CN111212919B - 纳米孔测序单元中的双电层电容的测量 - Google Patents
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Abstract
技术涉及测量测序单元的双电层电容。在某些实施方案中，在测序单元中的井上方形成膜之前测量双电层电容。将双电层电容器预充电到初始电压水平。使用具有已知电容值的电容器将双电层电容器反复充电或放电。使用双电层电容器的充电或放电率测定双电层电容。在一些实施方案中，在形成双层和纳米孔后测量双电层电容。将双电层电容器预充电到初始电压水平。然后对测序单元施加不同于初始电压水平的电压水平。使用与双电层电容器上的电压水平的衰减相关联的计时测定双电层电容。
Description
背景
具有内径大约1纳米的孔隙尺寸的纳米孔膜装置已在快速核苷酸测序中显示出希望。当跨浸在导电流体中的纳米孔施加电压信号时，电场可使导电流体中的离子移动穿过纳米孔。导电流体中的离子移动穿过纳米孔可引发小的离子电流。施加的电压也可使待测序的分子（或待测序的分子的分子代替物（molecular proxies））移入、穿过或移出纳米孔。离子电流（或相应电压）的水平取决于纳米孔的尺寸和化学结构和已移入纳米孔的特定分子。
作为移动穿过纳米孔的DNA分子（或其它待测序的核酸分子）的替代，分子（例如添加到DNA链中的核苷酸）可包括特定尺寸和/或结构的特定标签，其充当代替物（proxy）。作为测量与该分子对应的纳米孔电阻的一种方式，可以（例如在积分电容器处）测量包括纳米孔的电路中的离子电流或电压，由此能在纳米孔中检测特定分子和在核酸的特定位置的特定核苷酸。
纳米孔基测序芯片可包含配置为阵列的大量传感器单元（sensor cells）以用于平行DNA测序。在纳米孔基测序芯片的制造和/或使用过程中，为了如质量保证、一致性检验（uniformity check）、基线校准、数据归一化和/或碱基识别之类的目的，可能需要在制造和/或测序过程的不同阶段测量各种参数。
概述
本文中描述的技术涉及纳米孔基核酸测序。具有电容值cdbl的双电层电容器（double-layer capacitor）Cdbl可存在于纳米孔测序单元（sequencing cell）中的电解质和工作电极之间的界面处。电容值cdbl可随时间经过而变化，以在恒定施加电压下进行的测量中造成衰减。较高cdbl可降低周期内衰减。在每个单元的基础上已知cdbl可允许智能调节测量数据以准确识别碱基。可在纳米孔单元中形成双层(bilayer)和纳米孔之前和/或之后测量cdbl。
在某些实施方案中，可在将电解质添加到纳米孔单元中之后但在测序单元中的井（well）上形成膜（例如双层）和形成纳米孔之前测量cdbl。可将双电层电容器预充电到初始电压水平。可以使用具有已知电容值的电容器，例如与测量中使用的一个或多个积分电路相关联（下文称为积分电容器）并具有已知电容值cint的电容器Cint将双电层电容器反复充电或放电。可在一定次数的充电或放电后测量双电层电容器上的电压水平。可以使用双电层电容器的充电或放电率测定cdbl和cint之间的比率和因此当已知cint时测定cdbl的绝对值。
例如，积分电容器可反复与双电层电容器断开，充电到与双电层电容器的初始电压水平不同的已知电压水平，并再连接到双电层电容器。在每一个这样的周期中，积分电容器可提高或降低双电层电容器上的电压水平，提高或降低量取决于双电层电容器与积分电容之间的初始电压差和取决于cdbl和cint之间的比率。
在一些实施方案中，可在双层和纳米孔形成后测量cdbl，此时可能已形成具有电阻r孔隙的电阻器R孔隙（例如开放通道电阻器）和/或与纳米孔关联的电容器（C双层）。可将双电层电容器预充电到初始电压水平。然后可对脂质双层和纳米孔上方的主体电解质（bulkelectrolyte）施加不同于初始电压水平的电压水平。电压差可使双电层电容器上的电压水平经由与纳米孔关联的电阻器和/或电容器充电或放电（即衰减）。可以特定取样率或在特定时刻测量双电层电容器上的电压水平。当已知r孔隙时可以使用双电层电容器上的电压水平的衰减的时间常数(τ~r孔隙cdbl)测定cdbl。
下面详细描述本发明的这些和其它实施方案。例如，其它实施方案涉及与本文所述的方法相关的系统、装置和计算机可读介质。
参考下列详述和附图可以获得本发明的实施方案的性质和优点的更好理解。
附图简述
图1是阐释示例性纳米孔基测序芯片中的纳米孔单元的一个实施方案的简化结构。
图2阐释可用于表征多核苷酸或多肽的纳米孔传感器芯片中的示例性纳米孔单元。
图3阐释使用纳米孔基合成测序（sequencing-by-synthesis）（Nano-SBS）技术进行核苷酸测序的纳米孔单元的一个实施方案。
图4阐释在导电电极和相邻液体电解质之间的界面处形成的双电层电容器。
图5阐释在导电电极和相邻液体电解质之间的界面处可与如图4中所示的双电层电容器的形成同时形成的准电容效应。
图6阐释代表纳米孔单元的电气模型的示例性电路。
图7阐释在核苷酸测序过程中在纳米孔单元上的示例性控制和测量信号。
图8阐释纳米孔单元中的非法拉第传导的示例性小信号模型。
图9显示在AC周期的亮时段和暗时段的过程中由纳米孔单元捕获的示例性数据点。
图10A阐释根据某些实施方案在阶跃响应电容测量过程中用于建立基线的纳米孔单元中的电路的示例性配置。
图10B阐释根据某些实施方案在阶跃响应电容测量过程中用于测量负阶跃响应的纳米孔单元中的电路的示例性配置。
图10C阐释根据某些实施方案在阶跃响应电容测量过程中用于测量正阶跃响应的纳米孔单元中的电路的示例性配置。
图11阐释根据某些实施方案使用阶跃响应电容测量技术测量双电层电容的示例性AC阶跃信号。
图12A阐释根据某些实施方案使用阶跃响应电容测量技术测量具有较低电容的双电层电容器的示例性结果。
图12B阐释根据某些实施方案使用阶跃响应电容测量技术测量具有较高电容的双电层电容器的示例性结果。
图13阐释根据某些实施方案在阶跃响应电容测量过程中双电层电容器上的电压信号的衰减。
图14阐释使用电化学阻抗谱法（EIS）测量的双电层电容和使用阶跃响应电容测量技术测量的衰减时间之间的相关性。
图15阐释根据某些实施方案用于测量具有较高电容的双电层电容器的电容的示例性阶跃响应电容测量技术。
图16是阐释根据某些实施方案的阶跃响应电容测量的示例性方法的流程图。
图17A阐释根据某些实施方案在电荷滴定电容（charge titration capacitance）测量过程中纳米孔单元中的电路的示例性配置。
图17B阐释根据某些实施方案在电荷滴定电容测量过程中用于将积分电容器充电的纳米孔单元中的电路的示例性配置。
图17C阐释根据某些实施方案在电荷滴定电容测量过程中用于将积分电容器放电的纳米孔单元中的电路的示例性配置。
图18阐释根据某些实施方案在双电层电容器的电容和积分电容器的电容之间的不同电容比率下的电荷滴定电容测量的示例性模拟结果。
图19是阐释根据某些实施方案的电荷滴定电容测量的示例性方法的流程图。
图20是根据某些实施方案可与本公开的系统和方法一起使用的示例性计算机系统的方框图。
定义
“核酸”可以是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语可包含含有已知核苷酸类似物或修饰骨架残基或连接的核酸，它们是合成的、天然形成的和非天然形成的，具有与参考核酸类似的结合性质并以类似于参考核苷酸的方式代谢。这样的类似物的实例可包括但不限于硫代磷酸酯、亚磷酰胺（phosphoramidites）、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸（PNAs）。术语核酸可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。
除非另行指明，特定核酸序列除明确指出的序列外也隐含地涵盖其保守修饰变体（例如简并密码子取代）和互补序列。具体地，可通过生成其中一个或多个所选（或所有）密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代（Batzer等人, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka等人, J. Biol. Chem.260:2605-2608 (1985)；Rossolini等人, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。术语核酸可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。
术语“核苷酸”除了指天然形成的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体外，还可被理解为是指就使用核苷酸的特定环境（例如与互补碱基杂交）而言功能上等效的其相关结构变体，包括衍生物和类似物，除非上下文清楚地另行指明。
术语“模板”可以是指复制到用于DNA合成的DNA核苷酸的互补链中的单链核酸分子。在一些情况下，模板可以是指在mRNA的合成过程中复制的DNA序列。
术语“引物”可以是指提供DNA合成的起始点的短核酸序列。催化DNA合成的酶，如DNA聚合酶可将新的核苷酸添加到用于DNA复制的引物上。
“纳米孔”是指在膜中形成或以其它方式提供的孔隙、通道或通路。膜可以是有机膜，如脂质双层，或合成膜，如由聚合物材料形成的膜。纳米孔可毗邻或靠近传感电路或耦合至传感电路，例如诸如互补金属氧化物半导体（CMOS）或场效应晶体管（FET）电路的电极布置。在一些实例中，纳米孔具有大约0.1纳米(nm)至大约1000 nm的特征宽度或直径。一些纳米孔是蛋白质。
本文所用的术语“亮时段”通常可以指通过经AC信号施加的电场将已标记核苷酸的标签推入纳米孔时的时间段。术语“暗时段”通常可以指通过经AC信号施加的电场从纳米孔中推出已标记核苷酸的标签时的时间段。AC周期可包括亮时段和暗时段。在不同实施方案中，为使纳米孔单元进入亮时段（或暗时段）而施加于纳米孔单元的电压信号的极性可不同。
本文所用的术语“信号值”可以是指来自测序单元的测序信号输出的值。根据某些实施方案，测序信号可以是由一个或多个测序单元的电路中的点测得和/或输出的电信号，例如信号值可以是（或代表）电压或电流。信号值可代表直接测量电压和/或电流的结果和/或可代表间接测量，例如信号值可以是电压或电流达到指定值所花费的实测持续时间。信号值可代表与纳米孔的电阻相关并可由其推导出纳米孔（穿过(threaded)和/或未穿过(unthreaded)）的电阻和/或电导的任何可测量的量。
详述
本文中公开的技术涉及纳米孔基核酸测序。在各种实施方案中，提供用于更精确表征单个纳米孔单元（也称为测序单元）或一组纳米孔单元的组件（例如双电层电容器）的方法。为了如质量保证、一致性检验（uniformity check）、基线校准、数据归一化和/或碱基识别之类的目的，可在测序过程的不同阶段表征组件。
