CN111212908A - 编码信使核糖核酸(mRNA)的稳定核酸 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及聚腺苷酸化(聚A)尾的领域。在一些实施例中，DNA编码位于编码目的蛋白质的核苷酸3’的聚A尾，其中所述聚A尾包含一个或多个非腺嘌呤核苷酸。

Description

编码信使核糖核酸(mRNA)的稳定核酸
技术领域
本公开涉及稳定的信使核糖核酸(mRNA)和编码稳定的mRNA的DNA的领域。
背景技术
聚腺苷酸化是在信使RNA(mRNA)的3’端添加多个腺嘌呤核苷酸，从而形成聚A尾的过程。所述聚A尾由多个重复腺嘌呤核苷酸(例如单磷酸腺苷)组成，而没有其它碱基中断序列。聚A尾对于mRNA的核输出、翻译和稳定性至关重要。在自然界中，当mRNA从DNA产生时，末端转移酶将腺嘌呤核苷酸添加到mRNA的3’端。当离体产生mRNA时可应用此酶促过程，但所述过程难以控制而且产生不同长度的聚A尾。通过在质粒中编码聚A尾，有可能降低聚A尾中的异质性。然而，该过程不会消除异质性，而且具有其它缺点，例如质粒的潜在不稳定性。
聚A尾充当聚A结合蛋白的结合位点。聚A结合蛋白有助于从细胞核输出mRNA、翻译并抑制mRNA的降解。在没有从细胞核输出的情形下，mRNA通常被外来体降解。聚A结合蛋白募集翻译所需的蛋白质。
mRNA现在被用作治疗分子，例如用于治疗各种疾病和失调。mRNA代替蛋白质递送给受试者，从而使得受试者的细胞在细胞内产生由所述mRNA编码的蛋白质。出于这些和其它目的，可通过从通常含于质粒中的DNA模板转录来制备mRNA。在mRNA生产期间，聚A尾可在从质粒转录后酶促地添加到mRNA或在质粒自身上编码。当在质粒上编码聚A尾时，聚A尾可能在质粒DNA复制的循环中变得更短(即，丢失腺嘌呤核苷酸)，这可能导致所得DNA和后续mRNA群体中巨大的变化。因此，本领域需要设计编码聚A尾的质粒，所述质粒在DNA复制期间是稳定的，并且抵抗编码聚A腺嘌呤核苷酸的核苷酸的逐渐丢失。
发明内容
本文公开了编码聚腺苷酸化(聚A)尾的DNA和包含聚腺苷酸化(聚A)尾的mRNA，所述聚腺苷酸化(聚A)尾包含位于编码目的蛋白质的核苷酸3’的连续腺嘌呤核苷酸，其中通过插入非腺嘌呤核苷酸“锚”来稳定所述聚A尾。
如本文所用，术语“聚A尾”是指mRNA分子上的聚A尾，或DNA质粒内编码聚A尾的序列。聚A尾可由质粒内的互补DNA序列编码。DNA序列中的重复胸腺嘧啶(T)核苷酸的序列(例如均聚物T序列)可编码mRNA上的聚A尾。两个或更多个连续腺苷(例如腺苷或去氧腺苷)、胸苷或其它核苷酸称为均聚物。天然聚A尾包含长的、不间断的均聚物A序列。
本文所公开的非腺嘌呤核苷酸锚以规则或不规则隔开的间隔中断聚A尾并稳定编码所述聚A尾的DNA以及从所述DNA产生的mRNA。示例性非腺嘌呤核苷酸锚提供于表4中。例如，锚序列与聚A尾内的两个腺嘌呤核苷酸均聚物序列毗邻。
在一些实施例中，涵盖DNA组合物，其包含编码位于编码目的蛋白质的核苷酸3’的聚腺苷酸化(聚A)尾的核苷酸，其中所述聚A尾包含至少8个连续腺嘌呤(A)核苷酸和一个或多个非腺嘌呤(A)核苷酸。
在一些实施例中，聚A尾包含至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90个连续腺嘌呤核苷酸。
在一些情况中，与包含仅含有腺嘌呤核苷酸的相似或相同长度的3’尾的DNA中所发生的丢失相比，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸防止DNA复制期间一个或多个腺嘌呤核苷酸的丢失。
在一些实施例中，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸经定位以中断连续腺嘌呤核苷酸，使得聚(A)结合蛋白可结合到连续腺嘌呤核苷酸的区段。
在一些实施例中，聚A尾包含至少总共50个腺嘌呤核苷酸。
在一些实施例中，聚A尾包含总共40-500个腺嘌呤核苷酸。
在一些情况中，聚A尾包含总共95-100个腺嘌呤核苷酸。
在一些实施例中，聚A尾包含或含有总共90、91、92、93、94、95、96或97个腺嘌呤核苷酸。
在一些实施例中，聚A尾包含或含有总共96或97个腺嘌呤核苷酸。
在一些实施例中，聚A尾包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或一个2-10个非腺嘌呤核苷酸连续区段。
在一些实施例中，非腺嘌呤核苷酸位于至少8、9、10、11或12个连续腺嘌呤核苷酸之后。
在一些情况中，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8-50个连续腺嘌呤核苷酸之后。
在一些实施例中，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个连续腺嘌呤核苷酸之后。
在一些实施例中，聚A尾每8-50个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或一个2-10个核苷酸连续区段。在一些实施例中，聚A尾每8-50个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或一个包含至少两个非腺嘌呤核苷酸的2-10个核苷酸连续区段。在一些实施例中，聚A尾具有一个或多个非腺嘌呤核苷酸或一个或多个2-10个非腺嘌呤核苷酸连续区段，其沿聚A尾的长度在任意地方不规则地隔开，其中沿聚A尾长度的某处存在至少8个连续腺嘌呤。例如，聚A尾的长度可以是70-1000个核苷酸，且具有任何数量的沿长度不规则隔开的非腺嘌呤(单个或成组)，只要存在一个或多个至少8个连续腺嘌呤的区段即可。
在一些情况中，聚A尾每8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或一个2-10个核苷酸连续区段。
在一些情况中，聚A尾每8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或一个包含至少两个非腺嘌呤核苷酸的2-10个核苷酸连续区段。
在一些实施例中，聚A尾每8-50个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有1、2、3、4或5个连续非腺嘌呤核苷酸。
在一些情况中，聚A尾每8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有1、2、3、4或5个连续非腺嘌呤核苷酸。
在一些实施例中，聚A尾包含或含有一个以上非腺嘌呤核苷酸或一个以上2-10个核苷酸连续区段作为聚A尾内不规则隔开的中断序列。
在一些实施例中，聚A尾包含或含有在聚A尾内不规则隔开的一个以上非腺嘌呤核苷酸或一个以上包含至少两个非腺嘌呤核苷酸的2-10个核苷酸连续区段。
在一些情况中，聚A尾每12个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或2、3、4或5个连续非腺嘌呤核苷酸。
在一些实施例中，聚A尾每16个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或2、3、4或5个连续非腺嘌呤核苷酸。
在一些实施例中，聚A尾每25个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或2、3、4或5个连续非腺嘌呤核苷酸。
在一些情况中，聚A尾每30个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或2、3、4或5个连续非腺嘌呤核苷酸。
在一些实施例中，聚A尾每39个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或2、3、4或5个连续非腺嘌呤核苷酸。
在一些实施例中，非腺嘌呤核苷酸是鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。在一些情况中，非腺嘌呤核苷酸是鸟嘌呤核苷酸。在一些实施例中，非腺嘌呤核苷酸是胞嘧啶核苷酸。在一些实施例中，非腺嘌呤核苷酸是胸腺嘧啶核苷酸。
在存在一个以上非腺嘌呤核苷酸的一些情况中，非腺嘌呤核苷酸可选自：a)鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸；b)鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸；c)胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸；或d)鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸。
在一些实施例中，非腺嘌呤核苷酸由一个选自鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的非腺嘌呤核苷酸组成。
在一些情况中，非腺嘌呤核苷酸包含两个选自鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的一种或多种的非腺嘌呤核苷酸。
在一些实施例中，非腺嘌呤核苷酸包含三个选自鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的一种或多种的非腺嘌呤核苷酸。
腺嘌呤核苷酸可为单磷酸腺苷。
在一些实施方例中，由mRNA编码的蛋白质是治疗性蛋白质。在一些情况中，所述蛋白质是细胞因子、趋化因子、生长因子、Cas9或经修饰的Cas9。
在一些实施例中，涵盖由本文所述的任意DNA编码的mRNA。
在一些实施例中，DNA在载体内。载体可在宿主细胞内，包括昆虫、细菌或哺乳动物(例如人类)细胞。
在一些实施例中，与包含编码仅含有腺嘌呤核苷酸的相似或相同长度的聚A尾的核苷酸的DNA中所发生的丢失相比，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸防止宿主细胞生长期间载体内编码聚A尾的核苷酸的丢失。
