5d 참조) 얻어졌다. 상기 결과들로부터 Akt1 siRNA가 K-ras 제거 마우스의 폐에서 세포증식을 억제하였음을 명백히 입증할 수 있다.

도 1은 유전자 전달체로서 폴리(에스테르 아민)의 전달 효율을 도시한 사진(x200)이다.

도 2는 K-ras null 마우스의 폐내 폴리(에스테르 아민)/Akt1 siRNA 억제된 Akt1 활성의 에어로졸 전달을 도시한 도면 및 그래프로서, (a)는 Akt 단백질 패밀리의 웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한 도면(x200)이고, (b)는 관심있는 밴드를 농도계로 추가 분석한 결과를 도시한 그래프이고, (c)는 형광-Akt 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 도시한 도면(x200)이고, (d)는 형광-Akt 단백질의 농도계 분석 결과를 도시한 그래프이고, (e)는 K-ras 제거된 마우스의 폐내 형광-Akt 발현을 면역조직화학적 분석한 도면(x200)이고, (f)는 K-ras 제거된 마우스의 폐내 형광-Akt 표지 지수를 대비한 그래프로, CON은 대조군을, SCR은 scrambled 대조군을, siAkt1는 Akt1 siRNA을 나타내고, 스케일 바는 100㎛를 의미한다.

도 3은 K-ras 제거된 마우스내 폐의 종양 병리를 도시한 도면(x200)으로서, (a)는 K-ras 제거된 마우스 폐가 갖는 손상을 화살표 및 점선으로서 보이며, (b)는 K-ras 제거된 마우스 폐의 조직학 특성을 도시한 도면으로, 화살표는 K-ras 제거된 마우스의 폐내 선암종을 지시하며, CON은 대조군을, SCR은 scrambled 대조군을, siAkt1는 Akt1 siRNA을 나타내고, 스케일 바는 100㎛를 의미한다.

도 4는 K-ras 제거된 마우스의 폐내 Akt1-관련 단백질의 웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한 도면 및 그래프로서, (a)는 mTOR, p70S6K, 및 4E-BP1 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 도시한 도면(x200)으로, 에어로졸로 전달된 Akt1 siRNA로 처리된 K-ras 제거된 마우스의 폐내 용해물로부터 단백질 변환에 중요한 단백질을 분석하였으며, (b)는 관심있는 밴드를 추가로 농도계로 분석한 그래프로서, CON은 대조군을, SCR은 scrambled 대조군을, siAkt1는 Akt1 siRNA을 나타낸다.

도 5는 K-ras 제거된 마우스의 폐내 세포 주기 제어에 중요한 단백질을 분석한 결과를 도시한 도면으로서, (a)는 cyclin D1, cyclin D3, CDK4 및 PCNA 단백질의 발현을 도시한 도면으로(x200), 에어로졸로 전달된 Akt1 siRNA로 처리된 K-ras 제거된 마우스의 폐내 용해물로부터 K-ras 제거된 마우스의 폐내 세포주기 제어에 중요한 단백질을 분석하였다. (b)는 관심있는 밴드를 추가로 농도계로 분석한 결과를 도시한 그래프이다. (c)는 K-ras 제거된 마우스의 폐내 PCNA의 면역조직화학적 분석 결과를 도시한 도면(x200)이다. 진갈색은 PCNA의 발현을 지시한다. (d)는 K-ras 제거된 마우스의 폐내 PCNA 표지지수를 대조한 그래프이다. PCNA 양성 염색을 섹션별 임의 선별 3개의 필드로부터 계수하여 측정하고, x400 배율에서 100 세포별 DAB-양성 세포의 %를 측정하였다. CON은 대조군을, SCR은 scrambled 대조군을, siAkt1는 Akt1 siRNA을 나타낸다.

Claims

Akt1에 대한 siRNA와 상기 siRNA의 운반체로서 폴리에스테르 아민을 포함하고, 에어로졸 전달을 위한 제제로 제형화된 것을 특징으로 하는 폐암의 예방 또는 치료용 유전자 치료제.
삭제
제1항에 있어서, 상기 siRNA와 이 siRNA 운반체는 미리 복합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 폐암의 예방 또는 치료용 유전자 치료제.
삭제
삭제
제1항 또는 제3항에 따른 유전자 치료제 및 담체를 포함하는 폐암을 예방 또는 치료하기 위한 약제 조성물.
제6항에 있어서, 상기 담체는 리포좀, 나노리포좀, 세라마이드-함유 나노리포좀, 프로테오리포좀, 나노미립자, 칼슘-인 실리케이트 나노미립자, 인산칼슘 나노미립자, 이산화규소 나노미립자, 나노결정질 미립자, 반도체 나노미립자, 폴리(D-아르기닌), 나노덴드리머, 바이러스 및 인산칼슘 뉴클레오티드-매개된 뉴클레오티드 전달로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 약제 조성물.