在纳米孔基合成测序（sequencing-by-synthesis）（Nano-SBS）中，纳米孔单元中的工作电极（例如Pt或TiN）和液体电解质之间的界面可表现得像电容器，其可被称为双电层电容器(Cdbl)。表征纳米孔单元的双电层电容器可报告制成的纳米孔单元的质量，如单元的一致性或单元中的缺陷。双电层电容器Cdbl的电容cdbl可影响施加于单元的电压的周期内电压衰减和测量信号的其它特征，以及测量信号值的归一化和因此碱基识别的准确性。对于极大的Cdbl，测量数据的周期内衰减可忽略不计。对于较小的cdbl值，周期内衰减可能更显著并可使测量数据的归一化变复杂。因此希望在每个单元的基础上已知cdbl的值以可对测量数据进行智能调节。例如，已知单个纳米孔单元的双电层电容器的电容值cdbl，可对单个单元实施数据归一化。
可以使用一些现有技术测量双电层电容。但是，这些技术的一些，如电化学阻抗谱（EIS）技术，可能不能测量单个单元的双电层电容。一些技术可能需要外部仪器测量双电层电容。一些技术可能不能在测序过程的早期，如在测序单元的井上形成膜和在膜中形成纳米孔之前测量双电层电容。一些已有的技术可能需要长测量时间或可能不像精确测序所需的那样精确。
本文中公开的技术提供在测序过程的不同阶段表征双电层电容器的方法。可在工作电极与液体电解质接触时形成双电层电容器，其中工作电极和液体电解质之间的界面表现出电容行为。因此，可在纳米孔单元中形成双层和纳米孔之前或之后测量双电层电容器。本公开的方法可用于在测序过程开始时（例如在引入双层或孔隙前）更高效和更精确测量单个单元或一组单元的双电层电容。
纳米孔测序单元
纳米孔传感器芯片中的纳米孔单元可以许多不同的方式实施。例如，在一些实施方案中，可将不同尺寸和/或化学结构的标签连接到待测序的核酸分子中的不同核苷酸上。在一些实施方案中，可通过不同聚合物标记的核苷酸与模板的杂交合成与待测序的核酸分子的模板互补的链。在一些实施过程中，核酸分子和所带标签都可移动穿过纳米孔，且穿过纳米孔的离子电流可由于连接到核苷酸上的标签的特定尺寸和/或结构而指示纳米孔中的核苷酸。在一些实施过程中，只有标签可移入纳米孔。也有许多不同的方式在纳米孔中检测不同标签。
A. 纳米孔测序单元结构
图1是阐释纳米孔基测序芯片中的纳米孔单元100的一个实施方案的简化结构。纳米孔单元100可包括由介电材料，如氧化物106形成的井。可在井的表面上方形成膜102以覆盖井。在一些实施方案中，膜102可以是脂质双层。将可含有例如可溶性蛋白质纳米孔跨膜分子复合物（PNTMC）和感兴趣被分析物的主体电解质114置于单元的表面上。可通过电穿孔将单个PNTMC 104插入膜102。阵列中的各个膜不互相化学连接或电连接。因此，阵列中的各单元是独立的测序仪器，以产生与PNTMC相关联的单个聚合物分子独有的数据。PNTMC 104作用于被分析物并调制穿过原本不可透的双层的离子电流。
将模拟测量电路112连接到被电解质薄膜108覆盖的金属工作电极110上。通过离子不透膜102将电解质薄膜108与主体电解质114隔离。PNTMC 104穿过膜102并提供让离子电流从主体液体（bulk liquid）流向工作电极110的唯一路径。该单元还包括对电极(CE)116，其是电化电位传感器。该单元还包括参比电极117。
图2阐释纳米孔传感器芯片中的示例性纳米孔单元200的一个实施方案，其可用于表征多核苷酸或多肽。纳米孔单元200可包括由介电层201和204形成的井205；在井205上方形成的膜，如脂质双层214；和在脂质双层214上并通过脂质双层214与井205隔开的样品室215。井205可含有一定体积的电解质206，且样品室215可容纳含纳米孔，例如可溶性蛋白质纳米孔跨膜分子复合物（PNTMC），和感兴趣被分析物（例如待测序的核酸分子）的主体电解质208。
纳米孔单元200可包括在井205底部的工作电极202和安置在样品室215中的对电极210。信号源228可在工作电极202和对电极210之间施加电压信号。可通过由电压信号引起的电穿孔过程将单个纳米孔（例如PNTMC）插入脂质双层214，由此在脂质双层214中形成纳米孔216。阵列中的各个膜（例如脂质双层214或其它膜结构）可以不互相化学连接或电连接。因此，阵列中的各纳米孔单元可以是独立的测序仪器，以产生与纳米孔相关联的单个聚合物分子独有的数据，所述纳米孔作用于感兴趣被分析物并调制穿过原本不可透的脂质双层的离子电流。
如图2中所示，纳米孔单元200可在衬底230，如硅衬底上形成。可在衬底230上形成介电层201。用于形成介电层201的介电材料可包括例如玻璃、氧化物、氮化物等。可在衬底230上和/或在介电层201内形成用于控制电刺激和用于处理纳米孔单元200检测到的信号的电路222。例如，可在介电层201中形成多个图案化金属层（例如金属1至金属6），并可在衬底230上制造多个有源器件（例如晶体管）。在一些实施方案中，作为电路222的一部分包括信号源228。电路222可包括例如放大器、积分器、模拟数字转换器、噪声滤波器、反馈控制逻辑和/或各种其它组件。电路222可进一步耦合到处理器224，其耦合到存储器226，其中处理器224可分析测序数据以测定已在该阵列中测序的聚合物分子的序列。
工作电极202可在介电层201上形成，并可构成井205底部的至少一部分。在一些实施方案中，工作电极202是金属电极。对于非法拉第传导，工作电极202可由金属或其它耐腐蚀和氧化的材料，例如铂、金、氮化钛和石墨制成。例如，工作电极202可以是具有电镀铂的铂电极。在另一实例中，工作电极202可以是氮化钛(TiN)工作电极。工作电极202可以是多孔的，由此提高其表面积和与工作电极202相关产生的电容。由于一个纳米孔单元的工作电极可独立于另一纳米孔单元的工作电极，工作电极在本公开中可被称为单元电极。
介电层204可在介电层201上方形成。介电层204形成包围井205的壁。用于形成介电层204的介电材料可包括例如玻璃、氧化物、一氮化硅(SiN)、聚酰亚胺或其它合适的疏水绝缘材料。可将介电层204的上表面硅烷化。硅烷化可在介电层204的上表面上形成疏水层220。在一些实施方案中，疏水层220具有大约1.5纳米(nm)的厚度。
由介电层204形成的井205包括在工作电极202上方的电解质体积206。电解质体积206可以是缓冲的并可包括下列一种或多种：氯化锂(LiCl)、氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、谷氨酸锂、谷氨酸钠、谷氨酸钾、乙酸锂、乙酸钠、乙酸钾、氯化钙(CaCl2)、氯化锶(SrCl2)、氯化锰(MnCl2)和氯化镁(MgCl2)。在一些实施方案中，电解质体积206具有大约3微米(µm)的厚度。
也如图2中所示，可在介电层204顶部形成膜并横跨井205。在一些实施方案中，该膜可包括在疏水层220顶部形成的脂单层218。随着膜到达井205的开口，脂单层218可过渡到脂质双层214，后者横跨井205的开口。脂质双层可包含磷脂或由磷脂构成，磷脂例如选自二植烷酰基-磷脂酰胆碱(DPhPC)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二-O-植烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DoPhPC)、棕榈酰基-油酰基-磷脂酰胆碱(POPC)、二油酰基-磷脂酰-甲酯(DOPME)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、鞘磷脂、1,2-二-O-植烷基-sn-甘油；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-350]、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-乳糖基；GM1神经节苷脂、溶血磷脂酰胆碱(LPC)或它们的任何组合。
如所示，在脂质双层214中嵌入单个纳米孔216，例如由单个PNTMC形成。如上所述，可通过电穿孔将单个PNTMC插入脂质双层214以形成纳米孔216。纳米孔216可以足够大以感兴趣被分析物的至少一部分和/或小离子（例如Na+、K+、Ca2+、CI-）在脂质双层214的两侧之间穿行。
样品室215在脂质双层214上方，并可容纳用于表征的感兴趣被分析物的溶液。该溶液可以是含有主体电解质208的水溶液并缓冲到最佳离子浓度和保持在最佳pH以使纳米孔216保持打开。纳米孔216穿过脂质双层214并提供让离子电流从主体电解质208流向工作电极202的唯一路径。除纳米孔（例如PNTMCs）和感兴趣被分析物外，主体电解质208可进一步包括下列一种或多种：氯化锂(LiCl)、氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、谷氨酸锂、谷氨酸钠、谷氨酸钾、乙酸锂、乙酸钠、乙酸钾、氯化钙(CaCl2)、氯化锶(SrCl2)、氯化锰(MnCl2)和氯化镁(MgCl2)。
对电极(CE) 210可以是电化学电位传感器。在一些实施方案中，对电极210可在多个纳米孔单元之间共用，并因此可被称为共用电极。在一些情况下，共用电位和共用电极可以是所有纳米孔单元或至少特定分组内的所有纳米孔单元共用的。共用电极可配置为向与纳米孔216接触的主体电解质208施加共用电位。对电极210和工作电极202可耦合到信号源228以跨脂质双层214提供电刺激（例如偏压），并可用于传感脂质双层214的电特性（例如电阻、电容和离子电流量）。在一些实施方案中，纳米孔单元200也可包括参比电极212。
在一些实施方案中，可在纳米孔单元的建立过程中作为验证或质量控制的一部分进行各种检查。一旦建立纳米孔单元，可进行进一步验证步骤，例如鉴定表现理想的纳米孔单元（例如每个单元中有一个纳米孔）。这样的验证检查可包括物理检查、电压校准、开放通道校准和具有单个纳米孔的单元的鉴定。
B. 纳米孔测序单元的检测信号
纳米孔传感器芯片中的纳米孔单元可允许使用基于单分子纳米孔的合成测序（Nano-SBS）技术平行测序。
图3阐释使用Nano-SBS技术进行核苷酸测序的纳米孔单元300的一个实施方案。在Nano-SBS技术中，可将待测序的模板332（例如核苷酸分子或另一感兴趣被分析物）和引物引入纳米孔单元300的样品室中的主体电解质308中。作为实例，模板332可以是环形或线性的。核酸引物可杂交到模板332的一部分上，可在模板上添加四种不同聚合物标记的核苷酸338。
在一些实施方案中，酶（例如聚合酶334，如DNA聚合酶）可与纳米孔316关联以用于合成与模板332互补的链。例如，聚合酶334可共价连接到纳米孔316。聚合酶334可催化核苷酸338使用单链核酸分子作为模板并入引物上。核苷酸338可包含标签物类（“标签”），其中核苷酸为四种不同类型之一：A、T、G或C。当已标记的核苷酸与聚合酶334正确复合时，可通过电动力，如在由跨脂质双层314和/或纳米孔316施加的电压生成的电场存在下生成的力将标签拉动（加载）到纳米孔中。标签尾部可位于纳米孔316的桶（barrel）中。位于纳米孔316的桶中的标签可由于标签的独特化学结构和/或尺寸而生成独有的离子阻塞信号（ionic blockade signal）340，由此电子识别与标签相连的添加碱基。