涵盖从本文所述的任意DNA载体产生mRNA的方法，其包括：使聚A尾下游的载体线性化；使所述线性化载体变性；以及在鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和腺嘌呤核苷酸存在下使变性DNA与RNA聚合酶接触。
在一些实施例中，本公开包括DNA，其包含编码位于编码目的蛋白质的核苷酸3’的聚腺苷酸化(聚A)尾的核苷酸，其中所述聚A尾包含至少8个连续腺嘌呤(A)核苷酸的第一均聚物序列和包含一个或多个非腺嘌呤(A)核苷酸的中断序列。在一些这样的实施例中，聚A尾进一步包含至少连续腺嘌呤(A)核苷酸的第二均聚物序列。在一些实施例中，聚A尾包含至少8个连续腺嘌呤(A)核苷酸的三个或更多个均聚物序列。在一些实施例中，第一和/或后续均聚物序列包含至少10、15、20、25、30、35或40个连续腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，与包含仅含有腺嘌呤核苷酸的相似或相同长度的3’尾的DNA中所发生的丢失相比，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸防止DNA复制期间一个或多个腺嘌呤核苷酸的丢失。在一些实施例中，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸经定位以中断连续腺嘌呤核苷酸，使得聚(A)结合蛋白可结合到连续腺嘌呤核苷酸的区段。在一些实施例中，聚A尾包含至少总共50个腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，聚A尾包含总共40-1000、40-900、40-800、40-700、40-600、40-500、40-400、40-300、40-200或40-100个腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，聚A尾包含总共95-100个腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，聚A尾包含或含有总共90、91、92、93、94、95、96或97个腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，聚A尾包含或含有总共96或97个腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，所述一个或多个中断序列包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或一个2-10个非腺嘌呤核苷酸连续区段。在一些实施例中，所述一个或多个中断序列包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或一个包括两个或更多个非腺嘌呤核苷酸的2-10个核苷酸连续区段。在一些实施例中，非腺嘌呤核苷酸位于至少8、9、10、11或12个连续腺嘌呤核苷酸之后。在一些实施例中，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8-50个连续腺嘌呤核苷酸之后。在一些实施例中，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个连续腺嘌呤核苷酸之后。
在一些实施例中，如前一段所述，中断序列是三核苷酸、二核苷酸或单核苷酸中断序列。在一些这样的实施例中，聚A尾每8-50个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或一个2-10个非腺嘌呤核苷酸连续区段。在一些实施例中，聚A尾每8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或一个2-10个非腺嘌呤核苷酸连续区段。在一些实施例中，聚A尾每8-50个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有1、2、3、4或5个连续非腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，聚A尾每8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有1、2、3、4或5个连续非腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，聚A尾包含或含有一个以上非腺嘌呤核苷酸或一个以上2-10个非腺嘌呤核苷酸连续区段。在一些实施例中，所述一个以上非腺嘌呤核苷酸或一个以上2-10个非腺嘌呤核苷酸连续区段在聚A尾内不规则地隔开。在一些实施例中，聚A尾每12个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或2、3、4或5个连续非腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，聚A尾每16个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或2、3、4或5个连续非腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，聚A尾每25个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或2、3、4或5个连续非腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，聚A尾每30个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或2、3、4或5个连续非腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，聚A尾每39个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或2、3、4或5个连续非腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，非腺嘌呤核苷酸是鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。在一些实施例中，非腺嘌呤核苷酸是鸟嘌呤核苷酸。在一些实施例中，非腺嘌呤核苷酸是胞嘧啶核苷酸。在一些实施例中，非腺嘌呤核苷酸是胸腺嘧啶核苷酸。在一些实施例中，DNA包含一个以上选自以下的非腺嘌呤核苷酸：(a)鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸；(b)鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸；(c)胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸；或(d)鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸。在上文所述的一些实施例中，非腺嘌呤核苷酸由一个选自鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的非腺嘌呤核苷酸组成。在一些实施例中，非腺嘌呤核苷酸包含两个选自鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶中的一种或多种的非腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，非腺嘌呤核苷酸包含三个选自鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶中的一种或多种的非腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，腺嘌呤核苷酸是单磷酸腺苷。在一些实施例中，蛋白质是治疗性蛋白质。在一些实施例中，蛋白质是细胞因子或趋化因子。在一些实施例中，蛋白质是生长因子。在一些实施例中，蛋白质是Cas9或经修饰的Cas9。
本公开还涵盖由如先前段落中所述DNA编码的mRNA。
在一些实施例中，先前段落中所述的DNA也可包含在载体内。在一些实施例中，载体包含在宿主细胞内。在DNA是在载体内的一些实施例中，与包含编码仅含有腺嘌呤核苷酸的相似或相同长度的聚A尾的核苷酸的DNA中所发生的丢失相比，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸防止宿主细胞生长期间载体内编码聚A尾的核苷酸的丢失。
本公开还涵盖从本文所述DNA载体产生mRNA的方法，其包括：(a)使聚A尾下游的载体线性化；(b)使所述线性化载体变性；以及(c)在鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和腺嘌呤核苷酸存在下使变性DNA与RNA聚合酶接触。
附图说明
图1显示编码仅含有腺苷的聚A尾的序列，所述聚A尾的长度随生长轮数减少。每个克隆是指通过表达编码所述克隆的质粒的宿主细胞连续轮生长/纯化产生的DNA。
图2显示包含非腺嘌呤核苷酸的聚A尾经2次生长传代的大小保持。
图3显示分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)水平，其是在使用具有仅含有腺苷的聚A尾的Cas9 mRNA或具有包含非腺嘌呤核苷酸的聚A尾的Cas9 mRNA和靶向SEAP的单一向导RNA(SEQ ID NO:8)的Cas9 mRNA测定中测量的。
图4显示SEAP抑制百分比，其是在使用具有仅含有腺苷的聚A尾的Cas9 mRNA或具有包含非腺嘌呤核苷酸的聚A尾的Cas9 mRNA和靶向SEAP的单一向导RNA(SEQ ID NO:8)的Cas9 mRNA测定中利用24小时孵育测量的。