本文所用的“加载（loaded）”或“穿过”标签可以是置于纳米孔中和/或在纳米孔中或附近停留明显时间量，例如0.1毫秒(ms)至10000 ms的标签。在一些情况下，在从核苷酸中释放之前将标签加载在纳米孔中。在一些情况下，在核苷酸并入事件后释放的加载标签穿过纳米孔（和/或被纳米孔检测到）的概率合适地高，例如90%至99%。
在一些实施方案中，在将聚合酶334连接到纳米孔316之前，纳米孔316的电导可能高，例如诸如大约300皮西门子(300 pS)。当标签加载在纳米孔中时，由于标签的独特化学结构和/或尺寸而生成独有的电导信号（例如信号340）。例如，纳米孔的电导可为大约60pS、80 pS、100 pS或120 pS，各自对应于四种类型的已标记核苷酸之一。聚合酶可随后发生异构化和转磷酸反应以将核苷酸并入增长的核酸分子中并释放标签分子。
在一些情况下，一些已标记核苷酸可能与核酸分子（模板）的当前位置不匹配（互补碱基）。与核酸分子非碱基配对的已标记核苷酸也可能穿过纳米孔。这些非配对核苷酸可在比正确配对的核苷酸与聚合酶保持结合的时标短的时标（time scale）内被聚合酶排斥。结合到非配对核苷酸上的标签可能快速穿过纳米孔并短时间段（例如少于10 ms）被检测到，而结合到配对核苷酸上的标签可加载到纳米孔中并长时间段（例如至少10 ms）被检测到。因此，可通过下游处理器至少部分基于在纳米孔中检测到核苷酸的时间识别非配对核苷酸。
可通过穿过纳米孔的电流测量包括加载（穿过）标签的纳米孔的电导（或等效地，电阻），由此提供在当前位置的标签物类和因此核苷酸的识别。在一些实施方案中，可对纳米孔单元施加直流(DC)信号（例如以使标签移动穿过纳米孔的方向不反转）。但是，使用直流电长时间段运行纳米孔传感器可改变电极的组成，使穿过纳米孔的离子浓度失去平衡，并具有其它不合意的影响纳米孔单元寿命的效果。施加交流电(AC)波形可减轻电迁移以避免这些不合意的效果并具有如下所述的某些优点。使用已标记核苷酸的本文所述的核酸测序法与所施加AC电压完全相容，并且因此可使用AC波形实现这些优点。
当使用牺牲电极、在载流反应中改变分子特性的电极（例如含银电极）或在载流反应中改变分子特性的电极时，在AC检测周期的过程中将电极再充电的能力可以是有利的。当使用直流信号时电极会在检测周期的过程中消耗。再充电可防止电极达到消耗极限，如完全耗尽，这在电极小的时候（例如在电极足够小以提供具有每平方毫米至少500个电极的电极阵列时）可成问题。电极寿命在一些情况下随电极宽度而增减并且至少部分取决于电极宽度。
测量穿过纳米孔的离子电流的合适条件是本领域中已知的并在本文中提供了实例。可在跨膜和孔隙施加电压下进行测量。在一些实施方案中，所用电压可为-400 mV至+400 mV。所用电压优选在具有选自-400 mV、-300 mV、-200 mV、-150 mV、-100 mV、-50 mV、-20 mV和0 mV的下限和独立地选自+10 mV、+20 mV、+50 mV、+100 mV、+150 mV、+200 mV、+300 mV和+400 mV的上限的范围内。所用电压可更优选在100 mV至240 mV的范围内，并最优选在160 mV至240 mV的范围内。使用提高的所施加电位有可能提高纳米孔对不同核苷酸的辨别。在2013年11月6日提交的名称为“Nucleic Acid Sequencing Using Tags”的美国专利公开No. US 2014/0134616中描述了使用AC波形和已标记核苷酸测序核酸，其全文经此引用并入本文。除US 2014/0134616中描述的已标记核苷酸外，可使用不含糖或无环部分的核苷酸类似物，例如五种常见核酸碱基：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶和胸腺嘧啶的(S)-甘油三磷酸核苷(gNTPs)进行测序（Horhota等人, Organic Letters, 8:5345-5347 [2006]）。
在一些实施过程中，附加地或替代性地，可以测量其它信号值，如电流值并用于识别穿过在纳米孔中的核苷酸。
纳米孔单元中的双电层电容
如在例如超级电容器中观察到，双电层可存在于导电电极及其周围电解质之间的界面上。如果施加电压，在这一界面处可形成具有相反极性的两个离子层。在来自电解质的离子吸附到电极表面时，可形成该双层。这两个离子层（其中之一可能吸收或未吸收到电极表面上）可被表现得像典型电容器中的电介质的溶剂（例如水）分子层（未显示在图4中）隔开。溶剂分子层的厚度可为埃数量级。被溶剂分子层隔开的电荷因此可形成电容器。双电层电容是借助电双层效应储存电能的容量。双电层电容器的电容值可取决于许多因素，如电极电位、温度、离子浓度、离子类型、氧化物层、电极粗糙度、杂质吸附等。
在纳米孔单元，如纳米孔单元100、200和300中，电容可与工作电极和液体电解质相关联。与工作电极和液体电解质相关联的电容也可被称为电化学电容（c电化学）。电化学电容c电化学可包括双电层电容并可另外包括准电容。可调节双层电容器（bilayer capacitor）C双层的电容c双层和与工作电极相关联的电化学电容c电化学之间的比率以实现最佳整体系统性能。例如，可在使c电化学最大化的同时通过降低c双层实现提高的系统性能。可以通过例如改变井的面积或改变膜材料调节双层电容器C双层的值。可以通过例如改变井的面积或改变工作电极材料的孔隙率调节电化学电容c电化学的值。
图4阐释在导电电极410（例如工作电极110、202或302）和相邻液体电解质420（例如主体电解质114、208或308）之间的界面处形成的双电层电容器430。如上所述，导电电极可由金属或其它耐腐蚀和氧化的材料，例如诸如铂、金、氮化钛和石墨制成。例如，导电电极可以是具有电镀铂的铂电极。在另一实例中，导电电极可以是氮化钛(TiN)工作电极。在一些情况下，导电电极可以是多孔的。在一些实施过程中，导电电极可通过在导电层上布置多孔TiN电极层形成。因此，电解质可穿透在柱状TiN结构之间的空间，沿导电电极的未覆盖部分垂直向下，并然后水平进入如图2中所示在介电层下方的导电电极的覆盖部分，由此提高其表面积和与导电电极相关联的所得电容。
当施加电压时，电荷（正或负）可能在导电电极和相邻液体电解质之间的界面处积聚在电极上。在所示实例中，使电极表面带负电荷，以致积聚电解质中的带正电荷的物类440。在另一实例中，所有电荷的极性可与所示实例相反。可通过偶极子的重新取向和电解质中的相反电荷的离子积聚在界面附近来平衡电极中的电荷。在电极和电解质之间的界面的两侧（它们由于电解质中的带电物类和溶剂分子的有限尺寸而相隔小距离）上的电荷积聚造成电容效应。因此，术语“双层”可以是指在电极层和主体液体电解质层之间的界面附近的电子和离子电荷分布的集合。
图5阐释在导电电极510和相邻液体电解质520之间的界面处可与如图4中所示的双电层电容器的形成同时形成的准电容效应。准电容器可通过在电极和电解质之间的电子电荷转移法拉第式（faradaically）储存电能。这可通过电吸附、还原-氧化反应或插层法实现。图5显示由电荷转移添加准电容的双电层电容器530，以造成受可得表面积（由实心圆表示）限制的吸附、插层或还原-氧化反应。
对于工作电极理想的是具有高电容，由此降低其对电路的阻抗效应，这可由于在多次测量后积累的电荷而导致电压水平轻微移动。
纳米孔测序单元的电气模型
图6阐释代表纳米孔单元，如纳米孔单元200中的电气模型的电路600（其可包括图2中的电路222的一部分）。如上所述，在一些实施方案中，电路600包括可在纳米孔传感器芯片中的多个纳米孔单元或所有纳米孔单元之间共用的对电极640（例如对电极210），因此也可被称为共用电极。共用电极可配置为通过连接到电压源Vliq 620向与纳米孔单元中的脂质双层（例如脂质双层214）接触的主体电解质（例如主体电解质208）施加共用电位。在一些实施方案中，可使用AC非法拉第模式用AC信号（例如方波）调制电压Vliq并将其施加到与纳米孔单元中的脂质双层接触的主体电解质。在一些实施方案中，Vliq是具有±200-250 mV的幅度和例如25至600 Hz的频率的方波。可通过大电容器（未显示），如100 μF或更大，来对在对电极640和脂质双层之间的主体电解质建模。
图6也显示代表工作电极602（例如工作电极202）和脂质双层（例如脂质双层214）的电性质的电气模型622。电气模型622包括对与脂质双层相关联的电容建模的电容器626（C双层）和对与纳米孔相关联的可变电阻（其可基于纳米孔中的特定标签的存在而改变）建模的电阻器R孔隙 628。电气模型622还包括具有双电层电容cdbl并代表工作电极602的电性质的电容器Cdbl 624和单元的井（例如井205）。工作电极602可配置为独立于其它纳米孔单元中的工作电极施加不同电位。
传通设备（Pass device）606可以是可用于在电路600中连接或断开脂质双层和工作电极的开关。传通设备606可通过存储位控制以实现或禁止跨纳米孔单元中的脂质双层施加电压刺激。在沉积脂质以形成脂质双层之前，这两个电极之间的阻抗因为没有密封纳米孔单元的井可非常低，因此传通设备606可保持打开以避免短路状态。在已将脂质溶剂沉积到纳米孔单元以密封纳米孔单元的井之后可关闭传通设备606。
电路600可进一步包括芯片上积分电容器Cint 608（ncap）。可通过使用复位信号603关闭开关601以将积分电容器Cint 608连接到电压源Vpre 605而将积分电容器Cint 608预充电。在一些实施方案中，电压源Vpre 605提供具有例如900 mV的幅度的恒定正电压。当关闭开关601时，可将积分电容器Cint 608预充电到电压源Vpre 605的正电压水平。
在将积分电容器Cint 608预充电后，可以使用复位信号603打开开关601以将积分电容器Cint 608与电压源Vpre 605断开。此时，根据电压源Vliq的水平，对电极640的电位可在高于工作电极602（和积分电容器Cint 608）的电位的水平，或反之亦然。例如，在来自电压源Vliq的方波的正相位期间（例如AC电压源信号周期的亮或暗时段），对电极640的电位在高于工作电极602的电位的水平。在来自电压源Vliq的方波的负相位期间（例如AC电压源信号周期的暗或亮时段），对电极640的电位在低于工作电极602的电位的水平。因此，在一些实施方案中，由于对电极640和工作电极602之间的电位差，积分电容器Cint 608可在亮时段期间从电压源Vpre 605的预充电电压水平进一步充电到更高水平，并在暗时段期间放电到更低水平。在另一些实施方案中，充电和放电可分别在暗时段和亮时段发生。
可将积分电容器Cint 608充电或放电固定时间段，取决于模拟数字转换器(ADC)610的取样率，其可高于1 kHz、5 kHz、10 kHz、100 kHz或更高。例如，在1 kHz的取样率下，可将积分电容器Cint 608充电/放电大约1 ms的时段，然后在积分时段结束时取样电压水平并通过ADC 610转换。特定电压水平对应于纳米孔中的特定标签物类，并因此对应于在模板上的当前位置的核苷酸。