图5显示SEAP抑制百分比，其是在使用具有仅含有腺苷的聚A尾的Cas9 mRNA或具有包含非腺嘌呤核苷酸的聚A尾的Cas9 mRNA和靶向SEAP的单一向导RNA(SEQ ID NO:8)的Cas9 mRNA测定中利用48小时孵育测量的。
图6显示投用对照转化和储存溶液(TSS)缓冲液或投用液体纳米粒子(LNP)后7天小鼠中的血清转甲状腺素(TTR)水平，所述LNP是用SEQ ID NO:9的单一向导RNA(靶向小鼠TTR基因)和由SEQ ID NO:6编码的mRNA(HiCas9 mRNA)或由SEQ ID NO:7编码的mRNA(中断聚A mRNA)配制。
图7显示SEAP抑制百分比，其是在使用具有仅含有腺苷的聚A尾的Cas9 mRNA或具有包含非腺嘌呤核苷酸的聚A尾的Cas9 mRNA和靶向SEAP的单一向导RNA(SEQ ID NO:8)的Cas9 mRNA测定中利用48小时孵育测量的。
具体实施方式
本文公开了编码位于编码目的蛋白质的核苷酸3’的聚腺苷酸化尾的DNA，其中所述聚A尾包含一个或多个非腺嘌呤核苷酸。在DNA复制期间，与仅由腺嘌呤核苷酸组成的聚A尾相比，编码包含一个或多个非腺嘌呤核苷酸的聚A尾的DNA可显示较少的聚A尾内腺嘌呤核苷酸的逐渐丢失。因此，提供质粒，所述质粒包含编码包含一个或多个非腺嘌呤核苷酸的聚A尾的DNA。还涵盖由此类DNA编码的mRNA。比起包含非中断聚A尾的相似分子，所述DNA和RNA针对腺嘌呤核苷酸的进行性丢失均可展现更大的稳定性。
目的蛋白质可以是任何天然或非天然蛋白质。如本文所用，“蛋白质”是指任何连续氨基酸序列。同样地，蛋白质可以指包含天然蛋白质的全氨基酸序列的蛋白质。另外，蛋白质可以指包含全长蛋白质的片段的氨基酸序列。蛋白质可以是天然序列、具有一个或多个修饰的天然序列或自然界中不存在的人工序列。
目的蛋白质可在受试者中具有治疗用途，或这种蛋白质可在生化反应中使用。治疗性蛋白质包括例如生长因子、用于疫苗或免疫肿瘤学的抗原和酶等。治疗性蛋白质可以是天然的或经修饰的。在某些情况下，经修饰的蛋白质可以是融合蛋白。
在一些实施例中，通过mRNA表达蛋白质用作对疾病的治疗。在一些实施例中，通过mRNA表达蛋白质用作癌症免疫疗法、针对传染病的疫苗接种、诱导对I型过敏的耐受性、作为替代疗法或作为再生医药(参见Sergeeva OV等人，《生物化学(莫斯科)(Biochemistry(Moscow))》81(7):709-722(2016))。
在一些实施例中，利用编码前列腺特异性抗原(PSA)的mRNA离体转染自体树突细胞来调节患有转移性前列腺癌的受试者的T细胞免疫应答。
在一些实施例中，mRNA是预防性疫苗。在一些实施例中，mRNA编码一种或多种抗原性蛋白质。在一些实施例中，抗原性蛋白质是病毒蛋白。在一些实施例中，mRNA使体细胞产生并表达抗原性蛋白质。在一些实施例中，mRNA使抗原性蛋白质表达，而不具备危险或疾病或在个体间传播。在一些实施例中，抗原性蛋白质的表达使受试者的免疫系统产生抗体。在一些实施例中，这些抗体可以中和病毒并防止暴露于病毒后的未来感染。在一些实施例中，mRNA是用于传染病的预防性疫苗。在一些实施例中，mRNA是针对流行性感冒、基孔肯雅病(chikungunya)、寨卡病毒(Zika)、巨细胞病毒、人类偏肺病毒(HMPV)或3型副流行性感冒病毒(PIV3)的预防性疫苗。在一些实施例中，mRNA是针对流行性感冒H10或H7亚型的预防性疫苗。
在一些实施例中，mRNA是个性化的癌症疫苗。在一些实施例中，mRNA启动患有癌症的受试者的免疫系统以识别癌细胞并引发应答。在一些实施例中，这种应答针对个别患者的癌症或肿瘤而调整。在一些实施例中，mRNA编码患者的特异性新抗原(存在于患者癌症或肿瘤中的具有突变的独特蛋白质)。在一些实施例中，mRNA使患者的特异性新抗原表达。在一些实施例中，新抗原的表达引发患者的特异性免疫应答以识别并破坏癌细胞。在一些实施例中，mRNA用作个性化癌症疫苗。在一些实施例中，mRNA与一种或多种检查点抑制剂抗体(例如抗PD-1疗法)一起用作个性化癌症疫苗。
在一些实施例中，mRNA用于肿瘤内免疫肿瘤学。在一些实施例中，向肿瘤中注射mRNA降低脱靶效应和/或与全身用药与相比可能更强效。在一些实施例中，mRNA使CD134的配体OX40L(CD252)表达。在一些实施例中，mRNA使诸如白介素12(IL-12)的细胞因子表达。
在一些实施例中，mRNA使用于局部疗法的蛋白质表达。在一些实施例中，mRNA使得在局部组织中产生更多的血管并改善血液供应。在一些实施例中，mRNA使血管内皮生长因子A(VEGF-A)表达。在一些实施例中，VEGF-A的表达是局部且短暂的。在一些实施例中，局部且短暂的VEGF-A表达用于治疗心脏衰竭，或在心脏病发作后用于治疗糖尿病伤口愈合或其它缺血性血管疾病。
在一些实施例中，mRNA使用于替代疗法的蛋白质表达。在一些实施例中，蛋白质是表面活性剂蛋白质-B。
在一些实施例中，mRNA使RNA引导的核酸酶(例如2类CRISPR相关的Cas核酸内切酶，例如Cas9/Csn1(Cas9))表达。示例性Cas9序列是UniProt Q99ZW2。在一些实施例中，蛋白质是经修饰的Cas9或与另一功能性蛋白质或肽融合的Cas9蛋白。具有一个非活性催化结构域(RuvC或HNH)的Cas9的经修饰形式称为“切口酶”。在一些实施例中，组合物和方法包含切口酶。在一些实施例中，组合物和方法包含在靶标DNA上诱导缺口而不是双链断裂的切口酶Cas9。
在一些实施例中，Cas蛋白可经修饰以仅含有一个功能性核酸酶结构域。例如，Cas蛋白可经修饰以使得核酸酶结构域中的一个发生突变或完全或部分缺失以降低其核酸裂解活性。在一些实施例中，使用具有降低活性的RuvC结构域的切口酶Cas。在一些实施例中，使用具有非活性RuvC结构域的切口酶Cas。在一些实施例中，使用具有降低活性的HNH结构域的切口酶Cas。在一些实施例中，使用具有非活性HNH结构域的切口酶Cas。
在一些实施例中，嵌合Cas蛋白由DNA编码，其中蛋白质的一个结构域或区域由不同蛋白质的一部分替代。在一些实施例中，Cas核酸酶结构域可经来自不同核酸酶(例如Fok1)的结构域替代。在一些实施例中，Cas蛋白可以是经修饰的核酸酶。
I.编码包含非腺嘌呤核苷酸的聚A尾的DNA
如本文所用，“聚A尾”是指在mRNA的3’端包含腺苷或其它腺嘌呤核苷酸的序列。虽然天然聚A尾可仅包含腺嘌呤核苷酸，但本发明的“聚A尾”由一个或多个非腺嘌呤核苷酸“锚”稳定。在一些实施例中，聚A尾包含至少8个连续腺嘌呤核苷酸和一个或多个包含非腺嘌呤核苷酸的中断序列。换句话说，本发明的聚A尾包含至少8个连续腺嘌呤，但在中断或锚序列内还包含一个或多个非腺嘌呤核苷酸。本文所公开的中断序列以规则或不规则隔开的间隔中断聚A尾，并且稳定编码所述聚A尾的DNA以及从所述DNA产生的mRNA。示例性中断序列提供于表4中。
如本文所用，“非腺嘌呤核苷酸”是指不包含腺嘌呤的任何天然或非天然核苷酸。鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸是示例性非腺嘌呤核苷酸。
天然聚A尾是在DNA转录成mRNA后开始的聚腺苷酸化过程中添加的。然而，在分子生物学方法中，通常由位于编码目的蛋白质的质粒内的一部分DNA编码聚A尾。在这种情况中，聚A尾的大小(即，聚A尾中所包含的腺嘌呤核苷酸的数量)直接取决于质粒中编码这些连续腺嘌呤核苷酸的DNA核苷酸的数量。
编码聚A尾的DNA核苷酸的数量可在DNA复制期间，例如质粒在宿主细胞中生长期间逐渐降低。当质粒中编码连续腺嘌呤的核苷酸数量降低时，编码全长聚A尾的质粒产率降低，且具有较短聚A尾的所得mRNA可能具有降低的稳定性和/或增加的降解。例如，可预期具有40个连续腺嘌呤核苷酸的聚A尾的mRNA的稳定性要低于具有90个或更多个核苷酸的聚A尾的mRNA。较低的稳定性是指mRNA可更快地降解，且因此从具有较短聚A尾的mRNA的靶标蛋白质表达减少。因此，在宿主细胞内的多轮DNA复制中，维持DNA质粒内聚A尾的长度是有益的。另外，聚A尾对于翻译可能是重要的，且维持较长的聚A尾可能会改善蛋白质从mRNA的表达。
与包含仅含有腺嘌呤核苷酸的相似或相同长度的3’聚A尾的DNA中所发生的丢失相比，在位于编码目的蛋白质的核苷酸3’的聚A尾中纳入一个或多个非腺嘌呤核苷酸可防止DNA复制期间一个或多个腺嘌呤核苷酸的丢失。存在较长的聚A尾也可改善蛋白质从mRNA的翻译效率。
A.腺嘌呤核苷酸
本发明的聚A尾中连续腺嘌呤核苷酸的数量经设计以容许聚A结合蛋白结合到连续腺苷。如本文所用，“聚A结合蛋白(poly-A binding protein、poly A bindingprotein)”或“聚腺苷酸结合蛋白”是指结合到mRNA的聚A尾的蛋白质。聚A结合蛋白可以起调节翻译起始的作用。通过结合到聚A尾，聚A结合蛋白可以保护它们免受ZCCHC6/ZCCHC11的尿苷化，且因此有助于mRNA稳定性。聚A结合蛋白可位于细胞质信使核糖核蛋白(mRNP)颗粒中，其含有在细胞质与细胞核之间穿梭的未翻译的mRNA。示例性聚A结合蛋白是PABPC1(Uniprot参考号：P11940)。本发明的DNA可以编码足够的连续腺嘌呤核苷酸，使得在转录成mRNA时，一个或多个聚A结合蛋白保留结合聚A尾的能力。中断性非腺嘌呤核苷酸锚放置在该功能数目的连续腺嘌呤核苷酸之后。
在一些实施例中，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸经定位以中断连续腺嘌呤核苷酸，使得聚A结合蛋白可结合到连续腺嘌呤核苷酸的区段(即腺嘌呤核苷酸均聚物或“均聚物A”)。在一些实施例中，聚A尾包含至少8个连续腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，所述至少8个连续腺嘌呤核苷酸是8、9、10、11和/或12个连续核苷酸。在一些实施例中，聚A尾包含至少10、15、20、25、30、35和/或40个连续腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，聚A尾包含至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85和/或90个连续腺嘌呤核苷酸。例如，在聚A RNA序列中的均聚物可包含至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35或40个连续腺苷核苷酸。例如，在编码聚A尾的质粒序列中的均聚物可包含至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35或40个连续胸苷核苷酸。在一些实施例中，聚A尾包含两个或更多个不同长度的均聚物A序列，例如聚A尾中的中断序列是不规则隔开的。在一些实施例中，聚A尾包含规则隔开的中断序列和两种或更多种相同长度的均聚物。
在一些实施例中，聚A尾包含至少8个连续腺嘌呤核苷酸的第一均聚物序列、至少5个连续腺嘌呤核苷酸的第二均聚物序列和包含一个或多个非腺嘌呤核苷酸的锚。
在一些实施例中，聚A尾包含一组或多组8-50个连续腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，聚A尾包含一组或多组8-100个连续腺嘌呤核苷酸。对于具有多组连续腺嘌呤核苷酸(即多个均聚物序列)的聚A尾，每一组腺嘌呤核苷酸不需要具有相同的长度。
除了连续腺嘌呤核苷酸的数量以外，聚A尾也可由腺嘌呤核苷酸总量来表征。腺嘌呤核苷酸总量简单来说是聚A尾中所有腺嘌呤核苷酸的总和。因此，在腺嘌呤核苷酸的连续或非连续分组的不同组中的所有腺嘌呤核苷酸将包括在聚A尾中的腺嘌呤核苷酸总量中。
在一些实施例中，聚A尾包含总共40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160、160-170、170-180、180-190、190-200、200-210、210-220、220-230、230-240、240-250、250-260、260-270、270-280、280-290、290-300、300-310、310-320、320-330、330-340、340-350、350-360、360-370、370-380、380-390、390-400、400-410、410-420、420-430、430-440、440-450、450-460、460-470、470-480、480-490、490-500、500-510、510-520、520-530、530-540、540-550、550-560、560-570、570-580、580-590或590-600个腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，聚A尾包含一个或多个长度为至少8、9、10、12、25、30、50个核苷酸的均聚物A序列。
在一些实施例中，聚A尾包含总共40-1000、40-900、40-800、40-700、40-600、40-500、40-400、40-300、40-200或40-100个腺嘌呤核苷酸。
在一些实施例中，聚A尾包含至少总共40个腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，聚A尾包含至少总共50个腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，聚A尾包含至少40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280或300个腺嘌呤核苷酸。
在一些实施例中，聚A尾包含或含有总共90、91、92、93、94、95、96或97个腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，聚A尾包含或含有总共96或97个腺嘌呤核苷酸。
在一些实施例中，腺嘌呤核苷酸是单磷酸腺苷。核苷酸可以经修饰。
B.包含非腺嘌呤核苷酸的中断序列
本发明的非腺嘌呤核苷酸可包含天然或非天然核苷酸(例如鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶)或由其组成。核苷酸可以经修饰。
在一些实施例中，聚A尾在原本仅由腺嘌呤核苷酸组成的聚A尾中包含一个非腺嘌呤核苷酸。所述一个非腺嘌呤核苷酸可中断腺嘌呤核苷酸的序列。所述一个非腺嘌呤核苷酸可选自鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。在一些实施例中，所述一个非腺嘌呤核苷酸是鸟嘌呤核苷酸。在一些实施例中，所述一个非腺嘌呤核苷酸是胞嘧啶核苷酸。在一些实施例中，所述一个非腺嘌呤核苷酸是胸腺嘧啶核苷酸。中断序列可以是单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸序列。中断序列可包含1、2、3、4、5或更多个非腺嘌呤核苷酸，且其长度可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸。
在一些实施例中，单一非腺嘌呤核苷酸可以中断连续腺嘌呤核苷酸的集合或组。所述一个非腺嘌呤核苷酸可以使得聚A结合蛋白可结合到连续腺嘌呤核苷酸区段的方式经定位以中断连续腺嘌呤核苷酸。
在一些实施例中，聚A尾中存在一个以上非腺嘌呤核苷酸。所述一个以上非腺嘌呤核苷酸可以使得聚A结合蛋白可结合到连续腺嘌呤核苷酸区段的方式经定位以中断连续腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，非腺嘌呤核苷酸散布在一组以上连续腺嘌呤核苷酸之间，其中每一系列的连续腺嘌呤核苷酸中的腺嘌呤核苷酸数量足以容许聚A结合蛋白的结合。
非腺嘌呤核苷酸可在一个以上非腺嘌呤核苷酸的区段中。非腺嘌呤核苷酸可在包含一个或多个非腺嘌呤核苷酸的2-10个连续核苷酸的区段中。非腺嘌呤核苷酸可在散布在一组以上连续腺嘌呤核苷酸(例如，一个以上均聚物A序列)之间的中断序列中。在一些实施例中，连续非腺嘌呤核苷酸的数量可以是1个、2个、3个、4个或5个。在一些实施例中，存在2-10个非腺嘌呤核苷酸连续区段。在一些实施例中，存在包含至少两个非腺嘌呤核苷酸的2-10个核苷酸连续区段。
连续非腺嘌呤核苷酸可以是一个以上的相同核苷酸，或连续非腺嘌呤核苷酸可彼此不同。例如，非腺嘌呤核苷酸可以是一个以上的鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶核苷酸。非腺嘌呤核苷酸也可以是鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸；鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸；胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸；或鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸。非腺嘌呤核苷酸可包含两个选自鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶中的一种或多种的非腺嘌呤核苷酸。非腺嘌呤核苷酸可包含三个选自鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶中的一种或多种的非腺嘌呤核苷酸。非腺嘌呤核苷酸可包含三个以上选自鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶中的一种或多种的非腺嘌呤核苷酸。聚A尾可在非腺嘌呤核苷酸之间以规则或不规则的间隔包含腺嘌呤核苷酸。例如，可将聚A尾视为具有某种模式，其中所述模式规则或不规则。所述模式的关键是在聚A尾中的任何地方存在一个或多个非腺嘌呤核苷酸，只要在沿长度的任何地方存在至少8个连续腺嘌呤即可。在一些实施例中，聚A可在沿长度的任何地方包含具有至少8个连续腺嘌呤核苷酸的区段，其中所述腺嘌呤核苷酸在8个或更多个腺嘌呤后的任何地方经一个或多个非腺嘌呤核苷酸“中断”。中断序列可以是一个非腺嘌呤核苷酸或任选地包含至少两个非腺嘌呤核苷酸的2至10个连续核苷酸。每一核苷酸或包含至少两个非腺嘌呤核苷酸的核苷酸连续区段之后可以是一个或多个腺嘌呤、任选地之后是一个或多个非腺嘌呤核苷酸、任选地之后是一个或一个以上腺嘌呤核苷酸，依此类推，直到聚A尾的末端。腺嘌呤核苷酸/非腺嘌呤核苷酸的这种模式可以规则或不规则的间隔重复。或者，可以没有模式，例如仅有一个或一个2-10个核苷酸连续区段的情形，其任选地沿聚A的整个长度包含至少两个非腺嘌呤核苷酸。
II.聚A尾中腺嘌呤和非腺嘌呤核苷酸的示例性模式
本发明的聚A尾可包含多个不同模式的中断序列或由其组成，例如连续腺嘌呤核苷酸和一个或多个非腺嘌呤核苷酸。
聚A尾可以一个或一系列连续腺嘌呤核苷酸开始，之后是非腺嘌呤核苷酸。以一系列腺嘌呤核苷酸开始的聚A尾意指聚A尾的5’端由一个或一系列连续腺嘌呤核苷酸组成，其中在所述连续腺嘌呤核苷酸之后接有一个或多个非腺嘌呤核苷酸。“之后”意指非腺嘌呤核苷酸在一系列连续腺嘌呤核苷酸的3’。
在一些实施例中，聚A尾的5’端可由一系列连续腺嘌呤核苷酸组成，之后是一个或多个非腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8、9、10、11或12个连续腺嘌呤核苷酸之后。在一些实施例中，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8-50个连续腺嘌呤核苷酸之后。在一些实施例中，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8-100个连续腺嘌呤核苷酸之后。在一些实施例中，非腺嘌呤核苷酸在1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个腺嘌呤核苷酸之后，且之后是至少8个连续腺嘌呤核苷酸。