在ADC 610取样后，可通过使用复位信号603关闭开关601以将积分电容器Cint 608再连接到电压源Vpre 605而再次将积分电容器Cint 608预充电。将积分电容器Cint 608预充电、等待固定时间段以将积分电容器Cint 608充电或放电、和通过ADC 610取样和转换积分电容器的电压水平的步骤在测序过程的全程可周期性重复。
数字处理器630可处理ADC输出数据，例如用于归一化、数据缓冲、数据过滤、数据压缩、数据简化、事件提取或将来自纳米孔单元阵列的ADC输出数据组装到各种数据帧中。在一些实施方案中，数字处理器630可执行进一步下游处理，如碱基测定。数字处理器630可实现为硬件（例如在GPU、FPGA、ASIC等中）或为硬件和软件的组合。
相应地，可以使用跨纳米孔施加的电压信号检测纳米孔的特定状态。纳米孔可能的状态之一是当纳米孔的桶中不存在带标签的多磷酸盐时的开放通道状态。纳米孔的另外四种可能的状态各自对应于四种不同类型的带标签的多磷酸核苷酸（A、T、G或C）之一留在纳米孔的桶中时的状态。纳米孔的再另外可能的状态是当脂质双层破裂时。
当在固定时间段后测量积分电容器Cint 608上的电压水平时，纳米孔的不同状态可能导致测得不同的电压水平。这是因为积分电容器Cint 608上的电压衰减（通过放电降低或通过充电提高）的速率（即积分电容器Cint 608上的电压 vs 时间曲线的斜坡的陡度）取决于纳米孔电阻（例如电阻器R孔隙 628的电阻）。更特别地，由于与在不同状态下的纳米孔相关联的电阻不同——归因于分子（标签）的不同化学结构，可观察到电压衰减的不同相应速率并可用于识别纳米孔的不同状态。电压衰减曲线可以是具有RC时间常数τ = RC的指数曲线，其中R是与纳米孔相关联的电阻（即R孔隙 628）且C是与R并联地与膜（即电容器626(C双层)）相关联的电容。纳米孔单元的时间常数可以是例如大约200-500 ms。由于双层的实施细节，衰减曲线可能没有完全匹配指数曲线，而是衰减曲线可能类似于指数曲线并且是单调的，因此能够检测标签。
在一些实施方案中，与在开放通道状态下的纳米孔相关联的电阻可在100 MOhm至20 GOhm的范围内。在一些实施方案中，与标签在纳米孔的桶内的状态下的纳米孔相关联的电阻可在200 MOhm至40 GOhm的范围内。在另一些实施方案中，由于电气模型622中的电压衰减使得引向ADC 610的电压仍改变，可以省略积分电容器Cint 608。
可以不同方式测定积分电容器Cint 608上的电压衰减速率。如上文解释，可通过在固定时间间隔期间测量电压衰减来测定电压衰减速率。例如，可以首先在时间t1通过ADC610测量积分电容器608上的电压，和然后在时间t2再通过ADC 610测量电压。当积分电容器Cint 608上的电压 vs 时间曲线的斜率较陡时，电压差较大，而当该电压曲线的斜率较平缓时，电压差较小。因此，可以使用电压差作为用于测定积分电容器Cint 608上的电压衰减速率和因此纳米孔单元的状态的度量标准（metric）。
在另一些实施方案中，可通过测量所选电压衰减量所需的持续时间测定电压衰减速率。例如，可以测量电压从第一电压水平V1降低或提高到第二电压水平V2所需的时间。当电压 vs. 时间曲线的斜率较陡时，所需时间较少，而当电压 vs. 时间曲线的斜率较平缓时，所需时间较多。因此，可以使用测得的所需时间作为用于测定积分电容器Cint 608上的电压Vncap的衰减速率和因此纳米孔单元的状态的度量标准。本领域技术人员会认识到可用于测量纳米孔的电阻的各种电路，例如包括电流测量技术。
在一些实施方案中，电路600可以不包括在芯片上制造的传通设备（例如传通设备606）和额外电容器（例如积分电容器608 (Cint)），因此有利于减小纳米孔基测序芯片的尺寸。由于膜（脂质双层）的薄的性质，与膜（例如电容器626(C双层)）相关联的电容本身足以建立所需RC时间常数而不需要附加的芯片上电容。因此，可以使用电容器626作为积分电容器，并可通过电压信号Vpre预充电和随后通过电压信号Vliq放电或充电。原本在芯片上制造在电路中的额外电容器和传通设备的消除可显著降低纳米孔测序芯片中的单个纳米孔单元的占用空间（footprint），由此有利于纳米孔测序芯片的规模化以包括越来越多的单元（例如在纳米孔测序芯片中具有数百万个单元）。
纳米孔单元中的数据取样
为了进行核酸的测序，可在已标记核苷酸附加在核酸上的同时取样积分电容器（例如积分电容器Cint 608 (ncap)或电容器626 (C双层)）的电压水平并通过ADC（例如ADC610）转换。可通过经由对电极和工作电极施加的跨纳米孔的电场（例如当所施加电压使得Vliq低于Vpre时）将核苷酸的标签推入纳米孔的桶中。
A. 穿过
穿过事件是在已标记核苷酸附着于模板（例如核酸片段）并且标签进出纳米孔的桶时。这在穿过事件的过程中可发生多次。当标签在纳米孔的桶中时，纳米孔的电阻可能较高，并且较低电流可流过纳米孔。
在测序过程中，在一些AC周期中（被称为开放通道状态）标签可能不在纳米孔中，其中由于纳米孔的较低电阻，电流最高。当标签被吸引到纳米孔的桶中时，纳米孔在亮模式中。当标签从纳米孔的桶中推出时，纳米孔在暗模式中。
B. 亮和暗时段
在AC周期的过程中，可通过ADC多次取样积分电容器上的电压。例如，在一个实施方案中，以例如大约100 Hz跨该系统施加AC电压信号，并且ADC的采集率可为每个单元大约2000 Hz。因此，每个AC周期（AC波形的周期）可捕获大约20个数据点（电压测量值）。与1个AC波形的周期对应的数据点可被称为集（set）。在AC周期的一个数据点集中，可存在当例如Vliq低于Vpre时捕获的子集，这可对应于亮模式（时段），其中标签被推入纳米孔的桶中。另一子集可对应于暗模式（时段），其中通过所施加电场（当例如Vliq高于Vpre时）从纳米孔的桶中推出标签。
C. 实测电压
对于各数据点，当打开开关601时，积分电容器（例如积分电容器Cint 608 (ncap)或电容器626 (C双层)）处的电压会由于通过Vliq充电/放电而以衰减方式改变，例如当Vliq高于Vpre时从Vpre提高到Vliq或当Vliq低于Vpre时从Vpre降低到Vliq。当工作电极充电时最终电压值可能偏离Vliq。积分电容器上的电压水平的变化速率可取决于双层的电阻值，该双层可包括纳米孔，该纳米孔又可包括在纳米孔中的分子（例如已标记核苷酸的标签）。可在开关601打开后的预定时间测量电压水平。
开关601可以数据采集率运行。开关601在两次数据采集之间可关闭相对短时间间，通常刚好在通过ADC测量后。该开关能够对各周期收集多个数据点。如果开关601保持打开，积分电容器上的电压水平和因此ADC的输出值会完全衰减并停留在此处。这样的多次测量可用固定ADC实现更高分辨率（例如由于可求平均值的更多次测量，8位至14位）。多次测量也可提供关于穿过到纳米孔中的分子的动力学信息。计时信息可允许测定穿过（threading）进行多久。这也可有助于测定是否在测序添加到核酸链上的多个核苷酸。
图7阐释在引入标签之前，在核苷酸测序过程中在纳米孔单元上的示例性控制和测量信号。因此，纳米孔有效地为始终开放通道状态，并且测量信号没有显示在纳米孔中插入任何标签。可以使用AC电压源，如电压源Vliq 620作为纳米孔单元的对电极（例如对电极640）上的参考电压Vliq 710。在图7中，参考电压Vliq 710可以是具有标记的亮时段和暗时段的方波电压信号。还显示了相应的控制信号，如复位信号720（例如用于控制将积分电容器Cint 608和双电层电容器(Cdbl) 624连接至电压源Vpre 605的开关601的复位信号603）。
在每帧中，复位信号720在预充电时段T预充电中可以为高，在此期间可将双电层电容器（例如Cdbl 624）连至例如电压源Vpre 605，并可预充电到Vpre。复位信号720在积分时段T积分中可以为低，在此期间可将双电层电容器经由例如R孔隙 628和/或电容器626（C双层）连至参考电压Vliq 710，并可通过参考电压Vliq 710充电或放电。在图7中所示的实例中，在亮时段期间，参考电压Vliq 710低于Vpre，因此将双电层电容器放电。在暗时段期间，参考电压Vliq710高于Vpre，因此将双电层电容器充电。
可以使用ADC（例如ADC 610）由积分电容器（例如积分电容器Cint 608）测量双电层电容器上的电压水平。随时间经过，跨积分电容器的电压Vncap 730显示在图7中。电压的“锯齿”形状源自在亮和暗时段期间双电层电容器的放电（在亮时段期间）和充电（在暗时段期间）。各“锯齿”可对应于提取的各测量样品。例如，在各测量样品的亮时段期间，可将双电层电容器预充电到0.90 V，并通过纳米孔的电阻器R孔隙耗散这种电压/电荷直至双电层电容器的用于下一测量样品的下一次预充电。在这一实例中，在各测量样品的暗时段期间，首先将双电层电容器预充电/耗散（复位）到0.90 V，并以与纳米孔的电阻相关联的速率提高这一电压直至用于下一测量样品的电容器的下一次预充电/复位。
要指出，为了便于阐释，图7显示在亮或暗时段中的几个测量样品。在各时段可捕获更多或更少的测量样品。例如，在亮或暗时段中可捕获几十个样品或甚至几百个样品。还要指出，一些其它控制信号可用于测序但可能没有显示在图7中。还要指出，在一些实施过程中，参考电压Vliq 710可在恒定水平，同时电压源Vpre可以是AC信号。
图8阐释在如上所述的纳米孔单元中的非法拉第传导的示例性小信号模型800。小信号模型可包括具有电容cdbl的双电层电容器Cdbl 804、任选的积分电容器Cint 806、代表纳米孔的具有电阻r孔隙的孔隙电阻器R孔隙 802和代表双层（例如脂质双层214）的双层电容器C双层808。图8显示可通过孔隙电阻器R孔隙 802和双层电容器C双层808将双电层电容器Cdbl 804充电或放电。双层电容器C双层808可以小，因此C双层808的阻抗可比R孔隙 802大得多。因此，双层电容器C双层808在小信号模型800中可以是任选的（如虚线所示）。小信号模型800可用于测定双电层电容器Cdbl 804上的电压信号的衰减。例如，该衰减可具有通过τ~r孔隙cdbl测定的时间常数τ，其中时间常数τ可代表电压水平衰减到初始值的1/e ≈ 36.8%所需的时间。
在一些实施方案中，与在开放通道状态下的纳米孔相关联的电阻可在100 MOhm至20 GOhm的范围内。在一些实施方案中，与标签在纳米孔的桶内的状态下的纳米孔相关联的电阻可在200 MOhm至60 GOhm的范围内。
可以不同的方式测定积分电容器Cint 608上的电压衰减速率。如上文解释，可通过在固定时间间隔期间测量电压衰减来测定电压衰减速率。例如，可以首先在时间t1通过ADC610测量积分电容器Cint 608上的电压，和然后在时间t2再通过ADC 610测量电压。当积分电容器Cint 608上的电压 vs 时间曲线的斜率较陡时，电压差较大，而当该电压曲线的斜率较平缓时，电压差较小。因此，可以使用电压差作为用于测定积分电容器Cint 608上的电压衰减速率和因此纳米孔单元的状态的度量标准。