在一些实施例中，聚A尾的5’端由1至8个腺嘌呤核苷酸组成，之后是一个或多个非腺嘌呤核苷酸。在此类实施例中，所述非腺嘌呤核苷酸之后是更多个腺嘌呤核苷酸。在所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸之后的腺嘌呤核苷酸在另一非腺嘌呤核苷酸之前包含至少8个腺嘌呤核苷酸。
开始聚A尾的一组连续腺嘌呤核苷酸的大小范围可有所不同。在一些实施例中，聚A尾的5’端由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个连续腺嘌呤核苷酸组成。倘若第一个非腺嘌呤核苷酸落在1-7个腺嘌呤核苷酸之后，则聚A尾在所述非腺嘌呤核苷酸之后进一步包含具有至少8个腺嘌呤核苷酸的区段。
在一些实施例中，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个连续腺嘌呤核苷酸之后。
聚A尾可在3’端以非腺嘌呤核苷酸区段结束。聚A尾3’端的非腺嘌呤核苷酸的数量可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个非腺嘌呤核苷酸。或者，聚A尾的3’端可由一个或多个腺嘌呤核苷酸组成。
本发明的聚A尾可包含一个连续腺嘌呤核苷酸序列，之后是一个或多个非腺嘌呤核苷酸，任选地之后是其它腺嘌呤核苷酸。本发明的聚A尾也可包含一个以上的由一个或多个非腺嘌呤核苷酸中断的连续腺嘌呤核苷酸序列。连续腺嘌呤核苷酸的序列可以是至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个连续腺嘌呤核苷酸。中断序列中非腺嘌呤核苷酸的数量可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个非腺嘌呤核苷酸。
本发明的聚A尾也可包含一个系列以上的连续腺嘌呤核苷酸，其由非腺嘌呤核苷酸中断或散布有非腺嘌呤核苷酸。中断序列的长度可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。中断序列的长度可以是1-3、1-5、1-10、2-10、2-8、2-6或2-5个核苷酸。本发明的聚A尾可包含一组以上的连续腺嘌呤核苷酸和在每组连续腺嘌呤核苷酸之间包含一个非腺嘌呤核苷酸或一个以上2-10个非腺嘌呤核苷酸连续区段的中断序列。本发明的聚A尾可包含一组以上的连续腺嘌呤核苷酸和一个非腺嘌呤核苷酸或一个以上在每组连续腺嘌呤核苷酸之间包含至少两个非腺嘌呤核苷酸的2-10个核苷酸连续区段。本发明的聚A尾可包含一组以上的连续腺嘌呤核苷酸和一个或多个中断序列，所述中断序列各自包含一个或多个非腺嘌呤核苷酸。所述组可各自包含相同或不同数量的腺嘌呤核苷酸。在具有多组连续腺嘌呤核苷酸的实施例中，每一组连续腺嘌呤核苷酸的长度可足以容许结合聚A结合蛋白。
在一些实施例中，一个或多个非腺嘌呤核苷酸是以规则间隔位于聚A尾的中断序列。规则间隔意指以重复方式在一定数量的连续腺嘌呤核苷酸之后是非腺嘌呤核苷酸。
在一些实施例中，一个或多个非腺嘌呤核苷酸以不规则的间隔位于聚A尾。不规则间隔意指一定数量的连续腺嘌呤核苷酸之后是非腺嘌呤核苷酸，之后是另一组连续腺嘌呤核苷酸，所述另一组连续腺嘌呤核苷酸包含与第一组不同数量的腺嘌呤。
在一些实施例中，聚A尾每8-50个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或一个2-10个核苷酸非腺嘌呤核苷酸连续区段。在一些实施例中，聚A尾每8-50个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或一个2-10个非腺嘌呤核苷酸连续区段。在一些实施例中，聚A尾每8-100个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或一个2-10个核苷酸非腺嘌呤核苷酸连续区段。在一些实施例中，聚A尾每8-100个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或一个2-10个非腺嘌呤核苷酸连续区段。
在一些实施例中，聚A尾每8-50个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或一个包含至少两个非腺嘌呤核苷酸的2-10个核苷酸连续区段。在一些实施例中，聚A尾每8-50个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或一个包含至少两个非腺嘌呤核苷酸的2-10个核苷酸连续区段。在一些实施例中，聚A尾每8-100个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或一个包含至少两个非腺嘌呤核苷酸的2-10个核苷酸连续区段。在一些实施例中，聚A尾每8-100个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或一个包含至少两个非腺嘌呤核苷酸的2-10个核苷酸连续区段。
在一些实施例中，聚A尾每8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或一个包含非腺嘌呤核苷酸的2-10个核苷酸连续区段。
在一些实施例中，聚A尾每8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或一个包含至少两个非腺嘌呤核苷酸的2-10个核苷酸连续区段。
在一些实施例中，非腺嘌呤核苷酸的数量可以是1、2、3、4或5个连续非腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，连续腺嘌呤核苷酸的数量可以是8-50个腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，聚A尾每8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有1、2、3、4或5个连续非腺嘌呤核苷酸。
聚A尾中连续腺嘌呤核苷酸的数量可以是12、16、25、30或39。连续腺嘌呤核苷酸的数量也可大于39。在一些实施例中，聚A尾每12个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有1、2、3、4或5个连续非腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，聚A尾每16个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有1、2、3、4或5个连续非腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，聚A尾每25个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有1、2、3、4或5个连续非腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，聚A尾每30个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有1、2、3、4或5个连续非腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，聚A尾每39个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有1、2、3、4或5个连续非腺嘌呤核苷酸。连续非腺嘌呤核苷酸的数量也可大于5。
示例性三核苷酸中断序列包括GCG、CCG、GTG、TGG、CGG、GGT、TAT、CAT、CGT、CTC、GAT、CCT、TGT、CGC、CAC、TGC、TCG、TCT、CCC、GAC、TAG、GTT、CTG和TTT。存在63种可能的三核苷酸中断序列和36种没有末端A的三核苷酸中断序列。在一些实施例中，聚A尾包含一个或多个选自以下的三核苷酸中断序列：TGG、CGG、GGT、TAT、CAT、CGT、CTC、GAT、CCT、TGT、CGC、CAC、TGC、TCG、TCT、CCC、GAC、TAG、GTT、CTG和TTT。在一些实施例中，聚A尾包含多个中断序列，其经设计以使编码聚A尾的序列内或聚A尾内的3个或更多个核苷酸之间的杂交和退火最小化。在某些实施例中，使3个或更多个核苷酸之间的退火最小化的中断序列是选自没有末端A的34种三核苷酸中断序列。在一些实施例中，使3个或更多个核苷酸之间的退火最小化的中断序列选自TGG、CGG、GGT、TAT、CAT、CGT、CTC、GAT、CCT、TGT、CGC、CAC、TGC、TCG、TCT、CCC、GAC、TAG、GTT、CTG和TTT。在一些实施例中，例如SEQ ID NO:18，聚A尾包含选自以下的二核苷酸和/或三核苷酸中断序列：TGG、CGG、GGT、TAT、CAT、CGT、CTC、GAT、CCT、TGT、CGC、CAC、TGC、TCG、TCT、CCC、GAC、TAG、GTT、CTG、TTT和CG。在某些实施例中，聚A尾包含选自GCG、CCG和GTG的三核苷酸中断序列。示例性二核苷酸中断序列包括CG、GC、CC、GG、TT、CT、TC、GT和TG。存在15种可能的二核苷酸中断序列和9种不包括末端A的二核苷酸。单核苷酸中断序列可以是C、G和T。注意，关于以上任何核苷酸序列，当提到RNA序列(例如mRNA)时，与DNA序列相反，T由U替代。
所属领域技术人员将能够设计多种不同模式的编码具有连续腺嘌呤核苷酸和一个或多个非腺嘌呤核苷酸的聚A尾的DNA。一些包含至少8个连续腺嘌呤核苷酸和一个或多个腺嘌呤核苷酸的示例性聚A尾呈现在例如SEQ ID No:1-5、10、11和18中。
III.使用方法
本发明的DNA可用于产生由所述DNA编码的mRNA。在一些实施例中，mRNA由本发明的DNA编码。
在一些实施例中，制备本发明的DNA以用于产生mRNA。在一些实施例中，所述DNA在载体内。在一些实施例中，所述载体在宿主细胞内。在一些实施例中，由本发明的DNA编码的mRNA用于翻译由所述DNA编码的目的蛋白质。
在一些实施例中，与包含仅含有腺嘌呤核苷酸的相似或相同长度的3’尾的DNA中所发生的丢失相比，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸防止DNA复制期间一个或多个腺嘌呤核苷酸的丢失。DNA复制在质粒生长以供DNA纯化中是必要步骤。因此，与编码仅由腺嘌呤核苷酸组成的聚A尾的质粒相比，包含编码包含至少8个连续腺嘌呤核苷酸和一个或多个非腺嘌呤核苷酸的聚A尾的本发明DNA的质粒经一轮或多轮质粒生长和纯化可显示改善的稳定性。
与包含含有编码仅由连续腺嘌呤核苷酸组成的聚A尾的序列的DNA的质粒相比，包含含有编码包含至少8个连续腺嘌呤核苷酸和一个或多个非腺嘌呤核苷酸的聚A尾的序列的本发明DNA的质粒在宿主细胞中生长时可具有更大的稳定性。在表达含有DNA序列的质粒的宿主细胞生长期间，与仅由腺嘌呤核苷酸组成的聚A尾相比，编码包含连续腺嘌呤核苷酸和一个或多个非腺嘌呤核苷酸的聚A尾的DNA序列可抵抗编码聚A尾的DNA的长度减少。在一些实施例中，与包含编码仅包含腺嘌呤核苷酸的聚A尾的DNA的质粒相比，包含编码包含一个或多个非腺嘌呤核苷酸的聚A尾的DNA的质粒防止宿主细胞生长期间的腺嘌呤丢失。
所属领域技术人员已知的任何生长和纯化载体的方式均可用于编码质粒的宿主细胞的生长。载体的生长和纯化过程也可称为质粒制备。质粒纯化的标准步骤包括细菌培养物的生长、细菌的收获和裂解以及质粒DNA的纯化。可从各个制造商获得多种试剂盒以纯化质粒DNA。质粒制备的步骤可以是微量制备(minipreparation)(预期产量为20至40μg或50至100μg质粒DNA)、中量制备(midipreparation)(预期产量为100至350μg质粒DNA)、大量制备(maxipreparation)(预期产量为500-850μg质粒DNA)、超量制备(megapreparation)(预期产量为1.5-2.5mg质粒DNA)或超大量制备(gigapreparation)(预期产量为7.5-10mg质粒DNA)。对于治疗性mRNA生产，质粒可以以100mg、1g、10g或更大的规模生产。编码如本文所述具有非腺嘌呤核苷酸的聚A尾的质粒的稳定性和复制效率的提高可改善以这种规模制得的质粒的一致性和效率。
在一些实施例中，涵盖从本发明的DNA载体产生mRNA的方法。在一些实施例中，从DNA载体产生mRNA的方法包括使聚A尾下游的载体线性化；使所述线性化载体变性；以及使变性DNA与RNA聚合酶在RNA核苷酸，例如鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤或此类核苷酸的化学修饰形式，例如假尿苷、N-1-甲基假尿苷、甲氧基尿苷等的存在下接触。经修饰的残基(例如碱基、糖和核苷酸残基的骨架修饰)可用于本文所述的mRNA、多核苷酸和方法中。
此说明和示例性实施例不应视为具有限制性。出于本说明书和所附权利要求书的目的，除非另有指示，否则本说明书和权利要求书中所用的表示数量、百分比或比例的所有数字和其它数值均应理解为在所有情况中均由术语“约”修饰(如果它们尚未被如此修饰)。因此，除非指示相反情形，否则以下说明书和所附权利要求书中所阐述的数值参数是近似值，其可根据寻求获得的所需性质而变化。至少，并且不试图将等同原则的应用限制到权利要求的范围，每一数值参数应至少根据所报告有效数字的数量并通过应用普通舍入技术来解释。
应注意，除非特别且明确地限于一种指示物，否则如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一(a、an)”和“所述(the)”以及任何词语的任何单数使用均包括复数个指示物。如本文所用，术语“包括”及其语法变体旨在为非限制性的，使得列表中所列举项目不排除可经取代或添加到所列示项目中的其它类似项目。
序列的说明
此表提供本文所引用的某些序列的列表。再次注意，当提到下表中DNA序列的RNA形式时，T由U替代。当提到下表中RNA序列的DNA形式时，U由T替代。
表1
Figure BDA0002445894150000201
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Figure BDA0002445894150000761
Figure BDA0002445894150000771
硫代磷酸酯(PS)键联或键是指硫取代磷酸二酯键联(例如核苷酸碱基之间的键)中的一个非桥接磷酸氧的键。当使用硫代磷酸酯来产生寡核苷酸时，经修饰的寡核苷酸也可称为S-寡核苷酸。
“*”可用于绘示PS修饰。在本申请中，术语A*、C*、U*或G*可用于表示以PS键连接到下一个(例如3’)核苷酸的核苷酸。
在本申请中，术语“mA*”、“mC*”、“mU*”或“mG*”可用于表示已经由2’-O-Me取代且以PS键连接到下一个(例如3’)核苷酸的核苷酸。
实例
提供以下实例以说明某些公开的实施例，且不应解释为以任何方式限制本公开的范围。
实例1-用于聚A编码的稳定质粒的设计和稳定性
设计包含非腺嘌呤核苷酸的聚A尾。将编码这些具有连续腺嘌呤核苷酸和非腺嘌呤核苷酸(例如中断序列)的聚A尾的质粒的稳定性与仅由腺嘌呤核苷酸构成的聚A尾进行比较。
表2中突出了仅由腺苷组成的mRNA聚A尾中腺苷数量丢失的问题。将含有96个腺苷的聚A尾的序列插入到pUC57质粒(金斯瑞(Genscript))中并转化到大肠杆菌中。将细胞平铺在LB-Amp板上，并在30℃或37℃下孵育过夜。挑取8个群落并接种到具有LB-Amp培养基的96孔板中并在30℃或37℃下生长过夜(第1天)。将来自第1天培养物的样品添加到新鲜LB-Amp培养基中，且在30℃或37℃下再生长两天(第2天)。从第1天和第2天培养物中纯化DNA并进行测序以确定质粒中的聚A尾长度。示例性结果示于下表2和图1中。
表2：大肠杆菌中质粒生长后的聚A长度
Figure BDA0002445894150000772
Figure BDA0002445894150000781
对于多个群落来说，每一轮的生长都伴随着聚A尾内腺苷数量的减少，只有一个群落通过两轮复制维持超过90个腺苷。另外，细菌群落的大小与质粒中聚A尾长度的损失相关(即，较大的群落与聚A长度的损失对应)，这表明编码较长聚A尾的序列可能抑制质粒产生期间的细菌生长。从大肠杆菌群落纯化的DNA代表来自含有质粒DNA的个别大肠杆菌的DNA群体。因此，表2中所提供的值(和本文所述的相似值)代表群体的平均聚A长度。此外，在长重复序列(例如聚A)的PCR和测序期间，聚合酶可能会滑移，从而导致序列看起来比实际序列稍短。因此，对于显示95个腺苷的结果，不能确定质粒是否丢失了一个腺苷，或者其是否为PCR假象。然而，在PCR扩增和测序期间，显著的损失不是聚合酶滑移的假象。
在单独的实验中，利用含有SEQ ID NO:1的聚A尾的pUC57质粒转化大肠杆菌并平铺在LB-Amp板上。通过两轮生长培养8个克隆，并测试编码聚A尾的序列的维持。1个克隆的代表性数据示于图2中，其中在编码它的质粒的2轮生长中没有看到SEQ ID NO:1的聚A尾的尾大小发生改变。微量制备1是指第一轮生长，而微量制备2是指第二轮生长。使用英杰公司(Invitrogen)Purelink快速质粒微量制备试剂盒实施微量制备。
测试编码具有额外非腺苷模式的聚A尾(SEQ ID NO:3)的质粒在大肠杆菌中耐受复制的能力。将含有SEQ ID NO:3的聚A尾的序列插入到pUC19质粒(金斯瑞)中并转化到大肠杆菌中。将细胞平铺在LB-Kan板上，并在30℃或37℃下孵育过夜。挑取8个群落并接种到具有LB-Kan培养基的96孔板中，且在30℃或37℃下生长过夜(第1天)。将来自第1天培养物的样品添加到新鲜LB-Kan培养基中，且在30℃或37℃下再生长两天(第2天)。从第1天和第2天培养物中纯化DNA并进行测序以确定质粒中的聚A尾长度。在所测序的8个第1天培养物中，有6个维持25、24、24和24个腺苷的区段，且在所测序的12个第2天培养物中，有9个维持25、24、24和24个腺苷的区段，这证明与仅腺苷的序列相比，聚A保留有所改善。
这些数据指示，与编码仅含有腺苷的聚A尾的DNA相比，编码包含非腺嘌呤核苷酸的聚A尾的DNA经多轮质粒生长和纯化具有改善的稳定性。
实例2-具有包含非腺嘌呤核苷酸的聚A尾的构建体的活性
实施实验以确定具有包含非腺嘌呤核苷酸(中断序列)的聚A尾的mRNA与具有仅含有腺苷的聚A尾的那些mRNA的效能是否存在差异。使用模型系统，在该模型系统中通过电穿孔将编码Cas9蛋白的mRNA与编码分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的报告质粒以及靶向SEAP的向导RNA一起转染到HEK-293细胞中。Cas9蛋白从mRNA的成功表达使得SEAP靶序列裂解，从而导致反映SEAP产生减少的颜色变化。SEAP HEK-Blue报告试剂是从安维沃根公司(Invivogen)获得的。将含有T7启动子且编码具有仅腺苷聚A尾(设计具有100个腺苷核苷酸，但通过测序显示为具有97个腺苷核苷酸)的Cas9mRNA的序列(SEQ ID NO:6)或含有T7启动子且编码具有SEQ ID NO:1的聚A尾的Cas9 mRNA的序列(SEQ ID NO:7)克隆到pUC57质粒(金斯瑞)中。通过体外转录从编码每一mRNA的线性化质粒产生mRNA。
图3显示在HEK-Blue细胞分析中，0.005-50nM浓度的具有仅腺苷聚A或SEQ ID NO:1的聚A的Cas9 mRNA和1μM靶向SEAP的单一向导RNA(SEQ ID NO:8)的滴定。
HEK-Blue结果显示，在剂量-反应曲线中，具有任一聚A尾的mRNA的作用相似。由于基线蓝色指示SEAP表达，如由颜色变为粉色所证明，更高浓度的mRNA导致SEAP报告基因表达减少。因此，与仅含有腺苷的聚A尾相比，包含非腺嘌呤核苷酸的聚A尾不会改变Cas9构建体的表达和功能效能。