在另一些实施方案中，可通过测量所选电压衰减量所需的持续时间测定电压衰减速率。例如，可以测量电压从第一电压水平V1降低或提高到第二电压水平V2所需的时间。当电压 vs. 时间曲线的斜率较陡时，所需时间较少，而当电压 vs. 时间曲线的斜率较平缓时，所需时间较多。因此，可以使用测得的所需时间作为用于测定积分电容器Cint 608上的电压的衰减速率和因此纳米孔单元的状态的度量标准。本领域技术人员会认识到可用于测量纳米孔的电阻的各种电路，例如包括电流测量技术。
图9显示在AC周期的亮时段和暗时段的过程中由纳米孔单元捕获的示例性数据点。在图9中为了阐释目的而夸大数据点的变化。向工作电极或积分电容器施加的电压(Vpre)在恒定水平，如900 mV。向纳米孔单元的对电极施加的电压信号910 (Vliq)是显示为矩形波的AC信号，其中占空比可以是任何合适的值，如小于或等于90%，例如大约40%。
在亮时段 920的过程中，向对电极施加的电压信号910 (Vliq)低于向工作电极施加的电压Vpre，以可通过由在工作电极和对电极上施加的不同电压水平造成的电场将标签推入纳米孔的桶中（例如由于标签上的电荷和/或离子流）。当打开开关601时，在ADC前的节点处（例如在积分电容器处）的电压降低。在捕获电压数据点后（例如在指定时间段后），可以关闭开关601并将测量节点处的电压再提高回Vpre。该方法可重复以测量多个电压数据点。以此方式可在亮时段的过程中捕获多个数据点。
如图9中所示，在Vliq信号符号改变后在亮时段中的第一数据点922（也称为第一点Δ（FPD））可低于后续数据点924。这可能是因为在纳米孔中没有标签（开放通道），因此其具有低电阻和高放电速率。在一些情况下，如图9中所示，第一数据点922可能超过Vliq水平。这可由将信号耦合到芯片上电容器的双层的电容造成。可在已发生穿过事件，即将标签推入纳米孔的桶中后捕获数据点924，其中纳米孔的电阻和因此积分电容器的放电速率取决于推入纳米孔的桶中的标签的特定类型。如下文提到，由于双电层电容器（例如Cdbl 804）处的电荷积聚，每次测量的数据点924可能轻微降低。
在暗时段 930的过程中，向对电极施加的电压信号910 (Vliq)高于向工作电极施加的电压(Vpre)，以可从纳米孔的桶中推出任何标签。当打开开关601时，由于电压信号910(Vliq)的电压水平高于Vpre，在测量节点处的电压提高。在捕获电压数据点后（例如在指定时间段后），可以关闭开关601并将测量节点处的电压再降低回Vpre。该方法可重复以测量多个电压数据点。因此可在暗时段的过程中捕获多个数据点，包括第一点Δ932和后续数据点934。如上所述，在暗时段的过程中，从纳米孔中推出任何核苷酸标签，并且因此除用于归一化外，获得关于任何核苷酸标签的最少信息。因此，在暗时段的过程中来自单元的输出电压信号可能几乎或完全没有用。
图9也显示在亮时段 940的过程中，即使向对电极施加的电压信号910 (Vliq)低于向工作电极施加的电压(Vpre)，也没有发生穿过事件（开放通道）。因此纳米孔的电阻为低，且积分电容器的放电速率为高。因此，捕获的数据点，包括第一数据点942和后续数据点944，显示低电压水平。
在亮或暗时段的过程中测得的电压可能预计对于纳米孔的恒电阻的每次测量（例如在给定AC周期的亮模式期间在纳米孔中存在一个标签时进行）大致相同，但当电荷积聚于双电层电容器Cdbl时情况可能并非如此。这种电荷积聚可使纳米孔单元的时间常数变长。因此，电压水平可移动，由此使一个周期中的各数据点的测量值降低。因此，在一个周期内，如图9中所示，数据点可能从一个数据点到另一数据点有所改变。因此，可能希望测量双电层电容以用于数据归一化和基线调节以更精确测定与测得的电压水平相关联的碱基。
D. 测定碱基
对于纳米孔传感器芯片的每个可用的纳米孔单元，可以运行生产模式以测序核酸。在测序过程中捕获的ADC输出数据可归一化以提供更大准确度。归一化可考虑偏移效应（offset effects），如周期形状（cycle shape）和基线位移。在归一化后，实施方案可测定穿过通道的电压簇，其中各簇对应于不同的标签物类和因此不同的核苷酸。簇可用于测定与给定核苷酸对应的给定电压的概率。作为另一实例，簇可用于测定用于区分不同核苷酸（碱基）的截止电压。关于归一化的进一步细节可见于美国专利申请15/632,190和15/628,353，它们全文经此引用并入本文。
关于测序操作的进一步细节可见于例如名称为“Nanopore-Based SequencingWith Varying Voltage Stimulus”的美国专利公开No. 2016/0178577、名称为“Nanopore-Based Sequencing With Varying Voltage Stimulus”的美国专利公开No. 2016/0178554、名称为“Non-Destructive Bilayer Monitoring Using Measurement OfBilayer Response To Electrical Stimulus”的美国专利申请No. 15/085,700和名称为“Electrical Enhancement Of Bilayer Formation”的美国专利申请No. 15/085,713，它们全文经此引用并入本文。
双电层电容测量
可使用各种方法测量双电层电容。例如，电化学阻抗谱法（EIS）是用于表征电化学系统和用于测定这些系统中的电极或电解过程的贡献的技术。EIS可用于测定任何液体和固体材料之间的界面区体积中的连接或移动电荷的动力学。EIS技术在频域中工作并基于界面可被视为无源电路元件，即电阻、电容和电感的组合的概念。当向插入电解质中的电极施加小振幅（例如5至20 mV）的交变信号时，可获得产生的电流并用于基于欧姆定律测定阻抗。可通过测量电流和电压分量的相移或通过测量它们的振幅比较（施加的）初始扰动和电极的响应。这可使用外部仪器如频谱分析器或频率响应分析器在时域中或在频域中进行。但是，由于经过电解质测得的电流可包括经过暴露于电解质的多个工作电极（例如超过1000个工作电极）的电流，EIS技术不能在形成双层和纳米孔之前或之后测量单个单元的双电层电容。此外，EIS技术可作为总阻抗的一部分捕获电阻分量，而非仅测量电容分量。此外，EIS技术的准确性可能受到对刺激的响应幅度和来自没有在测量的单元的寄生贡献（parasitic contributions）的混淆效应限制。由于这些和另一些原因，可能限制EIS测量的准确性。
本文中公开的方法可以更准确地测量单个（纳米孔）单元或一组（纳米孔）单元在测序过程的不同阶段的双电层电容。一种示例性方法可通过使用具有已知电容值和已知初始电压水平的较小电容器将双电层电容器反复充电或放电来测量形成双层和纳米孔之前的双电层电容，这可被称为电荷滴定电容测量（CTCM）技术。另一示例性方法可通过将双电层电容器充电和测量经过纳米孔的双电层电容器上的电压衰减至参考电压水平来测量形成双层和纳米孔之后的双电层电容，这可被称为阶跃响应电容测量（SRCM）技术。CTCM和SRCM技术都可使用纳米孔传感器芯片上的已有电路进行。因此，该测量不需要外部仪器。此外，该测量可以相当快速地进行，如小于大约1分钟，而非使用一些其它技术的15-20分钟。
A. 阶跃响应电容测量(SRCM)
如上文参照图8描述，纳米孔单元的小信号模型可包括具有电容cdbl的双电层电容器Cdbl、积分电容器Cint、代表纳米孔的具有电阻r孔隙的孔隙电阻器R孔隙和代表双层的双层电容器C双层。可通过孔隙电阻器R孔隙和双层电容器C双层（其可忽略不计）将双电层电容器Cdbl（和积分电容器Cint）充电或放电。因此，双电层电容器Cdbl或积分电容器Cint上的电压水平的衰减可具有通过τ~r孔隙cdbl测定的时间常数τ。通过测量双电层电容器或积分电容器Cint上的电压水平的衰减，可用已知r孔隙测定时间常数和因此cdbl。在一些实施过程中，时间常数，而非双电层电容，可用于归一化，因为该衰减也受孔隙电阻器R孔隙的电阻影响。在一些实施过程中，可通过测量随时间经过流过双电层电容器Cdbl和孔隙电阻器R孔隙的电流的变化测定衰减时间。
在SRCM技术的一些实施过程中，可形成双层并可如上所述插入纳米孔。可向工作电极施加电压水平(Vpre)和可向对电极施加电压水平(Vliq)。随后，可将工作电极与Vpre断开，并可向对电极Vliq施加具有小振幅的慢方波AC信号，这可导致双电层电容器和积分电容器Cint上的电压水平位移，然后在AC周期的过程中衰减（充电和放电）。可基于例如积分电容器Cint上的实测电压信号测定周期内信号衰减以达到其初始值的设定分数所需的时间。所得时间常数可用于数据归一化。在一些实施过程中，可对各测序过程进行SRCM基双电层电容测量，以使各测序过程的测序信号可具有最近的相关SRCM基双电层电容测量结果。
1. 用于阶跃响应的电路
图10A阐释根据某些实施方案在阶跃响应电容测量过程中用于建立基线的纳米孔单元中的电路1000的示例性配置。电路1000可包括双电层电容器Cdbl 1004、孔隙电阻器R孔隙1002、双层电容器C双层1008、积分电容器Cint 1006、用于将工作电极和积分电容器Cint 1006连接到电压源Vpre的开关1010、用于将积分电容器Cint 1006连接到ADC 1014的开关1012。在图10A中，电压信号Vpre已经过开关1010连接到工作电极，在Vseq的水平的电压信号Vliq已连接到对电极。工作电极可已与Vpre断开，并且纳米孔单元可能已达到稳态。
图10B阐释根据某些实施方案在阶跃响应电容测量过程中用于测量负阶跃响应的纳米孔单元中的电路1000的示例性配置。在图10B中，可向对电极(Vliq)施加负阶跃信号（例如在等于Vseq-ΔV的水平），其可导致工作电极（和双电层电容器Cdbl 1004）上的电压水平瞬间降低（由于跨双电层电容器Cdbl 1004的电压无法瞬间改变），然后逐渐衰减（提高）。在衰减过程中可通过反复接通和断开开关1012以取样跨积分电容器Cint 1006的电压Vncap（其可等于工作电极上的电压VWE）而由ADC 1014捕获一系列样品。
图10C阐释根据某些实施方案在阶跃响应电容测量过程中用于测量正阶跃响应的纳米孔单元中的电路1000的示例性配置。在图10C中，可向对电极(Vliq)施加正阶跃信号（例如在等于Vseq+ΔV的水平），其可导致工作电极（和双电层电容器Cdbl 1004）上的电压水平瞬间提高（由于跨双电层电容器Cdbl 1004的电压无法瞬间改变），然后逐渐衰减（降低）。在衰减过程中可通过反复接通和断开开关1012以取样跨积分电容器Cint 1006的电压Vncap而由ADC 1014捕获一系列样品。
2. 阶跃响应的信号