还将通过SEQ ID NO:6的Cas 9mRNA表达赋予的编辑效能与SEQ ID NO:7的Cas9mRNA进行比较(即，仅腺苷聚A尾与SEQ ID NO:1的聚A尾进行比较)。在这些实验中，通过电穿孔用sgRNA(SEQ ID NO:8)和所述两种不同的mRNA转染HEK-Blue细胞。
图4显示两种构建体在24小时孵育后的SEAP抑制百分比。具有仅含有腺苷的聚A尾和具有包含非腺嘌呤核苷酸的聚A尾的mRNA的SEAP编辑的EC50相似，分别为0.050和0.054。
图5显示两种构建体在48小时孵育后的SEAP抑制百分比。具有仅含有腺苷的聚A尾和具有包含非腺嘌呤核苷酸的聚A尾的mRNA的SEAP编辑的EC50相似，分别为0.086和0.082。
还在体内确认了mRNA表达和活性。将SEQ ID NO:6(HiCas9 mRNA)和SEQ ID NO:7(中断聚A mRNA)的Cas9 mRNA与SEQ ID NO:9的单一向导RNA(靶向小鼠TTR基因)以1:1重量比配制成脂质纳米粒子(LNP)，并通过静脉内投药以1mg/kg或0.5mg/kg的总RNA施用给CD-1雌性小鼠(n＝5)。在投药后7天从动物收集血液，且通过ELISA测量TTR蛋白的血清水平。简单来说，使用小鼠前白蛋白(转甲状腺素)ELISA试剂盒(奥维亚系统生物公司(AvivaSystems Biology)，目录号OKIA00111)测定总TTR血清水平。根据制造商方案制备试剂盒试剂和标准品。在SpectraMax M5读板仪上在450nm吸光度下读板。通过SoftMax Pro软件6.4.2版，使用四参数逻辑曲线拟合标准曲线来计算血清TTR水平。针对测定稀释度调整最终血清值。
图6显示在投药后7天，两种聚A构建体的血清TTR敲低水平(代表TTR基因的编辑百分比)相当。通过对在第7天收获的小鼠肝脏中的TTR基因座进行测序来确认血清TTR敲低结果。接受仅腺苷聚A mRNA的小鼠在0.5mg/kg和1mg/kg总RNA下分别显示61.74％和69.84％编辑，而接受含有非腺苷核苷酸的聚A mRNA的小鼠在0.5mg/kg和1mg/kg总RNA下显示63.14％和70.82％编辑。
因此，与具有仅含有腺苷的聚A尾的Cas9 mRNA相比，表达具有包含非腺嘌呤核苷酸的聚A尾的Cas9 mRNA产生相似的编辑效能。
实例3-具有包含其它中断序列的聚A尾的构建体的活性
如实例2中实施实验以测定具有包含非腺嘌呤核苷酸的聚A尾的mRNA与具有仅含有腺苷核苷酸的聚A尾的那些mRNA的效能。使用并入聚A序列的引物通过PCR扩增制备含有T7启动子且编码Cas9 mRNA的序列，所述Cas9 mRNA具有包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的中断聚A尾。mRNA通过体外转录从这些PCR产物产生。SEQ ID NO:18的mRNA通过体外转录从编码所述mRNA的线性化质粒产生。
图7显示在HEK-Blue细胞测定中，0.02-6nM浓度的具有仅腺苷聚A[100PA]或SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的聚A的Cas9 mRNA和1μM靶向SEAP的单一向导RNA(SEQ ID NO:8)的滴定。具体来说，图7显示构建体在48小时孵育后的SEAP抑制百分比，且EC50值提供于下表3中。所有构建体均具有活性。
表3：SEAP抑制的EC50值
Figure BDA0002445894150000811
实例4-具有中断序列的长聚A的克隆
设计300个核苷酸长的聚A尾SEQ ID NO:18[300pa]，其包含12个来自表4(下文)的中断序列和12个连续腺苷的13个重复序列。设计SEQ ID NO:18的锚序列以使聚A尾的约300nt内的三核苷酸中断序列之间的杂交和自退火最小化。下表4提供使中断序列之间的退火最小化的中断序列，且包括此实验中所用的锚。
为克隆SEQ ID NO:18，在pUC57微型载体(金斯瑞)中产生序列聚A-1(SEQ ID NO:12)、聚A-2(SEQ ID NO:13)、聚A-3(SEQ ID NO:14)和聚A-4(SEQ ID NO:15)中的每一个。通过以下来产生pA1-2质粒：用Bcl11a引物扩增SEQ ID NO:12，用限制酶XhoI和AclI消化PCR产物并将限制片段连接到包含用XhoI和BstBI消化的SEQ ID NO:13的pA2质粒中。pA3-4质粒以相同方式产生，扩增SEQ ID NO:14并将其连接到质粒pA4上的相同限制位点中。通过以下来组装pA1-4质粒(包含SEQ ID NO:18)：从pA3-4扩增SEQ ID NO:17序列，用BbsI和XbaI限制酶消化PCR片段并将限制片段克隆到用BbsI和XbaI限制酶消化的聚A1-2(SEQ ID NO:16)构建体中。使用[pUC-M seq2正向引物和pUC-M seq反向引物]作为引物(SEQ ID No:20和21)，通过桑格(Sanger)测序从两个方向评价pA1-2和pA3-4中的插入片段。
通过用XhoI和XbaI消化pA1-4来切除所得SEQ ID NO:18(300PA)聚A序列以供克隆到蛋白质编码载体中的相同位点。所有步骤均是在标准条件下进行的。
表4：
CGG CGT CGC
CTG CTT CTC
CAG CAT CAC
CCC CCG CCT
GGG GGT GGC
GCG GCT GCC
GAG GAT GAC
GTG GTT GTC
TGG TGT TGC
TTG TTT TTC
TAG TAT TAC
TCG TTC TCC

Claims (46)

1.一种DNA，其包含编码位于编码目的蛋白质的核苷酸3’的聚腺苷酸化(聚A)尾的核苷酸，其中所述聚A尾包含至少8个连续腺嘌呤(A)核苷酸的第一均聚物序列和包含一个或多个非腺嘌呤(A)核苷酸的中断序列。
2.根据权利要求1所述的DNA，其中所述聚A尾进一步包含至少连续腺嘌呤(A)核苷酸的第二均聚物序列。
3.根据权利要求1或2所述的DNA，其中所述聚A尾包含至少8个连续腺嘌呤(A)核苷酸的三个或更多个均聚物序列。
4.根据权利要求1所述的DNA，其中所述第一和/或后续均聚物序列包含至少10、15、20、25、30、35或40个连续腺嘌呤核苷酸。
5.根据权利要求1所述的DNA，其中与包含仅含有腺嘌呤核苷酸的相似或相同长度的3’尾的DNA中所发生的丢失相比，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸防止DNA复制期间一个或多个腺嘌呤核苷酸的丢失。
6.根据权利要求1所述的DNA，其中所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸经定位以中断所述连续腺嘌呤核苷酸，使得聚(A)结合蛋白可结合到连续腺嘌呤核苷酸的区段。
7.根据权利要求1所述的DNA，其中所述聚A尾包含至少总共50个腺嘌呤核苷酸。
8.根据权利要求1所述的DNA，其中所述聚A尾包含总共40-1000、40-900、40-800、40-700、40-600、40-500、40-400、40-300、40-200或40-100个腺嘌呤核苷酸。
9.根据权利要求1所述的DNA，其中所述聚A尾包含总共95-100个腺嘌呤核苷酸。
10.根据权利要求1所述的DNA，其中所述聚A尾包含或含有总共90、91、92、93、94、95、96或97个腺嘌呤核苷酸。
11.根据权利要求1所述的DNA，其中所述聚A尾包含或含有总共96或97个腺嘌呤核苷酸。
12.根据权利要求1所述的DNA，其中所述一个或多个中断序列包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或一个2-10个非腺嘌呤核苷酸连续区段。
13.根据权利要求1所述的DNA，其中所述一个或多个中断序列包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或一个包括两个或更多个非腺嘌呤核苷酸的2-10个核苷酸连续区段。
14.根据权利要求12或13所述的DNA，其中所述非腺嘌呤核苷酸位于至少8、9、10、11或12个连续腺嘌呤核苷酸之后。
15.根据权利要求1所述的DNA，其中所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8-50个连续腺嘌呤核苷酸之后。
16.根据权利要求1所述的DNA，其中所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个连续腺嘌呤核苷酸之后。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的DNA，其中所述中断序列是三核苷酸、二核苷酸或单核苷酸中断序列。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的DNA，其中所述聚A尾每8-50个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或一个2-10个非腺嘌呤核苷酸连续区段。
19.根据权利要求1至16中任一项所述的DNA，其中所述聚A尾每8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或一个2-10个非腺嘌呤核苷酸连续区段。
20.根据前述权利要求中任一项所述的DNA，其中所述聚A尾每8-50个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有1、2、3、4或5个连续非腺嘌呤核苷酸。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的DNA，其中所述聚A尾每8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有1、2、3、4或5个连续非腺嘌呤核苷酸。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的DNA，其中所述聚A尾包含或含有一个以上非腺嘌呤核苷酸或一个以上2-10个非腺嘌呤核苷酸连续区段。