图11阐释根据某些实施方案使用阶跃响应电容测量技术测量双电层电容的示例性AC信号1100。可向对电极(Vliq)施加AC信号1100。在图11中所示的具体实例中，AC信号1100可在225 mV大约30秒以如上文论述在工作电极上建立稳态。此后，可向对电极施加多个周期（例如6个）的具有225 mV的偏移、20 mV的振幅（40 mV峰到峰）和0.2 Hz的频率（即5秒的时段）的方波信号。在每个周期中的当AC信号1100为245 mV的2.5秒时段期间，可多次取样跨积分电容器的电压Vncap（例如数十或数百次）以测量正阶跃衰减曲线。在各周期中的当AC信号1100为205 mV的2.5秒时段期间，可多次取样跨积分电容器的电压Vncap以测量负阶跃衰减曲线。
要指出，图11中所示的AC信号1100只是本文中公开的技术的一种可能的实施过程。在各种实施过程中，可以使用不同频率、振幅和/或偏移。此外，在各种实施过程中，可以使用不同周期数的方波信号。在一个实施过程中，可以使用单个周期的方波。在一些实施过程中，可以使用多于一个周期的方波并可获取在多个周期的方波中测得的结果的平均值以减少噪声和改进测量结果的准确性。
在一些实施过程中，可向工作电极施加AC信号1100，同时可使对电极(Vliq)上的电压保持在稳态。在每个周期中的当AC信号1100高时的时间段期间，可多次取样跨积分电容器的电压Vncap（例如数十或数百次）以测量衰减曲线。在每个周期中的当AC信号1100低时的时间段期间，可多次取样跨积分电容器的电压Vncap以测量衰减曲线。在一些实施过程中，当测量电压Vncap时，可暂时将工作电极与AC信号1100断开。
图12A阐释根据某些实施方案使用阶跃响应电容测量技术测量具有较低电容的双电层电容器的示例性结果。可向对电极(Vliq)施加包括保持时段1240和如上文对图11的AC信号1100描述的多个AC周期1250的方波的AC信号1210。跨积分电容器的测量电压（由例如8位 ADC输出值(0-255)表示）（即工作电极上的电压水平）由测量信号1220表示，其可包括许多数据点，如数十或数百或更多的数据点。如图12A中可见，对于具有较低电容的双电层电容器，衰减较快并且对于方波中的各电压阶跃可能看起来较大，并且正阶跃和负阶跃的基线位移都相对较低。
图12B阐释根据某些实施方案使用阶跃响应电容测量技术测量具有较高电容的双电层电容器的示例性结果。可向对电极(Vliq)施加包括保持时段和如上文对图11的AC信号1100描述的多个周期的方波的AC信号1210。跨积分电容器的测量电压（由例如8位 ADC输出值(0-255)表示）（即工作电极上的电压水平）由测量信号1230表示。如图12B中可见，对于具有较高电容的双电层电容器，方波中的各电压阶跃的衰减相对较慢和小，并且电压衰减到达的基线可显著位移并且对于正阶跃和负阶跃可能不同。
下面提供使用SRCM技术的双电层电容测量的测量信号1220或1230的波形的更详细描述和分析。
图13阐释根据某些实施方案在阶跃响应电容测量过程中双电层电容器或积分电容器上的电压信号1300的衰减。图13中所示的实测电压信号1300包括在保持时段中测得的电压水平1310。保持时段可足够长（例如大约30秒）以使电压信号1300可在保持时段结束前衰减到稳态（不改变或极小改变）以测定保持基线。例如，可以使用在保持时段捕获的最后30个样品点的中位数作为保持基线1320的值。
对于每个正阶跃，可作为一系列数据点测量工作电极上的电压水平。可从数据分析中除去前几个（例如5个）数据点，因为这些数据点可能在工作电极上的电压信号具有过冲时捕获。在一些实施过程中，可对数据点进行滚动均值滤波（rolling mean filtering）以平均波形。可以使用正阶跃时段的最后几个（例如10个）数据点测定正基线水平1360。然后可通过从各数据点的实测电压水平中减去正基线水平1360来调节各数据点。可以使用正阶跃时段的调节数据点中的最大电压水平1330作为纳米孔单元的正增益，其可与纳米孔单元的开放通道增益成正比并可取决于纳米孔单元的双层电容或积分电容和孔隙电阻r孔隙（~1/(r孔隙cint)）。工作电极上的电压水平从正增益值（电压水平1330）衰减到例如正增益的75%（电压水平1340）所花的时间可被测定为75%衰减时间pos_75。工作电极上的电压水平从正增益值（电压水平1330）衰减到例如正增益的50%（电压水平1350）所花的时间可被测定为50%衰减时间pos_50。75%衰减时间pos_75和/或50%衰减时间pos_50随后可如下所述用于测定衰减时间常数τ~r孔隙cdbl或双电层电容。要指出，在不同实施过程中，可基于工作电极上的电压水平衰减到正增益的75%或50%以外的水平所花的时间测定衰减时间。
在一些实施过程中，可以平均在不同正阶跃时段中捕获的相应数据点并用作单个正阶跃时段的波形以测定上述参数，如正增益、正基线、pos_75、pos_50、对于其它电压水平的衰减时间、衰减时间常数和双电层电容。可通过平均来自正阶跃时段的结果改进测量的准确度。
附加地或替代性地，对于每个负阶跃，可以类似方式捕获和分析数据点以测定参数，如负增益、负基线、75%负衰减时间、50%负衰减时间、其它电压水平的衰减时间、衰减时间常数、双电层电容等。例如，在一些实施过程中，可以使用来自负阶跃的测量结果验证来自正阶跃的测量结果或反之亦然，因为来自负阶跃的测量结果和来自正阶跃的测量结果通常类似，尽管不一定相同。
3. 准确度
图14阐释使用电化学阻抗谱法（EIS）测得的双电层电容和使用阶跃响应电容测量技术测得的衰减时间之间的相关性。在图14中，x-轴代表使用EIS对纳米孔芯片测得的平均双电层电容（以每个单元的pF为单位）。Y-轴代表使用SRCM技术对相应纳米孔芯片上的单个单元测得的衰减时间，其中对纳米孔芯片上的单个单元测得的衰减时间的分布由平均值和标准偏差值表示。
图14显示使用EIS测得的纳米孔芯片上平均双电层电容和使用SRCM技术对相应纳米孔芯片上的单个单元测得的50%正衰减时间pos_50（蓝色）的统计平均值之间的相关性的皮尔逊相关系数非常接近1（大约0.987）。图14也显示使用EIS测得的纳米孔芯片上平均双电层电容和使用SRCM技术对相应纳米孔芯片上的单个单元测得的75%正衰减时间pos_75（绿色）的统计平均值之间的相关性的皮尔逊相关系数为大约0.931。因此，在使用EIS测得的平均双电层电容和使用SRCM技术测得的50%或75%正衰减时间之间存在极好的相关性。因此可使用该相关性基于实测衰减时间测定电容值。
4. 在高电容下的示例性衰减
图15阐释根据某些实施方案用于测量具有较高电容（例如> 300 pF）的双电层电容器的电容的示例性阶跃响应电容测量技术。如上所述，对于具有大电容值的双电层电容器，衰减可能缓慢。因此，在正阶跃时段结束时，双电层电容器上的电压水平可能尚未衰减到实际正基线。因此，在该时段结束时的最后测量结果不能用作用于测定何时已发生特定衰减百分比，例如75%或50%的基线。在这样的情况下，可取而代之地使用来自保持时段的基线。例如，可以使用在保持时段捕获的最后30个样品点的中位数作为保持基线1520的值以及用于测定衰减速率的基线的缺省值。
为了阐释这一实例，对于每个正（或负）阶跃，与具有小电容值的双电层电容器的电压水平1580相比，由于缓慢衰减（大衰减时间常数），工作电极上的电压水平1570可能尚未衰减到实际正基线。因此，在正阶跃时段结束时测得的正基线1560可能比实际正基线高得多。如果使用正基线1560作为用于调节数据点的基线，基于调节数据点测定的所得正增益比该单元的实际正增益低得多。因此，工作电极上的电压水平从正增益值衰减到正增益的75%（显示为电压水平1545）或50%（显示为电压水平1555）的实测时间可能比实际75%（或50%）正衰减时间短。因此，在测量结果中可能存在大误差。
在一些实施过程中，可以使用保持基线1520作为用于测量具有大电容值的双电层电容器的正基线而不牺牲测量准确度。这是因为，如上所述，对于具有大电容值的双电层电容器，基线位移可能相对小。因此，可通过从各数据点的实测电压水平中减去保持基线1520的电压水平来调节各数据点。可以使用正阶跃时段的调节数据点中的最大电压水平1530作为纳米孔单元的正增益。工作电极上的电压水平从正增益值（电压水平1530）衰减到正增益的75%（电压水平1540）所花的时间可被测定为75%衰减时间pos_75。工作电极上的电压水平从正增益值（电压水平1530）衰减到正增益的50%（电压水平1550）所花的时间可被测定为50%衰减时间pos_50。75%衰减时间pos_75和/或50%衰减时间pos_50随后可用于更准确地测定衰减时间常数τ~r孔隙cdbl和/或双电层电容。
5. 流程图
图16是阐释根据本公开的某些方面的阶跃响应电容测量的示例性方法的流程图1600。可在纳米孔单元中形成双层和/或纳米孔后进行该方法。在该示例性方法中，可通过测量工作电极上的电压水平经由纳米孔的衰减来测量在纳米孔单元的电解质和工作电极之间形成的双电层电容器的电容，其中该衰减的时间常数可与双电层电容器的电容和纳米孔的等效电阻成正比。
在方框1610，可将电解质添加到纳米孔单元中以使电解质可与位于纳米孔单元的井中的纳米孔单元的工作电极接触。如上所述，电解质可包括例如下列一种或多种：氯化锂(LiCl)、氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、谷氨酸锂、谷氨酸钠、谷氨酸钾、乙酸锂、乙酸钠、乙酸钾、氯化钙(CaCl2)、氯化锶(SrCl2)、氯化锰(MnCl2)和氯化镁(MgCl2)。
在方框1620，可如上文参照例如图1-3所述形成覆盖井的双层。该双层可将双层上方的主体电解质与井内的电解质分隔。也可如上所述在该双层中形成纳米孔。纳米孔可形成主体电解质与井内的电解质之间的路径。该双层和纳米孔可如上文参照例如图6、8和10所述建模为双层电容器和孔隙电阻器。
任选地，可将工作电极连接到在第一电压水平（例如Vpre）的电压源并可对双层上方的电解质施加第二电压水平（例如Vliq）。因此，可用等于第一电压水平与第二电压水平之差（Vpre-Vliq）的跨电容器的电压将双电层电容器充电。随后，可将工作电极与在第一电压水平（例如Vpre）的电压源断开，同时仍对双层上方的电解质施加第二电压水平。这会导致工作电极上的电压水平逐渐衰减。第二电压水平可施加足够的时间段（例如30秒）以使工作电极上的电压水平达到稳态（基线）。在一些实施过程中，可在对电解质施加第二电压水平的同时在多个时刻测量工作电极上的多个电压水平。在所述多个时刻测得的工作电极上的所述多个电压水平可用于如上文参照例如图13和15所述测定保持基线。
在方框1630，可将在电解质和工作电极之间的界面处形成的双电层电容器预充电。例如，可将工作电极连接到在第一电压水平（例如Vpre）的电压源并可对双层上方的电解质施加第二电压水平（例如Vliq）。因此，可用等于第一电压水平与第二电压水平之差（Vpre-Vliq）的跨电容器的电压将双电层电容器充电。随后，可将工作电极与在第一电压水平（例如Vpre）的电压源断开。
在方框1640，可如上文参照例如图11-13和15所述对主体电解质施加阶跃电压信号。阶跃电压信号可以是方波或矩形波AC信号的一部分。阶跃电压信号可以是正阶跃信号或负阶跃信号。阶跃电压信号可能使工作电极处的电压水平瞬间提高/降低，和然后逐渐衰减。
在方框1650，可在对主体电解质施加阶跃电压信号的同时在多个时刻测量工作电极上的多个电压水平。可如上文参照例如图13和15所述进行所述多个电压水平的测量。
在方框1660，可基于在所述多个时刻测得的工作电极上的所述多个电压水平测定工作电极上的电压水平的衰减时间。例如，如上文参照例如图13和15所述，可基于在工作电极上测得的所述多个电压水平测定75%衰减时间、50%衰减时间或37%（即1/e）衰减时间。如所述，对于大的双电层电容器，可使用保持基线作为用于测定增益和衰减时间的正或负基线。
在方框1670，可基于工作电极上的电压水平的衰减时间测定双电层电容器的电容。例如，可基于37%衰减时间（即衰减时间常数）测定双电层电容器的电容，因为衰减时间常数与双电层电容和纳米孔的电阻成正比。也可如图14中所示基于双电层电容与电压水平的衰减时间（例如75%衰减时间、50%衰减时间或37%衰减时间）之间的相关性测定双电层电容器的电容。
要指出，尽管图16将数据处理描述为顺序过程，但许多操作可平行或同时进行。此外，可重新安排操作的顺序。操作可具有图中未包括的附加步骤。一些操作可能是任选的，因此在各种实施方案中可省略。在一个方框中描述的一些操作可与在另一方框中的操作一起进行。例如，一些操作可平行进行。此外，该方法的实施方案可在硬件、软件、固件、中间件、微代码、硬件描述语言或它们的任何组合中执行。
B. 电荷滴定电容测量(CTCM)
如上所述，SRCM技术可用于在形成纳米孔后测量双电层电容。但是，其不能在测序过程的早期，如在形成双层和纳米孔之前测量双电层电容。根据本公开的某些方面，电荷滴定电容测量技术可用于在测序过程的早期，例如在将电解质（缓冲液）施加到单元中以接触工作电极后的任何时刻测量单个单元的双电层电容。
在一个实例中，在将液体（例如缓冲液或电解质）添加到单元的井中并与井底部的工作电极的一个表面接触之后，可以例如经过对电极向缓冲液施加电压水平。可经过电路向工作电极的另一表面施加另一电压水平。因此，可向双电层电容器施加初始电压（电位差）以将初始电荷存储在双电层电容器中。在将初始电荷存储在双电层电容器中之后，开关电容器电路可使用具有已知电容值和初始电压水平的开关电容器（例如积分电容器）以在各充电或放电周期中将双电层电容器反复充电或放电。可通过将开关电容器(Cint)交替连接到具有已知电压水平的信号源和工作电极来实现充电或放电。当将开关电容器连接到具有已知电压水平的信号源时，可将开关电容器充电或放电以存储已知数量的电荷。当将开关电容器连接到工作电极时，电荷可在开关电容器和双电层电容器之间再分布以使连接到工作电极的开关电容器端子处的电位与工作电极处的电位相同。因此，如果稍后连接到工作电极的开关电容器端子处的初始电压水平高于工作电极处的初始电压水平，在连接后，开关电容器可将双电层电容器充电。否则，开关电容器可将双电层电容器放电。
在一个简化实例中，双电层电容器Cdbl可具有电容cdbl和跨双电层电容器Cdbl的初始电压V1 且开关电容器Cint可具有电容cint和跨开关电容器Cint的初始电压V2。当并联两个电容器时，跨两个电容器的电压可变成：
。
因此，在每次电荷再分布后双电层电容器上的电压变化为：
。
如果cint比cdbl小得多，电压变化ΔV可写为：
。/>
因此，电压变化率与成正比。例如，如果V2为0（即开关电容器Cint在每次电荷再分布后接地），通过开关电容器Cint将双电层电容器放电，并且对于每次放电，开关电容器Cint上的电压变化为：
。
如果V2大于V1，通过开关电容器Cint将双电层电容器充电。通过使用具有已知电容和初始电压水平的开关电容器将双电层电容器反复充电或放电和在一定充电或放电周期数后测量双电层电容上的电压变化，可测定cint和cdbl之间的比率。
如果充电/放电周期以一定速率（例如每秒1000个周期）进行，Cdbl的充电或放电速率可与cint和充电/放电周期的频率f成正比。例如，如果Cint在每次电荷再分布后接地，Cint可充当对地具有1/(fc int )的阻抗的电阻元件。因此，跨双电层电容器的电压的衰减可具有时间常数τ~cdbl/ /(fc int )。
1. 用于电荷滴定的电路
图17A阐释根据某些实施方案在示例性电荷滴定电容测量过程中单元中的电路1700的示例性配置。电路1700可以是形成双层和纳米孔前的单元的简化电气模型。电路1700可包括双电层电容器Cdbl 1702、开关（积分）电容器Cint 1704、ADC 1806和开关1708、1710和1712。图17A显示在向与工作电极接触的液体（缓冲液或电解质）施加电压水平Vliq后的电路1700的配置，其中开关1708、1710和1712打开。如上所述，可经过对电极向液体施加电压水平Vliq。工作电极上的电压水平VWE可等于Vliq。跨开关电容器Cint的电压Vncap可在任何水平，例如等于预充电水平Vpre。
图17B阐释根据某些实施方案在电荷滴定电容测量过程中用于将积分电容器充电的电路1700的示例性配置。在图17B中，关闭开关1710，并因此可将跨开关电容器Cint的电压Vncap充电到等于预充电水平Vpre的水平。可仍向液体施加电压水平Vliq，和因此工作电极上的电压水平VWE可仍等于Vliq。
图17C阐释根据某些实施方案在电荷滴定电容测量过程中用于将积分电容器放电的电路1700的示例性配置。在图17C中，打开开关1710并关闭开关1708。因此，跨开关电容器Cint的电压水平Vncap等于工作电极上的电压水平VWE，其可由于由关闭开关1708前的不同电压水平Vncap和VWE造成的电荷再分布而等于Vliq+ΔV。ΔV的值可与开关电容器Cint 1704和双电层电容器Cdbl 1702的电容值之间的比率成正比。
在图17C中所示的电荷再分布后，可以开始另一充电周期。可以如图17B中所示打开开关1708和关闭开关1710以将开关电容器Cint 1704再充电。在将开关电容器Cint 1704再充电到Vpre后，可以如图17C中所示打开开关1710和关闭开关1708以使再充电开关电容器Cint 1704可将双电层电容器Cdbl 1702再充电。
上述充电周期可以重复例如数十次、数百次或数千次以将双电层电容器Cdbl 1702逐渐充电或放电。在反复充电周期的过程中可以定期、在一定周期数后或在给定时间通过打开开关1708和1710和关闭开关1712以将开关电容器Cint 1704连接到ADC 1706而测量Vncap（和因此VWE）。
2. 模拟结果
图18阐释根据某些实施方案在双电层电容器Cdbl的电容和开关电容器Cint的电容之间的不同电容比率下的电荷滴定电容测量的示例性模拟结果。在各充电周期后可以逐渐提高双电层电容器Cdbl上的电压水平。用于充电的时间常数可与双电层电容器Cdbl的电容和开关电容器Cint的电容之间的比率成正比，并可与充电周期的速率成反比。当双电层电容器Cdbl的电容和开关电容器Cint的电容之间的比率大时，在电荷再分布后在开关电容器Cint上测得的电压可接近进行的充电周期数的线性函数。在Cint上测得的电压水平曲线可与图18中所示的模拟曲线匹配，并且匹配的模拟曲线的双电层电容器Cdbl的电容和开关电容器Cint的电容之间的相应比率可以是待测量的双电层电容和用于测量的开关电容器Cint的电容之间的比率。作为一个实例，如果测得的曲线匹配曲线1810且用于测量的开关电容器Cint的电容为大约67 fF，可测定双电层电容器Cdbl的电容为大约150 pF。类似地，如果测得的曲线匹配曲线1820且用于测量的开关电容器Cint的电容为大约26 fF，可测定双电层电容器Cdbl的电容为大约150 pF。
3. 流程图
图19是阐释根据本公开的某些方面的电荷滴定电容测量的示例性方法的流程图1900。可在测序过程的早期，例如在将电解质添加到单元中之后但在单元中形成双层和/或纳米孔之前进行该方法。在该示例性方法中，可通过进行反复充电周期以用在各充电周期开始时预充电到已知电压水平的小开关电容器将双电层电容器充电或放电来测量在单元的电解质和工作电极之间形成的双电层电容器的电容。可基于多个充电周期后双电层电容器上的电压变化测定双电层电容器的电容与开关电容器的电容之间的比率。
在方框1910，可将电解质添加到单元中。电解质可进入单元的井以使电解质与位于井中的单元的工作电极接触。如上所述，电解质可包括例如下列一种或多种：氯化锂(LiCl)、氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、谷氨酸锂、谷氨酸钠、谷氨酸钾、乙酸锂、乙酸钠、乙酸钾、氯化钙(CaCl2)、氯化锶(SrCl2)、氯化锰(MnCl2)和氯化镁(MgCl2)。
在方框1920，可向电解质施加第一电压水平。如上所述，当在电解质和工作电极之间施加电压时，可由于电双层效应而在电解质和工作电极之间的界面处形成双电层电容器。对电解质施加第一电压水平可使工作电极预充电到第一电压水平。
在方框1930，可以进行多个充电周期。每个充电周期可包括将开关电容器设定到已知的初始电压水平（例如第二电压水平），和通过预充电到第二电压水平的开关电容器将双电层电容器充电或放电。
更具体地，在方框1932，可将开关电容器连接到在不同于第一电压水平的第二电压水平的电压源以将开关电容器预充电到第二电压水平。例如，可以使用开关1710将开关电容器连接到电压源Vpre。如上所述，第二电压水平可低于或高于第一电压水平。例如，在一些实施过程中，第二电压水平可为0以使开关电容器可完全放电。在一些实施过程中，第二电压水平可高于第一电压水平。
在方框1934，在将开关电容器设定到第二电压水平后，可以例如通过断开开关1710将开关电容器与电压源断开。
在方框1936，可将开关电容器连接到工作电极（例如经由开关1708），由此如上文参照例如图17C所述使存储在开关电容器和双电层电容器中的电荷再分布。例如，如果第二电压高于第一电压水平，电荷可从开关电容器转移到双电层电容器以将双电层电容器充电，且工作电极处的电压水平可高于第一电压水平。如果第二电压水平低于第一电压水平，电荷可从双电层电容器转移到开关电容器以将双电层电容器放电，且工作电极处的电压水平可低于第一电压水平。
在方框1938，在电荷再分布后，可以例如通过打开开关1708将开关电容器与工作电极断开。
如果开关电容器比双电层电容器小得多，在每一充电周期后工作电极处的电压水平可轻微改变。在取样和测量工作电极（和开关电容器）处的电压水平之前可进行多个充电周期，如数十、数百或数千个周期。如果使用大的开关电容器，可在一个或多个充电周期后取样和测量工作电极（和开关电容器）处的电压水平。
在方框1940，可将开关电容器连接到测量电路以测量开关电容器上的第三电压水平。例如，可经图17A-17C中所示的开关1712将开关电容器连接到ADC。可在将开关电容器连接到工作电极之后但在下一充电周期中将开关电容器连接到在第二电压水平的电压源之前测量开关电容器（和工作电极）上的第三电压水平。例如，可在方框1738后测量开关电容器上的第三电压水平。