23.如任一前述权利要求所述的DNA，其中所述一个以上非腺嘌呤核苷酸或一个以上2-10个非腺嘌呤核苷酸连续区段在所述聚A尾内不规则地隔开。
24.根据前述权利要求中任一项所述的DNA，其中所述聚A尾每12个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或2、3、4或5个连续非腺嘌呤核苷酸。
25.根据前述权利要求中任一项所述的DNA，其中所述聚A尾每16个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或2、3、4或5个连续非腺嘌呤核苷酸。
26.根据前述权利要求中任一项所述的DNA，其中所述聚A尾每25个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或2、3、4或5个连续非腺嘌呤核苷酸。
27.根据前述权利要求中任一项所述的DNA，其中所述聚A尾每30个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或2、3、4或5个连续非腺嘌呤核苷酸。
28.根据前述权利要求中任一项所述的DNA，其中所述聚A尾每39个连续腺嘌呤核苷酸包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或2、3、4或5个连续非腺嘌呤核苷酸。
29.根据前述权利要求中任一项所述的DNA，其中所述非腺嘌呤核苷酸是鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。
30.根据权利要求29所述的DNA，其中所述非腺嘌呤核苷酸是鸟嘌呤核苷酸。
31.根据权利要求29所述的DNA，其中所述非腺嘌呤核苷酸是胞嘧啶核苷酸。
32.根据权利要求29所述的DNA，其中所述非腺嘌呤核苷酸是胸腺嘧啶核苷酸。
33.根据权利要求29所述的DNA，其包含一个以上选自以下的非腺嘌呤核苷酸：
a.鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸；
b.鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸；
c.胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸；或
d.鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸。
34.根据前述权利要求中任一项所述的DNA，其中所述非腺嘌呤核苷酸由一个选自鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的非腺嘌呤核苷酸组成。
35.根据前述权利要求中任一项所述的DNA，其中所述非腺嘌呤核苷酸包含两个选自鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶中的一种或多种的非腺嘌呤核苷酸。
36.根据前述权利要求中任一项所述的DNA，其中所述非腺嘌呤核苷酸包含三个选自鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶中的一种或多种的非腺嘌呤核苷酸。
37.根据前述权利要求中任一项所述的DNA，其中所述腺嘌呤核苷酸是单磷酸腺苷。
38.根据前述权利要求中任一项所述的DNA，其中所述蛋白质是治疗性蛋白质。
39.根据权利要求38所述的DNA，其中所述蛋白质是细胞因子或趋化因子。
40.根据权利要求38所述的DNA，其中所述蛋白质是生长因子。
41.根据权利要求38所述的DNA，其中所述蛋白质是Cas9或经修饰的Cas9。
42.一种mRNA，其由根据前述权利要求中任一项所述的DNA编码。
43.根据前述权利要求中任一项所述的DNA，其中所述DNA在载体内。
44.根据权利要求43所述的DNA，其中所述载体在宿主细胞内。
45.根据权利要求43所述的DNA，其中与包含编码仅含有腺嘌呤核苷酸的相似或相同长度的聚A尾的核苷酸的DNA中所发生的丢失相比，所述一个或多个非腺嘌呤核苷酸防止宿主细胞生长期间载体内编码聚A尾的核苷酸的丢失。
46.一种从权利要求43的DNA载体产生mRNA的方法，其包括：
a.使聚A尾下游的载体线性化；
b.使所述线性化载体变性；以及
c.在鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和腺嘌呤核苷酸存在下使所述变性DNA与RNA聚合酶接触。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024041641A1 (zh) * 2022-08-26 2024-02-29 深圳瑞吉生物科技有限公司 在宿主细胞中稳定存在的多段化PolyA多核苷酸及其应用

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018201086A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Editas Medicine, Inc. Methods and systems for analyzing guide rna molecules
CN110997908A (zh) 2017-06-09 2020-04-10 爱迪塔斯医药公司 工程化的cas9核酸酶
EP3652312A1 (en) 2017-07-14 2020-05-20 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites
KR20200074134A (ko) * 2017-09-29 2020-06-24 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. 지질 나노파티클을 이용한 mRNA 전달의 체외 방법

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160243258A1 (en) * 2014-10-09 2016-08-25 Seattle Children's Research Institute Long poly(a) plasmids and methods for introduction of long poly(a) sequences into the plasmid
WO2017059902A1 (en) * 2015-10-07 2017-04-13 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh 3' utr sequences for stabilization of rna
US20170166905A1 (en) * 2014-07-11 2017-06-15 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Stabilization of poly(a) sequence encoding dna sequences

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MA41349A (fr) * 2015-01-14 2017-11-21 Univ Temple Éradication de l'herpès simplex de type i et d'autres virus de l'herpès associés guidée par arn
KR101786396B1 (ko) * 2016-10-27 2017-11-24 서울대학교산학협력단 전령 rna의 3′말단 서열 분석 방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170166905A1 (en) * 2014-07-11 2017-06-15 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Stabilization of poly(a) sequence encoding dna sequences
US20160243258A1 (en) * 2014-10-09 2016-08-25 Seattle Children's Research Institute Long poly(a) plasmids and methods for introduction of long poly(a) sequences into the plasmid
WO2017059902A1 (en) * 2015-10-07 2017-04-13 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh 3' utr sequences for stabilization of rna

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HYESHIK CHANG等: ""TAIL-seq: genome-wide determination of poly(A) tail length and 3\" end modifications"", 《MOL CELL》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024041641A1 (zh) * 2022-08-26 2024-02-29 深圳瑞吉生物科技有限公司 在宿主细胞中稳定存在的多段化PolyA多核苷酸及其应用

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