在方框1950，可基于开关电容器的电容、在测量第三电压水平前进行的充电周期数和第一电压水平与第三电压水平之差测定双电层电容器的电容。如上所述，第一电压水平与第三电压水平之差可以为在测量第三电压水平前进行的充电周期数和双电层电容器的电容与开关电容器的电容之间的比率的函数。因此，可基于在测量第三电压水平前进行的充电周期数和第一电压水平与第三电压水平之差测定双电层电容器的电容与开关电容器的电容之间的比率。例如，如图18中的线1830所示，在200个充电周期后，可基于在开关电容器（和工作电极）上测得的电压变化（或电压变化比率）测定双电层电容器的电容与开关电容器的电容之间的比率。例如，如果测得的电压变化（或电压变化比率）在点1840所示的值处，可以测定双电层电容器的电容与开关电容器的电容之间的比率为1000。然后可基于开关电容器的已知电容值（其可更精确地设计和制造）测定双电层电容器的实际电容。
在一些实施过程中，方框1930和1940的操作可反复进行多次迭代以更准确地测定双电层电容器的电容与开关电容器的电容之间的比率和因此双电层电容器的电容。每次迭代提供一次电容测量。例如，可以进行多次测量和电容比率测定，而非使用在图18中所示的模拟曲线上的一个数据点（其易受噪声影响），并可使用平均比率作为测定的电容比率。在一些实施方案中，如上所述，可将测得的电压变化曲线最佳匹配到模拟电压变化曲线以测定电容比率。
要指出，尽管图19将数据处理描述为顺序过程，但许多操作可平行或同时进行。此外，可重新安排操作的顺序。操作可具有图中未包括的附加步骤。一些操作可能是任选的，并因此在各种实施方案中可省略。在一个方框中描述的一些操作可与在另一方框中的操作一起进行。例如，一些操作可平行进行。此外，该方法的实施方案可在硬件、软件、固件、中间件、微代码、硬件描述语言或它们的任何组合中执行。
计算机系统
本文中所提及的计算机系统中的任一个可以利用任何合适数目的子系统。这样的子系统的实例在图16中被示出在计算机系统10中。在一些实施方案中，计算机系统包括单个计算机设备，其中子系统可以是计算机设备的组件。在其它实施方案中，计算机系统可以包括多个计算机设备，各自是子系统，具有内部组件。计算机系统可以包括台式和膝上型计算机、平板设备、移动电话和其它移动设备。
图20中所示的子系统经由系统总线75而互连。示出了附加的子系统，例如打印机74、键盘78、（多个）存储设备79、被耦合到显示适配器82的监视器76等。耦合到I/O控制器71的外设和输入/输出（I/O）设备可以被连接到计算机系统，其通过本领域中已知的任何数目的手段，诸如输入/输出（I/O）端口77（例如USB、FireWire®）。例如，I/O端口77或外部接口81（例如以太网、Wi-Fi等等）可以用于将计算机系统10连接到广域网，例如因特网、鼠标输入设备或扫描仪。经由系统总线75的互连允许中央处理器73与每个子系统通信，并且控制来自系统内存72或（多个）存储设备79（例如固定盘，如硬驱动器或光盘）的多个指令的执行，以及信息在子系统之间的交换。系统内存72和/或（多个）存储设备79可以具体化计算机可读介质。另一子系统是数据收集设备85，例如相机、麦克风、加速计等等。本文中所提及的任何数据可以从一个组件被输出到另一组件，并且可以被输出给用户。
计算机系统可以包括多个相同的组件或子系统，其例如通过外部接口81、通过内部接口、或经由可移除的存储设备而被连接在一起，所述可移除的存储设备可以从一个组件到另一组件地被连接和移除。在一些实施方案中，计算机系统、子系统或设备可以通过网络而通信。在这样的实例中，一个计算机可以被视为客户端，并且另一计算机可以被视为服务器，其中每一个都可以是相同的计算机系统的部分。客户端和服务器可以各自包括多个系统、子系统或组件。
实施方案的各方面可以如下被实现：使用硬件（例如专用集成电路或现场可编程门阵列）以控制逻辑的形式，和/或借助以模块化或集成方式的一般可编程处理器而使用计算机软件。如本文中所使用的，处理器包括相同集成芯片上的单核处理器、多核处理器、或者单个电路板上或联网的多个处理单元。基于本文中所提供的公开和教导，本领域普通技术人员将知道并且领会用于通过使用硬件以及硬件与软件的组合来实现本发明实施方案的其它方式和/或方法。
本申请中所描述的软件组件或功能中的任一个可以被实现为将由处理器执行的、使用任何合适的计算机语言的软件代码，所述计算机语言例如诸如Java、C、C++、C#、对象-C、Swift、或脚本语言，诸如Perl或Python，其使用例如常规或面向对象的技术。软件代码可以作为一系列指令或命令而被存储在计算机可读介质上以供存储和/或传输。合适的非暂时性计算机可读介质可以包括随机存取存储器（RAM）、只读存储器（ROM）、磁性介质、诸如硬驱动器或软盘、或者光学介质、诸如光盘（CD）或DVD（数字通用盘）、闪速存储器等等。计算机可读介质可以是这样的存储或传输设备的任何组合。
这样的程序还可以被编码并且通过使用载波信号被传输，所述载波信号被适配用于经由符合包括因特网的各种协议的有线、光学和/或无线网络来被传输。因而，可以通过使用利用这样的程序被编码的数据信号来创建计算机可读介质。被编码有程序代码的计算机可读介质可以与兼容设备一起被封装或与其它设备分离地被提供（例如经由因特网下载）。任何这样的计算机可读介质可以驻留在单个计算机产品（例如硬驱动器、CD、或整个计算机系统）上或其内，并且可以存在于系统或网络内的不同的计算机产品上或其内。计算机系统可以包括监视器、打印机、或用于将本文中所提及的任何结果提供给用户的其它合适的显示器。
本文中所述的任何方法可以完全或部分地利用计算机系统来被执行，所述计算机系统包括一个或多个处理器，其可以被配置成执行步骤。因而，实施方案可以针对被配置成执行本文中所述的任何方法的步骤的计算机系统，其潜在地具有执行相应的步骤或步骤的相应群组的不同组件。尽管被呈现为经编号的步骤，但是本文中的方法的步骤可以同时或以不同次序被执行。另外，这些步骤的部分可以与来自其它方法的其它步骤的部分一起使用。而且，步骤的全部或部分可以是任选的。另外，任何方法的任何步骤可以利用用于执行这些步骤的模块、单元、电路或其它构件来被执行。
特定实施方案的具体细节可以用任何合适的方式组合，而不偏离本发明的实施方案的精神和范围。然而，本发明的其它实施方案可以针对与每个单独方面或这些单独方面的特定组合有关的特定实施方案。
除非明确作出相反的指示，“一”或“该”的列举意在表示“一个或多个”。除非明确作出相反的指示，“或”的使用意在表示“可兼的或”而非“互斥的或”。提到“第一”组件不一定要求提供第二组件。此外，除非明确规定，提到“第一”或“第二”组件没有将所提组件限制在特定位置。术语“基于”意在表示“至少部分基于”。
本文中提到的所有专利、专利申请、出版物和说明书处于所有目的全文经此引用并入本文。没有一个被承认为现有技术。
Claims (14)
1.一种测量测序单元中的双电层电容器的电容的方法，所述方法包括：
通过测序单元接收电解质以使所述电解质与位于测序单元的井中的测序单元的工作电极接触；
在覆盖所述井的膜中形成纳米孔，所述膜分隔电解质；
将在电解质和工作电极之间的界面处形成的双电层电容器预充电，
其中将所述双电层电容器预充电包括：
将工作电极连接到在第一电压水平的电压源；
对膜上方的电解质施加第二电压水平；和
将工作电极与电压源断开；
对膜上方的电解质或工作电极施加阶跃电压信号；
在施加阶跃电压信号的时间段期间的多个时刻测量膜上方的电解质或工作电极上的多个电压或电流水平；
基于在所述多个时刻在膜上方的电解质或工作电极上测得的所述多个电压或电流水平测定膜上方的电解质或工作电极上的电压水平的衰减时间；和
基于在膜上方的电解质或工作电极上的电压水平的衰减时间测定所述双电层电容器的电容，其中进一步包括：
在对膜上方的电解质施加第二电压水平的同时在多个第二时刻测量工作电极上的多个保持电压水平；和
基于所述多个保持电压水平测定基线水平，
其中电压水平的衰减时间的测定进一步基于所述基线水平。
2.权利要求1的方法，其中所述阶跃电压信号是AC矩形波信号的一部分。
3.权利要求1的方法，其中所述衰减时间包括75％衰减时间、50％衰减时间或37％衰减时间的至少一种。
4.权利要求1的方法，其中基于工作电极上的电压水平的衰减时间测定所述双电层电容器的电容进一步包括：
基于衰减时间常数或双电层电容与衰减时间之间的相关性测定双电层电容器的电容。
5.权利要求4的方法，其中衰减时间常数与双电层电容器的电容和纳米孔的电阻成正比。
6.一种测量测序单元中的双电层电容器的电容的方法，所述方法包括：
在测序单元的井中接收电解质以使所述电解质与位于井中的测序单元的工作电极接触，在电解质和工作电极之间的界面处形成双电层电容器；
对电解质施加第一电压水平以将所述双电层电容器预充电到第一电压水平；
进行多个充电周期，其中每个充电周期包括：
将开关电容器设定到不同于第一电压水平的第二电压水平；和
使用所述开关电容器将所述双电层电容器充电或放电；
使用连接到所述开关电容器的测量电路测量该开关电容器上的第三电压水平；和
基于所述开关电容器的电容、在测量第三电压水平前进行的充电周期数和第一电压水平与第三电压水平之差测定所述双电层电容器的电容，其中测定所述双电层电容器的电容包括：
基于在测量第三电压水平前进行的充电周期数和第一电压水平与第三电压水平之差测定所述双电层电容器的电容和所述开关电容器的电容之间的比率；和
基于所述开关电容器的电容和所述双电层电容器的电容与所述开关电容器的电容之间的比率测定所述双电层电容器的电容。
7.权利要求6的方法，其中将开关电容器设定到第二电压水平包括：
将所述开关电容器连接到在第二电压水平的电压源以将该开关电容器设定到第二电压水平；和
在使用所述开关电容器将所述双电层电容器充电或放电之前将所述开关电容器与电压源断开。
8.权利要求6的方法，其中使用所述开关电容器将所述双电层电容器充电或放电包括：
将所述开关电容器连接到工作电极，由此使该开关电容器和所述双电层电容器中存储的电荷再分布。
9.权利要求6的方法，其中所述开关电容器包括与用于测量电压的积分电路相关联的电容器。
10.权利要求6的方法，其中所述开关电容器的电容小于所述双电层电容器的电容的1/100。
11.权利要求6的方法，其中在测量第三电压水平前进行的充电周期数大于100。
12.权利要求6的方法，其进一步包括：
多次迭代进行操作，所述操作包括：
进行所述多个充电周期；和
将所述开关电容器连接到测量电路以测量所述开关电容器上的第三电压水平；和
基于在所述多次迭代的过程中测得的第三电压水平测定所述双电层电容器的电容。
13.一种计算机产品，其包括存储用于控制测序系统以执行权利要求1-12中任一项的方法的操作的多个指令的计算机可读介质。
14.一种测序系统或仪器，其包括：
权利要求13的计算机产品；和
一个或多个用于执行存储在计算机可读介质上的指令的电路。
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